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    Diagnóstico Por Métodos Inmunológicos

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    David Vasquez
    El documento describe varios métodos inmunológicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Estos incluyen pruebas serológicas como aglutinación, precipitación e inhibición que detectan anticuerpos producidos en respuesta a un agente infeccioso. También describe técnicas como fijación de complemento que detectan la interacción entre anticuerpos y antígenos. El documento explica los principios subyacentes a estas pruebas serológicas y cómo se usan para diagnosticar recientemente infe

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    Diagnóstico Por Métodos Inmunológicos

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    David Vasquez
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    El documento describe varios métodos inmunológicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Estos incluyen pruebas serológicas como aglutinación, precipitación e inhibición que detectan anticuerpos producidos en respuesta a un agente infeccioso. También describe técnicas como fijación de complemento que detectan la interacción entre anticuerpos y antígenos. El documento explica los principios subyacentes a estas pruebas serológicas y cómo se usan para diagnosticar recientemente infe

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    PPT DE DIAGNOSTICOS POR Diagnóstico Por Métodos Inmunológicos

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    El documento describe varios métodos inmunológicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Estos incluyen pruebas serológicas como aglutinación, precipitación e inhibición que detectan anticuerpos producidos en respuesta a un agente infeccioso. También describe técnicas como fijación de complemento que detectan la interacción entre anticuerpos y antígenos. El documento explica los principios subyacentes a estas pruebas serológicas y cómo se usan para diagnosticar recientemente infe

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    Diagnóstico Por Métodos Inmunológicos

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    El documento describe varios métodos inmunológicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Estos incluyen pruebas serológicas como aglutinación, precipitación e inhibición que detectan anticuerpos producidos en respuesta a un agente infeccioso. También describe técnicas como fijación de complemento que detectan la interacción entre anticuerpos y antígenos. El documento explica los principios subyacentes a estas pruebas serológicas y cómo se usan para diagnosticar recientemente infe

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    Tcnicas inmunolgicas

    Tcnicas serolgicas

    DIAGNSTICO POR
    MTODOS
    INMUNOLGICOS

    Principios de Diagnstico Inmunolgico


    Las enfermedades infecciosas pueden ser
    diagnosticadas definitivamente solo por tres formas:
    1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente
    conocido capaz de provocar la enfermedad, por observacin
    directa en el material clnico obtenido del paciente o por cultivo
    de laboratorio (in vivo o in vitro)
    2) Deteccin de un producto especfico del agente infeccioso
    (que no pueda formarse sin la presencia del agente) en el
    material clnico obtenido del paciente
    3) Deteccin en el suero del paciente de una
    respuesta inmunolgica especfica dirigida contra el
    Agente infecciosos

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Categoras de la respuesta inmune


    Respuesta inmune mediada por clulas

    o Inmunidad Celular
    Respuesta inmune mediada por anticuerpos o
    Inmunidad humoral

    Para determinar si se ha producido un anticuerpo contra un


    agente en particular, se investiga en el suero (o plasma) del
    paciente la presencia de anticuerpos
    El diagnstico de las enfermedades por la medicin de los
    niveles de anticuerpo en suero se
    denomina serologa

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Caractersticas de los Anticuerpos


    Mecanismo determinado genticamente
    Dirigidos contra un antgeno o determinante

    antignico (eptope)
    Los microorganismos pueden contener
    numerosos determinantes antignicos
    Habr por lo tanto numerosos
    anticuerpos para cada antgeno
    Muchos determinante antignicos
    requieren ser expuestos

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Caractersticas de los Anticuerpos


    Los anticuerpos se unen a la superficie de los

    patgenos para:
    Facilitar su ingestin

    por las clulas


    fagocticas
    (Anticuerpos
    opsonizantes u
    opsoninas)

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune
    Contribuir a su destruccin por la accin ltica

    del complemento (Anticuerpos fijadores de


    complemento)

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Caractersticas de los Anticuerpos


    Aunque el ser humano produce varias

    clases de anticuerpos los mtodos


    serolgicos han sido desarrollados
    para medir principalmente dos clases:
    Inmunoglobulina M (IgM)
    Inmunoglobulina G (IgG)

    Solo en un caso se han desarrollado mtodos para

    detectar la Inmunoglobulina A (IgA): Toxoplasmosis

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Caractersticas de los
    Anticuerpos
    IgG
    Se producen mas

    tardamente pero
    persisten mas tiempo.
    Dos imgenes
    especulares, formadas
    por dos protenas, con los
    sitios de fijacin para el
    antgeno en el extremo.
    Unin mas espedfica al
    antgeno (avidez)

