01 03 14 Salmonella

LACC-EMB SALMONELLA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA
1. Características generales de Salmonella.
Todas los microorganismos del género Salmonella son potencialmente patógenos

para el hombre.
Los microorganismo del género Salmonella pertenecen a la familia

Enterobacteriaceae.
Son bacterias de forma bacilar, no esporuladas, habitualmente móviles mediante

flagelos perítricos, aunque existen mutantes inmóviles.
Son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con

producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen los nitratos a nitritos. Son
citocromo-oxidasa negativos.
Significa que la bacteria sí posee citocromo oxidasa, por lo que puede usar oxígeno
en la producción de energía con una cadena de transporte de electrones.
El que no la poseen significa que no puede usar el oxígeno en la cadena de

transferencia de electrones o aplican una citocromo diferente para transferir
electrones al oxígeno
2. Material
○ Matraces Erlenmeyer.
○ Pipetas estériles de 10 mL y 1 mL.
○ Gradillas. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.
○ Asa de cultivo.
○ Placas de Petri de 90 mm.
○ Estufa de cultivo.
○ Stomacher
○ Baño Maria.
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3. Medios de cultivo y reactivos
● Agua de peptona tamponada

● Caldo Müller-Kauffmann (Tetrationato)
● Caldo Selenito Cistina
● Agar Verde Brillante Rojo Fenol (Brilliant Green Agar: BGA)
● Agar Bismuto Sulfito (BS)
● Agar lisina hierro (Lysine Iron Agar: LIA)
● Agar TSI ó Kligler
● Agar Citrato de Simmons
4. Fases del aislamiento e identificación de Salmonella
0. Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo.

1. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.
2. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos.
3. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas.
4. Identificación Serológica
5. Fase 0: Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo
Esta etapa de pre-enriquecimiento no selectivo sirve para que si en el alimento existen

Salmonelas, éstas se multipliquen y se puedan aislar posteriormente, también tiene por
objeto reparar las células que pudieran haber sufrido lesiones subletales. Este último
objetivo se logra siempre sembrando en medios de cultivo líquidos no selectivos (como es el
caso del agua de peptona tamponada) a temperaturas óptimas para el microorganismo que
se quiere reparar, en este caso Salmonella.
Pesar, asépticamente y en envase estéril (bolsa Stomacher), 25 g de alimento
Añadir 225 mL de agua de peptona tamponada

Homogenizar en Stomacher
Incubar a 37ºC durante 18 a 20 horas
6. Fase 1: Enriquecimiento en medios líquidos selectivos
En esta fase se pretende restringir el crecimiento de la flora competitiva. Para ello se utilizan
medios que contienen agentes selectivos. Sin embargo no existe ningún medio de cultivo
que sea totalmente selectivo para Salmonella de modo que lo que conseguimos en realidad
es evitar el crecimiento de "parte" de la flora competitiva.
Agitar el cultivo de preenriquecimiento y sembrar, con pipeta estéril, en los siguientes

medios líquidos selectivos:
Fase 1a: caldo Müller Kauffmann
1 mL de cultivo sobre 10 mL de caldo Müller Kauffmann. Incubar a 43 ºC durante

18-24 horas
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En el caldo Müller Kauffmann, el tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes

y otras bacterias entéricas. La bilis, por su parte, estimula el crecimiento de las
Salmonella e inhibe el de la flora competitiva. El verde brillante impide el
desarrollo de la flora gram-positiva y el carbonato cálcico actúa de tampón para
mantener el pH.
Fase 1b caldo Selenito-Cistina:
1 mL de cultivo sobre 10 mL de caldo Selenito-Cistina. Incubar a 37 ºC durante 18-24

horas.
En el caldo Selenito-Cistina, el Selenito inhibe el crecimiento de gran parte de la

flora entérica competitiva sin afectar a Salmonella, Shigella, Pseudomonas y
Proteus. La Cistina favorece el crecimiento de Salmonella.
7. Fase 2: Aislamiento diferencial en medios sólidos
En esta etapa se utilizan medios de cultivo diferenciales que por su composición permiten
que las colonias de Salmonella crezcan con un aspecto característico en cada uno de ellos
(colonias típicas)
A partir de los dos cultivos obtenidos en los medios líquidos selectivos, sembrar, cada uno
de ellos sobre: Agar Verde brillante-Rojo fenol (BGA) y Agar Bismuto Sulfito (BS)
Fase 2a. Agar Verde brillante-Rojo fenol (BGA):

