Rev Argent Microbiol.

2016;48(3):252---258

REVISTA ARGENTINA DE
MICROBIOLOGÍA
www.elsevier.es/ram

ORIGINAL

Estimación de la biomasa fúngica en un suelo del

sudoeste de la provincia de Buenos Aires (Argentina)
con una tinción directa con blanco de calcoflúor
María B. Vázquez a,∗ , Martín R. Amodeo b y María V. Bianchinotti a,c

a
CERZOS-CONICET, CCT-Bahía Blanca, Centro de Recursos Renovables de la Zona Semiárida, Centro Científico Tecnológico
Bahía Blanca, Bahía Blanca, Buenos Aires, Argentina
b
GEKKO, Grupo de Estudios en Conservación y Manejo, Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca, Argentina
c
Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca, Argentina

Recibido el 14 de enero de 2016; aceptado el 31 de mayo de 2016

Disponible en Internet el 8 de septiembre de 2016

PALABRAS CLAVE Resumen Los microorganismos del suelo son vitales para el correcto funcionamiento de los
Biomasa fúngica; ecosistemas, principalmente por su papel en el ciclado de nutrientes. La intensificación del uso
Región pampeana; del suelo y las prácticas agrícolas alteran negativamente la actividad microbiana. La biomasa
Calcoflúor; fúngica es uno de los parámetros más utilizados para estudiar el impacto de las actividades
Epifluorescencia agrícolas en la estructura y el funcionamiento del suelo. El objetivo del presente trabajo fue
estimar la biomasa fúngica en un suelo del sudoeste bonaerense con el fin de obtener valores
de referencia que permitan usar este parámetro como un indicador de cambios en el ecosis-
tema y, por otro lado, demostrar que la metodología empleada es sensible a las variaciones en
las condiciones climáticas. Se colectaron muestras de suelos durante 2 años consecutivos. Se
prepararon frotis de suelo y se tiñeron con soluciones de distintas concentraciones de blanco
de calcoflúor y luego se estimó la biomasa fúngica observando los frotis con microscopio de epi-
fluorescencia. Los valores de biomasa fúngica estimados variaron entre 2,23 y 26,89 ␮g Cfúngico /g
de suelo y estuvieron dentro del rango esperable para el tipo de suelo estudiado. La biomasa
fúngica mostró una relación positiva con la temperatura y las precipitaciones. La metodología
empleada resultó ser confiable, repetible y sensible a cambios en las condiciones climáticas.
Los resultados podrían usarse como valores de referencia para estudiar la biomasa fúngica de
suelos bajo distintas condiciones y emplearse como indicadores del impacto de las distintas
prácticas agrícolas sobre el ecosistema.
© 2016 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un
artı́culo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).

∗ Autor para correspondencia.

Correo electrónico: mbvazquez@criba.edu.ar (M.B. Vázquez).

http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.05.006
0325-7541/© 2016 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artı́culo Open Access bajo la
licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Estimación indirecta de biomasa fúngica en suelo 253

KEYWORDS Fungal biomass estimation in soils from southwestern Buenos Aires province
Fungal biomass; (Argentina) using calcofluor white stain
Argentinean pampas;
Calcofluor; Abstract Soil microorganisms are vital for ecosystem functioning because of the role they play
Epifluorescence in soil nutrient cycling. Agricultural practices and the intensification of land use have a negative
effect on microbial activities and fungal biomass has been widely used as an indicator of soil
health. The aim of this study was to analyze fungal biomass in soils from southwestern Buenos
Aires province using direct fluorescent staining and to contribute to its use as an indicator of
environmental changes in the ecosystem as well as to define its sensitivity to weather condi-
tions. Soil samples were collected during two consecutive years. Soil smears were prepared and
stained with two different concentrations of calcofluor, and the fungal biomass was estimated
under an epifluorescence microscope. Soil fungal biomass varied between 2.23 and 26.89 ␮g
fungal C/g soil, being these values in the range expected for the studied soil type. The fungal
biomass was positively related to temperature and precipitations. The methodology used was
reliable, standardized and sensitive to weather conditions. The results of this study contribute
information to evaluate fungal biomass in different soil types and support its use as an indicator
of soil health for analyzing the impact of different agricultural practices.
© 2016 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an
open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).

