CARTILLA DE PRÁCTICOS

Curso de Evolución 2024

Laboratorio de Evolución. Facultad de Ciencias. Universidad de

la República
Práctico 1

Filogenias

Introducción

Los chimpancé, Pan troglodytes, de la región centro-oeste del continente Africano son
reconocidos como un reservorio de virus de inmunodeficiencia en Simios (SIVcpzPtt), los
cuales han cruzado la barrera específica en al menos dos oportunidades, resultando en la
pandemia provocada por el Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (HIV-1, grupo M) y
por otro lado en la infección aislada de unos pocos individuos en Camerún (HIV-1, grupo N).
Un tercer linaje de virus HIV-1 (grupo 0), también de la región centro-oeste de África, cae
igualmente dentro de la radiación de los virus de tipo «SIVcpzPtt». Más de 30 especies de
primates son portadores de virus que provocan inmunodeficiencia en Simios, pero los
chimpancés son los principales portadores de los tipos cercanamente emparentados al
HIV-1. Con la finalidad de establecer el origen de la cepa HIV-1 (grupo 0) se secuenciaron
algunos genes de varias muestras de chimpancés (SIVcpz) y gorilas (Gorilla gorilla, SIVgor)
de Camerún. El objetivo de esta actividad consiste, mediante un análisis filogenético de
secuencias de ADN, investigar el posible origen y relacionamiento de las diferentes cepas
de HIV-1 presentes en chimpancés, gorilas y humanos.

Datos y programa de análisis

La base de datos a analizar consiste en secuencias de los genes env –que codifica
proteínas de la envoltura– y pol –que codifica la transcriptasa inversa– del virus HIV-1. Las
secuencias ya se encuentran alineadas (las homologías posicionales entre las distintas
secuencias ya están establecidas), por lo que ya están listas para ser analizadas.

El programa que se usará para generar las hipótesis filogenéticas es el MEGA11. Éste es
un programa que se baja gratis de la red en http://www.megasoftware.net y que tiene varias
prestaciones, incluyendo el estudio descriptivo de las secuencias y reconstrucciones
filogenéticas mediante métodos de basados en distancias genéticas, máxima parsimonia y
máxima verosimilitud.

Actividades a realizar durante el práctico

1) Abrir el archivo “HIV.meg” en MEGA11 (“File\Open A File/Session”). Visualizar la matriz

de datos (“Data\Explore Active Data”) e identificar los primeros 5 sitios variables (botón “V”)
y los primeros 3 informativos (botón “Pi”). ¿Por qué algunos de los sitios variables no son
informativos?

2) Ir a la ventana principal de MEGA11 y realizar un análisis utilizando el criterio de Máxima

Parsimonia [“Phylogeny\Construct/Test Maximum Parsimony Tree(s)”]. Analice el apoyo de
los clados obtenidos utilizando «bootstrap», con 100 pseudoréplicas (opción “No. of
Bootstrap Replication -> 100”). Mantenga los demás parámetros del análisis en sus
condiciones por defecto. Luego de obtenido el árbol filogenético, moverse de la pestaña
“Original Tree” a la opción “Bootstrap consensus tree”. ¿Qué representan las
reconstrucciones filogenéticas que se muestran en cada una de esas dos opciones? Definir
el grupo externo en el “Bootstrap consensus tree”, utilizando las secuencias virales
obtenidas del Mono verde Africano, Cercopithecus aethiops (SIVagm). Para lograr esto,
seleccione primero la rama que representa a ese taxón y luego la opción: “Subtree\Root”
(también se puede hacer desde un botón ubicado en la barra lateral). ¿Qué función cumple
el grupo externo?

3) Registre la longitud e índice de consistencia del árbol consenso obtenido. Esta

información se encuentra disponible en la leyenda de la figura así como en la opción “i” del
menú. Registre el valor de apoyo de los clados obtenidos utilizando bootstrap. Indique
cuáles son los 3 clados que reciben menor apoyo estadístico.

4) Compare los valores de bootstrap con los obtenidos por otros compañeros. ¿Por qué
difieren?

5) Opcional: Repita la reconstrucción filogenética –incluyendo el análisis de bootstrap–

utilizando el algoritmo de unión de vecinos (“Phylogeny\Construct/Test Neighbor-Joining
Tree...”).

6) De acuerdo a los resultados obtenidos con la reconstrucción filogenética discutir el

posible origen y vías de contagio interespecíficas de los diferentes grupos de HIV-1. ¿Cuál
fue el origen del contagio del grupo “HIV-1 (grupo 0)” en humanos? Teniendo en cuenta las
vías de transmisión del virus, ¿cuáles serían las posibles formas de que se traspasaron las
barreras específicas?

Basado en:
Hillis, D. 2010. Phylogenetic Progress and Applications of the Tree of Life, 421-449 p. En: Evolution
since Darwin: The first 150 years, Editado por: Bell, M.; Futuyma, D.; Eanes, W.; & Levinton, J.;
688pp.
Van Heuverswyn et al. 2006. Human immunodeficiency viruses: SIV infection in wild gorillas. Nature
444:164, doi:10.1038/444164a.
Práctico 2

Métodos Comparativos Filogenéticos

Resumen del problema

Es bien sabido que la presión parcial de oxígeno disminuye con la altura. Las personas no
habituadas “se apunan” o sienten malestar al trasladarse a zonas de montaña,
especialmente al momento de realizar actividades físicas exigentes. Un individuo que se
traslada desde una zona baja hasta una de altura, experimenta a lo largo del tiempo una
serie de ajustes fisiológicos para paliar al menos parte de esos desajustes.

Por lo tanto, cabe preguntarse si hay cambios genéticos que han sido favorecidos por la
selección natural y que permiten a especies y poblaciones que viven a altas elevaciones
adaptarse mejor a dichas condiciones. Tanto en humanos como en especies animales (y
muchas otras), hay estudios orientados a identificar estos cambios.

Puesto que la afinidad de la sangre por el oxígeno es un factor clave para la vida en altura,
y dicha afinidad depende fuertemente de las características de la hemoglobina (recordemos
que la estructura cuaternaria de la hemoglobina combina dos cadenas de tipo alfa y dos de
tipo beta en un tetrámero, en torno a un núcleo de hierro), esta proteína ha sido el blanco de
muchos estudios.

Natarajan et al. (2016) se plantean identificar algunas de las adaptaciones de la

hemoglobina para la vida en la altura. La hipótesis de trabajo es que la selección natural
pudo haber favorecido cambios en las características de la hemoglobina de las especies
asociados a la elevación en la que vive cada una.

Algunas de las ideas del artículo son: - Realizar un estudio comparando múltiples especies
de aves, procurando elegir pares de especies cercanamente relacionadas, de modo que
una de las especies de cada par viva en tierras altas y otra en las tierras bajas cercanas. -
Para cada una de estas especies, aislar la hemoglobina y estudiar su afinidad con el
oxígeno en el laboratorio.

El estudio incluye un análisis de los cambios en las secuencias de las hemoglobinas, que
usaremos más adelante en el curso. Por el momento, extraemos del artículo los siguientes
datos para cada una de las 56 especies estudiadas:

1. La elevación en la que viven (específicamente la altura de la localidad en la que

fueron estudiadas).
2. La afinidad de su alfa globina por el oxígeno, tomada en condiciones controladas de
laboratorio (en un medio que aproxima las condiciones en sangre), resumida por el
valor conocido como P50.
3. El árbol filogenético que se utiliza en el artículo. Este árbol se toma como la mejor
hipótesis disponible de las relaciones entre las especies.
Preguntas 1
¿Cómo debería cambiar el P50 para que la hemoglobina tenga mayor afinidad con el
oxígeno, por ejemplo en una especie de altura?

Activando los paquetes de R

Para esta actividad práctica usaremos, R (https://cran.r-project.org/) el cual es un entorno y

lenguaje de programación enfocado al análisis estadístico. Se recomienda el uso RStudio
(https://rstudio.com/), que es un entorno de desarrollo integrado (IDE), en conjunción con R,
lo cual facilita el manejo de datos y la realización de los análisis.

Utilizaremos los siguientes paquetes de R, los cuales deben ser previamente instalados:

tidyverse: una colección de paquetes que facilitan el análisis de datos. broom: para
formatear salida de modelos de ajuste de estos datos phytools: varias funciones para
análisis filogenéticos, principalmente orientado a la biología comparada.

Trabajando con los datos originales

Mediante el comando “setwd(dir)” podemos indicarle a R en donde están ubicados los

archivos con los cuales vamos a estar trabajando, siendo “dir” la ruta hacia nuestro
directorio (e.g. C:\User\Desktop\R).También podemos ubicar el directorio de trabajo de R
mediante “getwd()” y colocar ahí nuestros archivos de interés.

El bloque de código siguiente lee solamente los datos de elevación y los de P50 de la HbA.

# activamos paquetes
library("phytools")
library("tidyverse")
library("formattable")

# Leemos los datos, tenemos pares de spp. en distinta elevación (categoria)

# más la elevación ocupada + P50 de cada spp

Datos <- read_tsv("Datos.tsv")

## Rows: 56 Columns: 5
## ── Column specification
────────────────────────────────────────────────────────
## Delimiter: "\t"
## chr (3): Familia, Especie, Elev.cat
## dbl (2): Elevacion, P50
##
## ℹ Use `spec()` to retrieve the full column specification for this data.
## ℹ Specify the column types or set `show_col_types = FALSE` to quiet this
message.
# notar cuantas columnas tengo y que tipo de variable es (categorica y numérica)
Datos # veo rapidamente los datos
## # A tibble: 56 × 5
## Familia Especie Elevacion P50 Elev.cat
## <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr>
## 1 Columbidae Metriopelia_melanoptera 4178 26.9 Alta
## 2 Columbidae Columbina_cruziana 372 28.4 Baja
## 3 Caprimulgidae Hydropsalis_longirostris 4401 30.2 Alta
## 4 Caprimulgidae Hydropsalis_decussata 309 36.1 Baja
## 5 Trochilidae Colibri_coruscans 4030 31.1 Alta
## 6 Trochilidae Schistes_geoffroyi 1395 36.8 Baja
## 7 Trochilidae Selasphorus_platycercus 2470 38.2 Alta
## 8 Trochilidae Archilochus_alexandri 2050 39.1 Baja
## 9 Trochilidae Amazilia_viridicauda 3005 24.2 Alta
## 10 Trochilidae Amazilia_amazilia 366 29.8 Baja
## # ℹ 46 more rows
Datos %>% count(Elev.cat) # un conteo de ocurrencias en la variable categoría de
elevación
## # A tibble: 2 × 2
## Elev.cat n
## <chr> <int>
## 1 Alta 28
## 2 Baja 28

Pregunta 2
La tabla de datos incluye varios pares de especies de un mismo género. Elegir algunos de
esos pares para discutir:

1. ¿De qué especies se trata? Averiguar algo de los nombres comunes, familias a las
que pertenecen, distribución geográfica.
2. ¿Qué tendencias se observan al examinar en varios de esos pares la relación entre
altura y P50?

