Cecytes Franco Javier Mina

Segundo parcial
Guía de estudios para la materia Obtención de productos fermentados utilizando procesos
biotecnológicos industriales.

Mtra. María de los Ángeles Borbón Castro.

SUSTRATOS UTILIZADOS EN FERMENTACIONES INDUSTRIALES Pag. 227

Es importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la

estabilidad en su composición química.

Las materias primas mas importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrógeno. Los
carbohidratos son las fuentes de carbono más utilizadas en la industria de la fermentación. Por razones
económicas la glucosa o la sacarosa puras rara vez son utilizadas como única fuente de carbono, excepto
en los procesos que exigen un control exacto de la fermentación.

Las fuentes de carbono pueden ser: Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa,
almidón, dextrina; alcoholes como glicerol y manitol; Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y
otros.

Las fuentes de nitrógeno. Las fuentes de naturaleza inorgánica más comunes son el amoníaco o las sales
de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como ser:

1. Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas
fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, queratina,
harina de soja, algodón, girasol, cacahuate, etc.

2. Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de
acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma.

3. Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo. Los extractos de levadura son
excelentes sustratos para muchos microorganismos.

4. Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada. 5) "Cornsteep", el agua
de maceración de la industria del maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente
esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas.

Acondicionamiento de sustratos. Los objetivos de la preparación y/o acondicionamiento de sustratos

son:
 Evitar el desarrollo de patógenos y alterantes para prolongar la vida del alimento
 Favorecer el desarrollo de los microorganismos deseados
 Hacer accesible el sustrato a los microorganismos que deben llevar a cabo la transformación
 Mejorar la textura, el aroma o el sabor del producto final.
 ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO Pag. 234

Objetivos.
1. Evitar el desarrollo de microorganismos patógenos.
2. Evitar el desarrollo de microorganismos alterantes.
3. Incrementar la reproducibilidad del proceso (rendimiento, pureza y tiempo de producción).
Puntos de control de la esterilidad.
1. Mantener la pureza del inóculo.
2. Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.
3. Esterilizar el material en contacto con el medio (recipiente del fermentador, válvulas, conductos).
4. Esterilizar los gases entrantes y salientes.
5. Mantener las condiciones asépticas durante la manipulación.
6. Construcción apropiada del biorreactor para su esterilización y para la prevención de la contaminación
durante la fermentación.
Es conveniente, al tratar este tema, dar una definición clara del término y de otros relacionados, ya que a
veces suelen producirse confusiones. Esterilización. Significa la eliminación de toda forma de vida de un
medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por
muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía. Esta definición excluye por lo tanto
cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos o atenuación de la
actividad de cualquier tipo.
La palabra desinfección se aplica a la remoción o destrucción por cualquier vía de organismos vivos que
pueden causar daño particular o infección. No significa por lo tanto la destrucción de todos los
microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado. Un
antiséptico es un desinfectante, o sea un agente químico usado para destruir microorganismos dañinos.
Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos.
Asepsia. Es la exclusión continuada de microorganismos contaminantes. Así por ejemplo el cultivo de
microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo asépticamente como en muchas fermentaciones
industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con el
cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones asépticas.
Pasteurización. Es el término aplicado al proceso que se utiliza para la destrucción de algunos de los
microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza.
Consiste en calentar la leche, por ejemplo a 62 °C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y después
enfriarla lo más rápidamente posible. Esta técnica no es de ninguna manera un procedimiento de
esterilización. Es solamente un método para destruir organismos patógenos y al mismo tiempo disminuir
el nivel de aquellos organismos que más pueden deteriorar la leche. Industrial es para evitar la
competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos
específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa y/o
metabolitos específicos.
Métodos de esterilización. Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
a) Por destrucción total de microorganismos. Por destrucción total se entiende un proceso muy
violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicación
de una llama. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por
supuesto ésta metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su empleo.
b) Por muerte o inactivación. La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin
que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por calentamiento, seco o
húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma de vapor
bajo presión, es muy útil y de gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en
autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación.
c) Por eliminación con medio físicos. La eliminación física está restringida a la esterilización de gases
líquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros
fibrosos.