Introducción partir de suspensiones homogenizadas de muestras de agua

y suelo8 .
Los microorganismos del suelo (bacterias y hongos) son una La investigación de los hongos en el suelo presenta una
parte fundamental en ese ecosistema, ya que participan dificultad adicional, debido a que pequeñas partículas com-
activamente en el ciclado de los nutrientes y en la descom- ponentes de suelo, como arcillas o clastos, interfieren en
posición de la materia orgánica muerta21,24 . Más del 50% de la observación de las muestras. Además de la compleji-
la biomasa microbiana del suelo está constituida por hongos, dad inherente al suelo, las hifas tienen una distribución
los cuales, además de su importancia como degradadores, heterogénea en ese ambiente, esto implica que un manejo
contribuyen al mantenimiento de la estructura y la humedad inadecuado de la muestras puede resultar en estimaciones
de ese medio, con lo que se previene su erosión21 . erróneas24 .
La productividad de un sistema agrícola está fuertemente La microscopia de fluorescencia se ha usado con
relacionada con la actividad microbiológica del suelo43 . A su éxito para realizar estimaciones de biomasa fúngica y
vez, la intensificación del uso del suelo y las prácticas agrí- a menudo ha llevado a mejores resultados que otras
colas alteran negativamente la actividad microbiana en el técnicas2,8,24,28 . El principio para realizar las estimaciones
suelo4,31,41 . Por ende, el estudio de la biomasa y la activi- de biomasa fúngica en suelo utilizando microscopia de
dad microbiana del suelo es relevante para comprender el fluorescencia es muy sencillo: un volumen conocido de
impacto que las actividades agrícolas tienen sobre la estruc- suspensión de suelo se monta sobre un área conocida
tura y el funcionamiento del ecosistema4 . de un portaobjetos y luego la muestra se tiñe con un
El estudio de los hongos provenientes de muestras colorante fluorescente seleccionado en función del tipo
medioambientales es complejo, en parte porque las técni- de muestra y del objetivo del estudio8 . Existen distintos
cas convencionales basadas en el uso de medios de cultivo protocolos para realizar estimaciones de biomasa fún-
son consideradas insuficientes a partir de un análisis exhaus- gica en muestras de suelo empleando microscopia de
tivo de tales muestras. Muchos hongos son incapaces de fluorescencia acoplada a tinciones específicas8,22,30,35,40 .
crecer en condiciones de laboratorio o solo una pequeña Entre los colorantes más usados para evidenciar hifas
fracción, inferior al 1%, es cultivable. Por ello, si bien las fúngicas está el blanco de calcoflúor (5-[[4-anilino-6-
técnicas dependientes del cultivo fueron las preferidas en [bis(2-hydroxyethyl)amino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-2-
el pasado, en la actualidad se considera que por sí solas son [(E)-2-[4-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-1,3,5-
insuficientes, ya que brindan información sesgada sobre la triazin-2-yl]amino]-2-sulfophenyl]ethenyl]benzenesulfonic
diversidad y biomasa fúngica del suelo26 . En consecuencia, acid), conocido comercialmente como Calcofluor White,
la búsqueda de metodologías que permitan lograr estimacio- Fluorescent Brightener 28 o Tinopal. Este fluorocromo
nes de biomasa confiables, independizándose del cultivo de tiñe las paredes celulares, haciéndolas lucir de color azul
los microorganismos, es relevante. Algunas técnicas propo- brillante cuando son observadas con epifluorescencia.
nen la cuantificación indirecta estimando parámetros como Debido a que esta metodología es fácilmente aplicable,
respiración y actividad enzimática o por medio de técnicas tiene bajo costo y puede emplearse sobre muestras fijadas,
moleculares. Por otro lado, se han desarrollado metodolo- muchos laboratorios han comenzado a utilizarla para la
gías basadas en conteo directo de los microorganismos a observación y el recuento de hongos a partir de muestras
254 M.B. Vázquez et al.

