Universidad de Puerto Rico Recinto de Rio Piedras

Departamento de Biología
Laboratorio de Biología General 3102

Título: Procariotas
Objetivos: Después de este laboratorio el estudiante podrá:
1. Conocer cómo se clasifican los organismos en cada Dominio.
2. Conocer cuáles son las características principales de los organismos dentro del Dominio
Bacteria.
3. Identificar las formas principales de las bacterias.
4. Familiarizarse con las técnicas asépticas y de transferencia.
5. Realizar una tinción Gram.
6. Conocer algunos ejemplos acerca de la importancia económica, ecológica y médica que
tienen las bacterias.

Introducción.
Los procariotas son organismos que carecen de núcleo verdadero porque no tienen una
membrana nuclear que rodee su material genético (ADN). Por ello su nombre Pro-cariota; el
prefijo “Pro” significa primitivo y el sufijo “cario” hace referencia al núcleo. Los Procariotas se
componen de los dominios Bacteria y Arqueas. Algunas de las diferencias fundamentales entre
las Bacterias y Arqueas son composición de membranas y las secuencias de ARN y ADN.
Ambos se pueden encontrar en cualquier tipo de ambiente; son ubicuas.

Los procariotas son los organismos más abundantes en la Tierra. Habitan todos los lugares de la
biosfera incluyendo ambientes extremos como por ejemplo las aguas termales en los baños de
Coamo e incluso las salinas de Cabo Rojo. Los procariotas tienen alta relevancia en diversos
campos. En el campo de la medicina son altamente relevantes ya que bacterias como los
Streptomyces sp. son los mayores productores de antibióticos utilizados para combatir
infecciones bacterianas. En la agricultura bacterias como Rhizobium sp. están encargadas de fijar
Nitrógeno y hacerlo disponible para que las plantas puedan utilizarlo. Uno de los usos más
comunes en la industria de los alimentos es la elaboración de lácteos fermentados como el yogur,
queso, mantequilla, entre otros. Dado a sus habilidades para descomponer diversos compuestos
orgánicos e inorgánicos las bacterias participan en diversos ciclos biogeoquímicos y en la
bioremediación.

Cuando un microbiólogo va a identificar un cultivo desconocido de una bacteria el mismo debe

recopilar información importante referente a la morfología microscópica y macroscópica del
organismo bajo estudio.

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Morfología microscópica de las bacterias

Existen diferentes formas bacterianas esta forma está determinada por la rigidez de su pared
celular. Se diferencian según su forma en cocos (esferas), bacilos (cilíndricas), y espirilos
(espirales). Estas son las más comunes:

El tamaño de las bacterias fluctúa entre 0.5 – 3 μm algunas pueden llegar a medir 10 μm y sólo
se pueden observar utilizando un microscopio. El que microscopio que comúnmente usamos en
el laboratorio es el microscopio compuesto, aunque existen otros tipos de microscopios. Cuando
observamos bacterias bajo el microscopio compuesto debemos realizar la técnica de inmersión
de aceite (Figura 2), la cual aumenta el poder de resolución del instrumento. Para ello se utiliza
el objetivo de inmersión (100X). Una vez haya enfocado su muestra hasta el objetivo de 40X
posicione los objetivos entre medio dejando un espacio para clocar el aceite. Luego coloque una
gota de aceite sobre el cubreobjetos de su laminilla como. Finalmente ponga el objetivo de 100X
en posición (sobre la gota de aceite) y haga los ajustes pertinentes con el tornillo micrométrico.

Para observar las células bacterianas bajo el microscopio debemos hacer una preparación la cual
consiste en colocar las células bacterianas en una laminilla (frotis) y luego fijarlas con calor
(pegarlas) en esa laminilla. La preparación del frotis consiste en extender homogéneamente la
muestra (por ejemplo, un cultivo bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una laminilla.
Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por ejemplo, con calor). Con la fijación del
frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesión a la laminilla y la
conservación de su morfología. Después de preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier
tipo de coloración (simple o diferencial).

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Las células bacterianas son incoloras por lo que debemos teñirlas para poder observarlas. Las
tinciones pueden ser simples o compuestas. La tinción simple requiere del uso de 1 solo tinte o
reactivo y se utilizan solo para observar la morfología de la célula bacteriana. Las tinciones
compuestas como la tinción de Gram, nos permiten observar la morfología de la célula
bacteriana pero también nos brindan información adicional como la presencia o ausencia de
estructuras en esas bacterias.

