Cultivos de Protoplastos

CULTIVOS DE
PROTOPLASTOS
¿Qué es un
protoplasto?:
Componentes vivos de las
células que están rodeados
solo por la membrana
plasmática.
Las paredes celulares han
sido degradadas por
procedimientos mecánicos u
enzimáticos.
AISAMIENTO DE
PROTOPLATOS
Fuente para la obtención
de protoplastos
En teoría es posible
aislar protoplastos de
cualquier tipo de planta,
órgano o tejido, pero las
fuentes usadas
comúnmente son
mésofilo foliar y tejidos
cultivados in vitro como
células en suspensión,
callos, ápices de
plántulas generadas in
vitro.
1. Método Mecánico
Sumergir tejido en solución
hipertónica
Plasmólisis
Seccionar tejido y
liberación de protoplastos
2. Método Enzimático
Consiste en incubar las células en una mezcla de
enzimas degradantes de la pared (celulasas,
hemicelulasas y pectinasas), en soluciones
apropiadas y con estabilizadores osmóticos.
Trabajar con mezcla de enzimas
Los principales factores a tener en cuenta para el
éxito del método son:
 el tipo de enzimas que se usarán,
 la composición del medio en que ellas actuarán
 el material de origen de los protoplastos

Método Enzimático
Ejemplo de aislamiento de
protoplastos por método
enzimático
Diferencias entre ambos
métodos
METODO MECANICO METODO ENZIMATICO
Evita el daño Usado comúnmente

metabólico. Se obtiene una mayor
Se obtiene una cantidad cantidad de protoplastos.
pequeña de Evitar intoxicación por
protoplastos. desechos de degradación.
Se segregan desechos
citoplasmáticos.
Características de los
protoplastos aislados
•Conservan la heterogeneidad del
tejido original
•En los protoplastos libres, se
observan cambios por la
remoción de la pared celular.
•Es posible obtener híbridos
somáticos.
•Presentan totipotencialidad.
Protoplastos aislados de
células de raíz de zanahoria
CULTIVO DE
PROTOPLASTOS
Factores que afectan el éxito del cultivo:
- Tipo y edad del material de origen de los protoplastos.
- Sistema de cultivo y la densidad de los protoplastos
contenidos en él.
- Adecuada composición del medio de cultivo.
Sistemas de cultivo:
- Sólidos
- Líquidos
Composición de los
medios de cultivo
Los medios adecuados para el cultivo de
protoplastos siguen generalmente el modelo de los
utilizados para el cultivo de células in vitro.
Sales inorgánicas: concentración de Ca++, es crítico
para la estabilización de los protoplastos.
Estabilizadores osmóticos: manitol o sorbitol en
concentraciones de 0.3-0.7M.
Reguladores de crecimiento: auxinas y/o
citoquininas.
Otros: extractos naturales (extracto de levadrura,
vitaminas, azúcares, etc)
Cultivo en medios
líquidos
Generalmente usado para obtener híbridos
Se suspende en el medio liquido los
protoplastos aislados.
Con pipeta Pasteur se agrega 1ml de
suspensión en forma de gotas en placas
petri.
Sellar con parafilm e incubar en la oscuridad
o luz difusa a 25-26ºC.
Después de 1a 2 semanas de cultivo añadir
cada 7 días medio fresco.
Cultivo en medio sólido
Usado para obtener clones celulares o
selección de mutantes
Misma composición del medio líquido mas
agar o agarosa
Agregar a los protoplastos en suspensión un
volumen igual de un medio de agar derretido
Verter mezcla en placas petri y sellar con
parafilm.
Incubar igual que al medio líquido.
Desarrollo del cultivo de
protoplastos
Dentro de las 24 horas de cultivo se regenera la pared
celular primaria. Además, aumentan de tamaño, forman
filamentos citoplasmáticos y presentan mayor actividad
metabólica, síntesis de ADN.
Después de 1 a 7 días se inician las primeras
divisiones. Controladas por reguladores de crecimiento
(auxinas y citokininas, controlan los cambios en la
expresión del gen, la síntesis de ácidos nucleicos y
proteínas, la elongación celular y la división misma).
Dentro de 1 a 3 semanas forma pequeñas colonias.
Aislamiento
y
Cultivo
Evaluación de la eficiencia
del cultivo
Se basa en cálculos de:
- La viabilidad de los protoplastos aislados y de su
supervivencia.
- La regeneración de células.
- La frecuencia de la división celular.
- Las colonias obtenidas en relación a los protoplastos
sembrados.
Para evaluar viabilidad, se usan compuestos fluorógenos como el

diacetato de fluoresceína. Otro indicador confiable de células no
viables es la fenosafranina.
La tasa de supervivencia se calcula de la siguiente manera:
TS = Nº Protoplastos que sobreviven X 100

Nº Total de protoplastos
El coeficiente de células regeneradas (CCR) se calcula así:
CCR = Nº Protoplastos con pared celular X 100