Examinando la relación entre elevación y P50

En el siguiente bloque se obtiene el coeficiente de correlación entre las dos variables de

interés, se aplica un modelo de regresión lineal entre dichas variables, y se grafican los
valores junto con la línea de tendencia obtenida en la regresión.

# Análisis exploratorios
class(Datos) # que tipo de objeto es? Puede ser vector, list, matrix, data
frame, etc...
## [1] "spec_tbl_df" "tbl_df" "tbl" "data.frame"
# Datos %>% formattable() # imprimo en pantalla toda la tabla formateada
summary(Datos) # Resumen de número y tipo de variables y nro de observaciones
## Familia Especie Elevacion P50
## Length:56 Length:56 Min. : 39.0 Min. :17.07
## Class :character Class :character 1st Qu.: 370.5 1st Qu.:27.77
## Mode :character Mode :character Median :2774.0 Median :31.67
## Mean :2548.0 Mean :32.04
## 3rd Qu.:4318.8 3rd Qu.:37.58
## Max. :4800.0 Max. :44.69
## Elev.cat
## Length:56
## Class :character
## Mode :character
# cual es la media de P50 y Elevación en este dataset
summarise(Datos, mean(P50)) # veo un estadístico de una variable en particular
## # A tibble: 1 × 1
## `mean(P50)`
## <dbl>
## 1 32.0
summarise(Datos, mean(Elevacion)) # veo un estadístico de una variable en
particular
## # A tibble: 1 × 1
## `mean(Elevacion)`
## <dbl>
## 1 2548.
Datos %>% count(Familia) # cuantas observaciones de cada Familia
## # A tibble: 10 × 2
## Familia n
## <chr> <int>
## 1 Anatidae 16
## 2 Caprimulgidae 2
## 3 Columbidae 2
## 4 Emberizidae 2
## 5 Fringillidae 2
## 6 Furnariidae 2
## 7 Hirundinidae 2
## 8 Thraupidae 8
## 9 Trochilidae 18
## 10 Troglodytidae 2

Datos %>% arrange(desc(Elevacion)) # ordenamos de mayor a menor, por Elevación

## # A tibble: 56 × 5
## Familia Especie Elevacion P50 Elev.cat
## <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr>
## 1 Anatidae Lophonetta_s_alticola 4800 25.1 Alta
## 2 Anatidae Chloephaga_melanoptera 4700 27.6 Alta
## 3 Anatidae Anas_georgicaH 4600 35.6 Alta
## 4 Anatidae Anas_c_orinoma 4600 29.4 Alta
## 5 Anatidae Anas_puna 4600 27.3 Alta
## 6 Trochilidae Aglaeactis_castelnaudii 4578 17.2 Alta
## 7 Anatidae Merganetta_armataH 4500 26.6 Alta
## 8 Hirundinidae Notiochelidon_murina 4470 30.9 Alta
## 9 Caprimulgidae Hydropsalis_longirostris 4401 30.2 Alta
## 10 Furnariidae Cinclodes_albiventris 4401 25.1 Alta
## # ℹ 46 more rows
Datos %>% arrange(P50) # ordenamos x P50
## # A tibble: 56 × 5
## Familia Especie Elevacion P50 Elev.cat
## <chr> <chr> <dbl> <dbl> <chr>
## 1 Troglodytidae Troglodytes_aedonH 4375 17.1 Alta
## 2 Trochilidae Aglaeactis_castelnaudii 4578 17.2 Alta
## 3 Trochilidae Heliodoxa_leadbeateri 1890 17.2 Baja
## 4 Trochilidae Coeligena_violifer 3779 19.1 Alta
## 5 Trochilidae Oreotrochilus_estella 4391 20.2 Alta
## 6 Trochilidae Coeligena_coeligena 2132 22.9 Baja
## 7 Trochilidae Amazilia_viridicauda 3005 24.2 Alta
## 8 Furnariidae Cinclodes_albiventris 4401 25.1 Alta
## 9 Anatidae Lophonetta_s_alticola 4800 25.1 Alta
## 10 Troglodytidae Troglodytes_aedonL 143 25.9 Baja
## # ℹ 46 more row
# ahora podemos encadenar alguno de estos comandos
# ¿cual es la media en las dos categorñías de elevacion?
Datos %>% group_by(Elev.cat) %>% summarise(mean(Elevacion))
## # A tibble: 2 × 2
## Elev.cat `mean(Elevacion)`
## <chr> <dbl>
## 1 Alta 4042.
## 2 Baja 1054.
hist(Datos$Elevacion)
hist(Datos$P50)
# dentro de una familia de interés
Datos %>% filter(Familia == "Trochilidae") %>% summarise(mean(P50))
## # A tibble: 1 × 1
## `mean(P50)`
## <dbl>
## 1 29.3
Datos %>% filter(Familia == "Trochilidae") %>% group_by(Elev.cat) %>%
summarise(mean(Elevacion))
## # A tibble: 2 × 2
## Elev.cat `mean(Elevacion)`
## <chr> <dbl>
## 1 Alta 3826.
## 2 Baja 1936.
Datos %>% filter(Familia == "Trochilidae") %>% group_by(Elev.cat) %>%
summarise(mean(P50))
## # A tibble: 2 × 2
## Elev.cat `mean(P50)`
## <chr> <dbl>
## 1 Alta 27.2
## 2 Baja 31.5

# Exploro relación P50 vs. Elevación (categórica)

ggplot(Datos, aes(Elev.cat, P50)) + # boxplt

geom_boxplot(outlier.colour = "red", outlier.shape = 1) + # vemos los outliers
en rojo
theme_classic() + ggtitle("P50 versus Elevación") + xlab("Elevación")
ggplot(Datos, aes(Elev.cat, P50)) +
geom_boxplot(outlier.colour = "red", outlier.shape = 2) +
geom_jitter(width = 0.5) + # hacemos esto solo para ver mejor todos los valores
theme_classic() + ggtitle("P50 versus Elevación") + xlab("Elevación")
# Ahora vemos la relación P50 vs. Elevación (numérica)
# Calculamos el coeficiente de correlación entre las dos variables
R = cor(Datos$Elevacion,Datos$P50)
# Aplicar un modelo lineal (lm) de regresión. Se define a P50 como la variable
dependiente
# y a Elevacion como la variable independiente.

ggplot(Datos, aes(Elevacion, P50)) + geom_point() +

geom_smooth(method='lm') + theme_classic() + ggtitle("Relación entre P50 de HbA
y elevación")
## `geom_smooth()` using formula = 'y ~ x'
Regresion <- lm(Datos$P50~Datos$Elevacion)
summary.lm(Regresion)
##
## Call:
## lm(formula = Datos$P50 ~ Datos$Elevacion)
##
## Residuals:
## Min 1Q Median 3Q Max
## -15.8125 -4.1662 0.8666 4.4904 12.3688
##
## Coefficients:
## Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)
## (Intercept) 35.9080738 1.5388246 23.335 < 2e-16 ***
## Datos$Elevacion -0.0015162 0.0004991 -3.038 0.00367 **
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## Residual standard error: 6.483 on 54 degrees of freedom
## Multiple R-squared: 0.1459, Adjusted R-squared: 0.1301
## F-statistic: 9.228 on 1 and 54 DF, p-value: 0.003667
# como alternativa podemos obtener una tabla ya formateada o lista
# broom::tidy(Regresion) %>% formattable() # tabla formateada
# broom::glance(summary(Regresion)) %>% %>% formattable() # tabla formateada

# Graficamos los valores de P50 y elevación, agregando la línea de ajuste

# ...obtenida de la regresión lineal.

Datos %>% filter(Familia == "Anatidae" | Familia == "Trochilidae" ) %>%

ggplot( aes(Elevacion, P50, group=Familia)) + geom_point(aes(color= Familia)) +
geom_smooth(method='lm') + theme_classic() +
ggtitle("Relación entre P50 de HbA y elevación ")
## `geom_smooth()` using formula = 'y ~ x'
Pregunta 3
1. ¿Cuál es el valor del coeficiente de correlación? ¿Qué sugiere respecto a la relación
entre las variables (signo, intensidad)?

2. Examinar la tabla de regresión. ¿Qué fracción de la varianza está explicada por el

modelo?

3. Identificar y explicar los parámetros relevantes del modelo y el p-valor asociado a cada
uno. ¿Qué sugieren estos resultados sobre la hipótesis de trabajo?

4. Examinar la gráfica, incluyendo la predicción obtenida por regresión lineal. ¿Qué sugiere
la gráfica y cómo se relaciona con los puntos discutidos más arriba?

Las especies, y por lo tanto sus rasgos, no pueden ser tratadas como variables
independientes desde el punto de vista estadístico dado que comparten una historia
evolutiva en común.Este problema se hace aún más evidente en taxa cercanamente
emparentados. La respuesta a tal problema fue propuesta por Felsenstein (1985) mediante
el cálculo de Contrastes Filogenéticos Independientes (PIC por sus siglas en inglés),
mediante el cual se transforma a los rasgos analizados en variables independientes,
empleando la filogenia de las especies como marco de análisis. En la siguiente sección,
vamos a abordar este problema y analizaremos nuevamente la correlación entre la P50 y la
Altura, pero esta vez corrigiendo la falta de independencia de los datos, utilizando los PIC
como nuevas variables, independientes de la historia evolutiva compartida entre las
diferentes especies de aves.