de suelo2,10,12,25 . Esta metodología brinda estimaciones Preparación y tinción de los frotis de suelo
confiables y reproducibles que son comparables con las
realizadas utilizando otras técnicas indirectas2 . Se utilizó una modificación de la técnica de Bloem y Vos8 .
En Argentina, las primeras investigaciones relativas Para preparar los frotis de suelo se utilizaron portaobjetos
a los hongos del suelo fueron realizadas hace más de de inmunofluorescencia de 11 mm de diámetro de campo
30 años empleando exclusivamente técnicas dependientes (LabSud, Argentina). Se colocó una alícuota de 20 ␮l de la
de cultivo13-15,18,20 . Con el advenimiento de las técnicas suspensión de suelo (50 mg/ml) en el centro del campo y
independientes del cultivo, las investigaciones se comple- se dejó secar completamente a temperatura ambiente. Las
mentaron con el empleo de alguna de ellas, por ejemplo, muestras se sembraron por cuadruplicado.
la estimación de biomasa a través de la actividad enzimá- Las soluciones de blanco de calcoflúor empleadas (2,5%
tica o la cuantificación del contenido de ergosterol en el y 5%) (Fluorescent Brigthener 28, Sigma-Aldrich Argentina,
suelo realizadas por Aon et al.3 , Bórtoli et al.11 y Gaspar C40 H44 N12 O10 S2 ) se prepararon disolviendo completamente
et al.19 . En la última década se popularizó el uso exclusivo el colorante en 5 ml de NaOH al 10% (v/v) durante unos
de metodologías independientes del cultivo, como la cuan- minutos. Luego se llevaron a un volumen final de 100 ml con
tificación del contenido de ácidos grasos del suelo empleada etanol al 50%, se filtraron a través de un filtro de membrana
por Montecchia et al.27 y Vargas Gil et al.37 . de 0,2 ␮m diámetro (Whatman) y se conservaron a 4 ◦ C en
Hasta la fecha, el blanco de calcoflúor no había sido oscuridad.
empleado para cuantificar la biomasa fúngica en el suelo en Los frotis de suelo se colocaron sobre papel absorbente
Argentina. El objetivo del presente trabajo fue estimar la húmedo y a partir de ese momento se mantuvieron en oscuri-
biomasa fúngica en un suelo del sudoeste de la provincia de dad. Las hifas fúngicas se tiñeron colocando 50 ␮l de solución
Buenos Aires utilizando una tinción específica con blanco de de calcoflúor sobre cada frotis durante una hora. Luego, se
calcoflúor acoplada a microscopia de fluorescencia, con el eliminó el exceso de colorante realizando 3 lavados de 5 min
fin de obtener valores de referencia que permitan usar este con etanol al 50% y por último un lavado de un minuto en
parámetro como un indicador de cambios en el ecosistema. agua destilada. Luego del lavado, los preparados se deja-
Asimismo, se intentó demostrar que la técnica empleada es ron escurrir y se conservaron en oscuridad a 4 ◦ C hasta un
suficientemente sensible para detectar las variaciones en máximo de 60 días.
la biomasa fúngica del suelo atribuibles a cambios en las
condiciones climáticas.
Recuento de las hifas fúngicas
Materiales y métodos Los frotis de suelo se montaron con una gota de aceite de
inmersión de baja fluorescencia (Cicarelli, Argentina), sobre
Muestras de suelo la que se colocó el cubreobjetos. Las observaciones se reali-
zaron con un microscopio Nikon Eclipse (objetivo 20X, filtro
Las muestras de suelo fueron recolectadas de una parcela sin de excitación BP 340-380 nm, divisor de haz 400 nm y fil-
historia de uso agrícola ubicada en la estación experimental tro barrera LP 430 nm).
Colonia Napostá, perteneciente a la Universidad Nacional
del Sur, provincia de Buenos Aires, Argentina (38◦ 29 56
Cálculos y estimaciones
S; 62◦ 17 36 O). El suelo estudiado fue un haplustol típico
con bajo contenido de materia orgánica (< 2%). Se realiza-
ron 4 muestreos por año, entre los meses de mayo y junio, La longitud total de hifas fúngicas (H) se estimó utilizando el
durante 2 años consecutivos (2010 y 2011). En cada muestreo método de intersección1 . Se usó la fórmula: H = I ×  × 2L A
;
se tomaron 4 muestras del horizonte superficial del suelo (0- donde I es el número de intersecciones por grilla; A es el área
10 cm). Las muestras se colocaron en bolsas de polietileno de la grilla, y L es la longitud de las líneas de la grilla, para
estériles y se mantuvieron a 4 ◦ C; se procesaron dentro de las calcular la longitud de hifas en la grilla. Luego se calculó la
24 h posteriores a la recolección, para evitar los efectos del  dehifas por gramo de suelo (F) como F = H ×
longitud total
almacenamiento sobre la comunidad microbiana29 . Los datos 10−6 × AB × 1S donde H es la longitud total de hifas en la
meteorológicos fueron tomados de la estación meteoroló- grilla; A es el área del frotis; B es el área de la grilla, y S es la
gica perteneciente al CERZOS, ubicada en el CCT-CONICET cantidad de suelo en el frotis. El biovolumen de hifas  fúngi- 
Bahía Blanca, Argentina. Se analizaron la temperatura y la cas por gramo de suelo (V) se estimó como V = 4 W2 F − W3 ,
precipitación durante los períodos de muestreo y se calculó donde W es el ancho promedio de las hifas fúngicas (según
la temperatura promedio y las precipitaciones acumuladas Bloem y Vos8 ). A partir de V se estimó el contenido de car-
durante los 7 días previos a cada fecha de muestreo. bono fúngico por gramo de suelo  como Cfúngico /g de suelo =
V × 1, 3 × 10−13 g Cfúngico /␮m3 utilizando un valor de car-
bono específico tomado de la literatura1 .
Suspensiones de suelo