Nº Total de protoplastos
La regeneración de la pared celular es una condición para que

los cultivos de protoplastos prosperen; esta pared se puede
visualizar fácilmente con “Calcoflour White” en un
microscopio de luz UV.
La frecuencia de la división, se verifica de 7 a 10 días de iniciado
el cultivo, comparando el número de protoplastos en división con
el número de protoplastos cultivados o de protoplastos que
sobreviven.
La frecuencia absoluta de división (FAD) es:

FAD = Nº Células en división X 100
Nº Total de protplastos cultivados

La frecuencia relativa de división (FRD) es:

FRD = Nº Células en división X 100
Nº Células que sobreviven

Los índices anteriores expresan la efectividad del periodo inicial,
puesto que éste es un período sumamente crítico en el cultivo,
tales valores también caracterizan adecuadamente la eficiencia
del cultivo (EC); este se relaciona con el número de colonias
regeneradas, en función de los protoplastos cultivados, así:

EC = Colonias regeneradas (Nº/caja) X 100%
Protoplastos sembrados (Nº/caja)

El índice EC expresa la capacidad de los protoplastos para
dividirse sostenidamente y para formar colonias.
Aplicaciones
1.- Fusión de protoplastos
Existen dos mecanismos de fusión de protoplastos:
a) Fusión espontánea.
b) Fusión Inducida.
-Fusión química requiere de un agente inductor, entre los que
tenemos: Nitratos, mezclas de sales, soluciones de
polietilenglicol (PEG)..
-Electrofusión: Inducción de la fusión de protoplastos mediante
un campo eléctrico.
FUSION DE
PROTOPLASTOS
Productos de la fusión de protoplastos
Fusión de protoplastos
Fusión de protoplastos
de células de mesófilo
Protoplast Fusion in Sugar Beet (Beta vulgaris)
(Fusión de protoplastos en beterraga azucarera)
Autores: Songui GUREL, Ekrem GUREL, Zeki KAY
El objetivo del
estudio es
encontrar un
protocolo de
fusión óptimo
para la obtención
de la mayor
cantidad de
heterocariontes,
junto con la
mayor tasa de
viabilidad.
Razones para usar la técnica:
Permite generar células híbridas con nuevas

combinaciones nucleares y citoplasmáticas
Supera las limitaciones de la mejora convencional
(mediante cruces).
La eficiencia en la fusión fue determinada midiendo la
viabilidad, la frecuencia de heterocariontas.
Conclusión
Se logró obtener una viabilidad y densidad óptima a
una concentración de 25% de PEG, con un tiempo de
incubación de 20 minutos.
Se observó que los híbridos obtenidos no desarrollaron

callos macroscópicos (fase caulogénica), por lo que se
cree es posible la formación de brotes adventicios o
embriones somáticos.
2.- Transformación Genética Con Protoplastos.
Transferencia de un gen a la planta de maíz
Protoplastos de maíz fueron incubados con el plásmido

pMP1 que contiene la región codificadora para NPT II
(neornicina fosfotransferasa lI= marcador resistencia a
kanamicina) y sometidos a un pulso eléctrico de alto
voltaje.
Se obtuvo colonias derivadas de protoplastos, con el
gen NPTII, producto de una exitosa transformación
genética.
•Protocolo para la
transformación genética
de células vegetales,
mediante el uso de
protoplastos.
Callos cultivados a
Partir de protoplastos
Regeneración de
plantas.
A un ritmo constante de división celular, las
colonias desarrolladas se pueden transferir a un
medio dirigido a la regeneración de plantas.
Requiere del uso de citokininas y la regeneración
de la planta se efectúa con la diferenciación
separada de la raíz del brote.
Si se utilizan protoplastos de cultivos celulares
formadores de embriones, las células pueden
producir los embriones directamente y regenerar
las plantas mediante embriogénesis somática.
La mayoría de especies de importancia
económica, a excepción de la papa, fracasan en
la regeneración de plantas a partir de
protoplastos ya que se encuentra restringido a
ciertos genotipos o células.
Actualmente es posible aplicar dicha tecnología
a los programas de fitomejoramiento de las
especies.
Regeneración de plantas
(nabo silvestre)

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CULTIVOS DE

 la composición del medio en que ellas actuarán

 el material de origen de los protoplastos

Evita el daño Usado comúnmente

Para evaluar viabilidad, se usan compuestos fluorógenos como el

TS = Nº Protoplastos que sobreviven X 100

El coeficiente de células regeneradas (CCR) se calcula así:

CCR = Nº Protoplastos con pared celular X 100

La regeneración de la pared celular es una condición para que

La frecuencia absoluta de división (FAD) es:

Permite generar células híbridas con nuevas

Se observó que los híbridos obtenidos no desarrollaron

Protoplastos de maíz fueron incubados con el plásmido

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