#leemos el árbol filogenético

tree<-read.tree("tree.tre")

#enraizamos el árbol en su punto medio

treeR<-midpoint.root(tree)

#visualizamos el árbol enraizado

plotTree(treeR, edge.width=1, ftype="i", fsize=0.7)
# Para simplificar los comandos, leemos otro archivo que contiene solo las
especies y las máximas alturas registradas,
# y leemos otro archivo con los valores de P50
elevacion_2<-read.table("Elevacion.txt")
P50_2<-read.table("HbA_KCLHIP_P50.txt")

#Creamos un vector numérico de las variables para calcular los contrastes

VP50 <- P50_2$P50
Velevacion <- elevacion_2$Elevacion

#Paso necesario para que los datos y los taxa terminales se asocien
correctamente
names(VP50) <- row.names(P50_2)
names(Velevacion) <- row.names(elevacion_2)

enframe(VP50) # acá corroboramos como asociamos nombre spp. ~ valor

## # A tibble: 56 × 2
## name value
## <chr> <dbl>
## 1 Metriopelia_melanoptera 26.9
## 2 Columbina_cruziana 28.4
## 3 Hydropsalis_longirostris 30.2
## 4 Hydropsalis_decussata 36.1
## 5 Colibri_coruscans 31.1
## 6 Schistes_geoffroyi 36.8
## 7 Selasphorus_platycercus 38.2
## 8 Archilochus_alexandri 39.1
## 9 Amazilia_viridicauda 24.2
## 10 Amazilia_amazilia 29.8
## # ℹ 46 more rows
enframe(Velevacion) # para la otra variable
## # A tibble: 56 × 2
## name value
## <chr> <int>
## 1 Metriopelia_melanoptera 4178
## 2 Columbina_cruziana 372
## 3 Hydropsalis_longirostris 4401
## 4 Hydropsalis_decussata 309
## 5 Colibri_coruscans 4030
## 6 Schistes_geoffroyi 1395
## 7 Selasphorus_platycercus 2470
## 8 Archilochus_alexandri 2050
## 9 Amazilia_viridicauda 3005
## 10 Amazilia_amazilia 366
## # ℹ 46 more rows
#calculamos los contrastes filogenéticamente independientes
ContrasteVP50 <- pic(VP50, treeR)
ContrasteVelevacion <- pic(Velevacion, treeR)

#si queremos extraer además de los contrastes, su varianza asociada

ContrasteVP50.var <- pic(VP50, treeR, var.contrasts=TRUE)
ContrasteVelevacion.var <- pic(Velevacion, treeR, var.contrasts=TRUE)

#Ahora visualizamos los contrastes filogenéticos calculados anteriormente

# ContrasteVP50
enframe(ContrasteVP50) # aca lo veo como 'tabla'
## # A tibble: 55 × 2
## name value
## <chr> <dbl>
## 1 57 1.22
## 2 58 1.56
## 3 59 -1.81
## 4 60 -4.43
## 5 61 6.93
## 6 62 5.38
## 7 63 1.63
## 8 64 -2.49
## 9 65 -1.63
## 10 66 0.771
## # ℹ 45 more rows
#ContrasteVelevacion
enframe(ContrasteVelevacion) # aca lo veo como 'tabla'
## # A tibble: 55 × 2
## name value
## <chr> <dbl>
## 1 57 -68.2
## 2 58 443.
## 3 59 301.
## 4 60 -712.
## 5 61 -58.0
## 6 62 196.
## 7 63 353.
## 8 64 -434.
## 9 65 79.9
## 10 66 -626.
## # ℹ 45 more rows
# vemos los contrastes filogenéticos calculados y también su varianza asociada

# ContrasteVP50.var
# ContrasteVelevacion.var

enframe(ContrasteVP50.var) # la varianza P50

## # A tibble: 55 × 2
## name value[,"contrasts"] [,"variance"]
## <chr> <dbl> <dbl>
## 1 57 1.22 2.93
## 2 58 1.56 4.66
## 3 59 -1.81 3.32
## 4 60 -4.43 3.32
## 5 61 6.93 3.32
## 6 62 5.38 3.32
## 7 63 1.63 3.32
## 8 64 -2.49 3.31
## 9 65 -1.63 3.25
## 10 66 0.771 3
## # ℹ 45 more rows
enframe(ContrasteVelevacion.var) # la varianza Elevacion
## # A tibble: 55 × 2
## name value[,"contrasts"] [,"variance"]
## <chr> <dbl> <dbl>
## 1 57 -68.2 2.93
## 2 58 443. 4.66
## 3 59 301. 3.32
## 4 60 -712. 3.32
## 5 61 -58.0 3.32
## 6 62 196. 3.32
## 7 63 353. 3.32
## 8 64 -434. 3.31
## 9 65 79.9 3.25
## 10 66 -626. 3
## # ℹ 45 more rows
# Los contrastes asociados a P50 aparecerán en azul y los asociados a la
Elevación
# aparecerán en verde.

plot(treeR, no.margin=TRUE,edge.width=1 ,cex=c(0.6,0.6))

nodelabels(round(ContrasteVelevacion.var [,1], 3), adj = c(1, -0.4), frame="n",
col = "blue", cex=0.6)
#volvemos a plotear la filogenia solo para que nos se superpongan ambos
contrastes
plot(treeR, no.margin=TRUE, edge.width=1 ,cex=c(0.6,0.6))
nodelabels(round (ContrasteVP50.var [,1], 3), adj = c(1, 1.1), frame="n",
cex=0.6, col = "darkgreen")
#Analizamos la evolución correlacionada de ambos rasgos a partir de los archivos
sin el cálculo de varianzas
RegresionP50_elevacion <- lm(ContrasteVP50~ContrasteVelevacion)

#Visualizamos los parámetros de la regresión

summary.lm(RegresionP50_elevacion)
##
## Call:
## lm(formula = ContrasteVP50 ~ ContrasteVelevacion)
##
## Residuals:
## Min 1Q Median 3Q Max
## -9.4792 -1.6509 -0.0061 2.1798 10.1324
##
## Coefficients:
## Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)
## (Intercept) -0.17539 0.60601 -0.289 0.773392
## ContrasteVelevacion -0.00146 0.00037 -3.947 0.000235 ***
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## Residual standard error: 3.671 on 53 degrees of freedom
## Multiple R-squared: 0.2271, Adjusted R-squared: 0.2126
## F-statistic: 15.58 on 1 and 53 DF, p-value: 0.0002347
broom::tidy(summary(RegresionP50_elevacion)) # %>% formattable() # tabla
formateada
## # A tibble: 2 × 5
## term estimate std.error statistic p.value
## <chr> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl>
## 1 (Intercept) -0.175 0.606 -0.289 0.773
## 2 ContrasteVelevacion -0.00146 0.000370 -3.95 0.000235
broom::glance(summary(RegresionP50_elevacion)) # %>% formattable() # tabla
formateada
## # A tibble: 1 × 8
## r.squared adj.r.squared sigma statistic p.value df df.residual nobs
## <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <int> <dbl>
 ## 1 0.227 0.213 3.67 15.6 0.000235 1 53 55
broom::glance(summary(Regresion)) # %>% formattable() # tabla formateada
## # A tibble: 1 × 8
## r.squared adj.r.squared sigma statistic p.value df df.residual nobs
## <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <int> <dbl>
## 1 0.146 0.130 6.48 9.23 0.00367 1 54 56
# broom::glance(summary(Regresion)) %>% formattable() # tabla anterior

#visualizamos la relación entre los contrastes y agregamos una línea de

tendenica a la regresión

#
Contraste <- bind_cols(enframe(ContrasteVP50), enframe(ContrasteVelevacion)) %>%
rename(CVP50 = `value...2`, CElevacion = `value...4`)
## New names:
## • `name` -> `name...1`
## • `value` -> `value...2`
## • `name` -> `name...3`
## • `value` -> `value...4`
ggplot(Contraste, aes(CElevacion, CVP50)) + geom_point() +
geom_smooth(method='lm') + theme_classic() +
ggtitle("Relación entre contrastes de P50 de HbA y de elevación")
## `geom_smooth()` using formula = 'y ~ x'
#Veamos ahora cómo se distribuyen los caracteres sobre la filogenia
#primero definimos el nombre de los datos
P50_2<-setNames(P50_2[,1],rownames(P50_2))
elevacion_2<-setNames(elevacion_2[,1],rownames(elevacion_2))

#y luego obtenemos su distribución sobre la filogenia propuesta

#para el valor de P50
Dist_P50<-contMap(treeR,P50_2,fsize=c(0.5,1),outline=FALSE)
#modificamos la leyenda del gráfico
plot(Dist_P50,fsize=c(0.5,1),outline=FALSE,lwd=c(3,7),leg.txt="P50")
#para las altitudes máximas registradas para cada taxón
Dist_elevacion<-contMap(treeR,elevacion_2,fsize=c(0.5,1),outline=FALSE)
#nuevamente, modificamos la leyenda del gráfico
plot(Dist_elevacion,fsize=c(0.5,1),outline=FALSE,lwd=c(3,7),leg.txt="Elevacion")

Pregunta 4
¿Según los resultados obtenidos, la historia filogenética compartida de las especies parece
haber influido en la evolución de P50? ¿La inercia filogenética (o tendencia en la historia del
rasgo P50) parece haber impedido la adaptación en algunos pares de spp?
Práctico 3

Procesos de diversificación

Darwin pudo haber sido el primero en describir la radiación adaptativa cuando,

contemplando la variedad de pinzones que ahora llevan su nombre, comentó: “Al
ver esta diversidad de estructura en un grupo pequeño e íntimamente relacionado
grupo de aves, uno realmente podría imaginar que partiendo desde una escasez
original de aves en este archipiélago, una especie ha sido tomada y modificada en
diferentes fines” (Darwin, 1845). Desde la época de Darwin, los naturalistas y
biólogos evolutivos han estado fascinados por la extraordinaria diversidad de
ecología, morfología, comportamiento y riqueza de especies de algunos clados,
pero ahora ha resurgido el interés por la radiación adaptativa.

La explosión de las filogenias moleculares en las últimas tres décadas (!) han
contado las historias detrás de la diversificación de innumerables clados y ha
proporcionado la materia prima para un renacimiento de los estudios de radiación
adaptativa (1). Las filogenias moleculares han ofrecido descubrimientos
sorprendentes sobre la historia y la magnitud de muchas radiaciones adaptativas,
como las vángidas de Madagascar (Vangidae), las córvidos de Australia (Corvidae),
los cíclidos del lago Victoria (Cichlidae), las lobelias de Hawaii (Lobelioideae) etc. En
cada uno de estos casos, se pensaba que la gran diversidad ecológica y
morfológica de un grupo era el resultado de eventos de colonización independientes
de múltiples linajes ancestrales adaptados de manera diferente. En cambio, nuevas
filogenias moleculares revelaron que la gran diversidad en estos grupos es el
resultado de la evolución in situ, es decir, una radiación adaptativa.

Con filogenias calibradas en el tiempo, uno puede plantearse si la ocurrencia de

radiación está correlacionada con eventos históricos (por ejemplo, extinciones
masivas, cambios en el clima) o si el ritmo de diversificación disminuye con el
tiempo, como a menudo se espera de una radiación adaptativa.

Con el estadístico gamma, calculado a partir de la topología podemos describir

tendencias macroevolutivas como una primera aproximación a ver las tendencias
dentro de un grupo taxonómico. Se puede averiguar si hubo tasa de diversificación
constante. Se puede detectar cambios en la tasa de diversificación a lo largo del
tiempo: si gamma es negativo ~ ha habido una desaceleración en la tasa de
diversificación a lo largo del tiempo y si gamma es positivo ~ esto sugiere que ha
habido una aceleración en la tasa de diversificación a lo largo del tiempo. También,
si el estadístico gamma es significativamente diferente entre dos clados, entonces
esto sugiere que las tasas de diversificación de los dos clados son diferentes.
Actividad Práctica

Objetivos

(i) ver métodos que se aplican luego de obtener un árbol.

(ii) ver cómo emplear estadísticos simples teniendo en cuenta solo la topología y
largo de rama de los árboles
(iii) discutir cómo la ecología o historia pueden afectar el éxito de un grupo.

Paso 1

Ir a esta página https://birdsoftheworld.org/bow/species

Cada subgrupo elegirá una familia de aves y trataremos de ver los patrones de
especiación dentro de cada linaje.

A priori ¿conoce algún grupo "especioso"?

