UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU

-------------------
École Doctorale
Sciences et Technologies
--------------------
Laboratoire de Microbiologie et
Biotechnologies Microbiennes
N° d’ordre…………..
(LAMBM)

THÈSE Présentée

Par SOMDA Kounbèsiounè Marius

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université de Ouagadougou

Option : Sciences Biologiques Appliquées

Spécialité : Microbiologie-Biotechnologie

Contribution à la dépollution de l’environnement par la

valorisation de la biomasse végétale au Burkina Faso : cas
de la biotransformation des résidus de mangues

Soutenue le 21 Février 2012, devant le Jury composé de :

Président : Comlan De SOUZA, Professeur Titulaire, Université de Lomé (Togo)

Membres : Alfred S. TRAORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thėse, Burkina Faso)

Philippe THONART, Professeur Titulaire, Université de Liège-Gembloux (Rapporteur, Belgique)

Georges AMANI, Professeur Titulaire, Université de Cocody (Rapporteur, Côte d’Ivoire)

Dayéri DIANOU, Maître de Recherche, CNRST/IRSS (Rapporteur, Burkina Faso)

 PREFACE DU PRESIDENT DU RA-BIOTECH.
L’école Doctorale régionale de Ouagadougou offre une formation doctorale de biotechnologie dans ses options : Biotechnologie
microbienne et cellulaire, Biotechnologie Animale et Biotechnologie végétale.
Elle regroupe la plupart des Universités de l’Afrique francophone sub-saharienne en un réseau : le Réseau Ouest Africain de
Biotechnologie (RA-BIOTECH) fruit de la coopération inter-universitaire et dont le siège est au CRSBAN, à l’Université de
Ouagadougou.
Les Universités et structures de formation des pays ci-dessous constituent les membres fondateurs de ce réseau : Bénin, Burkina Faso,
Côte d’Ivoire, Guinée-Conakry, Mali, Niger, Togo et d’autres partenaires comme le Centre International de Recherche Développement
sur l’Elevage en zone Sub-humide (CIRDES)-Bobo Dioulasso ; EISMV-Sénégal.
Ce réseau sous régional bénéficie de l’appui de plusieurs partenaires de l’enseignement supérieur : Association des Universités
Africaines -AUA, UNESCO, Banque Mondiale, CAMES, Agence Universitaire de la Francophonie -AUF, Agence Africaine de
Biotechnologie -AAB, etc.
L’école Doctorale que le réseau anime assure une formation de haut niveau à travers une recherche utilitaire sur plusieurs thématiques
touchant la vie quotidienne des populations africaines. Cette école a permis au CRSBAN d’être érigé en pôle régional d’excellence en
Biotechnologie d’une part par l’AUA et d’autre part par l’AUF. Elle accueille des étudiants de plus de 14 pays d’Afrique centrale et
de l’Ouest.

Le réseau bénéficie aussi du soutien de certains spécialistes des biotechnologies des universités du Nord : Université de la
méditerranée (France), Université Louis Pasteur de Strasbourg (France), Centre de Génétique Moléculaire de Gif-sur-Yvette-CNRS
(Paris France), Université de liège (Belgique), Faculté Universitaire de Gembloux (Belgique) , Université de Rome, Université
Agronomique de Wagenningen .

L'importance des biotechnologies dans la résolution des problèmes de développement socioéconomiques des pays de l’Afrique sub-
saharienne (Alimentation, Santé, Environnement, etc.) Justifie amplement la mise en place de cette formation. Elle est cogérée par un
comité pédagogique international africain, constitué par des enseignants, des chercheurs, tous spécialistes dans les divers domaines des
biotechnologies.
La mutualisation des expériences par toutes ces compétences est un atout majeur pour la formation des ressources humaines de qualité
au profit du continent africain et de l’humanité.
Pr. Alfred S TRAORE
Professeur titulaire de Biochimie Microbiologie
CRSBAN/UFR-SVT/Université de Ouagadougou
Chevalier de l’ordre du mérite
Officier de l’ordre des palmes académiques/ CAMES
Directeur pédagogique du CRSBAN
Chevalier de l’ordre national
Chevalier de l’ordre international

i
 «Le merveilleux est la chose la plus noble dont nous puissions

faire l’expérience. C’est l’émotion qui se tient près du berceau de la

véritable science.