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Caractersticas de los
    Anticuerpos
    IgM
    Es el primer anticuerpo

    producido en respuesta a
    un antgeno (infeccin
    reciente)
    Cinco protenas idnticas
    unidas por la cadena J
    Unin al antgeno menos
    avida.
    No fija complemento

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Respuesta humoral relativa frente a un


    estmulo antignico

    Caractersticas generales de la
    respuesta inmune

    Interpretacin de las pruebas serolgicas


    El dogma central de la serologa es el

    concepto de aumento de ttulo


    Ttulo de un anticuerpo es la recproca de
    la mayor dilucin de suero del paciente en la
    cual an se puede detectar el anticuerpo
    Pacientes con gran cantidad de anticuerpos
    tendrn ttulos altos
    Dos muestras de suero: perodo agudo y convalecencia. Se procesan
    pareados.
    Un aumento de ttulo de dos diluciones al medio (1:8 a 1:32) se
    considera diagnstico de infeccin reciente (aumento de cuatro veces el
    ttulo)
    En la actualidad se cuentan con metodologas que permiten manejar
    valores mas continuos, en ocasiones hasta en forma cuantitativa

    Principios de los Mtodos Serolgicos


    Reaccin Antgeno-Anticuerpo
    La reaccin entre un antgeno y un anticuerpo
    dirigido especficamente contra l da lugar a un
    complejo antgeno anticuerpo

    Utilizada ampliamente en los laboratorios para


    la deteccin y cuantificacin de gran cantidad
    de sustancias en diversos medios biolgicos.

    Reacciones de
    Aglutinacin
    Cuando
    el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo,
    el complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una
    aglutinacin
    El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin
    de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los
    antgenos
    Los anticuerpos IgM son mas eficaces para aglutinar (Anticuerpos
    completos). Los anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos
    (Anticuerpos
    incompletos)
    Se expresan como aumento
    de ttulo
    Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de
    antgeno o anticuerpo sin aglutinacin

    Reacciones de
    Aglutinacin
    Factores que influyen en las reacciones de
    aglutinacin
    Carga de las partculas
    Tipo de anticuerpo
    Concentracin de electrolitos
    Viscosidad
    Nmero de determinantes antignicos
    Se emplean tanto para la deteccin de antgenos
    como de anticuerpos.
    Se pueden hacer de dos maneras: directas o
    indirectas

    Reacciones de Aglutinacin Directa


    Para deteccin de antgenos
    Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos
    Distintos tipos de tcnicas segn la naturaleza fsica de soporte
    Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visibles
    Deteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis,
    Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
    Streptococcus agalactiae
    Hemaglutinacin pasiva: hemates como soporte
    Coaglutinacin: bacterias muertas como soporte; Staphylococcus
    aureus expresa la Protena A capaz de fijar el Fc de los anticuerpos

    Reacciones de Aglutinacin Directa


    Para deteccin de anticuerpos
    Se pueden hacer en tubo, portaobjetos,
    placa o pocillo de microplaca
    Se enfrentan las partculas microbianas
    (generalmente muertas) en suspensin
    con el suero del paciente.
    Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman
    agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la
    microplaca
    Deteccin de anticuerpos frente a Brucella (Reaccin de Huddleson) o
    Salmonella (Reaccin de Widal

    Reacciones de Aglutinacin Indirecta


    Para deteccin de anticuerpos
    Se adsorben los antgenos en un elemento partculado (partculas de
    ltex, gelatina o bentonita, o clulas como hemates humanos, ovinos
    o de pavo
    Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al
    suero del paciente.
    Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo,
    porta o pocillo de microplaca
    Deteccin de Treponema pallidum, Echinococcus granulosus

    Pruebas de Antiglobulina
    Se puede utilizar el microorganismo entero o adsorbido a un soporte
    particulado.
    Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al suero del
    paciente.
    Se incuba la muestra con una anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (antigamma)
    Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o
    pocillo de microplaca.
    til para detectar anticuerpos incompletos, en especial en Brucelosis.

    Reacciones de Inhibicin
    Basadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar
    determinadas actividades biolgicas en presencia de anticuerpos
    especficos. Las mas utilizadas son dos:
    Inhibicin de la Hemaglutinacin
    Algunos virus (Rubeola, Influeza, Parainfluenza, Parotiditis, Adenovirus)
    se unen a receptores de la superficie de los hemates provocando su
    aglutinacin.
    Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos
    especficos en el suero del paciente
    Neutralizacin
    Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico habitual en
    clulas de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos especficos.