¿Conoce algún grupo con una aparición repentina de especies?
Para ver “estos patrones” entre linajes ¿por qué es importante comparar grupos o
linajes equivalentes?

Paso 2

Ver esta otra fuente adicional de datos de Aves (la usaremos luego)
https://www.worldbirdnames.org/new/classification/family-index-2/

¿Qué datos podríamos extraer de aquí?

Ver tabla Excel online o Google spreadsheet con las familias disponibles acá
https://tinyurl.com/3jvx6afa

Teniendo en cuenta los datos de este sitio: https://birdsoftheworld.org:

➔ Anotar la distribución geográfica de la familia elegida.

➔ Anotar el número de especies y géneros.

Paso 3 en R

Cargar el árbol de la familia elegida.

Hacer plot de los linajes a través del tiempo (ltt)
Anotar estadístico gamma y su p-valor asociado.
Simular 100 LTTs (para árboles de tamaño similar) y hacer plot del ltt 'real' junto a
los 100 simulados.

Ahora para la familia que eligieron:

Anotar el estimado de gamma e interpretar la tendencia en el tiempo.
Ajustar la tasa de especiación y extinción para este árbol. ¿Qué modelo es
favorecido bd o yule (puro nacimiento)? Anotar "b" (especiación) y "d" (extinción).

Paso 4 …seguimos en R

Ahora nos adentramos en una familia en concreto…

Cargar el árbol de "Trochilidae.tree"
Cargar los datos de la distribución "South.tsv"
Ver ambos datos, árbol & datos.
¿Teníamos datos de distribución faltantes? ¿Cómo recuperamos esa data?

¿Cómo puede influir la región geográfica en la especiación?

¿Cómo puede influir el tipo de hábitat en la especiación?

Primero, hacemos la reconstrucción del área geográfica.

Ahora, viendo el plot de LTTs:

¿Cuál es la región que acumula más linajes a través del tiempo? Entonces, ¿influyó
la región en la diversificación de los picaflores?

¿Qué otros datos "geográficos" o de la distribución de estas especies podemos

considerar para examinar los patrones macroevolutivos en estas aves? ¿Qué otros
rasgos de estas especies podemos considerar para examinar los patrones
macroevolutivos en estas aves? Veamos pot ejemplo los datos de una especie
dentro de este grupo https://www.iucnredlist.org/species/22687097/166914847

Citas
1. Losos, Jonathan B., and D. Luke Mahler. "Adaptive radiation: the interaction of
ecological opportunity, adaptation, and speciation." Evolution since Darwin: the first
150 (2010): 381-420.
2. Harmon, Luke J., James A. Schulte, Allan Larson, and Jonathan B. Losos. "Tempo
and mode of evolutionary radiation in iguanian lizards." Science 301, no. 5635
(2003): 961-964.
3. Jetz, Walter, Gavin H. Thomas, Jeffrey B. Joy, Klaas Hartmann, and Arne O. Mooers.
"The global diversity of birds in space and time." Nature 491, no. 7424 (2012):
444-448.
4. McGuire, Jimmy A., Christopher C. Witt, J. V. Remsen, Ammon Corl, Daniel L.
Rabosky, Douglas L. Altshuler, and Robert Dudley. "Molecular phylogenetics and the
diversification of hummingbirds." Current Biology 24, no. 8 (2014): 910-916.
Práctico 4

Deriva genética

Parte I. Ley de Hardy-Weinberg

El modelo de Hardy-Weinberg describe el comportamiento de las frecuencias génicas de

una generación a la otra en poblaciones ideales. Se dice que una población está en
equilibrio de Hardy-Weinberg cuando sus frecuencias alélicas y genotípicas se ajustan a las
predicciones del modelo.
Bajo los supuestos del modelo, siendo pi la frecuencia del alelo Ai, las predicciones de
frecuencias genotípicas serían las siguientes:

E(Ai Ai) = pi2 E(Ai Aj) = 2pipj

Las predicciones de Heterocigosidad, para múltiples alelos, estarán dadas por la siguiente
ecuación:

E(H) = 1 – Σpi2

Siendo “Σ pi2” la suma de las frecuencias esperada de homocigotos, o sea la

Homocigocidad.

La Heterocigosis (medida de la variabilidad en la población) aumenta a medida que

aumenta el número de alelos en la población.

Figura1 El área sombreada representa la fracción de homocigotos esperados bajo equilibrio

Hardy-Weinberg.
Caso de estudio- Se estudia la variación genética de una población de Ctenomys
rionegrensis. A partir del mismo, calcule las frecuencias alélicas y genotípicas observadas
globales. Calcule la heterocigosis observada y la esperada a partir del modelo de
Hardy-Weinberg considerando a toda la muestra como parte de una única población.
Interprete los resultados.

Figura2 Gel de la poliacrilamida mostrando los resultados de la amplificación de microsatélites para

tres individuos de cada una de ocho subpoblaciones de Ctenomys rionegrensis (arriba), y su
representación esquemática (abajo).

La resolución de este problema se encuentra disponible en los materiales del

práctico.

Parte II. Deriva genética

Cuando de los supuestos del modelo de Hardy-Weinberg se abandona la condición de que

las poblaciones tienen tamaño infinito, se puede observar que de una generación a otra se
producen cambios aleatorios en las frecuencias génicas. Esto es efecto directo de que los
alelos que forman una nueva generación son un muestreo al azar de los alelos presentes en
la generación parental. En este caso, el sentido de la evolución no se puede predecir, ya
que está causada por los efectos de muestreo de generación en generación, un proceso
llamado deriva genética.
El modelo poblacional que sólo difiere del de Hardy-Weinberg en poseer un tamaño
poblacional finito es el modelo Fisher-Wright, que modela la probabilidad de un alelo de
tener determinada frecuencia en la generación siguiente, únicamente a partir de la
frecuencia inicial del alelo y el tamaño poblacional, realizando muestreos al azar con
reposición.

Para los siguientes ejercicios se utilizará el programa AlleleA1

(https://faculty.washington.edu/herronjc/a1/) que permite simular variaciones en la
frecuencia génica en función del tiempo, cambiando parámetros como la frecuencia alélica
inicial y el tamaño poblacional, entre otros.

Las simulaciones se pueden hacer para uno o varios loci no ligados cada uno con dos
alelos, lo que también se puede interpretar como varios ensayos sucesivos independientes
para un solo locus con dos alelos (Genetic Drift → Number of finite populations to simulate).
En cualquiera de los casos, el programa grafica la frecuencia de uno de los dos alelos del
locus, y el otro alelo será el complemento de esa. El botón “Run Again” en la ventana
gráfica de la derecha permite realizar nuevas simulaciones.

Ejercicio 1. Efecto del tamaño poblacional

¿Cómo crees que es el efecto de la deriva genética según el tamaño poblacional?

Para comparar el efecto de diferentes tamaños poblacionales, realizaremos simulaciones
manteniendo una frecuencia inicial de 0.5, para 5 loci, durante 500 generaciones (ventana
de la izquierda), y dos tamaños poblacionales diferentes:

Simulación A: N = 500 (gran tamaño poblacional)

Simulación B: N = 100 (pequeño tamaño poblacional)

Anotar por lo menos para una simulación de cada tipo las frecuencias finales de los alelos
¿Cuántos alelos se fijan o eliminan? ¿en cuántas generaciones? Comparar y discutir tus
resultados con los de tus compañeros. ¿Son estos resultados coherentes con tus
predicciones?

Ejercicio 2. Efecto de la frecuencia alélica inicial

Reflexione acerca de con qué frecuencia inicial se encontrará una mutación que recién
surge en un población. ¿Cuál será su probabilidad de fijarse?

Corre algunas veces la siguiente simulación durante 500 generaciones:

Simulación C: N = 500, y una baja frecuencia alélica inicial: 0,1

Nuevamente registre para al menos una corrida, cuántos alelos se fijan o eliminan y en
cuántas generaciones. Comparar los resultados obtenidos en esta última simulación con los
de la simulación A. ¿Son estos resultados coherentes con sus predicciones?

Ejercicio 3. Efecto a largo plazo sobre la heterocigosis

Realizar una nueva simulación con N=500, por 1000 generaciones, y frecuencia inicial de
0,5, y calcula la heterocigosis promedio mediante la ecuación básica H = 2pq en t = 0, 500 y
1000. ¿Existe alguna tendencia en los resultados?

Parte III. Deriva genética y mutación

Ahora introduciremos una fuente de variación abandonando otro de los supuestos de los
modelos de Hardy-Weinberg y de Fisher-Wright. Permitiremos el surgimiento de mutaciones
neutrales (sin selección) a una tasa μ por alelo por generación. Consideramos que cada
variante nueva puede surgir por mutación una única vez.

Ejercicio 4

Reflexione sobre: ¿cuántas mutaciones neutrales, en promedio, se fijarán por deriva en

cada generación? ¿Cómo afecta el tamaño de la población a esta tasa de sustitución?
Realizar una simulación inicial con freq. inicial A1 = 0.8, 10 poblaciones, con una tasa de
mutación A1 to A2=0,00005, 5000 generaciones y un tamaño poblacional N=100. ¿Qué
observa? Ahora repetimos pero agregamos mutación A2 to A1 = 0,00005 también. ¿Qué
observa? Discutir nuevamente que aporta la mutación.

Opcional

Para visualizar una manera de cómo pueden realizarse algunas de estas simulaciones a
partir de la distribución binomial, usaremos nuevamente el entorno de programación R con
el archivo “Deriva genética.rmd'', en donde también podremos cambiar algunos parámetros,
pero sabiendo cuál es la base del cálculo.
Práctico 5

Selección Natural y Selección Sexual

Objetivo: Familiarizarse con el concepto de selección natural y algunos métodos para

detectar su acción en distintos tipos de datos.

1. Estimación de eficacia y coeficiente de selección a partir de datos de campo

El tucu-tucu de Río Negro presenta fenotipos melánicos, agutís y dorso oscuro, con
frecuencia coexistiendo en suelos arenosos. El fenotipo melánico debería ser más
fácilmente detectable, y por tanto sufrir mayor mortalidad por depredación. Un estudio de la
población de Estancia “La Tabaré”, Depto. de Río Negro, –en donde solo coexisten las
variedades melánica y agoutí– obtuvo 74 juveniles en una estación reproductiva: algunos en
trampas colocadas dentro de las cuevas y otros en bolos regurgitados en torno a un nido de
“Lechuza de las vizcacheras” (Athene cunicularia) localizado en el mismo campo1. En la
siguiente tabla, se estima la supervivencia de cada fenotipo descontando los observados en
bolos de lechuza del total de juveniles de cada fenotipo2:

Fenotipos Total de Sobrevivientes Eficacia Eficacia Coeficiente de S (%)

juveniles absoluta relativa (w) selección (s)

Agutís 46 38

Melánicos 28 19

Ejercicio

- Calcular la eficacia absoluta (fracción de sobrevivientes), la eficacia relativa w (cociente

entre eficacia absoluta de un fenotipo y la correspondiente al fenotipo más apto).
- Calcular el coeficiente de selección (s) para cada fenotipo. ¿Qué significan en términos
biológicos los coeficientes de selección calculados?

