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Identificacion de Sustancias Farmaceuticas

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Ficha 14-22: IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS

FARMACÉUTICAS | CROMATOGRAFÍA EN PLACA


DELGADA ( TLC )

IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS FARMACÉUTICAS | CROMATOGRAFÍA


EN PLACA DELGADA ( TLC )

Muchos se preguntarán para que complicarme con Cromatografía si hay otros métodos más
sencillos como los Colorimétricos para identificar sustancias.Los organolépticos, la toma
del punto de fusión… Y para todo hay un porque… Cuando recibimos una materia prima en
nuestras farmacias, no tenemos idea si la misma presenta impurezas, muchas de las reac-
ciones colorimétricas pueden dar falsos positivos tanto como falsos negativos debido a las
mismas. Alguna vez leí por ahí, que para controlar cloruros en el agua desmineralizada,
usando unas gotas de Nitrato de Plata y observando si se formaba un precipado blanco, este
sería Cloruro de Plata, lo cual me estaba dando una reacción positiva de cloruros. Lo que no
advertían que también los responsables de la dureza del agua daban precipitados blancos,
salvo neutralizando a los mismos con Acido Nítrico, podía decir que la reacción era positiva
para cloruros. La Cromatografía, además de servir para identificar sustancias, sirve para la
separación de 2 ó más sustancias presentes en una muestra. Si al hacer la corrida de identifi-
cación aparece más de una mancha, podemos encontrarnos que tal vez nuestra materia
prima presenta alguna impureza, la cual puede estar presente por no cumplir con las normas
de fraccionamiento de las mismas.
J. R. B

Introducción

Todas las técnicas de cromatografía se basan en el mismo principio. Se produce una distri-
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bución preferencial de un soluto entre 2 fases, una de las cuales está Inmóvil ó Estacionaria
(Adsorbente ó papel) y la otra móvil (Disolvente ó Eluyente).

La fase móvil se pone en equilibrio con una porción de la fase estacionaria y luego fluye hacia
la siguiente porción estacionaria, donde vuelve a ponerse en equilibrio. Luego fluye hacia una
tercera fase estacionaria y así sucesivamente, alcanzando el equilibrio de reparto en cada
una de ellas.

En la Cromatografía de Adsorción, las sustancias quedan retenidas por efecto de la adsor-


ción selectiva en la superficie de finas partículas de relleno. Aquí la fase fija (adsorbente) es
un polvo finamente dividido: gel de sílice (en el 80 % de las separaciones), Óxido de aluminio
ó alúmina (ácida, neutra ó básica), celulosa (Nativa ó microcristalina), poliamida, carbonato

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de calcio, talco, etc. Generalmente es una placa de sílica-gel depositada sobre un soporte
plano, como una lámina de aluminio, una placa de vidrio ó plástico.

La ventajas de este tipo de cromatografía en placa delgada son : fácil elución de las sustan-
cias adsorbidas, buena separación tanto de sustancias hidrofóbicas como hidrofílicas, se
puede utilizar solventes anhidros, corren una distancia entre 5 y 20 cm.

Aplicación de las muestras

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico no


polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después
de la aplicación. Para eso se busca las distintas solubilidades de la sustancia a identificar.
Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1)
es efectiva.

Frecuentemente se emplean disoluciones al 1% P/ V, de manera que al aplicar 2 µl resulta en


la carga 20 µg de producto sólido.

Es decir : Si tengo 1% P/V —> 1g producto sólido en 100 ml de sc


Ahora bien, 2 µl equivale a 2.10ˉ³ ml = 0,002 ml
Si en 100 ml __________ 1 g p.sólido
en 0,002 ml ________ X = 1g x 0,002 ml / 100 ml = 0,00002 g

Ahora bien, 1 µg equivale a 1.10ˉª g siendo a = 6 —> 0,000001 g


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Si 0,000001 g ______ 1 µg
en 0,00002 g ________ X = 1 µg x 0,00002 g / 0,000001 g = 20 µg

Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 µg de material.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de


siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. Es lo más aplica-
ble en una farmacia. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micro-
pipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de
dos centímetros aproximadamente. Se marca el sitio de sembrado con un lápiz de grafito. El
punto de aplicación de la muestra se denomina toque. Una vez colocado el toque se deja
secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará la muestra a anali-

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zar. De ser necesario se puede utilizar un secador de cabellos, manteniéndolo a una distancia
de no menos de 15 cm de la placa.

Es conveniente sembrar a 2,0 cm del borde

Elección del eluyente

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del
material en que la separación se lleva a cabo.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:


• Eter de petróleo
• Eter dietílico
• Ciclohexano
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• Acetato de etilo
• Tetracloruro de carbono*
• Piridina
• Benceno*
• Etanol
• Cloroformo*
• Metanol
• Diclorometano
• Agua
• Ácido acético

*compuestos cancerígenos.