Celui à qui cette émotion est étrangère et qui ne peut

s’émerveiller ni s’étonner, celui-là est comme s’il était mort».

Albert Einstein.

ii
 DEDICACE

A mon père Yvon et ma Mère Djina

Pour le support et la compréhension dont il s ont fait preuve a

mon egard tout au long de mes études…

A mes sœurs Theodile et Madeleine

A mon Grand père Wend-yanin, médaillon d’honneur à Dien

bien-fu dont le courage et la combativité ont été des modèles
pour moi

iii
 REMERCIEMENTS

Le présent travail a été effectué au Burkina Faso au Centre de Recherche en Sciences

Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN) de l‟Université de Ouagadougou et en
Belgique au Centre Wallon de Bio-industries (CWBI) à l‟université de Liège.
Bien de personnes ont été très actives à l‟accomplissement de cette œuvre. Aussi voudrais-je
personnellement leur témoigner ma très grande reconnaissance.
Je témoigne ma grande reconnaissance aux illustres rapporteurs et membres du jury qui ont bien
voulu me faire l‟honneur de juger ce travail. Principalement aux Pr. Alfred S. TRAORE, Pr.
Comlan De Souza, Pr. Georges AMANI, Dr. Dianou DAYERI, Pr. Philippe THONART.
Mes profonds remerciements vont droit :
Au Professeur Alfred S. TRAORE, responsable de la formation de troisième cycle au
Département de Biochimie-Microbiologie, et Directeur du Centre de Recherche en Sciences
Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN) et Directeur de cette thèse, pour
l‟opportunité qui m‟a été offerte pour réaliser mes travaux de recherche dans les meilleures
conditions possibles. Par ailleurs, ses enseignements et sa disponibilité constante à m‟assister
m‟ont largement aidé à m‟orienter dans ma jeune carrière scientifique. Puisse-t-il trouver dans ce
document, la concrétisation de ses multiples conseils et encouragements pour lesquels je lui
exprime toute ma reconnaissance.
Je tiens tout particulièrement à exprimer ma reconnaissance et ma profonde gratitude au
Docteur Aly SAVADOGO pour avoir guidé mon stage de DEA qui a abouti aux travaux de la
présente thèse. Sa participation tant enrichissante à mon encadrement du DEA à la thèse, la
qualité et la rigueur scientifique exigées à mon égard et ses conseils si précieux surtout dans
l‟élaboration de mes protocoles d‟études m‟ont été d‟un grand recours. Il a permis la valorisation
des résultats de mes travaux à travers plusieurs publications dans des journaux internationaux.
Mes remerciements vont droit au Professeur Nicolas BARRO pour sa contribution si
enrichissante dans la valorisation des résultats de mes travaux, ses conseils, ses encouragements
et surtout d‟avoir relever notre moral pendant les instants difficiles.
Je remercie le professeur THONART de m‟avoir accueilli dans son laboratoire CWBI
(Centre Wallon de Bio-industries) à l‟université de Liège (Belgique) et pour sa disponibilité ainsi
que ses conseils précieux.

iv
 J‟adresse toute ma reconnaissance aux enseignants du CRSBAN qui ont chacun à un
moment donné ou à un autre contribué efficacement à ma formation. Je pense en particulier au
Pr. Aboubakar S. OUATTARA, et aux Dr Cheik A.T. OUATTARA, Philippe NIKIEMA,
Marcel D. BENGALY, André Jules ILBOUDO, Marcel D. Imaël N. BASSOLE.
Mes sincères amitiés aux personnels techniques du CRSBAN qui ont contribué chacun à sa
façon à la réalisation de cette thèse, particulièrement à Benoît Sa TRAORE technicien de
laboratoire au CRSBAN.