Técnicas de esterilización.

1. Calor húmedo (autoclave o chorro de vapor). 121 ºC, 15 min. 15-17 lb.

2. Calor seco. Para material de vidrio o de acero.

3. Radiación (Rayos X, luz UV y rayos). Solo para equipos que no soporten calor húmedo o seco.

4. Esterilización química con líquidos o gases (desinfectantes). Yodo, Hipoclorito de sodio, etc.

5. Filtración (filtros de superficie o de profundidad). Para gases.

6. Nuevos métodos (altas presiones, campos eléctricos)

FACTORES QUE INFLUYEN EN UN PROCESO FERMENTATIVO Pag. 240

Primer y más importante factor a considerar en un proceso fermentativo industrial:

El oxígeno, porque interviene en el metabolito de las células, y en segundo lugar la Temperatura pues
ésta controla la tasa o velocidad de crecimiento de una población microbiana, así como el metabolismo
interno de las células.

El punto de partida de cualquier fermentación es un recipiente limpio que ha sido esterilizado y

rellenado con el medio de cultivo estéril. Posteriormente, el fermentador se inocula con el
microorganismo adecuado. El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen
total del medio. Si es inferior a esta proporción puede existir un excesivamente prolongado período de
latencia, lo que prolongará el período de fermentación.

Para evitar estos problemas, el proceso de fermentación se lleva a cabo en cuatro etapas:

Etapa I: Preservación del inóculo. La preservación de las cepas de producción a lo largo de un período
de tiempo largo es un requisito básico para una fermentación práctica. El objetivo no es la mera
supervivencia de las cepas. Los microorganismos pueden ser mantenidos viables fácilmente a través de
un período de transferencia, pero lo que debe ser preservado es su capacidad de formar el producto de
interés.

El objetivo de la preservación es, por consiguiente, mantener las cepas durante tanto tiempo como sea
posible sin división celular. Las cepas maestras no deberían ser cultivadas más que una vez cada dos años
controlando los niveles de actividad con cada uso. Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo
periódicamente programas de selección. Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras. Las cepas
de trabajo deben ser inspeccionadas en relación a su pureza y su capacidad de formar producto para
posteriormente ser almacenadas hasta su uso.
Etapa II: Crecimiento del inóculo. El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en
un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas. Las condiciones
utilizadas en el cultivo inicial (composición del medio, temperatura de incubación, etc.) dependerán del
proceso específico.

Etapa III: Precultivo en fermentador. A fin de obtener suficiente inóculo para el fermentador de
producción, deben realizarse precultivos en fermentadores más pequeños. Si un fermentador de
producción se inicia con demasiado poco inóculo, el crecimiento se retrasa y la velocidad de formación
del producto puede ser insatisfactoria. La concentración óptima del inóculo para el fermentador de
producción determina el número de etapas del precultivo de fermentación que son necesarias.

En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo: Actinomicetos: 5-10 % Otras

Bacterias: 0.1-3,0 % Hongos: 5-10 % A veces el medio de cultivo de producción se utiliza en la última
etapa de formación del inóculo a fin de inducir la formación del producto.

Etapa IV: Fermentación de producción. Dependiendo de la fermentación se utilizan biorreactores de

distinto tamaño y no puede darse un esquema general para la inoculación de un fermentador de
producción.

Escalado de inóculos. El escalado es el paso de un procedimiento de laboratorio a un proceso industrial.

De manera ideal se debe iniciar con una colonia aislada (cultivo puro), sobre todo si se trabaja con cepas
modificadas genéticamente.

