Análisis microbiológico

de los alimentos.
Guía de aplicación de normas ISO
 Análisis microbiológico
de los alimentos.
Guía de aplicación de normas ISO

David Tomás Fornés

Nuria López-Molina Cantera
Natalia Prado Marrón
Título: Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO
Autores: David Tomás Fornés, Nuria López-Molina Cantera, Natalia Prado Marrón

© AENOR Internacional, S.A.U., 2022

Todos los derechos reservados. Queda prohibida la reproducción total o parcial en cualquier soporte, sin
la previa autorización escrita de AENOR Internacional, S.A.U.

ISBN: 978-84-17891-90-9
Impreso en España – Printed in Spain

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 Índice

Prólogo .................................................................................................... 11

Capítulo 1. Generalidades en Microbiología

1.1. UNE-EN ISO 7218:2008/A1:2013 Microbiología de los alimentos
para consumo humano y alimentación animal.
Requisitos generales y guía para el examen microbiológico .................... 13

Capítulo 2. Medios de cultivo

2.1. UNE-EN ISO 11133:2014/A1:2018/A2:2020 Microbiología de los
alimentos para consumo humano, alimentación animal y agua.
Preparación, producción, conservación y ensayos de rendimiento
de los medios de cultivo ..................................................................... 33

Capítulo 3. Preparación de muestras

3.1. UNE-EN ISO 6887-1:2017 Reglas generales para la preparación
de la suspensión inicial y las diluciones decimales .................................... 47
3.2. UNE-EN ISO 6887-2:2017 Reglas específicas para la preparación
de carne y productos cárnicos .............................................................. 53
3.3. UNE-EN ISO 6887-3:2017/A1:2021 Reglas específicas para la
preparación de pescados y productos de la pesca .................................... 56
3.4. UNE-EN ISO 6887-4:2017 Reglas específicas para la preparación
de productos variados ......................................................................... 60
3.5. UNE-EN ISO 6887-5:2021 Reglas específicas para la preparación
de leche y productos lácteos ................................................................ 65

7
8 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

Capítulo 4. Verificación de métodos de ensayo

4.1. UNE-EN ISO 16140-3:2021 Protocolo para la verificación en un único
laboratorio de métodos de referencia y de métodos alternativos validados ... 69

Capítulo 5. Colonias a 30 ºC
5.1. UNE-EN ISO 4833-1:2014 Recuento de colonias a 30 °C mediante la
técnica de siembra en profundidad ........................................................ 79
5.2. UNE-EN ISO 4833-2:2014 Recuento de colonias a 30 °C mediante la
técnica de siembra en superficie ........................................................... 82

Capítulo 6. Psicrotrofos
6.1. ISO 17410:2019 Recuento de microorganismos psicrotrofos ..................... 85

Capítulo 7. Bacterias ácido lácticas

7.1. ISO 15214:1998 Recuento de bacterias ácido lácticas mesófilas a 30 °C .... 89

Capítulo 8. Mohos y levaduras

8.1. ISO 21527-1:2008 Recuento de mohos y levaduras en productos
con actividad de agua mayor de 0,95 ................................................... 93
8.2. ISO 21527-2:2008 Recuento de mohos y levaduras en productos
con actividad de agua menor o igual a 0,95 .......................................... 96
Capítulo 9. Enterobacterias
9.1. UNE-EN ISO 21525-1:2018 Detección de Enterobacteriaceae .................. 99
9.2. UNE-EN ISO 21528-2:2018 Recuento de colonias
de Enterobacteriaceae ....................................................................... 102

Capítulo 10. Coliformes

10.1. ISO 4832:2006 Recuento de colonias de coliformes .............................. 107
10.2. ISO 4831:2006 Detección y recuento de coliformes
por la técnica del NMP ...................................................................... 110