Se realizaron diluciones seriadas de las muestras de suelo Análisis estadístico

utilizando solución salina estéril (0,4 g MgSO4 [H2 O]7 ; 0,02 g
FeSO4 [H2 O]7 ; 0,2 g K2 HPO4 ; 0,2 g [NH4 ]2 SO4 ; 0,08 g CaSO4 ; Se realizó una regresión múltiple entre los valores promedio
1000 ml H2 O destilada). Las suspensiones con 50 mg de de biomasa correspondientes a cada fecha de muestreo con
suelo/ml se fijaron con formol al 37% y se conservaron a el valor de temperatura y precipitación. Se realizaron Q-Q
4 ◦ C en oscuridad. plots y análisis de residuales para verificar el cumplimiento
Estimación indirecta de biomasa fúngica en suelo 255

Figura 1 Frotis de suelo teñidos con solución de calcoflúor al

5%. Las flechas indican hifas fúngicas, el círculo marca un cristal
de calcoflúor.

de los supuestos del análisis. Para los cálculos y gráficos se

utilizaron los paquetes stats, gridExtra y ggplot2 del soft-
ware R17 .

Resultados

La intensidad de la fluorescencia en los frotis se mantuvo

sin alteraciones hasta 60 días luego de la tinción. Si bien
se observó tinción en los frotis teñidos con ambas concen-
traciones de colorante (2,5% y 5%), con la solución al 5%
de calcoflúor se obtuvo una elevada tinción de fondo y se Figura 2 Frotis de suelo teñidos con solución calcoflúor al
observaron grandes cristales de colorante, que dificultaron 2,5%. a) Detalle de un frotis con numerosas partículas de suelo.
la identificación de las hifas fúngicas (figura 1). Los frotis b) Hifa fúngica teñida correctamente. c) Pequeños fragmentos
teñidos con la solución al 2,5% de calcoflúor presentaron una de hifas. Las flechas indican las hifas fúngicas.
tinción de fondo muy baja, con pequeños cristales del colo-
rante. Las hifas presentaban un color azul brillante, y si bien
diversas partículas de suelo se tiñeron junto con las hifas, al
haber menor tinción de fondo las estructuras fúngicas fueron semana previa a los muestreos fueron mayores en la tem-
fácilmente distinguibles (figura 2). porada 2011 (F[1,6] = 12,8, p < 0,05). Para el caso de las pre-
La biomasa fúngica estimada tuvo un mínimo de cipitaciones acumuladas la semana previa a cada muestreo,
2,23 ␮g Cfúngico /g de suelo y un máximo de 26,89 ␮g Cfúngico /g no se hallaron diferencias significativas (F[1,6] = 0,02, p > 0,8).
de suelo, ambos valores registrados durante el año 2011. La Sin embargo, se registró en la temporada 2011 un valor de
biomasa fúngica promedio estimada del año 2010 varió entre precipitación extremo antes del tercer muestreo del año. El
4,35 y 7,92 ␮g Cfúngico /g de suelo y la del año 2011, entre 4,75 análisis de regresión mostró que el valor de biomasa fúngica
y 20,8 ␮g Cfúngico /g de suelo. estimada presenta una relación positiva significativa con las
El análisis de las variables climáticas de los períodos de 2 variables ambientales analizadas, temperatura y precipi-
estudio reveló que los valores de temperatura registrados la taciones (F[3,4] = 13,07, p = 0,015, R2 = 0,907), y que existe a
256 M.B. Vázquez et al.

embargo, aún no había sido empleado con dicho propósito

en Argentina.
En el presente trabajo se propusieron modificaciones
al protocolo original, que vuelven a la técnica fácilmente
aplicable y apta para trabajar con grandes volúmenes de
muestras y con los insumos disponibles en nuestro país. El
colorante calcoflúor comercializado en la Argentina es una
formulación sin sodio distinta de la indicada en la técnica
original por Bloem y Vos8 . La variación en la formulación quí-
mica del colorante fue compensada con la adición de NaOH y
los cristales de colorante se disolvieron completamente, con
lo que se logró una tinción pareja en los frotis de suelo. A su
vez, la concentración del colorante utilizado para realizar
las tinciones fue menor que la recomendada previamente.
Los resultados de este trabajo mostraron que en los frotis
de suelo teñidos con soluciones de calcoflúor al 2,5% la tin-
ción fue más pareja y se obtuvo menor tinción de fondo
y menor cantidad de cristales de calcoflúor sin disolver. El
empleo de altas concentraciones de colorante fluorescente
Figura 3 Relación entre la biomasa fúngica del suelo, la tem- puede ocasionar una elevada tinción de fondo, que dificulta