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En la elección del eluyente influyen varios factores:


• Precio
• Pureza
• No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad)
• No utilizar compuestos muy volátiles
• Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores)

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del com-
ponente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.


b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa
para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distan-
ciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de
cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma
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que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz.

Desarrollo de la cromatografía

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascen-
dente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción
de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima satura-
ción posible de la atmósfera de la cámara, las paredes se tapizan con papel de filtro impregna-
do del eluyente. El eluyente no debe tocar la zona de siembra. Es decir, si sembré a 2 cm del
borde, el eluyente no debe sobrepasar los 1,5 cm del borde. Generalmente el eluyente se intro-
duce en la cámara 40 minutos antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfe-

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ra. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. Las placas pueden desa-
rrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia
fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta
distancia es de 10 cm.; parece ser la más conveniente para medir valores de RF. Después del
desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. Se puede
hacer una cámara con un vaso de precipitado y cubrirlo con un vidrio de reloj.

Localización de la sustancia

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos


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compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:

• Métodos químicos.
• Métodos físicos.

Métodos químicos
Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes
separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un
pulverizador ó atomizador. Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el
reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse bajo campa-
na. La pulverización se realizará poco a poco. Generalmente se utiliza como reactivo revelador
yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amari-

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llo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar
las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que
reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Además de estos
reveladores generales, existen otros específicos:

• 2,4 - dinitrofenilhidracina (para Aldehidos y Cetonas)


• Verde de bromocresol (para ácidos Carboxílicos)
• Ninhidrina (para Aminoácidos)
• Vainillina – Acido Sulfúrico (para Alcoholes Superiores)
• Nitrato Cérico Amónico (para Alcoholes)
• Tiocianato de Cobalto (ll (para Alcaloides)
• Alizarín (para Aminas)
• Para- Anisaldehído (para Carbohidratos)
• Hidroxilamina/Nitrato Férrico (para Esteres y Amidas)
• Rodamina B (Lípidos)
• Reactivo de Dragendorff’’s (Fosfolípidos)
• Difenilamina / Zinc (Pesticidas)
• Vanadato de Amonio/Anisidina (Fenoles)
• Anisaldehído / Tricloruro de Antimonio (Esteroides)
• Acido Fosfomolibdico (Terpenos)

Elaboración de los mismos y visualización de manchas

• 2,4 – dinitrofenilhidracina : Disuélvanse 100 mg de 2,4 – dinitrofenilhidracina en 50 ml de


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ácido clorhídrico 2 N . Rociar el cromatograma. Los aldehídos y cetonas, dan manchas amari-
llas, naranjas ó rojas dependiendo del grado de instauración ó aromaticidad del compuesto.
Solvente de corrida, Eter etílico: Eter Isopropílico en relación ( 7 : 3 )

• Verde de Bromocresol : Disuélvanse, 50 mg de Verde de Bromocresol, 2,5 ml de NaOH 0,1N


en 250 ml de EtOH. Rociar el cromatograma. Los ácidos carboxílicos dan manchas rojas.
Solvente de corrida, Metanol: Amoníaco en relación ( 99 : 1 )

• Ninhidrina : Disolver 0,2 grs de ninhidrina en 95 ml de alcohol butílico y añádanse 5 ml de


ácido acético al 10 %. Rociar el cromatograma. Los aminoácidos dan manchas violáceas.
Solvente de corrida, Acetona: Agua en relación ( 6 : 4 )

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• Vainillina – Acido Sulfúrico : Se disuelve 0,5 grs de vainillina en 1,7 ml de etanol y se le añade
0,1 ml de ácido sulfúrico.

Métodos físicos
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al
colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de
onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros
casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.Algunos compues-
tos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados
directamente en una lámpara de ultravioleta. En este tipo se utilizan placas de “Silica Gel Gf
254“. La letra G ( GYPSUM ), indica que contiene yeso como aglutinante y F 254, el indicador de
fluorescencia a esa longitud de onda.

Constantes Rf Y Rx
La constante RF, RELACIÓN DE FRENTE (Ratio of Front) es simplemente una manera de expre-
sar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención
de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el punto de siembra


hasta el centro de la mancha y la distancia del eluyente desde el punto de siembra hasta el
frente. Los cálculos se simplifican si el denominador es 10.
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Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas


una serie de condiciones (espesor de la placa, fase
móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra).

El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1,


lo ideal es un RF entre 0.65 y 0,75.

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Identificación de distintas sustancias farmacéuticas con placa Gf254

1) BARBITÚRICOS: Luminal, Veronal, Seconal, Amytal

2) HIDANTOINAS: Difenilhidantoína

Se siembra la muestra que se quiere identificar.