Capítulo 11. Escherichia coli

11.1. UNE-EN ISO 16649-1:2013 Recuento de Escherichia coli b-glucuronidasa
positivo. Técnica de recuento de colonias a 44 °C utilizando membranas y
5-bromo-4-cloro-3-indolil b-D-glucurónido .......................................... 115
11.2. ISO 16649-2:2001 Recuento de Escherichia coli b-glucuronidasa positivo.
Técnica de recuento de colonias a 44 °C utilizando
5-bromo-4-cloro-3-indol b-D-glucurónido ........................................... 118
11.3. UNE-EN ISO 16649-3:2015 Recuento de Escherichia coli b-glucuronidasa
positivo. Detección y recuento por la técnica del NMP
utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil b-D-glucuronato ............................ 121
 Índice 9

11.4. ISO 7251:2005 Detección y recuento de presuntivas Escherichia coli

mediante la técnica del NMP ................................................................. 124

Capítulo 12. Escherichia coli O157

12.1. UNE-EN ISO 16654:2001 Detección de Escherichia coli O157 ................ 127

Capítulo 13. Salmonella spp.

13.1. UNE-EN ISO 6579-1:2017/A1:2021 Detección de Salmonella spp. ......... 131

Capítulo 14. Yersinia enterocolitica patógena

14.1. UNE-EN ISO 10273:2017 Detección de Yersinia enterocolitica patógena .. 137

Capítulo 15. Listeria monocytogenes y Listeria spp.

15.1. UNE-EN ISO 11290-1:2018 Detección de Listeria monocytogenes
y de Listeria spp. .............................................................................. 143
15.2. UNE-EN ISO 11290-2:2018 Recuento de Listeria monocytogenes
y de Listeria spp. .............................................................................. 148

Capítulo 16. Campylobacter spp.

16.1. UNE-EN ISO 10272-1:2018 Detección de Campylobacter spp. ............... 153
16.2. UNE-EN ISO 10272-2:2018 Recuento de Campylobacter spp. ............... 157

Capítulo 17. Estafilococos coagulasa positivos

17.1. UNE-EN ISO 6888-1:2022 Recuento de estafilococos coagulasa
positivos (Staphylococcus aureus y otras especies)
mediante la técnica que utiliza el medio BP ........................................... 161
17.2. UNE-EN ISO 6888-2:2022 Recuento de estafilococos coagulasa
positivos (Staphylococcus aureus y otras especies)
mediante la técnica que utiliza el medio RPF ......................................... 165

Capítulo 18. Bacillus cereus

18.1. UNE-EN ISO 7932:2005/A1:2021 Recuento de Bacillus cereus
presuntivos ...................................................................................... 169
18.2. UNE-EN ISO 21871:2007 Recuento de números bajos de
presuntos Bacillus cereus ................................................................... 173

Capítulo 19. Cronobacter spp.

19.1. UNE-EN ISO 22964:2017 Detección de Cronobacter spp. ..................... 179

Capítulo 20. Vibrio spp.

20.1. UNE-EN ISO 21872-1:2018 Detección de Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio cholerae y Vibrio vulnificus potencialmente enteropatogénicos ......... 183
10 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

Capítulo 21. Anaerobios sulfito-reductores

21.1. ISO 15213:2003 Recuento de anaerobios sulfito-reductores ................... 189

Capítulo 22. Clostridium perfringens

22.1. UNE-EN ISO 7937:2005 Recuento de Clostridium perfringens ................. 193

Anexo I. Medios de cultivo ........................................................................ 197

Anexo II. Abreviaturas .............................................................................. 203