¿Qué conclusión es posible sacar sobre la mortalidad diferencial de los dos fenotipos por
causa de la depredación a partir de estos datos?, ¿cuáles serían sus limitaciones?
¿Qué utilidad tienen estos resultados para entender la eficacia darwiniana general de
ambos fenotipos? Razone sobre las posibles limitaciones.
¿Cómo podría explicarse la persistencia del fenotipo melánico? ¿Qué estudios podrían
realizarse para avanzar en la comprensión del problema?

Opcional
Ingresa los valores de eficacia relativa obtenidos en el simulador de AllelleA1 utilizado en el
práctico anterior (https://faculty.washington.edu/herronjc/a1/).

1
Vasquez Herrera, A. 2003. Posible depredación diferencial sobre individuos agutís y melánicos de Ctenomys
rionegrensis, reflejada en bolos de Athene cunicularia. Informe de Pasantía, Licenciatura en Ciencias Biológicas,
Facultad de Ciencias, Universidad de la República, 35 pp.
2
Datos adicionales: De los 50 bolos estudiados, 26 contenían restos de tucu-tucus. De estos, fue posible
determinar el color del pelaje en 17.
2. Selección Sexual

La selección sexual resulta en variación en el éxito reproductivo entre individuos del mismo
sexo y típicamente actúa más fuertemente sobre los machos. Puede ser dividida en
intrasexual e intersexual y, aunque la evolución de ciertos rasgos de los machos puede ser
promovida exclusivamente por uno de los dos componentes, a menudo actúan en forma
simultánea. La evidencia empírica sugiere que podrían actuar en direcciones opuestas y el
resultado neto reflejaría el equilibrio entre esos dos procesos. Sin embargo, en muchos
casos la selección intra e intersexual tienen efectos complementarios, promoviendo la
expresión de los mismos rasgos en machos.

El caso de los peces anuales

Austrolebias charrua es una especie de pez anual endémica del sistema de lagunas
Patos-Merín. Habitan charcos temporales en cuyos sustratos depositan huevos resistentes
a la desecación. La especie presenta un dimorfismo sexual muy marcado: los machos son
más grandes, tienen distinta coloración y un patrón de bandas verticales oscuras en los
flancos del cuerpo. Un estudio evaluó la selección sexual sobre el tamaño corporal de los
machos por medio de la elección de la hembra y la competencia entre machos (Passos et
al. 20133) (videos de cortejo y agresión en peces anuales).

Actividad i) Preferencias de las hembras.

Se llevaron a cabo observaciones comportamentales usando el diseño del experimento que
se muestra en la figura 1a. Se registró el tiempo que una hembra interactuaba con cada
macho, la frecuencia de actividades de cortejo realizada por cada macho y se calculó un
índice de apariencia del macho que resume la intensidad del color y el despliegue de la
aleta dorsal. Los resultados se ejemplifican en la Tabla 1.

Figura 1- a) Diseño del experimento para evaluar la preferencia de la hembra. La hembra se

encuentra sola en un compartimento (i) y puede ver los dos compartimentos de los machos (ii),
separados por un tabique que impide que estos se vean entre ellos. b) Diseño del experimento para
evaluar competencia entre machos. La hembra se encuentra sola en un compartimento y puede ver
los dos machos en el compartimento contiguo.

3
Passos C, B Tassino, M Loureiro y GG Rosenthal. 2013. Intra- and intersexual selection on male body size in
the annual killifish Austrolebias charrua . Behavioural Processes 96, 20–26 .
Tabla 1. Tiempo que la hembra interactuó con cada macho (en segundos), la frecuencia de
actividades de cortejo realizada por cada macho y el índice de apariencia del macho (2-6). Se
muestran 3 casos y se presenta un promedio (última fila) para 30 casos.
Indiv\Variable Tamaño Prop. tiempo Cortejo Apariencia Macho
(medido como tiempo) (medido como prop. tiempo)

Grande Chico Preferido No Preferido Preferido No Preferido

Hembra 1 388 192 0.571 0.909 4 4

Hembra 2 245 145 0.833 0.708 5 5

Hembra 3 284 435 0.613 0.751 5 4

….. ….. ….. ….. ….. ….. …..

Promedio 813* 425* 0,683 0,641 5 4

*denota diferencias significativas (p< 0,05) entre los valores

a) De las características estudiadas, ¿cuál/es condiciona/n la elección de la hembra?

Justifique su respuesta.
b) De ser así, ¿cuáles podrían ser las causas de dicha preferencia?

Actividad ii) Competencia entre machos.

Se llevaron a cabo observaciones comportamentales usando el diseño del experimento que
se muestra en la Figura 1b (ver video). Se registraron datos de frecuencia de distintos
comportamientos agonísticos, el tiempo de resolución del conflicto, la diferencia de tamaño
entre los machos (dominante – subordinado) y a partir de ellos se confeccionaron las
gráficas de la Figura 2.

Figura 2. a) Frecuencia de los distintos comportamientos de interacción agonística. En gris oscuro se

muestran los datos para los machos más grandes, y en gris claro para los más chicos de cada díada.
b) Tiempo de resolución del conflicto (s) en función de la diferencia de tamaño de los machos (mm).

c) ¿Qué diferencias comportamentales se observan entre los machos dominantes y los

subordinados?
d) ¿Qué relación hay entre el tiempo de resolución del conflicto y la diferencia de tamaño
entre machos?
e) ¿Qué consecuencias fenotípicas tendrían las preferencias de las hembras a nivel
poblacional?; y ¿qué otros procesos podrían modificar dichas consecuencias fenotípicas?
Práctico 6
Estructura poblacional y flujo génico

Introducción
Ctenomys rionegrensis es una de las tres especies de este género de roedores
subterráneos reconocidas en Uruguay. Su distribución geográfica para nuestro país está
restringida a un área de aproximadamente 60 x 50 km al suroeste del departamento de Río
Negro (fig. 1).

Figura 1. Distribución geográfica de Ctenomys rionegrensis en Uruguay. Los sitios que se detallan
corresponden a las localidades de muestreo.

Pese a su pequeña distribución, existen tres coloraciones de pelaje marcadamente

diferentes: melánico, agutí y dorso oscuro. Mientras que algunas de las poblaciones están
enteramente constituidas por individuos que presentan la misma coloración, otras son
polimórficas, presentando distintas combinaciones de pelajes.

Esta marcada diferenciación cromática de C. rionegrensis es llamativa por varias razones.

En primer lugar, por ocurrir en un área geográfica tan reducida. Segundo, no se cumple con
la regla general (que incluye a roedores subterráneos) de correspondencia entre color de
pelaje y color del sustrato en el que se habita (debida probablemente a presiones selectivas
impuestas por la depredación). Todas las poblaciones de esta especie se limitan a la
ocupación de suelos arenosos claros, sin diferencias obvias en la vegetación, y de esta
forma los individuos melánicos contrastan marcadamente con el sustrato donde viven. A
diferencia del comportamiento de otros roedores subterráneos, los tucos emplean más
tiempo en la superficie, dedicándose a tareas asociadas al forrajeo y dispersión,
incrementando así el riesgo de depredación.
La estructura genética de las poblaciones de roedores subterráneos, como Ctenomys
rionegrensis, estaría principalmente determinada por:

a) su baja vagilidad, y por lo tanto bajos niveles de flujo génico, y

b) el pequeño tamaño de sus poblaciones, que las hace más susceptibles a los efectos de
la deriva genética (operando en mayor grado, fijando o eliminando alelos al azar).

Bajo estas premisas, y dado que hasta el momento no se ha encontrado ninguna posible
explicación seleccionista que explique la fijación del pelaje melánico en algunas
poblaciones, se ha planteado la hipótesis de una posible fijación del melanismo por deriva
genética.

Esta hipótesis prevé:

1) Una reducción de la variación genética en las poblaciones melánicas.

2) Bajos niveles de flujo génico entre las poblaciones, posibilitando que la deriva se
sobreponga a los efectos homogeneizadores del primero.

Métodos y Resultados

Para poner a prueba esta hipótesis, se analizaron 11 loci de microsatélites en 150 individuos
de C. rionegrensis pertenecientes a 8 poblaciones donde se encuentran representados los
tres tipos de pelaje, tanto en alopatría como en simpatría (ver mapa).

1) Se calculó la heterocigosis promedio observada Ho y la esperada He para cada

población y los estadísticos F de Wright.

Valores Las Arrayane Nuevo

Chaparei Abrojal Guarida Tabaré Mafalda
promedio Cañas s Berlín

# alelos 4 3.18 2.09 3.36 2.27 4.73 3.91 1

Ho 0.54 0.42 0.19 0.43 0.39 0.65 0.54 0

He 0.63 0.46 0.25 0.48 0.39 0.64 0.54 0

FIS

Actividad 1) Calcular los FIS para cada población.

Los niveles de flujo génico, globales y entre pares de poblaciones fueron estimados de dos
formas:

a) Niveles globales: a partir del estadístico FST, mediante la fórmula 𝑁𝑚 =

( 1
𝐹𝑆𝑇 − 1 ),
4
obteniéndose un Nm = 0.45.

b) Estimaciones pareadas: a partir de FST calculados para cada par de poblaciones.

Para evidenciar si existe un patrón de “aislamiento por distancia”, se construyó el siguiente

gráfico con los valores de flujo génico entre pares de poblaciones (obtenidos a partir de las
estimaciones pareadas de FST ) en función de la distancia geográfica que las separa (fig. 2).
Los valores de FST fueron estimados para dos marcadores genéticos: microsatélites y el gen
del citocromo b del ADN mitocondrial.
Figura 2. Gráfica del logaritmo del número de migrantes, expresado como Nm, vs. el logaritmo de las
distancias geográficas. Los círculos y los triángulos denotan estimaciones basadas en microsatélites
y citocromo b, respectivamente.

Además, para el gen del citocromo b se obtuvieron las distintas variantes de las secuencias
(haplotipos) y se estudió su frecuencia, su relación con la procedencia de la muestra y la
relación entre ellas (fig 3).

Figura 3. Red de distancias mínimas para los 15 haplotipos de citocromo b encontrados. Cada
haplotipo se representa con un círculo, cuya área es proporcional a la frecuencia. Sobre las líneas
que conectan haplotipos, los cambios están marcados como rayas transversales. Cada trama
representa una población (ver referencia).
Actividad 2) ¿Qué sugiere el gráfico de la Fig. 2 de flujo génico en función de distancias
geográficas para pares de poblaciones? (vea también la Fig. 3)

Actividad 3) ¿Las estimaciones de flujo génico obtenidas, corresponden a métodos directos

o indirectos? ¿Tiene esto alguna implicancia para nuestros resultados?