peratura y las precipitaciones acumuladas. R2 = 0,907. la observación de los preparados42 y genera un sesgo en las
estimaciones39 .
Los frotis de suelo teñidos se conservaron sin montar y
su vez una interacción significativa entre las variables pre-
aun con esta modificación la intensidad de la fluorescencia
dictivas (F[1:4] = 4,73, p < 0,1) (figura 3).
y la tinción de fondo se mantuvieron sin variaciones luego
de 60 días de almacenamiento. En concordancia con nues-
Discusión tros resultados, estos parámetros también se mantuvieron
constantes por un período similar en otros trabajos ya publi-
Existen distintos métodos para estimar la biomasa fúngica, cados, pero con los preparados montados y sellados8 . Esta
pero la aplicación de ninguno de ellos ha mostrado ser variación vuelve a la técnica más ágil y a la vez disminuye
eficiente bajo una amplia gama de suelos y condiciones el tiempo de manipulación de los preparados, lo cual evita
climáticas38 . Las técnicas moleculares se pueden aplicar su exposición y la posible disminución en la intensidad de la
en la mayoría de los suelos y son ampliamente utilizadas fluorescencia por contacto con la luz.
para estimar la diversidad fúngica del suelo, pero no brin- La magnificación utilizada para la observación de los pre-
dan información sobre la biomasa microbiana2 . Por otro parados fue menor que la propuesta en la técnica original.
lado, las estimaciones de biomasa microbiana del suelo La biomasa fúngica del suelo está estrechamente relacio-
empleando observaciones microscópicas implican procedi- nada con las condiciones ambientales y la abundancia de
mientos más laboriosos que las técnicas indirectas, como la recursos, en especial materia orgánica24 ; por ello, en suelos
cuantificación de la respiración29 , pero permiten diferenciar de regiones semiáridas, como los aquí estudiados, la densi-
y cuantificar la biomasa fúngica independientemente de la dad de hifas es generalmente baja. Bloem y Vos8 mencionan
bacteriana. que al observar los preparados con una magnificación muy
Este es el primer trabajo de Argentina que utiliza la tin- elevada, existe la probabilidad de subestimar la biomasa,
ción con blanco de calcoflúor acoplada a la microscopia ya que muchos de los campos observados estarían vacíos.
de epifluorescencia para estimar la biomasa fúngica en un En el presente estudio se usó una magnificación menor que
suelo. Los valores de biomasa fúngica estimados en el suelo la recomendada, precisamente para disminuir ese riesgo de
estudiado estuvieron dentro del rango de los observados subestimación.
en diversos suelos agrícolas, con un contenido de materia La biomasa fúngica mostró una relación positiva con la
orgánica similar o aun mayor2,16,24,32,36 . temperatura y las precipitaciones. Se observaron resultados
Al ser una metodología bastante reciente, todavía no ha similares en otras investigaciones, en las que se destaca la
sido empleada en distintos tipos de suelos; por ello aún no marcada influencia de las condiciones climáticas sobre la
son suficientes los trabajos existentes como para realizar actividad fúngica5-7,9,33,34 . El suelo es un sistema muy com-
comparaciones vis a vis de los resultados obtenidos en suelos plejo en el que los procesos físicos, químicos y biológicos
con características similares. A pesar de esto, los resultados están interrelacionados y son fuertemente influenciados por
estuvieron dentro del rango de los publicados en la literatura factores ambientales.
utilizando técnicas comparables2,12 . En conclusión, los resultados del presente estudio mos-
El blanco de calcoflúor, por su alta especificidad, es uno traron que la metodología empleada resultó ser una técnica
de los fluorocromos más usados en estudios de morfología y confiable, reproducible y sensible a cambios en las condi-
desarrollo de hongos23 . El calcoflúor tiñe de color azul las ciones climáticas. Las estimaciones de la biomasa fúngica
paredes celulares con quitina, celulosa y otros polisacári- total registradas en el suelo estudiado son compara-
dos con uniones ß 1,4. Su uso para estimar biomasa fúngica bles con las obtenidas aplicando otras técnicas de mayor
en muestras de suelo fue propuesto por Bloem y Vos8 ; sin complejidad.
Estimación indirecta de biomasa fúngica en suelo 257