 Prólogo

Los métodos normalizados de análisis microbiológicos de alimentos permiten a los

laboratorios disponer de métodos de ensayo reconocidos internacionalmente que
aseguren que los resultados obtenidos sean comparables y fiables, con el objetivo
último de garantizar el comercio, la calidad y, sobre todo, la seguridad de los ali-
mentos sometidos a control. Juegan, por tanto, un importante papel en los sectores
económico, social y sanitario.
Con el presente libro, hemos intentado realizar una tarea de síntesis y simplificación
de las normas aplicables, sin obviar los aspectos fundamentales para la implantación
de las guías generales y la ejecución de los métodos de ensayo, aportando nuestra
experiencia en el uso de estos últimos.
Nuestro enfoque pretende alcanzar varios objetivos y abarcar un público diverso.
Por un lado, se incluyen conceptos e información relevantes para las personas que
se acercan por primera vez a las técnicas de análisis microbiológicos, así como refe-
rencias que permiten profundizar en los métodos y que sirven de guía tanto en el
ámbito académico como en el profesional.
Por otra parte, en el caso de la aplicación de los métodos de ensayo microbiológicos
en un laboratorio de análisis, el objetivo es facilitar la implantación de las normas.
Creemos que los diagramas que acompañan a cada método de análisis serán bien-
venidos para facilitar su entendimiento y consulta. No obstante, los resúmenes y
gráficos aportados no reemplazan las normas de referencia en toda su extensión y
detalle, por lo que, para determinados usos, consideramos que puede ser imprescin-
dible consultar la fuente original en la que nos hemos basado.
Respecto a las normas recogidas en este libro, debemos indicar que son todas las
que están, pero no están todas las que son. Hemos querido limitar el alcance del
libro a las guías generales que deben ser de uso común para todos los laboratorios

11
12 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

de microbiología, a los métodos de ensayo que tienen su fundamento en técnicas

de cultivo y a aquellos microorganismos de mayor relevancia para la industria ali-
mentaria. Así pues, no hemos contemplado aquellos métodos relacionados con el
empleo de técnicas como la PCR ni algunas normas que, si bien están relacionadas
con la microbiología alimentaria, no aplican técnicas convencionales (p. ej.: virus
entéricos, parásitos, toxinas).
Creemos que también es importante destacar el arduo trabajo asociado al desarro-
llo, la publicación y la revisión de las normas. Cada método lleva consigo un proce-
so preliminar de investigación y desarrollo, seguido del proceso de normalización,
basado en el consenso y la armonización entre múltiples partes, como agencias de
seguridad alimentaria, laboratorios de referencia, tanto públicos como privados,
universidades, centros tecnológicos, compañías de diagnóstico, de equipamiento,
etc. Este trabajo pretende buscar un equilibrio entre la validez científica y su apli-
cación práctica por parte de los laboratorios, para que se puedan implementar de
forma simple y evitando tecnologías o medios cuya propiedad intelectual esté pro-
tegida. Además, su publicación requiere la aprobación por parte de una amplia ma-
yoría de organismos oficiales de normalización de los países miembros. Todo este
proceso garantiza la transparencia, el reconocimiento internacional y, sobre todo,
su adecuación al uso.
Por último, queremos agradecer a AENOR que nos haya brindado la oportunidad
de materializar este libro, así como a la Sociedad Española de Microbiología (SEM)
por tomar la iniciativa de involucrar a los autores y servir de vínculo entre ellos.

Los autores
 1 Generalidades en
Microbiología

1.1. UNE-EN ISO 7218:2008/A1:2013

Microbiología de los alimentos para
consumo humano y alimentación animal.
Requisitos generales y guía para el examen
microbiológico

1.1.1. Introducción
La realización de análisis microbiológicos de alimentos tiene como objetivo detectar
y cuantificar los microorganismos presentes en la muestra objeto de ensayo. Para
ello, la presente norma aporta requisitos y recomendaciones para la correcta ejecu-
ción de los métodos de análisis contemplados tanto en norma de referencia como de
aplicación a muchos de los aspectos relacionados con métodos rápidos y alternativos.
La norma incluye un amplio número de ejemplos e instrucciones que no pueden
desarrollarse por completo en este documento, pues su objeto no es servir de guía
exhaustiva (para ello se debe acudir a la propia norma) sino de resumen y aplicación
práctica de los aspectos más relevantes de aquella en un laboratorio de investigación
o control de calidad.