J‟ai passé des bons moments avec les doctorants du CWBI : Rasoul de l‟université de
l‟Iran, Delia de l‟université de la Roumanie, wissal, Asma, Wafa de l‟université de la Syrie et du
Maroc, Irène du Centre Agro-Biotech de l‟université de Gembloux. J‟ai bénéficié également de
l‟expérience des chercheurs du CWBI: Christophe, Sabri, Julien, Slim. Que toutes ces personnes
recoivent le témoignage de mon amitié.

Je remercie mes aînés Docteurs pour leur encouragement : Dr. Fidèle TIENDREBEOGO,
Dr. Ynoussa MAIGA, Dr. Christel NADEMBEGA.

Mes remerciements vont aussi à tous les doctorants du CRSBAN pour leur soutien :
CHeikna ZONGO, Rakieta COMPAORE, Isidore O. Juste BONKOUNGOU, Zara NIKIEMA,
Léon NITIEMA, Zenabou SEMDE, François TAPSOBA, Monique SORO, Pauline
OUEDRAOGO, Clarisse COMPAORE, Assèta KAGAMBEGA, Oumar TRAORE, Nicolas
OUEDRAOGO, Joseph SAWADOGO, KOURAOGO Rakeita, Chaibou YAHOU, Joseph
MAKAYA. Merci et surtout bon courage à vous pour la suite de vos travaux.

Je remercie enfin tous mes amis pour leurs encouragements et leurs multiples soutiens :
Mr. Bienvenu Martin SOMDA, Hamidou ILBOUDO, Lucien BADO doctorants à l‟université de
Bobo Dioulasso, Denise ILBOUDO doctorante à l‟université de Milan (Italie), François
KIEMDE, Olivier OUEDRAOGO, Berthine DABIRE, Abel ILLA, Harouna SAMA, Mahamat
ABDELLATIF, Antoinette OUEDRAOGO, Fatouma ABDOULATIF, Cymphor MEDA.

Je remercie dernièrement ma très chère fiancée Flore W. D. Bissyandé, elle qui a supporté
mes multiples absences liées à la préparation de cette thèse, je voudrais qu‟elle trouve
aujourd‟hui une raison de se consoler.

v
Merci à tous ceux dont les noms n‟ont pu être cités mais qui, de loin ou de près, ont discrètement
mais efficacement, contribué à l‟aboutissement de ce travail.

La réalisation de l‟ensemble des travaux de la présente thèse a été rendue possible grâce à
l‟appui financier du Programme ISP / IPICS (International Sciences Programm/ International
Programm in the Chemicals Sciences, Suède), de l‟UEMOA (Union Economique et Monétaire
de l‟Afrique de l‟Ouest), de l‟IFS (Fondation Internationale pour la Science, Suède). Que ces
donnateurs soient assurés de me sincères remerciements.