La pared celular de las bacterias y la tinción de Gram

La mayoría de las bacterias tienen pared celular, pero su composición no es igual a la pared
celular vegetal. El componente principal de la pared en bacterias lo es el peptidoglicano o
mureina, mientras que el de las células vegetales es la celulosa. Las bacterias se pueden
clasificar en dos grandes grupos de acuerdo a su pared celular; Gram positivas y Gram negativas
y esta clasificación se basa en el peptidoglicano que contienen.

Es una de las tinciones más usadas en bacteriología y debe su nombre al Danés Cristian Gram
quien desarrollo la técnica en 1884. Nos permite diferenciar de manera explícita a las bacterias
categorizándolas en dos grandes grupos Gram positivo y Gram negativo. Los resultados se basan
en la diferencia de la pared celular de las bacterias. Las Gram positivas tiñen de color violeta y
las Gram negativas de color rojo. La Tabla 1 muestra el procedimiento y la descripción de los
pasos para la tinción Gram.

Tabla 1. Procedimiento y descripción para tinción de Gram.

Reactivo Función Tiempo Gram + Gram -
Cristal Tinte Primario 1 minuto Violeta Violeta
Violeta
Yodo Lugol Mordiente 1 minuto Violeta Violeta
Alcohol Decolorante Añadir hasta que no salga Violeta Incoloro
más color.
Safranina Contra tinte 45 segundos Violeta Rojo

Diferencia entre la pared celular bacterias

Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias
Gram negativas poseen una tri-capa formada por
una membrana plasmática, una capa fina de
peptidoglicano y una membrana externa con
proteínas distribuidas al azar y lipopolisacarido.
Las bacterias Gram positivas poseen una bi-capa
compuesta de la membrana plasmática y una capa
bien gruesa de peptidoglicano que contiene ácido tectoico y ácido lipotectoico. Bajo el

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microscopio compuesto las bacterias Gram – se aprecian de color rojo y las Gram + se aprecian
de color violeta.

Morfología macroscópica de las bacterias

Cuando inoculamos una cepa bacteriana en un medio de cultivo sólido y luego incubamos el
mismo por un periodo definido podremos observar colonias bacterianas a simple vista. Una
colonia es un conglomerado de bacterias de la misma especie las cuales son la progenie de una
sola célula. Cada especie posee características distintivas que ayudan a clasificar las mismas.
Para identificar bacterias observamos la forma, color, tamaño, márgenes y textura de la colonia.

La forma de la colonia puede ser

circular, irregular o filamentosa
entre otros. Los bordes pueden ser
ondulados, lisos, filamentoso etc.
La elevación puede ser plana,
elevada o convexa. La superficie
de la colonia puede ser brillante,
rugosa o arrugada. El pigmento
también es una característica para
identificación pueden ser de
amplia gama de colores. Algunas
especies bacterianas pueden
secretar olores particulares (frutas o putrefacto entre otros) los cuales ayudan a identificarlas. La
textura de la colonia también ayuda a revelar su identidad pueden ser mucoidales, rugosos o
lisos.

Resumen de Técnicas asépticas

Las técnicas asépticas son procesos que llevamos a cabo para evitar contaminar el ambiente con
nuestros cultivos y de igual modo evitar contaminar nuestros cultivos con bacterias ambientales.
La rigurosidad de las mismas depende del tipo de microorganismo con el que estemos trabajando
para propósitos de este laboratorio enumeraremos algunas de las más comunes.
1. Lavarse las manos antes y después de haber trabajado con microbios.
2. Usar equipo de seguridad, batas de laboratorio, gafas y guantes al manejar cultivos
bacterianos.
3. Limpiar su área de trabajo con desinfectante antes y después de haber trabajado con
microbios.
4. Mantener la mesa de trabajo despejada en todo momento.
5. Utilizar el mechero (de gas o de alcohol) en todo momento, toda inoculación se tiene que
hacer al lado del mismo para evitar que los cultivos se contaminen.
6. Todo cultivo debe de ser manejado con precaución y debe asumir que es un patógeno.
7. Si un cultivo se derrama deberá notificar a su instructor. Inmediatamente deberá cubrir el
área con papel toalla y saturar el mismo con desinfectante (exponga el mismo durante 15
minutos). Después de ese tiempo el papel se puede recoger y descartar en el zafacón de
desperdicios biopeligrosos.
8. Estar pendiente a las instrucciones especiales que su instructor de laboratorio le ofrecerá.