Un estudio anterior que considera algunas de las mismas poblaciones y que emplea
marcadores alozímicos, propone una estimación de Nm ≈ 6 a 10 y los siguientes valores de
FIS:

Localidad
Abrojal Guarida Mafalda Las Cañas Nuevo Berlín
FIS 0,365 0,577 0,312 0,349 0,242

Actividad 4) Discutir a que pueden atribuirse las discrepancias entre ambas

aproximaciones al mismo problema.

Actividad 5) Evaluando la totalidad de los resultados presentados, ¿acepta o rechaza la

hipótesis de que el melanismo se fijó por deriva en algunas poblaciones? ¿Qué
interpretación plantearías para explicar el patrón de estructura poblacional encontrado?

Bibliografía

Wlasiuk, G., Garza, J. C. y Lessa, E. P. 2003. Genetic and geographic differentiation in the
Río Negro Tuco-tuco (Ctenomys rionegrensis): inferring the roles of migration and drift from
multiple genetic markers. Evolution, 57 (4), pp. 913-926.
Práctico 7
Selección natural: análisis a nivel molecular

Objetivo:​ Familiarizarse con el concepto de selección natural y algunos métodos para

detectar su acción usando datos moleculares.

Introducción
Cuando la selección natural actúa sobre las poblaciones deja huellas que pueden ser
reconocidas en el ADN. Para identificar esas huellas se han desarrollado diferentes pruebas
aplicables a secuencias nucleotídicas codificantes de proteínas. Una aproximación robusta
y sencilla desarrollada por McDonald y Kreitman es considerar que, bajo neutralidad, la
relación entre la tasa de cambio nucleotídico sinónimo (dS) y no sinónimo (dN) o de
reemplazo aminoacídico será la misma dentro y entre poblaciones. Cualquier desviación
sugiere un apartamiento de la neutralidad, incluyendo algún tipo de selección positiva. Si no
se cuenta con información poblacional, otra aproximación muy utilizada aunque exigente es
considerar que, bajo neutralidad estricta, ambas tasas deberían ser iguales, por lo que
dN/dS, también conocido como ω será 1. Si dN supera ampliamente dS, es decir si ω>1, se
asume que actuó selección positiva (el caso inverso, ω<1 indicaría selección purificadora).
En este práctico aplicaremos ambas aproximaciones.

Ejercicio 1 - ​Test de McDonald y Kreitman

Cuando McDonald y Kreitman en 1991 propusieron su test de neutralidad, lo aplicaron a un
conjunto de secuencias de la enzima Alcohol deshidrogenasa (Adh), para tres especies
diferentes.

Actividad
La Tabla 1 muestra el resumen de los sitios variables de las secuencias de Adh incluidas en
la base de datos.
- Interprete la Tabla 1: ¿qué hay en las filas y las columnas?
- Completar los siguientes cuadros a partir de los datos de la tabla.
- Utilizando los cuadros completados, realizar el test de McDonald y Kreitman (MK) y sacar
conclusiones.
D. simulans vs. D. yakuba
Polimorfismos Sustituciones
Reemplazo
Sinónimos

D. melanogaster vs. D.yakuba

Polimorfismos Sustituciones
Reemplazo
Sinónimos

D. melanogaster vs. D.yakuba

Polimorfismos Sustituciones
Reemplazo
Sinónimos
Tabla 1. Resumen de los sitios variables de las secuencias de Adh usadas por McDonald y Kreitman (1991)
para proponer su test de neutralidad. La primera columna a la izquierda indica la posición del sitio en cuestión, la
segunda es la secuencia consenso de referencia; el símbolo – indica un nucleótido idéntico a la secuencia
consenso. Se muestran los estados para cada sitio para 12, 6 y 12 individuos de las especies D. melanogaster,
D. simulans y D. yakuba respectivamente. Sitios subrayados indican individuos heterocigotas (portan la variante
de consenso y la subrayada).

Ejercicio 2 - ​Variación en el ​ω ​entre sitios y entre linajes

En este ejercicio usaremos las secuencias de la Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe.
Esta proteína es una glucoproteína antigénica que se encuentra en la superficie del virus y
es la mayor responsable de la unión del virus a la célula infectada. Esta proteína es muy
estudiada en el diseño de vacunas, porque presenta una evolución asimétrica que sugiere
una fuerte selección de aquellas variantes que son las que mejor escapan al sistema
inmune del hospedero. Además, el análisis de los cambios nucleotídicos sinónimos y no
sinónimos muestra que muchos residuos aminoacídicos en la HA concentrados en el
extremo distal y externo de la proteína (que son aquellos sitios que interactúan con el
sistema inmune del hospedero) están siendo seleccionados positivamente (Fig. 1).

Fig 1. A) Modelo tridimensional de la Hemaglutinina del virus de la gripe, mostrando los sitios aminoacídicos
seleccionados positivamente para cambiar. B) Filogenia de cepas del virus aisladas desde 1985 a 1996, basada
en el análisis de las secuencias nucleotídicas de ese gen (Tomado de Hillis, 2009).

A continuación, estimaremos la tasa de cambio nucleotídico sinónimo (dS) y no sinónimo

(dN) y su relación mediante máxima verosimilitud (ML). Estas estimaciones pueden ser
realizadas para cada codón y/o linaje, considerando una filogenia que permita estimar las
secuencias de los nodos ancestrales. Utilizaremos un servidor llamado Datamonkey
(​https://www.datamonkey.org/​) y usaremos el método SLAC (Single-Likelihood Ancestor
Counting).
SLAC es una de las tantas formas de evaluar sitios bajo selección. Utiliza una combinación
de enfoques de ML y conteos para inferir dN y dS por sitio para un conjunto de secuencias
nucleotídicas codificantes de proteínas alineadas y la filogenia que las vincula. En este
caso, cargaremos al programa la información de las secuencias, y el árbol será estimado
por el propio programa. SLAC comienza optimizando las longitudes de las ramas y los
parámetros de sustitución de nucleótidos bajo un modelo complejo (denominado
MG94xREV). Sin embargo, en lugar de usar ML para ajustar los parámetros dN y dS
específicos del sitio, SLAC usa ML para inferir la secuencia ancestral más probable en cada
nodo de la filogenia. Así, compara secuencias nucleotídicas entre nodos adyacentes, y
luego cuenta directamente el número total de cambios no sinónimos y sinónimos que se han
producido en cada sitio (para eso emplea una versión modificada del método de recuento
Suzuki-Gojobori). La significancia estadística se determina en cada sitio utilizando una
distribución binomial extendida. Es importante destacar que, debido a su enfoque basado en
el recuento, es posible que SLAC no sea preciso para conjuntos de datos con altos niveles
de divergencia. A su vez, esta aproximación asume que la presión de selección para cada
sitio es constante a lo largo de toda la filogenia, algo poco realista. Existen otros métodos
más flexibles y sensibles que pueden ser explorados en el servidor Datamonkey.

Actividad

- En la página "datamonkey.org" seleccionamos el método desde la barra superior o vamos

directamente a "https://www.datamonkey.org/slac"

- Usamos el archivo fasta SecuenciasHA.fas (en la carpeta de Prácticos) y dejamos el

código Universal que viene por default. Ahora ejecutamos con "Run_analysis". En caso que
haya dificultades puede ver los resultados en el siguiente link:
https://www.datamonkey.org/slac/651b2089353125059b6397cd

- Interprete los resultados. ¿Existe algún sitio y/o linaje seleccionado? ¿Qué sitio presenta
una fuerte evidencia de selección positiva? ¿Qué valores de dN y dS tiene ese sitio? ¿Qué
cambios aminoacídicos se registran en ese sitio? ¿Dónde cree que se ubicará ese sitio en
la proteína dados los antecedentes planteados?

-En la sección "SLAC Phylogenetic Alignment" visualizar los sitios con más evidencia de
selección.

-¿Qué similitudes y diferencias encuentra entre esta aproximación y el test de MK?

- Ahora probemos otro enfoque. Podemos usar MEME (Mixed Effects Model of Evolution),
que permite estimar selección donde solo algunas de las ramas han experimentado
presiones selectivas. Como dice el portal permite "Detectar sitios individuales bajo selección
episódica diversificadora". En caso que haya dificultades puede ver los resultados en el
siguiente link: https://www.datamonkey.org/meme/651b2acc353125059b639850 .
-De forma similar probemos FUBAR (Fast, UnconstrainedBayesian AppRoximation). En
caso que haya dificultades puede ver los resultados en el siguiente link:
https://www.datamonkey.org/fubar/651b2d03353125059b6398c0

Referencias

1. McDonald, J., Kreitman, M. Adaptive protein evolution at the Adh locus in ​Drosophila ​
. Nature 351, 652–654 (1991). ​https://doi.org/10.1038/351652a0
2. Hillis, DM. (2009). Phylogenetic Progress and Applications of the Tree of Life. En:
Evolution since Darwin: The First 150 Years, pp. 421-449. Eds: MA Bell, DJ Futuyma,
WF Eanes, JS Levinton. Sinauer Associates, Inc. • Publishers Sunderland,
Massachusetts U.S.A.
3. Kosakovsky Pond, SL and Frost, SDW. "Not So Different After All: A Comparison of
Methods for Detecting Amino Acid Sites Under Selection." Mol. Biol. Evol. 22,
1208--1222 (2005).
4. Murrell, B et al. "Detecting individual sites subject to episodic diversifying selection."
PLoS Genetics 8, e1002764 (2012).
Práctico 8
Patrones de evolución molecular

Objetivos: A partir del análisis del patrón de sustituciones nucleotídicas de una secuencia
codificante en un grupo taxonómico particular: 1) visualizar patrones generales de evolución
molecular y 2) discutir la validez y el alcance de la idea de “reloj molecular”, identificando
factores que pueden producir desviaciones aparentes del mismo.

Datos
El archivo Primates_datos.meg contiene los 1000 primeros sitios del gen del citocromo b del
ADN mitocondrial de 13 especies de primates.

Clasificación de los primates considerados en este práctico

Suborden Familia Género Nombre común Distribución

Lemur
Strepsirrhini Lemuridae Lemur Madagascar
Microcebus
Cebus Mono capuchino
Platyrrhini Cebidae Neotrópico
Saimiri Mono ardilla
Papio Babuino
Cercopithecidae África
Macaca Macaco
Hylobatidae Hylobates Gibón Asia, Indonesia
Catarrhini Pongo Orangután Borneo
Gorilla Gorila África
Hominidae
Pan Chimpancé África
Homo Humano Cosmopolita

Tiempos de divergencia
Datos paleontológicos sugieren los siguientes tiempos de divergencia4 desde el ancestro
común (dados en millones de años desde el presente):
58 Lemúridos vs. los restantes primates
40 Platirrinos vs. Catarrinos
15 Orangután vs restantes homínidos
6 Gorila vs. Chimpancés y Humanos
Actividades
1) Usar el programa Mega X
Una vez abierta la base de datos “primates_datos.meg” en el programa, realizar las
siguientes actividades.
- ¿Por qué será útil indicarle al programa el carácter codificante de la secuencia? ¿y que el
origen de la secuencia sea ADN mitocondrial de mamíferos?