13
14 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

En este sentido, los puntos que se abordan de forma resumida se pueden agrupar
en las siguientes áreas:
• Instalaciones y condiciones ambientales.
• Personal.
• Aparatos, equipos y material de laboratorio.
• Ejecución de los análisis.
• Informe de resultados.
• Validación.
• Control de calidad en el laboratorio.

1.1.2. Alcance
El objetivo de esta norma es la implementación y ejecución de métodos de ensayo y
el empleo de buenas prácticas de laboratorio aplicables de forma horizontal para el
análisis de microbiología de muestras de la cadena alimentaria. También puede em-
plearse como guía para la acreditación de laboratorio acorde a la Norma ISO/IEC
17025, aunque en este caso, es importante considerar de forma adicional las guías y
los criterios publicados por los respectivos organismos de acreditación.
Es importante destacar que los requisitos de esta norma anulan y sustituyen a los de
las normas específicas ya existentes.
La norma se ha desarrollado básicamente para la realización de todo tipo de ensayos
de bacterias, mohos y levaduras basados en medios de cultivo (recuento en placa,
NMP, detección) aunque muchas de sus prácticas, como las relacionadas con la ma-
nipulación de microorganismos, equipos, etc., son de aplicación para un amplio
rango de técnicas (p. ej.: inmunocaptura, impedancia, biología molecular). Algunas
de las prácticas incluidas pueden emplearse para análisis de priones, virus y parási-
tos, pero quedan excluidas las toxinas y otros metabolitos de microorganismos.

1.1.3. Instalaciones y condiciones ambientales

1.1.3.1. Áreas del laboratorio

Se recomienda disponer de localizaciones separadas o áreas claramente destinadas a
la realización de las siguientes actividades:
• Actividades generales, entre las que se encuentran los accesos, almacenes, salas
administrativas, vestuarios y salas de descanso.
 Generalidades en Microbiología 15

• Actividades de análisis, incluyendo una clara separación entre:

– Actividades que pueden generar un mayor riesgo de contaminación, como
la limpieza y descontaminación de residuos y la recepción y preparación
de muestras (en particular, muestras altamente contaminadas, como ciertas
materias primas o muestras procedentes de producción primaria, etc.).
– Actividades que requieren un ambiente aséptico o estéril, como el análisis
de muestras, o la preparación y manipulación de medios de cultivo y reacti-
vos y su almacenamiento.
Es importante adecuar estas recomendaciones al tipo de muestras y análisis que
realice el laboratorio, siendo en algunos casos necesario disponer de salas específicas
para limpieza y esterilización cuando el laboratorio realiza toda la limpieza de ma-
terial de vidrio como pipetas, matraces, frascos, etc., así como la esterilización de
residuos como caldos de enriquecimiento y placas Petri, lo cual no es tan relevante si
el laboratorio utiliza material de un solo uso y los residuos contaminados son gestio-
nados de forma externa sin manipulación por parte del laboratorio.
Del mismo modo, el tipo de muestras que analice el laboratorio puede implicar la
necesidad de salas o de condiciones especiales de extracción y manejo del aire para las
zonas de preparación de muestras. Así pues, si se analizan muestras procedentes de
producción primaria como heces, calzas, cáscaras de huevos o estiércol, o bien mues-
tras altamente contaminadas en polvo o pulverizadas, se debe disponer de una sala
o área perfectamente separada del resto de las actividades, incluyendo la preparación
de otras muestras como muestras estériles o con bajos niveles de microorganismos.
También pueden emplearse las mismas áreas para operaciones diferentes si se ga-
rantiza una adecuada separación temporal o espacial, con limpieza y desinfección
entre ellas. Las diferentes actividades deberían distribuirse con el principio de “no
retorno” y de forma secuencial.
El empleo de una cabina de flujo laminar puede considerarse un área claramente
separada dentro de una sala común, y, del mismo modo, una campana de extracción
puede ser un equipo necesario para la manipulación de ciertas muestras que generan
polvo contaminado.