Incubar en estufa a 37 ºC durante 24 horas
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Las colonias sospechosas de Salmonella crecidas sobre agar Verde Brillante

son de color rosado, transparentes, rodeadas de un halo rojo, al no fermentar la
lactosa.
Las bacterias no sospechosas sobre agar Verde Brillante, es decir,

fermentadoras de la lactosa forman colonias amarillo-verdosas al virar a
amarillo el rojo fenol del medio por producción de ácido.
Fase 2b: Agar Bismuto Sulfito (BS):

Incubar en estufa a 37 ºC durante 48 horas
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.
Las colonias sospechosas de Salmonella crecidas sobre Agar Bismuto sulfito
(BS) son SH2 positivas (es decir, negras o marrones) y pueden presentarse con
un centro negro rodeado de un borde claro; también pueden estar bordeadas
de un precipitado negro con brillo metálico, por la reducción de iones de
bismuto que se transforman en bismuto metálico
Las colonias no sospechosas de Salmonella crecidas sobre Agar Bismuto

sulfito (BS) son de color verde o marrón sin presentar el centro negro ni el brillo
metálico.
Suelen corresponder a coliformes, Serratia, Proteus y Pseudomonas que
crecen en este medio
Lectura de resultados sobre agar Verde Brillante del supuesto práctico
Resultados obtenidos en las siembras sobre agar Verde Brillante en busca de

colonias sospechosas de Salmonella.:
LACC-EMB SALMONELLA
VB1 VB2
VB3 VB4
VB5 VB6
preguntas
3. Se han encontrado colonias sospechosas de Salmonella en las placas de

Verde Brillante:
LACC-EMB SALMONELLA
4. No se han encontrado colonias sospechosas de Salmonella en las placas de

Verde Brillante:
5. En algunas placas de Verde Brillante se han encontrado tanto colonias

sospechosas como no sospechosas de Salmonella en:
Lectura de resultados sobre agar Bismuto Sulfito del supuesto práctico
Se trata de interpretar los resultados obtenidos en las siembras sobre agar

Bismuto Sulfito en busca de colonias sospechosas de Salmonella.
placa BS1 BS2
BS3 BS4
LACC-EMB SALMONELLA
BS5 BS6

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1. Características generales de Salmonella.

Todas los microorganismos del género Salmonella son potencialmente patógenos

Los microorganismo del género Salmonella pertenecen a la familia

Son bacterias de forma bacilar, no esporuladas, habitualmente móviles mediante

Son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con

El que no la poseen significa que no puede usar el oxígeno en la cadena de

3. Medios de cultivo y reactivos

● Agua de peptona tamponada

4. Fases del aislamiento e identificación de Salmonella

0. Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo.

5. Fase 0: Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

Esta etapa de pre-enriquecimiento no selectivo sirve para que si en el alimento existen

Pesar, asépticamente y en envase estéril (bolsa Stomacher), 25 g de alimento

Añadir 225 mL de agua de peptona tamponada

6. Fase 1: Enriquecimiento en medios líquidos selectivos

Agitar el cultivo de preenriquecimiento y sembrar, con pipeta estéril, en los siguientes

Fase 1a: caldo Müller Kauffmann

1 mL de cultivo sobre 10 mL de caldo Müller Kauffmann. Incubar a 43 ºC durante

En el caldo Müller Kauffmann, el tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes

Fase 1b caldo Selenito-Cistina:

1 mL de cultivo sobre 10 mL de caldo Selenito-Cistina. Incubar a 37 ºC durante 18-24

En el caldo Selenito-Cistina, el Selenito inhibe el crecimiento de gran parte de la

7. Fase 2: Aislamiento diferencial en medios sólidos

Fase 2a. Agar Verde brillante-Rojo fenol (BGA):

Las colonias sospechosas de Salmonella crecidas sobre agar Verde Brillante

Las bacterias no sospechosas sobre agar Verde Brillante, es decir,

Fase 2b: Agar Bismuto Sulfito (BS):

Las colonias no sospechosas de Salmonella crecidas sobre Agar Bismuto

Lectura de resultados sobre agar Verde Brillante del supuesto práctico

Resultados obtenidos en las siembras sobre agar Verde Brillante en busca de

3. Se han encontrado colonias sospechosas de Salmonella en las placas de

4. No se han encontrado colonias sospechosas de Salmonella en las placas de

5. En algunas placas de Verde Brillante se han encontrado tanto colonias

Lectura de resultados sobre agar Bismuto Sulfito del supuesto práctico

Se trata de interpretar los resultados obtenidos en las siembras sobre agar

placa BS1 BS2

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