vi
Résumé

Cette thèse a porté sur la valorisation des résidus de mangues par la biotransformation et
l‟optimisation des rendements de conversion de ces résidus en bioéthanol. Les travaux réalisés
s‟incrivent dans un axe de recherche des énergies renouvelables, notamment dans le domaine des
biocarburants.
L‟analyse chimique des résidus de mangues montre qu‟ils renferment 22,62% (g/g)
d‟hydrates de carbone, dont 5,7 % (g/g) de sucres réducteurs, substrats exploitables pour la
biofermentation. La sélection de microorganismes performants nécessaires pour la
transformation des carbohydrates de résidus de mangues en bioéthanol, a permis de retenir six
(6) souches levuriennes et deux (2) bactériennes. Ces souches qui ont été isolées par des
techniques standards de microbiologie présentent les atouts nécessaires pour leur utilisation en
fermentation éthanolique. Parmi les souches de levures caractérisées, la souche de levure S3 a
fourni une conversion maximale des résidus de l‟ordre de 12 g/L de bioéthanol.
L‟étude de l‟influence des paramètres environnementaux sur la performance des
microorganismes, a conduit à la sélection de ceux capables de s‟adapter aux facteurs externes par
la conservation de leurs propriétés métaboliques. Les souches de levures caractérisées (A1, S1,
S3, B1, W1, W6) sont thermo-tolérantes (45°C) et alcoolo-tolérantes (14 % v/v). Les souches
bactériennes (Bacillus sp1 (A1M1), Bacillus licheniformis) renferment des enzymes (α-
amylases) hydrolysant les polymères des polysaccharides complexes comme l‟amidon et ses
derivés. Les taux de sucres réducteurs dans les résidus de mangues ont été optimisés pour
atteindre 62 % à 78 % (g/g) sous l‟action des enzymes provenant d‟espèces de Bacillus.
Les procédés d‟optimisation combinant une saccharification du substrat par Bacillus
suivie d‟une fermentation par Saccharomyces sp, ont permis d‟obtenir des concentrations de
bioéthanol de l‟ordre de 14 à 16 g/L. Ces concentrations atteignent 18 à 21,75 g/L avec l‟ajout de
sels minéraux dans le milieu de fermentation. Il ressort de cette étude que les résidus de mangues
constituent une biomasse potentiellement valorisable par voies biotechnologiques. Cela
permettra de diversifier les sources d‟alcool à coût réduit en utilisant des substrats peu onéreux
que sont les résidus de mangues.

Mots-clés : Mangue, résidus, microorganismes, valorisation, bioéthanol

vii
Abstract
This study relayed on was the valorization of mango residues by their biotransformation
into bioethanol and the optimization of the conversion yield. The achieved works are oriented in
the research of the renewable energy, notably in the domain of biofuels.
The chemical analysis of mango residues showed 22.62% (g/g) of carbon hydrates, along
with 5.7% (g/g) of reducing sugars.
The selection of efficient microorganisms for the transformation of the carbohydrates of
mango residues into bioethanol, permitted to retain six (6) yeast strains and two (2) bacterial
strains. These strains that have been selected by microbiological standard technics, present the
necessary assets for their use in ethanolique fermentation. Among the selected yeast strains, S3
gave the highest conversion yield of the mango residues in the order to 12 g/L of bioethanol.
Indeed, the study of the influence of environmental parameters on the strains‟
performance drove to the selection of those capable to adapt to the external factors while keeping
their properties. The yeast strains selected (A1, S1, S3, B1, W1, W6) were found thermo-tolerant
(45°C) and alcoolo-tolerant (14 % v/v). The bacterial strains (Bacillus sp1 (A1M1), Bacillus
licheniformis) produced some enzymes (α-amylases) which can hydrolyze the polymers of the
polysaccharides complex as starch and its derivatives. The rates of reducing sugars in the mango
residues have been optimized to reach 62 % to 78 % (g/g) under the action of the enzymes issued
from the Bacillus strains. The processes of optimization which combined a saccharification of
the substrate by Bacillus strains followed by Saccharomyces fermentation, permitted to get
concentrations of bioethanol ranging from 14 to 16 g/L. These concentrations reached 18 to
21.75 g/L with the addition of mineral salts and nitrogen source in the medium of fermentation.
It appears from this study that mango residues constitute a biomass potentially valorizable by
biotechnical way. The process will allow to produce alcohol at low cost from various substrates
such as mango residues.

Keys words: Mango, residues, microorganisms, valorization, bioethanol.

viii
Listes des articles et communications

a) Articles publiés

1. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Production of alcohol from mango (Mangifera Indica L.) using strains of
Saccharomyces and Schizosaccharomyces genera isolated from wasted mangos in Burkina Faso.
Biosci. Biotech. Res. Asia. 7(2): 529-536, (2010).

2. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Thermotolerant and alcohol-tolerant yeasts targeted to optimize hydrolyzation from
mango peel for high bioethanol production. Asi. J. Bioetch. 3(1): 77-83, (2011a).

3. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Improvement of bioethanol production using amylasic properties from Bacillus
licheniformis and yeast strains fermentation for biomass valorization. Asi. J. Biotech. 3(3): 254-
261, (2011b).

4. M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, N. BARRO, P. THONART, A. S.TRAORE. Effect of

mineral salts in fermentation process using mango residues as carbon source for bioethanol
production. Asi. J. Industri. Engineer. 3(1): 29-38, (2011c).

b) Communications

1-M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.TRAORE.

Isolement et characterization de souches de levures d‟intérêt industriel au Burkina Faso
Communication orale. Journées portes ouvertes sur les travaux des doctorants. (Mai 2009,
Université de Ouagadougou/ Burkina Faso).

2- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.

TRAORE. Valorization of agri-resources of Burkina Faso by the biofuels production. Poster
presented at the International conference of Research ISP/IPICS Networks/1-4 September, 2009,
Addis-Abeba (Ethiopia).

ix
3- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.
TRAORE. Valorization of agri-resources of Burkina Faso by the biofuels production.

Communication at the International conference on Waste and Biomass Residues valorization in

Developing countries. Waste Engineering/2Eie.9-11 July, 2009, Ouagadougou (Burkina Faso).

4- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A.

S.TRAORE. Valorisation de la biomasse végétale (mangues) par la recherche de source de
biocarburant et contribution à la dépollution de l‟environnement. Communication orale. Journées
portes ouvertes sur les travaux des doctorants. (Février 2010, Université de Ouagadougou/
Burkina Faso).

5- M. K. SOMDA, A. SAVADOGO, C. A. T. OUATTARA, A. S. OUATTARA, A. S.

TRAORE. Valorization of agri-resources of Burkina Faso by the biofuels production. Poster
presented at the International conference of Environment Wastes and Durable Development
Networks/28 March-02 April, 2010. Alexandrie (Egypt).

x
Liste des abréviations

a) Organismes et institutions

CEAS : Centre Ecologique Albert Schweitzer

CRSBAN : Centre de Recherche en Sciences Biologiques Alimentaires et

Nutritionnelles
FAO : Food and Agricultural Organisation
IFS : International Foundation for Science
ISP / IPICS : International Science Programme/ International Program in the Chemical
Sciences
UFR/SVT : Unité de Formation et de Recherche/Sciences de la Vie et de la Terre
b) Autres abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN : Acide Ribonucléique
CPG : Chromatographie en phase gazeuse
DHAP : Dihydroxyacétone phosphate
DO : Densité optique
EMP : Voie d‟Embden Meyerhof Parnas
F6P : Frucose 6 Phostate
G6P : Glucose 6 Phostate
PEP : Phosphoénolpyruvate
PGA: Phosphoglycérate
SSF : Procédé de saccharification et fermentation simultanée
T: Température
X: Biomasse
Xo : Biomasse initiale
YE/S : Rendement en éthanol produit par rapport au substrat consommé
YX/S Rendement en biomasse produite par rapport au substrat consommé

xi
c) Lettres grecques
α: Alpha
ß: Bêta
μ: Vitesse spécifique de croissance
μmax : Vitesse spécifique de croissance maximale