1.1.3.2. Características de las salas

Generalmente, el grupo de responsables y analistas de laboratorio no forman parte
de los equipos de diseño y materiales con los que se construye el laboratorio, por
lo que aquí se citan tan solo los aspectos de mayor relevancia para el grupo usuario.
16 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

En el caso de realizar ensayos de baja contaminación, estos se deberían realizar en

cabinas de flujo laminar o de bioseguridad. Estos equipos no se situarán en zona
de paso.
Se debería disponer de lavamanos en las salas de análisis, preferiblemente cerca de
los accesos, así como sistemas de seguridad y de primeros auxilios fácilmente acce-
sibles y de un autoclave para la eliminación de residuos excepto si se dispone de un
gestor externo para todos los residuos contaminados.

1.1.3.3. Limpieza y condiciones ambientales

El laboratorio debería implantar y disponer de un sistema de limpieza y desinfec-

ción periódicas, incluyendo sistemas de ventilación y filtros, que garantice las con-
diciones adecuadas para la realización de los análisis. Las superficies contaminadas
deberían descontaminarse utilizando desinfectantes con actividad bactericida o fun-
gicida reconocida. Es recomendable disponer de material para la recogida de verti-
dos accidentales, principalmente de los relacionados con medios de cultivo (p. ej.:
polvo higroscópico, paños absorbentes).
La temperatura de ambiente del laboratorio (entre 18 ºC-27 ºC) y la calidad mi-
crobiológica deben ser compatibles con las necesidades analíticas. Debería com-
probarse de forma periódica la calidad higiénica de las superficies de trabajo y del
aire. La frecuencia se debe establecer en función del riesgo de contaminación y
de los resultados obtenidos. A modo de ejemplo, los puntos de control podrían
analizarse al menos una vez al mes, y también podrían muestrearse semanalmente
diferentes zonas. Los controles de superficie pueden contemplar análisis de re-
cuento de colonias a 30 ºC con placas de contacto o hisopos (incluyendo neutra-
lizantes si se sospecha la presencia de residuos de desinfectantes). Si existe riesgo
o se sospecha de contaminación cruzada, es conveniente implantar también un
control de superficies (con gasas o esponjas) para la detección de patógenos en
zonas críticas.
El control de aire puede contemplar también recuento de colonias a 30 ºC y mohos
y levaduras y puede realizarse mediante exposición de placas Petri (p. ej.: 15 min
en general y al menos 30 min en zonas estériles, como las cabinas de flujo) o bien
mediante sistemas de captación de aire.
No existen criterios definidos en la norma, pero a modo de ejemplo pueden con-
siderarse aceptables bajos niveles de recuentos en puntos donde no se requiera
esterilidad (p. ej.: 5 ufc/placa RODAC o 15 ufc/placa Petri de 90 mm, tras 15 min
de exposición).
 Generalidades en Microbiología 17

1.1.4. Personal

1.1.4.1. Cualificación

La norma no indica un nivel de formación académica necesario para la cualificación

del personal, pero sí que deben definirse criterios objetivos con los que valorar el
nivel de competencia, tanto inicial como a lo largo del tiempo.
La norma no establece criterios objetivos, pero la cualificación puede basarse en los
parámetros de rendimiento del método que se va a ejecutar, como son los valores de
precisión y exactitud obtenidos inicialmente en la validación o a través del control
de calidad interno para ensayos cuantitativos o la obtención de resultados positivos,
incluyendo las pruebas de confirmación, en las muestras inoculadas con el microor-
ganismo diana a niveles próximos al límite de detección en los ensayos de detección.
La participación satisfactoria en intercomparativos es también una forma de garan-
tizar la cualificación inicial y continua.