El escalado de inóculos debe tener los siguientes objetivos:

 Minimizar el número de generaciones para evitar posibles mutaciones

 En cada etapa el inóculo debe ser entre un 5-10% del volumen del anterior inóculo

 Se suelen transferir células que se están desarrollando de manera vigorosa para evitar el alargamiento
de los tiempos de latencia y por lo tanto del proceso

 El cultivo se debe reavivar inicialmente por crecimiento en un cultivo líquido agitado o en un medio
sólido (si se requiere formación de esporas)

 Se suele producir una segunda serie de cultivos para obtener una mayor cantidad de inóculos

 Una parte de este inóculo se transfiere a los fermentadores de planta piloto

 La etapa anterior al fermentador de producción es la más crítica y conviene llevarla a cabo en un

fermentador con control de pH, temperatura y aireación

 La última etapa consiste en pasar al fermentador de producción El escalamiento puede ocurrir en dos
direcciones: Escalamiento hacia arriba. Es cuando se pasa de un proceso de laboratorio a un proceso de
planta piloto y posteriormente a un proceso industrial. Generalmente se utiliza para encontrar nuevos
microorganismos, mejorar cepas de producción, buscar nuevos productos, se estudian mecanismos de
control, y experimentar con sustratos diferentes.

Escalamiento hacia abajo. Es cuando se pasa de un proceso industrial a uno de planta piloto y
finalmente se llega al de laboratorio. Se utiliza para buscar parámetros óptimos para un proceso dado,
encontrar formas de controlar la disipación de calor o la presencia de productos inhibidores, resolver
problemas que se presentan a nivel industrial.

FACTORES FISICOQUIMICOS QUE AFECTAN EL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES.

Pag. 247

Oxígeno. Uno de los factores más críticos en la operación de una fermentación a gran escala es el
suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para
el metabolismo microbiano y el CO2 es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas
muy soluble, ya que una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9mg/L de este gas en
agua. Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente
es más bajo de lo que debería ser en agua pura.

El suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso. Una vez disuelto el
oxígeno, éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula individual. Para ello deben ser
superadas varias resistencias parcialmente independientes:

a. La resistencia dentro de la película de gas a la interfase.

b. La penetración de la interfase entre la burbuja de gas y el líquido.

c. Transferencia desde la interfase al líquido.

d. Movimientos dentro de la solución de nutrientes.

e. Transferencia a la superficie de la célula En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos
unicelulares como bacterias o levaduras, el factor más importante que controla la velocidad de
transferencia es la resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el líquido.

Temperatura. Existen diferentes rangos de temperatura, según el tipo de microorganismos: Psicrófilas:

Son aquellos microorganismos que se desarrollan de manera óptima a rangos de -10-15º C. Mesófilas:
Son aquellos microorganismos que se desarrollan de manera óptima a rangos de 30-40ºC. Termófilas:
Son aquellos microorganismos que se desarrollan de manera óptima de 45-55ºC. 93 Se utilizan algunos
conceptos para clasificar los microorganismos según su temperatura óptima:

Temperatura óptima. Temperatura en la cual el microorganismo puede vivir y se desarrolla óptimamente

y realiza sus funciones de una forma veloz.

Temperatura de sobrevivencia. Temperatura en la cual el microorganismo puede vivir, pero si se le

somete a un tiempo prolongado, va a tender a morir.

Punto térmico de muerte. Es la temperatura mínima que se puede aplicar a un microorganismo para
lograr su extinción.

Tiempo térmico de muerte. Es el tiempo necesario que se debe de aplicar a una temperatura de
muerte.

pH. La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH de 5.5-8.5. Pero durante el
crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar
un cambio en el pH del medio de cultivo. Por lo tanto, se debe controlar el pH del medio de cultivo
añadiendo un ácido o una base cuando se necesite para mantener el pH constante. Por supuesto que
esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de
cultivo sea el mismo en todo el fermentador. La sustancia que se agrega generalmente es un tampón, lo
cuales funcionan a un rango de pH, por lo cual se deben utilizar diferentes tampones dependiendo del
pH que se quiera en el medio. Para pH neutros se utiliza el tampón fosfato. Los ambientes naturales
tienen un rango de pH que oscila entre 5 y 9.