Responsabilidades éticas 12. Busse MD, Sanchez FG, Ratcliff AW, Butnor JR, Carter EA, Powers
RF. Soil carbon sequestration and changes in fungal and bacte-
Protección de personas y animales. Los autores declaran rial biomass following incorporation of forest residues. Soil Biol
Biochem. 2009;41:220---7.
que para esta investigación no se han realizado experimen-
13. Cabello M. Micoflora del suelo de la región interserrana (Partido
tos en seres humanos ni en animales. de Coronel Suárez, Provincia de Buenos Aires). Boletín Sociedad
Argentina Bot. 1983;22:7---20.
Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que en 14. Cabello M. Análisis de la metodología empleada en el aisla-
este artículo no aparecen datos de pacientes. miento de hongos en suelos de la región interserrana (Partido
de Coronel Súarez). Ciencia del Suelo. 1986;2:225---9.
Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los 15. Cabello M, Arambarri A. Diversity in soil fungi from undistur-
autores declaran que en este artículo no aparecen datos de bed and disturbed Celtis tala and Scutia buxifolia forests in
pacientes. the eastern Buenos Aires province (Argentina). Microbiol Res.
2002;157:115---25.
16. De Vries FT, Bloem J, van Eekeren N, Brusaard L, Hoffland E.
Financiación Fungal biomass in pastures increases with age and reduced N
input. Soil Biol Biochem. 2007;39:1620---30.
Este trabajo fue parcialmente financiado a través del 17. di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini MG, Gonzalez L,
proyecto PICT-FONCYT (PICT-07/00380). Los autores María Tablada M, Robledo CW. Infostat Software versión Univer-
Belén Vázquez y Martín Raúl Amodeo tienen una beca de sidad Nacional de Córdoba, Córdoba, 2012. Disponible en:
investigación otorgada por CONICET. http://www.infostat.com.ar/.
18. Gasoni L, Rimólo M. Evolución de la microflora en campos ane-
gables de la pampa deprimida. Cienc Suelo. 1983;2:97---103.
Conflicto de intereses 19. Gaspar ML, Cabello MN, Pollero R, Aon MA. Fluorescein dia-
cetate hydrolysis as a measure of fungal biomass in soil. Curr
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Microbiol. 2001;42:339---44.
20. Godeas A. Estudios cuali y cuantitativos de los hongos del suelo
del bosque de Nothofagus dombeyi. Cienc Suelo. 1983;1:21---31.
Bibliografía 21. Hagn A, Pritsch K, Schloter M, Munch JC. Fungal diversity in
agricultural soil under different farming management systems,
1. Alef K, Nannipieri P. Methods in applied soil microbiology and with special reference to biocontrol strains of Trichoderma spp.
biochemistry. Academic Press: New York; 1995. Biol Fert Soils. 2003;38:236---44.
2. Aleixo AP, Kaschuk G, Alberton O. Soil fungal and bacterial 22. Hieber M, Gessner MO. Contribution of stream detrivores, fungi,
biomass determined by epifluorescence microscopy and mycorr- and bacteria to leaf breakdown based on biomass estimates.
hizal spore density in different sugarcane managements. Cienc Ecology. 2002;83:1026---38.
Rural. 2014;44:588---94. 23. Hoch H, Galvani C, Szarowski D, Turner J. Two new fluorescent
3. Aon M, Cabello M, Sarena D, Colaneri A, Franco M, Burgos dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia.
J, Cortassa SI. Spatio-temporal patterns of soil microbial and 2005;97:580---8.