1.1.4.2. Higiene

Las precauciones de higiene personal que deben adoptarse para evitar contamina-
ción en las etapas analíticas e infección del personal son las siguientes:
• Utilizar vestuario limpio y específico para la zona de trabajo.
• Llevar protección para el pelo y la barba y mantener cortas y limpias las uñas.
• Lavarse las manos exhaustivamente en agua templada, preferiblemente en un
grifo que no se accione directamente con las manos.
• Evitar hablar y toser cuando se trabaja con muestras y cultivos expuestos.
• No comer, ni beber, ni introducir comida destinada a consumo personal en el
laboratorio.
• Está prohibido pipetear con la boca.

1.1.5. Aparatos, equipos y material de laboratorio

Todos los aparatos y el equipamiento deberían mantenerse limpios y en buenas con-
diciones de funcionamiento. Antes de su utilización, debería verificarse que el equi-
pamiento es adecuado para el uso previsto, así como comprobarse periódicamente
para asegurar su utilidad y su seguridad e indicar claramente su estado de uso y sus
limitaciones con etiquetas visibles.
22 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

1.1.5.1. Material de laboratorio

Se debe garantizar la limpieza o esterilidad del material de vidrio y del resto del
material de laboratorio utilizado en microbiología, asegurando su limpieza o esteri-
lidad hasta el momento de su uso.
El material que se va a esterilizar debería tener acceso libre al vapor y colocarse en
recipientes especiales o envolverse con un material apropiado (papel especial, papel
de aluminio, etc.) incluyendo una fecha de caducidad en cada paquete. La tempe-
ratura de esterilización de material limpio en autoclave debe ser de 121 ºC ±3 ºC
durante un tiempo de 15 min como mínimo, y durante al menos 30 min para mate-
rial contaminado después de su uso. En horno de esterilización, como mínimo 1 h
a 170 ºC ±10 ºC o equivalente.
Si se emplea desinfección química, el material debe enjuagarse para garantizar la
ausencia de residuos.

1.1.6. Ejecución de los análisis

1.1.6.1. Toma, transporte y recepción de muestras

La toma de muestra de alimentos y muestras ambientales no es parte de la presente

norma, ya que existen normas dirigidas a ese objetivo, como la Norma ISO/TS
17728, la Norma ISO 17604 y la Norma ISO 18593, respectivamente.
No obstante, la norma aporta algunas recomendaciones generales a seguir relacio-
nadas con la toma y el transporte de la muestra, que se describen a continuación.
La muestra debería protegerse de contaminaciones externas ocasionadas por el aire,
el recipiente de la muestra, los equipos de toma de muestras o por una incorrecta
manipulación. El recipiente de la muestra no debería llenarse en más de tres cuartas
partes de su capacidad para evitar posibles vertidos.
La forma de transporte de las muestras al laboratorio debe asegurar que se man-
tienen en condiciones que minimicen cualquier tipo de alteración en el número de
microorganismos presentes. Las temperaturas recomendadas para el transporte son
las siguientes:
• Productos estables: temperatura ambiente (por debajo de 40 ºC).
• Productos congelados o ultracongelados: menos de –15 ºC, preferiblemente
menos de –18 ºC.
• Otros productos inestables a temperatura ambiente: entre 1 ºC-8 ºC.
 Generalidades en Microbiología 23