Los microorganismos que crecen a pH inferiores a 5 se denominan acidófilos (Thiobacillus pH: 0,5).

Los microorganismos que crecen a pH superiores a 9 se denominan alcalinófilos (Bacillus pH: 11).

Concentración de inóculo. A una concentración mayor de inóculo propicia la muerte del

microorganismo, debido a que consume más rápidamente el sustrato, propiciando la competencia entre
ellos mismos, por lo tanto no se producirá el producto deseado. Por lo contrario si la concentración de
inóculo es menor, se tendrá una fase estacionaria larga, por lo tanto el proceso fermentativo tenderá
alargarse, el fermentador estará entonces más tiempo trabajando, por lo cual hay más probabilidades
que el producto obtenido se contamine, debido a los mismos metabolitos diferentes que el
microorganismo pueda producir, ya en esas etapas avanzadas del proceso.

Actividad de agua (aw): Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua
del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de
agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR). El valor de la actividad de agua nos da una
idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente.

Agitación. La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una
fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones
líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.
1. La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una
segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua.
2. La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del
metabolismo que precipitan.
3. La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para la eliminación del CO2
o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.
Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los
siguientes efectos en las tres fases:
a. Incrementar la velocidad de transferencia de oxígeno desde las burbujas de aire al medio líquido; los
microorganismos no pueden utilizar oxígeno gaseoso, sino solamente el que se encuentra en disolución.
b. Aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno y nutrientes desde el medio a las células. Debido al
movimiento se evita que las células creen áreas estancadas con bajos niveles de oxígeno y nutrientes.
c. Impedir la formación de agregados celulares.
d. Aumentar la velocidad de transferencia de productos metabólicos de las células al medio. Aumentar la
tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeración del
fermentador.

Exposiciones:
EQ.1 TIPOS DE FERMENTADORES

Que tipos de fermentadores industriales existen: Tanque agitado, Columna, Biorreactor air lift,
Biorreactor Biocon, Propelas y Jet.

EQ.2 ACCESORIOS DE UN FERMENTADOR:

Camisas de refrigeración, chaquetas o serpentines; dispositivos de agitación, deflectores, manómetro,

válvulas de seguridad, válvulas de control, control de temperatura, control de PH, control de espumas,
puntos de muestreo, tuberías.

¿Cuáles son las propiedades mas comunes que se miden en un biorreactor?

Temperatura, PH, flujo de aire, presión, intensidad de agitación, nivel o volumen del medio de cultivo,
espuma, concentración de oxígeno disuelto, concentración celular, concentración del sustrato o
producto.

EQ. 3 PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACION DE UN FERMENTADOR

El éxito de un proceso fermentativo industrial implica el tener cultivos libres de contaminantes en todas
y cada una de sus etapas, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de producción. De esta
manera, se hace necesario esterilizar el fermentador y sus aditamentos y el medio de cultivo antes de la
inoculación así como el aire y los aditivos que se suministran durante la fermentación. El fermentador
puede esterilizarse (provocando la muerte total de los microorganismos contaminantes) utilizando algún
agente letal como el calor, radiación o algún producto químico o mediante la filtración para separar
organismos viables.

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se esterilizan en volúmenes discontinuos en el

biorreactor a una temperatura de 121 °C y los tiempos se calculan a partir de la naturaleza del medio y
del tamaño del fermentador considerando un tiempo adicional para el esterilizado de electrodos,
válvulas y uniones del fermentador.