    Pruebas de Fijacin de Complemento


    Se incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de anticuerpos
    en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.
    Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos).
    Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la
    activacin del complemento , consumiendo todos los componentes del
    sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece.
    Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a
    anticuerpos antihemates (hemolisina)
    Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a
    los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos de lisan.
    Se utiliza en laboratorios de referencia para diagnsticos de virus
    respiratorios

    Reacciones de
    Precipitacin
    Formacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno soluble y
    el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en solucin
    El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas de
    nefelometra o inmunoturbidimetra, que pueden a su vez ser adaptadas a
    autoanalizadores de qumica clnica o instrumentos especializados
    (nefelmetros o inmunoturbidmetros)
    Se pueden usar para determinar protenas reactantes de fase aguda
    como PCR o demostrar infecciones previas por Streptococcus pyogenes
    por AELO (neutralizacin ltica de estreptolisina O)
    Tambin pueden ser observados por tincin
    en placas de agarosa

    Inmunodifusin doble
    Tcnica de Outcherlony
    Se enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble con un
    antisuero problema en un medio gelificado
    Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos elementos
    puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de
    precipitacin que pueden ser identificadas a simple vista o mediante
    tincin proteica
    Se emplea en la prctica en la deteccin de anticuerpos frente a
    diversos hongos productores de neumonitis por hipersensibilidad

    Inmunodifusin Radial
    Tcnica de Mancini
    Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos
    diluciones del antgeno.
    Si se corre simultneamente una curva patrn puede cuantificarse
    por regresin la cantidad de antgeno.
    Es mas til para para la deteccin de antgenos que de anticuerpos

    Contrainmunoelectroforesis
    Puede ser utilizada tanto para detectar antgenos como anticuerpos
    Combina la electroforesis (migracin de antgenos y anticuerpos en un
    gel de agarosa por accin de un campo elctrico) con la precipitacin
    (formacin de lneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se
    produce la reaccin antgeno-anticuerpo)
    El antgeno de carga negativa en medio
    alcalino migra hacia el anodo, es decir hacia
    los pocillos del anticuerpo. Los anticuerpos
    en estas mismas condiciones migran al
    polo negativo o ctodo.
    Se emplea en la identificacin del Arco 5
    de Echinococcus granulosus

    Pruebas con Anticuerpos Fluorescentes


    Se utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes
    (fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de
    acridina.
    Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un
    microscopio de fluorescencia
    Dos variantes:
    Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la muestra en un
    portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el
    florocromo (inmunofluerescencia directa IFD). Deteccin de
    Pneumocystis carinii en esputo inducido
    Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega primero el
    suero del paciente sobre antgeno improntado en portaobjetos; en la
    segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con
    fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI)

    Inmunohistoqumica enzimtica
    Se usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con
    enzimas.
    Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color.
    Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo
    pacientes infectados con Rabia

    Inmunoensayos
    Para detectar antgenos Metodologa ELISA
    Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos,
    esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc.
    Se aade la muestra problema con antgeno
    Se lava para eliminar otras protenas unidas en la muestra
    Se agrega un segundo anticuerpo contra el antgeno, unido a un marcador
    enzimtico (una enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rbano
    picante) .
    Se agrega el sustrato de la enzima, que dar un color si haba antgeno unido
    Diagnstico de Chlamydia trachomatis en muestras de cuello uterino

    Inmunoensayos
    Para detectar anticuerpos Metodologa ELISA
    Utilizan antgenos unidos a un elemento slido
    (esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al
    que se le aade suero del paciente.
    Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a os antgenos.
    La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con:
    Enzima
    Enzimoinmunoensayo (EIA)
    Istopo radioactivo (I125)
    Radioinmunoensayo (RIA)
    Sustancia fluorescente
    Fluoroinmunoanlisis (FIA)
    Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de centelleo (RIA)
    o un fluormetro (FIA)

    Inmunotransferencias
    Inmunobloting o Western Blot
    Separacin de antgeno proteico por electroforesis en gel de poliacrilamida
    Transferencia del antgeno separado a una membrana de nitrocelulosa
    Se incuba la membrana con el suero del paciente y se detectan los
    anticuerpos mediante una anti-inmunoglobulina humana conjugada con
    una enzima.
    Se forman bandas coloreadas donde se ha producido la reaccin antgeno
    anticuerpo.
    Se puede usar tanto para detectar antigenos como anticuerpos.
    Se emplea para confirmar resultados positivos de pruebas de tamizaje por
    EIA de anticuerpos frente al virus del SIDA

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