4
En la discusión sobre el reloj molecular y temas relacionados se habla de “divergencia” para referirse al cambio
total que ha ocurrido en la evolución de dos especies desde su ancestro común. Este cambio se cuenta, por
tanto, a lo largo de dos líneas evolutivas; bajo la hipótesis del reloj molecular la “tasa de divergencia” de un gen
o región cualquiera es el doble que la “tasa de evolución”.
- ¿Las secuencias aminoacídicas son más o menos informativas que las secuencias
nucleotídicas?
- Obtener una filogenia usando el criterio de Máxima Parsimonia (utilizando las opciones
que vienen por defecto). Definir como grupo externo a Lemuridae, reportar el índice de
consistencia (en i > general). ¿Qué información aporta este índice acerca de la filogenia?
- Representar el árbol anterior como filograma (por defecto aparece un cladograma).
Reportar si existen diferencias entre grupos en la tasa de evolución y reflexionar las
posibles causas que pueden producirlas.
- Obtener una tabla de distancias absolutas pareadas. Escoger en el menú la opción
Distances, Compute Pairwise y elegir la opción Model / Nucleotide / No. of Differences.
Visualizar las otras opciones.
- Observar la copia de la matriz obtenida anteriormente que se encuentra a continuación.
Luego: a) Completar la información ausente, b) en la matriz reconocer los recuadros para
las 2 comparaciones con que se cuenta con información paleontológica.

2) Usar el programa Excel

- Abrir el archivo “distancias primates.xls”. Encontrarás el número de diferencias
discriminadas entre las posiciones del codón, así como entre transiciones y transversiones,
obtenidas de la forma anterior. Estas distancias pareadas se han graficado para cada uno
de los tiempos de divergencia. Observe los rangos de valores para cada una de estas
medias, y saque conclusiones de las dos gráficas.
- Pensar, discutir y responder: para el caso de la cantidad de cambios según las posiciones
del codón, ¿qué gráfico esperaría obtener según el reloj molecular? ¿Se ajustan en
apariencia las gráficas a la idea del reloj molecular? ¿Qué factores pueden dar cuenta de
las variaciones observadas? ¿Cómo pueden explicarse estas tasas en términos
neutralistas?
- De ser posible, estimar el tiempo de divergencia de los gibones y los homínidos.

3) Mencione los problemas asociados a la estimación del tiempo de divergencia entre

gibones y homínidos, realizada anteriormente.
De encontrarse un pseudogen del citocromo b para estas especies, discuta cómo espera
que sea el patrón de sustituciones nucleotídicas en esta secuencia.
Bajo neutralidad, ¿es esperable obtener un gen, o región de un gen, con mayor cantidad de
cambios no sinónimos que sinónimos?, ¿qué interpretación podría darle a este
fenómeno?
Práctico 9

Evolución en familias multigénicas - “Globinas”

Objetivo: Mediante el estudio de los genes de Globinas en primates, familiarizarse con la

identificación de familias multigénicas, su problemática y limitaciones.

Una familia génica o familia multigénica es un grupo de loci

cromosómicos cuya secuencia de nucleótidos es similar y derivan
de una secuencia común ancestral. Puede incluir copias de genes
ligeramente diferentes y/o pseudogenes más variables, en uno o
varios cromosomas.
Los genes codificantes para las globinas representan un ejemplo
clásico de familia multigénica. En general, estas proteínas portan
un grupo “heme” y se caracterizan por unirse y transportar
oxígeno. Presentan dominios homólogos en varios taxa: a)
hemoglobinas tetraméricas de vertebrados (componente proteico
principal de los eritrocitos), b) flavohemoglobinas en
microorganismos, c) hemoglobinas homodiméricas bacterianas, d)
leghemoglobinas en plantas (asociadas al metabolismo del
nitrógeno en plantas con rhizomas), e) hemoglobinas de
invertebrados, f) mioglobinas monoméricas usualmente
encontradas en el músculo animal entre otras.
En primates existen varias clases de globinas dentro de la familia,
generalmente designadas con letras griegas (por ejemplo, α, β, γ,
δ, ε, ξ y Mioglobina MB). Recientemente se ha identificado una
nueva clase, la citoglobina (CYGB). En humanos, el gen que la
codifica parece expresarse en todos los tejidos y se localiza en el
brazo largo del par cromosómico 17. Se sugiere que su tamaño
está conservado en varios mamíferos y es de 190 aminoácidos.

Figura 1 - Localización de los genes codificantes para globinas en humanos.

Conceptos generales
 ➔ ¿Qué procesos podrían estar involucrados en la aparición de las familias
multigénicas?
➔ ¿Qué ventajas conferirían estas familias génicas?

Alineamiento e identificación de globinas

Análisis del alineamiento de secuencias proteicas de globinas, identificación de regiones

conservadas
Cargue el alineamiento en el programa MEGA X: Ir a Align → Edit/Build Alignment →
Retrieve a sequence from a file → cargar el archivo “globinas_aa.fas” y elegir Align.
Aora nos detenemos unos segundos a ver la estructura de los alineamientos.

➔ Identifique los sitios conservados en todas las secuencias y sugiera su posición en la

proteína. Justifique.

➔ ¿Visualiza algún patrón particular en la secuencia de estas proteínas? Interprete.

➔ Selecciones y copie (ctr + c) la región conservada (al menos 50 aa.) en una de las
secuencias y haga un blastp (blast de sec. aminoacídicas) contra la base de datos
en UniProt (https://www.uniprot.org/blast). ¿A qué corresponde dicha región?

➔ En la seccion Structure podemos apreciar la estructura 3D de esta proteína.

➔ En la sección Family and domain databases podemos ir a CDD “Conserved Domain
Database”

Cargue los datos en el programa MEGA (File / Open Data / globinas_nt.meg). Esta base
de datos tiene las secuencias codificates (ADNc) reportadas de genes miembros de la
familia de las globinas en los siguientes primates: Homo sapiens, Gorilla gorilla, Pongo
abelii, Macaca mulatta, Callithrix jacchus, Papio anubis, Pan troglodytes, Microcebus
murinus y Otolemur garnettii (ver Figura 2).

Figura 2 - Cladograma de las especies incluidas los datos

 ➔ En base a los datos disponibles (ver Fig 1 y 2), ¿cómo piensa usted que ocurrió la
evolución de los diferentes tipos de globinas dentro de los primates? Genere un
esquema.

Distribución filética de los parálogos

Realice la reconstrucción filogenética en base a los datos que se le brindan (Método:

Neighbor-Joining, Gaps: Pairwise deletion, Bootstrap: 1000 pseudoréplicas).

➢ ¿Son los resultados coincidentes con el esquema que usted generó?

➢ Identifique aquellos nodos que se corresponden con eventos de especiación y/o
duplicación.
➢ Analice e interprete algunos casos particulares:
○ clase delta en humanos
○ ausencia de γ-globina en M. murinus y O. garnettii
○ ausencia de μ-globina en M. murinus
○ relación de las citoglobinas con las otras globinas

➔ A grandes rasgos ¿a qué se corresponde la distribución filética de los distintos

parálogos de globinas?

➔ Si tenemos que buscar de nuevo un parálogo ¿en cuál cromosoma buscaría la

μ-globina en humanos?

➔ ¿Qué información adicional sería útil para establecer el origen de un nuevo gen de
globinas?

Estimación de las tasas de evolución en los distintos parálogos

Estimación del parámetro ω (dN/dS) entre clases y dentro de las clases

Los genes ya están agrupados en las clases correspondientes en la base de datos. Calcular
las distancias media dentro (ortólogos) y entre clases (parálogos).

➔ ¿Cuál espera sea el resultado dentro y entre clases? ¿Por qué? ¿Qué relación tiene
esto con el árbol reconstruido? ¿Cómo piensa que será la estimación de la tasa
sinónima y por qué?

En MEGA… Ir a Distances → Compute within group mean y luego Compute between

group mean, incluyendo sustituciones sinónimas (dS) y no-sinónimas (dN), estimadas con
el modelo de Kumar (LogDet (Tamura-Kumar)) y Gaps: Pairwise deletion.

➔ Abrir el archivo Cálculo dn-ds familias multigénicas.xlsx

➔ A partir de los valores de distancia media sinónima y no-sinónima calcule la relación
entre ellas (≈ dN/dS) dentro de cada parálogo (entre ortólogos) y entre parálogos, y
tome nota.
➔ Interprete ambos resultados, relacione los mismos con procesos evolutivos dados en
clase
Práctico 10

Genómica Comparada

Introducción
Saccharomyces cerevisiae ('levadura de fermentador' o 'levadura de horneado') es una
especie de levadura (hongo unicelular). La especie ha sido fundamental en la elaboración
del vino y cerveza y en el horneado desde la antigüedad. Saccharomyces fue el primer
eucariota cuyo genoma fue completamente secuenciado (¡1996!). Es un organismo modelo
dado su corto tiempo de generación, la posibilidad de hacer transformación por
recombinación homóloga y su relevancia económica. También se la utiliza en estudios de
envejecimiento, reparación de ADN, entre otros usos.

Otro género cercano a Saccharomyces es Hanseniaspora. Estas levaduras apiculadas se

encuentran no sólo en las uvas, sino también en muchas otras frutas. Las levaduras
apiculadas representan aproximadamente el 70% de la microflora asociada a la uva.
Hanseniaspora vineae está emergiendo como una especie prometedora para la producción
de vino de calidad. Los vinos producidos por una mezcla de estas levaduras H. vineae con
S. cerevisiae exhiben consistentemente sabores frutales más intensos y más complejos que
los vinos producidos sólo por S. cerevisiae. Las especies de Hanseniaspora también son
participantes clave en la fermentación de una gran variedad de otros productos alimenticios
que van desde el chocolate hasta el tequila o la sidra de manzana.

El artículo en el que nos basamos (Giorello et al. 2018) detectó que Hanseniaspora vineae
no forma parte de una ronda de duplicación que abarca un linaje de 6 especies dentro de la
radiación de estas levaduras, donde se encuentra Saccharomyces (ver figura). Este trabajo
encontró numerosos genes relevantes (ej., ejemplo aminotransferasas y descarboxilasas)
que son resultado de duplicaciones génicas.
Más recientemente se encontró que dentro del género Hanseniaspora, H. vinae es parte de
un linaje de evolución lenta (slow evolving lineage, SEL), de aparición más reciente (ver
figura, Steenwyk et al, 2019). Esta literatura sugiere una rica historia evolutiva en estos dos
géneros y más en general en la clase Saccharomycetes, la cual incluye a todas estas
especies.

Objetivo
Compararemos la riqueza funcional dentro de este grupo de levaduras analizadas en estos
dos artículos, identificar qué clados sufrieron más duplicaciones y tener un panorama de la
función que cumplen los genes duplicados a lo largo de la historia de este grupo y en
especial en Hanseniaspora.