enzymatic activities in an agricultural soil. Appl Soil Ecol. 24. Klein D, Paschke M. Filamentous fungi: The indeterminate
2001;18:239---54. lifestyle and microbial ecology. Microbial Ecol. 2004;47:
4. Arshad MA, Martin S. Identifying critical limits for soil 224---35.
quality indicators in agro-ecosystems. Agr Ecosyst Environ. 25. Li Y, Dick WA, Tuovinen OH. Fluorescence microscopy for visua-
2002;88:153---60. lization of soil microorganisms ----a review. Biol Fert Soils.
5. Barbaruah B, Chutia M, Boruah P. Soil hyphomycetes population 2004;39:301---11.
dynamics in disturbed and undisturbed tropical soils of North- 26. Lorch H, Benckieser G, Ottow J. Basic methods for counting
eastern India. Afr J Microbiol. 2012;6:5344---52. microorganisms in soil and water. Methods Appl Soil Microbiol
6. Bardgett RD, Lovell RD, Hobbs PJ, Jarvis SC. Seasonal chan- Biochem. 1995;14:6---61.
ges in soil microbial communities along a fertility gradient of 27. Montecchia MS, Correa OS, Soria MA, Frey SD, García AF, Gar-
temperate grasslands. Soil Biol Biochem. 1999;31:1021---30. land JL. Multivariate approach to characterizing soil microbial
7. Bateman G, Murray G. Seasonal variations in populations communities in pristine and agricultural sites in Northwest
of Fusarium species in wheat-field soil. Appl Soil Ecol. Argentina. Appl Soil Ecol. 2011;47:176---83.
2001;18:117---28. 28. Nielsen MN, Winding A. Microorganisms as indicators of soil
8. Bloem J, Vos A. Fluorescent staining of microbes for total health, NERI Technical Report No. 388. Denmark, Ministry of the
direct counts. En: Kowalchuk GA, de Bruijn FJ, Head IM, Akker- Environment, National Environmental Research Institute, 2002.
mans ADL, van Elsas JD, editores. Molecular microbial ecology 29. Paul EA. Soil microbiology, ecology and biochemistry. Burling-
manual. 2nd ed. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers; 2004. ton: Academic Press Elsevier Inc; 2006.
p. 861---73. 30. Ploem J, Tanke H. Introduction to fluorescence microscopy.
9. Boddy L, Büntgen U, Egli U, Gange AC, Heegaard E, Kirk PM, Oxford: Oxford University Press; 1987.
Mohammad A, Kauserud H. Climate variation effects on fungal 31. Qin H, Wang H, Strong PJ, Li Y, Xu Q, Wu Q. Rapid soil
fruiting. Fungal Ecol. 2014;10:20---33. fungal community response to intensive management in a bam-
10. Bölter M, Bloem J, Meiners K, Möller R. Enumeration and boo forest developed from rice paddies. Soil Biol Biochem.
biovolume determination of microbial cells ----a methodologi- 2014;68:177---84.
cal review and recommendations for applications in ecological 32. Scheu S, Parkinson D. Changes in bacterial and fungal biomass
research. Biol Fert Soils. 2002;36:249---59. C, bacterial and fungal biovolume and ergosterol content after
11. Bórtoli P, Verdenelli R, Conforto C, Vargas Gil S, Meriles J. drying, remoistening and incubation of different layers of cool
Efectos del herbicida glifosato sobre la estructura y el fun- temperate forest soils. Soil Biol Biochem. 1994;26:1515---25.
cionamiento de comunidades microbianas de dos suelos de 33. Schneider T, Gerrits B, Gassmann R, Schmid E, Gessner
plantaciones de olivo. Ecol Austral. 2012;22:33---42. MO, Richter A, Riedel K. Proteome analysis of fungal and
258 M.B. Vázquez et al.