Se pueden llevar acabo diferentes procedimientos para eliminar microorganismos no deseados de los
procesos fermentativos, dentro de los más utilizados son los que se mencionan a continuación:

1. Esterilización térmica. Antes de comenzar la fermentación, el medio de cultivo y el equipo deben

esterilizarse para que el microorganismo requerido pueda ser introducido y que crezca sin
contaminación o competencia. El método de esterilización más frecuente empleado consiste en calentar
a una temperatura suficientemente elevada para matar los microorganismos vivos y mantener esa
temperatura un tiempo suficiente para conseguir la esterilidad, enfriando después a la temperatura de
cultivo. Puesto que la velocidad de muerte del microorganismo aumenta con el aumento de
temperatura, cuanto mayor sea menor será el tiempo requerido para la esterilización. El tiempo lo
determina el tipo de microorganismo, que tan resistente sean sus esporas a cierta temperatura. En el
laboratorio, el método estándar de esterilización es: 120ºC de calor húmedo durante 15 minutos, ó
160ºC de calor seco durante 1 hora.

2. Esterilización sin calor. Cuando se utilizan materiales que pueden ser destruidos por el calor de
esterilización, se deben emplear otros métodos alternativos. El medio nutritivo puede contener
componentes que se destruyen o sufran reacciones no deseables a temperaturas de esterilización, al
mismo tiempo que algunos componentes de la instalación pueden verse afectados por las elevadas
temperaturas, o bien los ciclos repetitivos de calentamiento y enfriamiento. Los líquidos, que no lleven
partículas sólidas en suspensión pueden esterilizarse pasándolos a través de filtros que tengan un
tamaño de poro suficientemente pequeño para que puedan ser atrapados los microorganismos del
líquido. La esterilización por filtración elimina todas las partículas mayores de un determinado tamaño,
así como también los microorganismos vivos como muertos, mientras que las esterilizaciones por calor
solamente los microorganismos vivos dejando los restos.

EQ.4 PROCESOS DOWNSTREAM

El desarrollo de una fermentación industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por sus
nombres en inglés, procesos upstream y procesos downstream.

Los procesos upstream comprenden la selección y preparación del microorganismo, la preparación del
medio de cultivo y de las condiciones de fermentación (cultivo).

Los procesos downstream incluyen la purificación del producto y el tratamiento de los residuos de la
fermentación, denominados procesos de bioseparación. Los procesos de bioseparación involucran la
recuperación y purificación de productos que provienen del fermentador, comprenden todos los
tratamientos que requiere el caldo de cultivo para obtener el producto en las condiciones deseadas. Las
operaciones de bioseparación para un proceso deben seleccionarse cuidadosamente ya que cuando se
hace de manera apropiada, se tiene un fuerte impacto en el éxito del proceso.

Elementos que intervienen en un Metabolito de fermentación. Mapa mental pag. 267

Recuperación y separación:

Métodos de separación: Extracción, Destilación, Cristalización, Ultrafiltración, filtración, ósmosis inversa,

adsorción, Diálisis, Cristalización, electrodiálisis, Membranas líquidas y otros.

Pasos para la recuperación: Remoción de insolubles y Ruptura celular.

1. Remoción de insolubles: Centrifugación (para levaduras y bacterias) y Filtración (para hongos).

2. Remoción celular: Métodos químicos y mecánicos.

Concentración: Extracción y Adsorción.

1. Extracción: Por medio de un solvente o usando un equipo (extractores por lotes o extractores
continuos)

2. Adsorción: hay varios tipos como física, iónica, hidrofóbica y afinidad.

Purificación: Precipitación, cromatografía, ultrafiltración y Electroforesis.

Caracterización: se debe tomar en cuenta los siguientes factores para el producto que se va a elaborar.

1. Estructura pared celular.

2. Sistemas celulares de secreción
3. Métodos de rompimiento celular.
 4. Métodos de permeabilización celular.

Métodos de rompimiento celular:

Métodos químicos: Choque osmótico, disolución lipídica, digestión enzimática y tratamiento alcalino.
Métodos mecánicos: Molienda húmeda y homogeneización.
Métodos de permeabilización celular: Molienda, homogenización, ultrasonido, congelación y
descongelación, detergentes, tratamientos ácidos o con solventes orgánicos y liofilización.
Métodos Biológicos: Tratamientos enzimáticos.