xii
xiii
xiv
xv
xvi
INTRODUCTION

L‟épuisement à terme des réserves de pétrole brut ainsi que la prise en compte des
problèmes liés à l‟environnement ont conduit à rechercher des sources alternatives aux énergies
d‟origine fossile (Makkar et Cameotra, 2002). La crise pétrolière de 1973, l‟augmentation
progressive du prix du baril de pétrole, ainsi que les différentes crises économiques que traverse
le monde, ont créé une conjoncture favorable au développement des biocarburants par la
transformation des matières premières d‟origine végétale. Les plantes et les déchets agricoles sont
vis-à-vis de la biologie, sources de substances fermentescibles pour la production de bioéthanol,
pouvant être employé comme combustible (Alazard-Toux et al., 2006). La recherche sur les
énergies renouvelables prend de l‟essor dans l‟optique de préserver l‟environnement d‟une
exploitation non contrôlée.
Dans le contexte de developpement durable pour l'Afrique et le Burkina Faso en
particulier, la protection de l'écosystème figure parmi les priorités. En ce sens qu'il faut
promouvoir la gestion des déchets afin de réduire leur impact sur l'environnement. La biomasse
végétale accumulée constitue une source de déchets biologiques pouvant engendrer la pollution
environnementale. Ainsi il est nécessaire de gérer les déchets agro-industriels en y extraiant les
biomolécules qu‟ils renferment pour les valoriser si l‟on veut réduire cette pollution.
En effet plusieurs techniques de valorisation des résidus agro-industriels sont aujourd‟hui
connues dans le monde. Il s‟agit essentiellement de techniques de biotransformation.
Des techniques de biotransformation sont améliorées au Brésil et aux USA où la production de
bioénergie est axée sur la matière végétale à travers la synthèse de bioéthanol, par la
fermentation de différents sucres contenus dans les déchets (Sree et al., 2000; Kim et Dale 2004;
Farell et al., 2006; Baï et al., 2008). Ces sucres sont présents dans un état plus ou moins
polymérisé dans de nombreuses espèces végétales comme la bétterave, la canne à sucre, le blé, le
maïs, mais également dans le bois (Naim et al., 1983). Le Brésil a produit 14,2 millions de litres
d‟éthanol en 2004 par fermentation de la canne à sucre (Licht, 2005). L‟équipe de Lee en 1992
au Japon a pu amélorer la capacité fermentative de Zymomonas mobilis et obtenir ainsi 40 g/L
d'éthanol sur 100 g/L d'amidon (Lee et al., 1992).
En 2000, une autre équipe de chercheurs Japonais dirigée par Montesinos , a réussi à obtenir
67 g/L d'éthanol sur de la paille de blé, en utilisant successivement des α-amylases et
glucoamylases (Montesinos et Navarro, 2000) .
1
En effet l'amélioration du taux de sucres fermentescibles dans la matière brute est faite en
utilisant des enzymes spécifiques telles les α et ß amylases (Nakurama et al., 2002; Gupta et al.,
2003).
En Afrique, le Maroc a fait des essais de production de bioéthanol à partir de l‟amidon
essentiellement extrait du maїs en utilisant des α-amylases du champignon Candida tropicalis.
L‟utilisation de cette technique a permis d‟accroître le rendement de production de bioéthanol
jusqu‟à 56 g/L (Latifa et al., 2007). En Côte d'Ivoire, Yeboua (1989) utilisant l'hydrolysât
d'amidon de manioc a obtenu un rendement de 0,502 g d'éthanol pour 1 gramme de matière
utilisée.
Le Burkina Faso n‟est pas en reste dans cette dynamique de recherche sur les bioénergies à
travers la production d'alcool. De nombreuses expérimentations sont en cours pour la production
de bioéthanol à partir de la canne-à-sucre (Saccharum officinarum), et de la betterave
(Betavulgaris) et également la production des bioesters sur les grains de coton (Gossipum sp.).
Actuellement ce moment, une politique basée sur la production de biocarburants à partir de
Jatropha (Jatropha curcas) est largement vulgarisée à travers tout le pays. Au Burkina Faso,
chaque année on enregistre une production importante de fruits (substrats très riches en
carbohydrates fermentescibles). En effet la production annuelle est d'environ 150000 tonnes dont
on estime 1/3 de pertes (Fogue, 1998). Ces pertes sont liées à plusieurs facteurs : le temps
d'écoulement des fruits sur le marché, les conditions de conservation et les attaques par les
parasites. Ces déchets peuvent aussi causer de sérieux problèmes sanitaires et environnementaux
(De Laroussilhe et al.,1980). Toutefois, les résidus issus de ces pertes sont susceptibles de servir
de matières premières dans la valorisation des déchets.
Des stratégies sont recherchées pour la valorisation des déchets de mangues issus non
seulement des pertes annuelles mais également de l‟activité industrielle. Elles visent aussi à
contribuer à la dépollution de l‟environnement et à améliorer l‟environnement sanitaire pour les
populations.
La principale voie de valorisation des mangues est assurée par les techniques de
transformation et de conservation dévelopées par des unités industrielles telles que : DAFANI,
CEAS, STATION MAYA etc. Mais ces unités gèrent une faible proportion des quantités
produites. Les pertes demeurent toujours importantes malgré les transformations susmentionnées
et les exportations.