bacterial involvement in leaf litter decomposition. Proteomics. of ectomycorrhizal mycelium in forests soils ----A review. Soil Biol
2010;10:1819---30. Biochem. 2013;57:1034---47.
34. Talley SM, Coley PD, Kursar TA. The effects of weather on fungal 39. Weinbauer MG, Beckmann C, Höfle MG. Utility of green fluores-
abundance and richness among 25 communities in the Inter- cent nucleic acid dyes and aluminum oxide membrane filters for
mountain West. BMC Ecology. 2002;2:7. rapid epifluorescence enumeration of soil and sediment bacte-
35. Taylor D, Salmon E. Basic fluorescence microscopy. En: Wang ria. Appl Environ Microbiol. 1998;64:5000---3.
YL, Taylor DL, editores. Methods in cell biology Vol. 29. Fluo- 40. Wijnand E, Blomquist G, Nielsen BH, Heldal KK. Recognition
rescence microscopy of living cells in culture Part A. San Diego: errors in the quantification of micro-organisms by fluorescence
Academic Press Inc; 1989. microscopy. Ann Occup Hyg. 2001;45:493---8.
36. Van der Wal A, van Veen JA, Smant W, Boschker HT, Bloem 41. Williamson WM, Wardle DA, Yeates GW. Changes in soil micro-
J, Kardol P, de Boer W. Fungal biomass development in bial and nematode communities during ecosystem decline
a chronosequence of land abandonment. Soil Biol Biochem. across a long-term chronosequence. Soil Biol Biochem.
2006;38:51---60. 2005;37:1289---301.
37. Vargas Gil S, Meriles J, Conforto C, Basanta M, Radl V, Hagn A, 42. Yu W, Dodds WK, Banks MK, Skalsky J, Strauss EA. Optimal
March GJ. Response of soil microbial communities to different staining and sample storage time for direct microscopic enume-
management practices in surface soils of a soybean agroecosys- ration of total and active bacteria in soil with two fluorescent
tem in Argentina. Eur J Soil Biol. 2011;47:55---60. dyes. Appl Environ Microb. 1995;61:3367---72.
38. Wallander H, Ekblad A, Godbold D, Johnson D, Bahr A, Baldrian 43. Zhang W, Ricketts TH, Kremen C, Carney K, Swinton SM.
P, Björk R, Kieliszewska-Rokicka B, Kjøller R, Kraigher H. Evalua- Ecosystem services and dis-services to agriculture. Ecol Econ.
tion of methods to estimate production, biomass and turnover 2007;64:253---60.