SOLVENTE DE DESARROLLO: Cloroformo : Acetona (80 : 20)
REACTIVOS REVELANTES:
A ) Acetato de Cobalto al 0,5 % en metanol
B ) Hidróxido de Litio al 0,5 % en metanol

Se rocía la placa primero con el RA, se deja secar y luego con el RB, se deja secar. Si hay man-
chas azules de distinta intensidad significa la presencia de Barbitúricos. Si aparecen manchas
de color lila, indica la presencia de Fenil Hidantoínas.

3) ANALGÉSICOS: Aspirina, Paracetamol, Dipirona


SOLVENTE DE DESARROLLO: Cloroformo : Acetona (80 : 20)
REACTIVO REVELANTE :
C ) Solución de Cloruro Férrico al 1 %
Se rocía la placa, se deja secar. Aspirina da manchas color violeta. Paracetamol da manchas
de un color grisáceo azulado. Dipirona manchas de color rosa viejo.

4) DIGITAL:
SOLVENTE DE DESARROLLO: Acido Perclórico conc.
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REACTIVO REVELANTE: A la exposición ultravioleta, aparecerá fluorescencia roja.

5) BENZODIAZEPINAS l:
SOLVENTE DE DESARROLLO: Cloroformo : Acetona ( 80 : 20 )
REACTIVO REVELANTE: Se rocía con Acido Clorhídrico conc. A la exposición UV 366 nm , [(
nanómetros ). Para recordar un 1 nm = 10ˉª (siendo a =o sea ( 0,000000001 mts )], produce
fluorescencia amarilla ó amarillo-verdosa.

BENZODIAZEPINAS ll:
SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco ( 100 : 1,5 )
REACTIVO REVELANTE: Acido Clorhídrico al 10 % . Se detectan como máculas de color amari-
llo, exponiéndolas al UV de onda larga ( 360 nm ) tienen fluorescencia generalmente amarillen-
ta. ( Diazepam, Flunitrazepam, Oxacepam, Lorazepam )
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6) SALICILATOS :
SOLVENTE DE DESARROLLO: Cloroformo : Acetona ( 80 : 20 )
REACTIVO REVELANTE: A la exposición UV, aparecerá fluorescencia celeste.

7) IMIPRAMINA:
SOLVENTE DE DESARROLLO: Acido Perclórico conc. , y calentar aprox . a 100 ° C
REACTIVO REVELANTE: A la exposición UV, aparecerán manchas fluorescentes de color rosa.

8) CARBAMATOS (MEPROBAMATO):
SOLVENTE DE DESARROLLO: Cloroformo : Acetona ( 9 : 1 )
REACTIVO REVELANTE: para-dimetilaminobenzaldehído al 1 % en etanol , aparecerán man-
chas amarillas.

9) FENOTIACINAS:
SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco (100 : 1,5)
REACTIVO REVELANTE : Acido Clorhídrico al 10 %, da manchas de distintos colores:
Stelazine: color rosado, Tioridazine: color verde, Ampliactil: color rojo intenso, Nonizam: color
violeta.

10) AMINAS DESPERTADORAS: ( Anfetamina, Metanfetamina, Efedrina, etc)


SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco (100 : 1,5)
REACTIVO REVELANTE: RA : 2, 4 – dinitrofluorbenceno al 0,5 % en etanol y RB : Acido Clorhídri-
co al 10 % . Se rocía la placa con el RA y se dan manchas de color amarillo fuerte sobre fondo
amarillo tenue. Se calienta la placa hasta secarse, se deja enfriar y se rocía con el RB. Se elimi-
na el amarillo del fondo y quedan las manchas amarillas fuertes que solo son características
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de la Anfetamina y Metanfetamina.

11) ANESTÉSICOS ARIL - AMINÍCOS PRIMARIOS: (Novocaína, Procaína, Benzocaína). No


detecta Lidocaína.
SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco (100 : 1,5 )
REACTIVO REVELANTE: Naftoquinonsulfonato de sodio al 1% en agua (N.Q.S.). Se detectan
como manchas rojizas.

12) DIURÉTICOS TIAZÍDICOS :


SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco (100 : 1,5)
REACTIVO REVELANTE: Naftoquinonsulfonato de sodio al 1%. Se rocía la placa y dan man-
chas color naranja.

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13) ANTIDEPRESIVOS TRICÍCLICOS:


SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco (100 : 1,5)
REACTIVO REVELANTE: Naftoquinonsulfonato de sodio al 1 % . Se rocía la placa y se calienta
a 100 °C. Se van a presentar manchas que van del amarillo, rosa y verde.

14) LIDOCAÍNA:
SOLVENTE DE DESARROLLO : Metanol : Amoníaco (100 : 1,5)
REACTIVO REVELANTE: Iodoplatinato de potasio (Se prepara : Cloruro Platínico 0,25 grs,
Ioduro de Potasio 5,00 grs, Agua csp 100 ml). La presencia de una mancha identifica lidocaína.