2
Environ 3000 tonnes de mangues fraîches seulement sur 50000 tonnes de production, ont été
exportées vers l'Europe en 2002 (Rey et al., 2004).
Les résidus issus de différentes pertes et transformations industrielles sont susceptibles de
servir de matières premières en biotechnologie. La biotransformation de ces résidus de mangues
constitue donc une deuxième voie de valorisation de la production des fruits (mangues) au
Burkina Faso, à travers la production de divers solvants (bioéthanol) ou de biocombustibles
(biogaz, biocarburants).
Notre travail s‟incsrit dans cette dynamique de production de bioéthanol à partir des résidus
de mangues sous l‟action de microorganismes. L‟objectif général est de valoriser les déchets de
mangues par la biotransformation de sucres fermentescibles qu‟ils renferment et partant
contribuer du même coup à la dépollution de l‟environnement.
Pour ce faire nous nous donnons comme objectifs spécifiques:
La détermination de la composition chimique et macromoléculaire des résidus de
mangues, afin d'évaluer leur potentiel de bioconversion en alcool;
Le screening à partir de différents biotopes de la flore microbienne capable de convertir
les sucres en alcool dans des conditions de mésophilie (20-30°C) et de thermophilie (45-
50°C) avec des rendements économiquement intéressants;
L‟étude des conditions optimales de métabolisme des souches sélectionnées;
Le suivi de la cinétique de production de bioéthanol pour déterminer les souches les plus
performantes et l‟optimisation du rendement en bioéthanol, en utilisant des processus
simultanés d'hydrolyse et de fermentation dans le même milieu réactionnel.

3
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

4
I. GENERALITES SUR LES MANGUES

1. Historique et évolution de la filière mangue

Le manguier (Mangifera indica) aujourd‟hui très apprécié en Afrique de l‟Ouest pour ses
fruits et son ombrage est pourtant d‟introduction récente en Afrique.
Originaire d‟Inde, le manguier a été signalé pour la première fois en Afrique de l‟Ouest,
au Sénégal, en 1824. C‟est à la fin du 19è siècle que les manguiers ont commencé à connaître une
diffusion significative, surtout dans les zones côtières. Leur extension deviendra importante
pendant la première moitié du 20è siècle. Une des variétés de manguiers “Amélie” introduite au
Mali vers 1890 fut à l‟origine de nombreux plants greffés qui furent largement diffusés dans les
pays limitrophes. Dès la fin des années 1940, des collections furent établies progressivement dans
toute la zone et, au cours de la décennie 1970-1980, chaque pays d‟Afrique de l‟Ouest
francophone possédait au moins une collection de manguiers (Rey et al., 2004), (Figure 1).
Le Mali fut le premier pays à exporter, vers la fin des années 1960, des mangues vers
l‟Europe. Il fut suivi par le Burkina, la Guinée, le Sénégal, et surtout la Côte d‟Ivoire, dont les
exportations, d‟environ 2500 tonnes au début des années 1990, ont été multipliées par 4,5 en
2000. Cette croissance rapide des exportations ivoiriennes a bénéficié de la présence d‟une façade
maritime et d‟un effet de masse créé par les exportations de bananes et d‟ananas. La varièté
“Amélie” a longtemps constitué l‟essentiel des exportations de mangue du Mali, du Burkina Faso
et de la Côte d‟Ivoire. Cependant dès 1971, des expéditions expérimentales de mangues colorées
furent réalisées avec succès. La consommation de mangues s‟augmentant en Europe, le choix
variétal s‟est progressivement resserré : Amélie, en début de campagne, puis Kent, Keitt et
Palmer (Rey et al., 2004). Parallèlement à cette évolution variétale, les techniques de
conditionnement se sont progressivement modernisées.