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Resumen de Técnicas de Transferencia bacteriana
Transferencia cultivo en tubo a cultivo en
tubo. a) Sujetar ambos tubos en la misma
mano, sujetar el haza en la mano libre. b)
Flamear el haza de inoculación. c) Quitar
ambas tapas y mantener las mismas en la
mano con la que está sujetando el haza de
inoculación, flamear la boca de ambos tubos.
d) Introducir el haza dentro del cultivo para
tomar la muestra. e) Inocular el medio de
cultivo limpio. f). Flamear el haza de
inoculación, flamear los tubos y colocar las
tapas a ambos.

¿Porque debemos flamear el haza de

inoculación y la boca de los tubos de ensayo?
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Transferencia desde cultivo en plato Petri a

tubo de ensayo. Observe la figura y anote el
procedimiento, discutir con el grupo. ¿Por qué
las tapas de los cultivos no se ponen en la
mesa de trabajo?
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Ejercicio 1. Morfología celular
En esta actividad el estudiante practicara las técnicas de microscopia discutidas en laboratorios
anteriores. Observara e identificara la morfología microscópica de bacterias utilizando laminillas
que preparara usted mismo. NO SE PERMITE TRABAJO COOPERTIVO. Practicará la técnica
de inmersión de aceite.

Materiales

Microscopio compuesto Desconocidos en caldo (2 tubos)

Aceite de inmersión Fósforos
Papel de lente Reactivos para la tinción de Gram
Laminillas y cubreobjetos Botella con gotero de agua destilada
Palillos de dientes Bandeja para tinción
Mechero Botella con agua destilada
Caldo en tubo de ensayo (2 tubos) Papel secante o papel toalla.

Procedimiento.
Consiga una laminilla, cubre objetos el haza (loop) mechero y haga un frotis en la laminilla.
1. Permita que la preparación se seque al aire libre.
2. Pase la laminilla sobre la flama del mechero para sellar las bacterias a la laminilla.
3. Espere unos segundos para que enfríe la laminilla.
4. Haga una tinción Gram como se describe en la tabla 1.
a. Añadir de 2 a 3 gotas de cristal violeta y deje teñir por 1 minuto.
b. Enjuagar con agua.
c. Añadir de 2 a 3 gotas de yodo lugol permita contacto por 1 minuto.
d. Enjuagar con agua.
e. Enjuagar con alcohol.
f. Enjuagar con agua.
g. Añadir de 2 a 3 gotas de safranina permita contacto por 45 segundos.
h. Enjuagar con agua.
i. Secar gentilmente con papel.
j. Observar bajo el microscopio compuesto.

5. Coloque la laminilla en su microscopio y observe utilizando el objetivo de rastreo 4X y el de

10x.
¿Qué puede distinguir? ¿Qué implica esto acerca del tamaño de las bacterias?
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6. Cambie a una magnificación mayor, usando el objetivo 40X y observe.
¿Puede distinguir la morfología? ¿Qué formas puede observar?
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Utiliza el objetivo de inmersión de aceite 100X. Enfoque la laminilla usando solamente el botón
de ajuste fino o micrométrico.

7. ¿Puede observar alguna diferencia al usar el aceite de inmersión? Dibuje los tipos de
bacterias por su forma.
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* Al terminar de observar la laminilla con aceite de inmersión se debe limpiar la laminilla y el

lente objetivo con papel de lente para remover los rastros del aceite.

Ejercicio 2. Tinción Gram utilizando muestra de placa dental.

Las partículas de alimento que se acumulan en las encías crean un ambiente ideal para el
crecimiento de las bacterias. Los residuos de alimentos y las bacterias junto con las bacterias
bucales forman lo que conocemos como placa dental. En este ejercicio preparan una tinción de
Gram y observarán la morfología de las bacterias que forman la placa dental.

Materiales

Microscopio compuesto Fósforos

Aceite de inmersión Reactivos para la tinción de Gram
Papel de lente Botella con gotero de agua destilada
Laminillas y cubreobjetos Bandeja para tinción
Palillos de dientes Botella con agua destilada
Mechero Papel secante o papel toalla.