En el momento de la recepción de la muestra en el laboratorio, se debe comprobar

su estado. Si sus condiciones no son satisfactorias, o si las muestras son insuficien-
tes, el laboratorio debería rechazar las muestras. En caso necesario, las superficies
externas de los recipientes deberían desinfectarse.
Se debe asegurar la trazabilidad de las muestras a lo largo de todas las etapas de su
paso por el laboratorio. En su recepción, se debe registrar al menos:
• Fecha (y hora, cuando sea relevante) de la recepción.
• Detalles sobre la toma de muestras (día y hora de toma de muestras, y, cuando
sea relevante y se conozca, estado de las muestras).
• Nombre y dirección del cliente.
• Temperatura de recepción (en el caso de muestras perecederas).
Las muestras se analizan lo antes posible tras su recepción, preferiblemente en un
plazo de 24 h. Para los productos altamente perecederos (como el marisco), los
análisis deberían iniciarse en un plazo de 24 h desde la toma de muestras. Para los
productos perecederos (como el pescado o la leche cruda), los análisis deberían ini-
ciarse en un plazo de 36 h.
Se recomiendan las siguientes temperaturas de almacenamiento en el laboratorio a
la espera del inicio de los análisis:
• Productos estables: temperatura ambiente (entre 18 ºC-27 ºC).
• Productos congelados o ultracongelados: menos de –15 ºC, preferiblemente
menos de –18 ºC.
• Otros productos inestables a temperatura ambiente, incluidos los alimentos
alterados: 3 ºC ±2 ºC.

1.1.6.2. Preparación de la muestra y precauciones durante el

análisis
Existen normas específicas para la preparación de muestras como la serie de Normas
ISO 6887 contempladas en el presente libro.
Las muestras de laboratorio se conservan en su temperatura de almacenamiento
original en un recipiente estéril hasta que se hayan obtenido todos los resultados.
Los productos perecederos deberían congelarse. No obstante, la repetición de los
análisis no es una práctica aceptada habitualmente, debido a los posibles cambios en
su situación microbiológica.
En este apartado se incluyen las consideraciones de carácter higiénico que se deben
seguir durante todas las etapas, que contemplan:
24 Análisis microbiológico de los alimentos. Guía de aplicación de normas ISO

• Los productos en polvo se deben manipular en una zona específica separada

del laboratorio (área, habitación o cabina).
• Antes de abrir las muestras normales, esterilizar la zona prevista de apertura
con alcohol al 70% y dejar evaporar. En el caso de los productos estériles, di-
cha zona se sumerge en una solución de 100 ppm y 200 ppm de cloro libre (o
algún otro esterilizante adecuado) durante un tiempo mínimo de 10 min.
• Todos los instrumentos en contacto con los envases, muestras, medios de cul-
tivo y reactivos deben ser estériles, y las áreas de trabajo y las manos deben
desinfectarse antes de comenzar los análisis, al finalizarlos y si se produce al-
gún vertido.
• Cuando se retira una pipeta estéril, no se deja que la punta toque las super-
ficies externas de las otras pipetas, ni el borde o el cuello de las botellas de
dilución. Si no se utiliza todo el contenido de un paquete de placas de Petri,
pipetas, etc., durante el desarrollo de un análisis, se asegura que el paquete
queda bien cerrado después de su uso.
• Se debe reducir al máximo la formación de aerosoles, en particular al mani-
pular placas de Petri, tubos y botellas; cuando se utilizan agitadores, jeringas,
centrífugas; cuando se vacían las pipetas; cuando se flamean agujas o asas de
siembra o cuando se abren ampollas que contienen cultivos liofilizados.
El tiempo transcurrido desde el final de la preparación de la suspensión inicial y el
momento en el que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe ser
superior a 45 min, salvo que se mencione específicamente algo distinto en la norma
internacional correspondiente.

1.1.6.3. Método de recuento

A pesar de que existen diversas técnicas de recuento de microorganismos (examen
microscópico, citometría de flujo, impedancia, qPCR, etc.), la norma solo contem-
pla aspectos relacionados con medios de cultivo sólidos y líquidos.

1.1.6.3.1. Recuentos en medio sólido

El recuento en medio sólido se basa en la capacidad de muchos microorganismos de
producir colonias en el interior o sobre la superficie de los medios de agar, que se
pueden reconocer como tales a simple vista.
Deberían seleccionarse las diluciones adecuadas que aseguren que las placas contie-
nen un número adecuado de colonias (p. ej.: entre 10 y 300 o entre 10 y 150). Para
cada dilución debe emplearse una pipeta estéril diferente, salvo si se trabaja desde la
dilución más diluida a la más concentrada.