15) MORFINA, CODEÍNA, TEBAÍNA, PAPAVERINA:


SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Amoníaco (100 : 1,5)
FASE FIJA: SILICAGEL G ó HF 254
REACTIVO REVELANTE: Iodoplatinato de Potasio Acidificado ( Se prepara : Cloruro Platínico
0,25 grs, Ioduro de Potasio 5,00 grs, Acido Clorhídrico 5,00 ml, Agua csp 100 ml ). Se rocía la
placa con el revelador . La Morfina da manchas color azul violáceo, La Codeína da manchas de
color gris violáceo, La Tebaína da manchas color violeta, La Papaverina da manchas color rosa
violáceo.

16) PENICILINA, NEOMICINA, POLIMIXINA:


SOLVENTE DE DESARROLLO: Metanol : Acetona : Cloroformo : Amoníaco (3 : 2 : 2 : 2)
REACTIVO REVELANTE : La placa para determinar Penicilina se introducen en una cámara con
pequeños cristales de yodo, se la deja hasta que aparezcan manchas amarillas en el patrón y
se prolonga la exposición a los vapores de yodo por 2 minutos adicionales. Se la retira de la
cuba y se la expone al aire hasta que solamente se vea esa mancha y el resto de la placa
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permanezca blanca. Se asperja con solución de almidón soluble al 1 % en agua, para que la
mancha violeta formada, perdure varias horas.

Tanto la placa para identificación de Neomicina, como para determinar Polimixina, se asperjan
con solución de Ninhidrina, se deja reaccionar 5 minutos y luego se seca, hasta que aparezca
una mancha violeta.

17) PIRAZINAMIDA:
SOLVENTE DE CORRIDA : Metanol : Tolueno : Amoníaco (12 : 10 : 0,5) REACTIVO REVELANTE
: Yodo sublimado. Se presentan manchas azul violáceas.

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18) TETOSTERONA:
SOLVENTE DE CORRIDA: Benceno : Acetato de etilo (1 : 1)
FASE FIJA: Placas de silicagel Gf 254
REACTIVO REVELANTE: Secar la placa. La aparición de una mancha a la luz UV indica positivo.

19) DEXAMETASONA:
SOLVENTE DE CORRIDA: Cloruro de metileno : Metanol (45 : 4)
FASE FIJA: Placas de silicagel Gf 254
REACTIVO REVELANTE: Secar la placa. La aparición de una mancha a la luz UV indica positivo.

20) PROTIONAMIDA:
SOLVENTE DE CORRIDA: Acetato de etilo : Metanol (18 : 2)
REACTIVO REVELANTE: Yodo Sublimado. Después de secar la placa, se coloca en una cámara
y los vapores de yodo, dan una mancha color violáceo.

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Biografía

- Mercé Camps. "Son útiles los protectores labiales". (2019). Colegio de Farmacéuticos de Barce-
lona. Recuperado de:
https://www.farmaceuticonline.com/es/son-utiles-los-protectores-labiales/

- Codex Farmacéutico Bonaerense 2 Edición. Revisión 1. (2017). Colegio de Farmacéuticos de la


Provincia de Buenos Aires.

- Centro Nacional de Información Biotecnológica. Resumen de compuestos de PubChem para


CID 204, alantoína. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Allantoin . Consultado el 31
de mayo de 2022.

- Alantoina. Ficha técnica Acofarma. Recuperado de:


h t t p s : // w w w . g o o g l e . c o m / u r l ? s a = t & s o u r c e = w e b & r c t = j & u r l = h t t p s : // -
formulasmagistrales.acofarma.com/idb/descarga/3/f40c02e5ff3a1362.pdf&ved=2ahUKEwj7q
PORoor4AhXEuZUCHT0DD2YQFnoECAYQAQ&usg=AOvVaw0OIlN2v48s5GU0_86Q0SXD

- Centro Nacional de Información Biotecnológica (2022). Resumen de compuestos de PubChem


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https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Octamethyltrisiloxane .

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Recuperado de //www.ulprospector.com/es/la/PersonalCare/Detail/2163/51883/ABIL-350 Colegio de Farmacéu�cos de la Prov. de Buenos Aires | Colaboradora: Julia Bo�ni

- Makerere University Institute of Environment and Natural Resources (1998). «Vitellaria para-
doxa». Lista Roja de especies amenazadas de la UICN 2010.3 (en inglés). ISSN 2307-8235.
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nal de Información Biotecnológica; 2004-. Resumen de compuestos de PubChem para CID
86472, acetato de alfa-tocoferol; [citado el 31 de mayo de 2022].
Disponible en: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/alpha-Tocopherol-acetate

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