Procedimiento
1. Coloque una gota de agua en una laminilla limpia.
2. Consiga un palillo de dientes limpio.
3. Raspe el área del diente cercana a la encía.
4. Frote el palillo con el que tomo la muestra en la gota de agua de la laminilla.
5. Permita que la preparación se seque al aire libre.
6. Fije la muestra de la laminilla.
7. Haga una tinción Gram como se describe en la tabla #1.
a. Añadir de 2 a 3 gotas de cristal violeta y deje teñir por 1 minuto.
b. Enjuagar con agua.
c. Añadir de 2 a 3 gotas de yodo lugol permita contacto por 1 minuto.
d. Enjuagar con agua.
e. Enjuagar con alcohol.
f. Enjuagar con agua.
g. Añadir de 2 a 3 gotas de safranina permita contacto por 45 segundos.
h. Enjuagar con agua.
i. Secar gentilmente con papel.
j. Observar bajo el microscopio compuesto.

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8. Describa la morfología observada.
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9. ¿Se pueden observar todas las formas de las bacterias?
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10. ¿Qué tipo de bacterias son las más abundantes?
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Ejercicio 3. Estudio de la diversidad de bacterias aéreas cultivables en el interior y en el

exterior del edificio de ciencias naturales de la UPR-Rio Piedras.

Las bacterias se encuentran en una gran variedad de medios ambientes tales como el suelo,
cuerpos de agua, nuestro cuerpo e incluso el aire que respiramos. En el aire que respiramos se
encuentran partículas de polvo las cuales arrastran consigo polen y diversos microorganismos.
Los microbios suspendidos en el aire pueden ser alérgenos y por esto es importante monitorear la
calidad del para poder alertar a la comunidad y evitar se expongan a estos alérgenos.
Actualmente la Estación de Aero alérgenos del Recinto de Ciencias Médicas (RCM) de la
Universidad de Puerto Rico (UPR) destacó la relevancia del estudio de los Aero-alérgenos para
conocer los factores ambientales que desencadenan el asma en Puerto Rico.
En esta actividad vamos a tomar muestras aéreas en el interior y el exterior del edificio de
ciencias naturales con el fin de calcular la diversidad de bacterias aéreas cultivables y tener un
estimado de la calidad de aire. Usaremos el método de exposición de platos.

Materiales
4 Platos Petri con medio de cultivo general (por ejemplo, Tryptic Soy Agar) por mesa.
Papel de parafina
Marcador permanente
Incubadoras

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Procedimiento:
Dado a que tomaremos muestras en el interior y el exterior del edificio de ciencias naturales
formule una pregunta de investigación y una hipótesis.
Pregunta de investigación:
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Hipótesis de investigación:
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1. Divida cada mesa en 2 grupos.
2. Cada grupo va a recibir 2 platos Petri.
3. Enumere los platos (plato exterior, plato interior).
4. Rotule cada plato con el # de mesa, el lugar de muestreo, fecha de muestreo, sección de
laboratorio.
5. Un grupo tomara muestra de aire en el laboratorio de biología general.
6. Otro grupo tomara muestra de aire debajo del dosel del árbol que se encuentra entre la
biblioteca de CN y el edificio de CN.
7. Colocar los platos Petri en una superficie plana.
8. Destape los platos.
9. Coloque las tapas al lado del plato correspondiente.
10. Exponga los platos al aire durante 15 minutos.
11. Tape los platos Petri.
12. Regrese al laboratorio.
13. Coloque parafina alrededor de los platos.
14. Incube sus cultivos de 24 a 48 horas a temperatura de 25 ºC a 37ºC. (Los grupos de los
viernes pueden colectar sus resultados el lunes).

Colecta de Resultados.
¿Qué observa? ¿Hubo crecimiento bacteriano en los platos Petri?
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¿Qué morfología observa?
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¿Cuál es la morfología más abundante?
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¿De qué color son las colonias de bacterias?
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¿Cuál es el color que predomina?
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Cálculos de diversidad
Para propósito de este ejercicio usted debe asumir que
cada color distinto representa una especie bacteriana
distinta. Por ejemplo, colonias de color rojo representan la
especie #1, las colonias amarillas representan la especie
#2 y así por el estilo.

Este cultivo tiene aproximadamente:

8 individuos de la especie roja

18 individuos de la especie amarilla

Tabla 2. Abundancia de bacterias aéreas en el interior y exterior del edificio ciencias

naturales
Color de Plato #1 (interior) Plato #2 (exterior)
colonia ni pi ln(pi) pi*ln(pi) ni pi ln(pi) pi*ln(pi)
Amarilla
Anaranjada
Crema
Blanco
Peach
Rosa claro
Rosa oscuro
Verde

Suma *** ***

H’ *** ***
J *** ***

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Haciendo uso de los resultados obtenidos comente si apoyan o no si hipótesis.
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Como comparan estos resultados con la predicción que usted realizo.
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