Metodología
Tomaremos algunas de las especies utilizadas en el trabajo de Steenwyk et al. y
realizaremos un análisis genómico, incluyendo anotación funcional, análisis de ortología
sumado a análisis de pérdida y ganancia de genes. Se considerarán Hanseniaspora
guilliermondii, H. occidentalis, H. osmophila, H. valbyensis, H. vineae, Cyberlindnera jadinii,
Kazachstania servazzii, Saccharomyces cerevisiae, Wickerhamomyces anomalus.

Parte 1. Acceso a datos genómicos.

a) Localizar uno de los dos genomas de levadura de uva de vino Tannat de Uruguay (ir a
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/ y buscar en la barra de búsqueda).

b) En Uniprot (https://www.uniprot.org/) buscar las proteínas de interés que se encuentran

en la siguiente tabla, restringiendo la búsqueda a Saccharomyces. Ya que los usaremos en
la siguiente etapa, apuntar el código/acceso de Ensembl y completar la tabla. En la sección
“About us” encontrarás más información sobre ambos repositorios.
 Acceso de Acceso de OMA № de ortólogos
GEN Ensembl

PDC1 YLR044C EQRYNDI 502

ARO8

ARO9

ARO10

ATF2

SLI

Ejemplo para PDC1:

Acceso de Ensembl: sequence > Genome annotation databases > EnsemblFungi > YHR137W.
Acceso de OMA: Family & Domains> Phylogenomic databases > OMA > EQRYNDI.
№ de ortólogos: abrir link de OMA > OMA GROUP 1187478 with 502 members.

Parte 2. Exploración de sintenia

Observar el contexto genómico en "FungiDB" [https://fungidb.org/fungidb/app/] y en

"Genomicus"
[https://www.genomicus.bio.ens.psl.eu/genomicus-fungi-43.01/cgi-bin/search.pl].

a) En FungiDB para ver sintenia buscar código Ensembl > primer resultado >
'Synteny'. Ir al link que aparece a la derecha de Ortholog Group ¿Qué genomas
están anotados y mantienen ortología para este gen?
b) En Genomicus, buscar código Ensembl. De nuevo identificar qué especies estamos
comparando y cuánto se mantiene la sintenia. Ya que la visualización es más
amigable, identificar duplicaciones génicas en alguno de estos genes (nodos rojos:
duplicación; nodos azules: especiación). ¿Aproximadamente, cuántos genomas
logramos comparar por este método? También podemos centrar la visualización en
otros genes o comparaciones. ¿De qué dependemos para usar este tipo de
comparación o visualización en estos sitios?

Parte 3 Evaluación de calidad del genoma y anotación funcional

Con la herramienta BUSCO, vemos cuán completo está cada cada genoma a partir de una
base de datos de genes ortólogos de copia única. Si sólo consideramos genes de este tipo,
¿cómo se han originado estos genes? Cuando hacemos "Benchmarking Universal
Single-Copy Orthologs" (BUSCO) logramos cuantificar la completitud de un genoma ya que
la expectativa es encontrar estos genes en el genoma como "copia única".
Observando los resultados de BUSCO (a) ¿Qué genoma se encuentra mejor representado
(i.e. más completo)? (b) ¿Qué desventaja tiene incluir genomas poco completos?

Con los resultados de la anotación funcional de H. vineae y S. cerevisiae (carpeta Parte3 >
tablas '*emapper.xlsx'). (c) ¿Cuántos genes en total anotamos con eggNOG para cada
especie?

(d) ¿Hay diferencias entre estas spp. al fijarnos en estos genes anotados en las tablas xlsx?
Ejemplo busquemos OLE, URA9, MP65 y URA1 en la columna "Preferred_name"

Parte 4. Análisis de ortología y anotación funcional (en R).

Por un lado, OrthoFinder nos permitió estimar los ortólogos entre 10 genomas de
levaduras. eggNOG nos permitió hacer la anotación funcional o conocer qué función
cumplen los genes presentes en estos genomas.

Cuando procesamos parte de los resultados de OrthoFinder logramos más detalle de la

historia evolutiva de estas especies. Algunos de los resultados son: un árbol de especies,
múltiples árboles de genes, lista con genes ortólogos, lista con duplicaciones génicas y
todos los archivos fasta con los ortólogos (carpeta Parte4).

Para esta actividad práctica usaremos, R (https://cran.r-project.org/) el cual es un entorno y

lenguaje de programación enfocado al análisis estadístico. Los paquetes de R (y sus
dependencias!) ya han sido instalados: phytools, tidyverse, formattable.
Ahora comenzamos a seguir el script Hvineae.R

# los números usados debajo -con este formato '(#1)'- están asociados en el script de R.

Siguiendo los comandos en el script podemos ver el árbol de OrthoFinder. ¿Cómo se

construyó? Prestar atención al nombre o etiqueta de los nodos (#1)

Teniendo en cuenta el análisis global de ortología nos podemos fijar en algunos resultados
que ayudan a describir 'el éxito' de recuperar distintos ortólogos.

¿Cuál es el número de genes en los ortogrupos? (#2)

¿Número de ortogrupos de copia simple?
¿Número de ortólogos con todas las spp presentes?

¿Qué spp tiene más duplicaciones? Ver plot. (#3)

¿A qué clado pertenece esta spp.?

¿Qué especies comparten más ortólogos? Para esto vemos la tabla en R o excel donde se
compara cada especie y sus ortólogos compartidos. ¿A qué se debe este patrón? (#4)

Tenemos acceso a la estadística de ortólogos por cada genoma. Grafiquemos los siguientes
resultados. (#5)

Nº ortogrupos por spp.

Nº genes por spp.
Nº genes en ortogrupos por spp.

Ahora vemos ahora la lista de Anotaciones (LAnot)

Con esta información “extra” podemos hacernos otras preguntas...como por ejemplo buscar
entre todos los genes anotados cierta gen o función de interés en estas levaduras que
sabemos que tienen todo un 'arsenal' de genes asociados a la fermentación.

Nos concentramos en una "alcohol dehydrogenase" mencionada en la Tabla 3 del artículo.

¿Cuántas variantes de SPE1 o SPE2 se pudieron anotar? (#6)

Ahora nos fijamos en la lista de duplicaciones + anotaciones funcionales

¿Cuántos genes (con anotación) tienen duplicaciones? (#7)

En qué categorías COG están presentes estos genes duplicados? (#8)

¿Qué función cumplen?

Recordando el resumen del artículo, hay genes señalados como relevantes en estas
levaduras. Nos concentramos en un gen en particular…
¿Cuántos genes 'ARO' hay en los Ortólogos? (#9)
¿Cuántos genes 'ARO' se encuentran duplicados? (#10)

Si agrego detalle de qué genes se duplicaron en qué especies tengo otra dimensión de la
historia del grupo, podemos hacer otras preguntas. De esta forma podemos entender si la
diversidad de genes responde a duplicaciones en el ancestro de estos grupos de levaduras
o duplicaciones dentro de cada especie.

¿Cuántas duplicaciones hay en todo el género Hanseniaspora? Para esto buscamos antes
qué nodo es el ancestro común más cercano de este grupo (recordar paso #1). (#11)

Si le agrego anotación fusionando las tablas puedo responder otras

¿Qué genes están duplicados en estas “otras” levaduras hermanas de Hanseniaspora?
(#12)

Podemos buscar qué función que cumplen estos genes duplicados (podemos dividir la tarea
en distintas máquinas)

¿Qué COGs abundan en H. vineae? ¿Qué función cumplen? (#13)

¿Qué genes podrían ser deshidrogenasas? (#14)

¿Qué genes son los más duplicados en estas 10 spp? (#15)

Finalmente, ahora podemos visualizar las duplicaciones de algunos genes para poner en
contexto cuáles son ortólogos y parálogos.

Visualice las duplicaciones para algunos genes como los ARO, PDC1, descarboxilasas,
GTPasas o aminotransferasas (#16)

¿Qué genomas agregarían para entender aún más la diversidad funcional de estas
levaduras? ¿Qué genes o grupo de genes se podrían explorar con más detalle? Haga el
ejercicio volviendo a la parte '2b' con 'Genomicus + PDC1' como "punto de partida".

Parte 5.

¿Crees que con las herramientas manejadas en el práctico, se aborda completamente el

objetivo propuesto?

Puede responder si hay duplicaciones específicas Hanseniaspora que puedan interpretarse

como adaptaciones. Justifique.
MINI GLOSARIO

Anotación funcional: el proceso de adjuntar información biológica a secuencias de genes

o proteínas.

Aminotransferasas: enzimas que catalizan una reacción de transaminación entre un

aminoácido y un α-cetoácido. Son importantes en la síntesis de aminoácidos, que forman
las proteínas.

Categorías COG: en la base de datos "Clusters of Orthologous Groups" (COG), cada COG
incluye proteínas que se cree que son ortólogas. El propósito de la base de datos COG es
servir como plataforma para la anotación funcional de genomas recién secuenciados y para
estudios sobre la evolución del genoma. Para facilitar los estudios funcionales, los COG se
clasificaron en 17 categorías funcionales amplias.

Descarboxilasas: son liasas de carbono-carbono que agregan o eliminan un grupo

carboxilo de los compuestos orgánicos. Estas enzimas catalizan la descarboxilación de
aminoácidos, beta-cetoácidos y alfa-cetoácidos.

Deshidrogenasas: una enzima perteneciente al grupo de las oxidorreductasas que oxida

un sustrato al reducir un aceptor de electrones, generalmente NAD+/NADP+[1] o una
coenzima flavina como FAD o FMN. Como todos los catalizadores, catalizan reacciones
inversas y directas, y en algunos casos esto tiene un significado fisiológico: por ejemplo, la
alcohol deshidrogenasa cataliza la oxidación de etanol a acetaldehído en animales, pero en
la levadura cataliza la producción de etanol a partir de acetaldehído.

Genes de copia única (o ortólogos copia única): marcadores universales presentes sólo
una vez en cada genoma (para un grupo dado, ejemplo vertebrados o fungi).

GTPasas: una superfamilia de proteínas que regulan muchos procesos celulares, como la
señalización celular, el transporte vesicular y la regulación de la forma y motilidad celular.

Ortogrupo: es el conjunto de genes de múltiples especies que descienden de un solo gen

en el último ancestro común (LCA) de ese conjunto de especies.

Ortólogo: el “mismo” gen en diferentes especies que ha divergido como resultado de la

especiación.

Sintenia: la conservación de bloques de orden dentro de dos conjuntos de cromosomas (o

genomas) que se comparan entre sí.

BIBLIOGRAFÍA
Giorello, Facundo, et al. "Genomic and transcriptomic basis of Hanseniaspora vineae's
impact on flavor diversity and wine quality." Applied and Environmental Microbiology
85.1 (2019): e01959-18.
Steenwyk, Jacob L., et al. "Extensive loss of cell-cycle and DNA repair genes in an ancient
lineage of bipolar budding yeasts." PLoS Biology 17.5 (2019): e3000255.