5
Figure 1 : Zone d‟extension du manguier en Afrique de l‟Ouest francophone (Rey et al., 2004).
 : Site de production de mangues.

2. Importance des mangues au Burkina Faso

Les fruits sont en général des produits alimentaires à haute valeur nutritive et
commerciale. Ils contribuent à l‟amélioration du bien-être social et à de l‟état de santé des
populations (FAO, 1999). Ces fruits contiennent généralement de la vitamine A dont la
déficience provoque souvent un sévère problème de santé publique (Nana et al., 2006). Au
Burkina Faso, diverses spéculations fruitières sont rencontrées, dont 4 connaissent une activité
économique importante. Il s‟agit de la mangue, des agrumes, de la banane et de l‟anacarde
(Ouédraogo, 2002).
6
Occupant 57,73% de la superficie du verger national et 55,78% de la production fruitière
nationale, la mangue constitue la première culture fruitière du Burkina Faso (SICAREX, 2000).
L‟exportation des produits fruitiers, incluant la mangue fraîche ou séchée, vers des pays
de la sous région, de l‟Europe et de l‟Asie constitue une source d‟entrée notable de devises pour
l‟économie burkinabé. Ces exportations représentaient une valeur d‟environ un milliard cent
trente millions (1.130.000.000) de francs CFA en 2002 pour la mangue séchée (JUDICOME,
2004). Selon les responsables du terminal fruitier de Bobo-Dioulasso, citant les services de
Douane du Burkina Faso, les exportations de mangues fraîches en direction de l‟Union
Européenne pour la campagne 2005-2006 étaient de l‟ordre de 2000 tonnes. Une étude du
ministère de l‟agriculture conduite en 2004 par le cabinet JUDICOME estimait à environ 5332
tonnes les exportations de mangues fraîches du Burkina Faso vers la sous région. Selon la même
source, l‟importance de la filière mangue pour l‟économie nationale vient aussi du fait qu‟elle fait
fonctionner de petites unités de transformation et tout un réseau de démarcheurs et de
transporteurs, constituant ainsi, une source de revenus pour des milliers de personnes à travers le
pays. Dans les régions Ouest et Sud-Ouest du Burkina Faso où sa production est développée, la
mangue constitue une source de revenu pour des milliers de producteurs et contribue à améliorer
l‟alimentation des populations locales. De ce fait, dans le cadre de la politique de développement
des filières agricoles, la filière mangue a été retenue comme une des filières porteuses pour le
Burkina Faso.
Aussi, l‟ouverture du terminal fruitier de Bobo-Dioulasso en avril 2005 et l‟implantation
d‟une usine de transformation de fruits, dont la mangue à Orodara, traduisent la place et
l‟importance de cette filière dans les Hauts Bassins et particulièrement dans la province du
Kénédougou, souvent qualifiée de « verger du Burkina ». Cette province contribue en effet de
façon significative à la production fruitière du Burkina Faso.
Les pertes post-récoltes de mangues
A l‟instar des autres cultures, la mangue en Afrique, et particulièrement au Burkina Faso,
est attaquée par de nombreux prédateurs, dont les phytopathogènes, les insectes, et les acariens
(FAO, 1999). Les exportations de mangues fraîches du Burkina en direction de l‟Union
Européenne ont connu une baisse de l‟ordre de 10% entre 1995 et 2002, due aux problèmes
phytosanitaires (Dabiré, 2001; JUDICOME, 2004).

7
 La mangue occupe la première place en terme de production et d‟exportation de fruits au
Burkina Faso. Sa production annuelle est d'environ 150000 tonnes dont 50000 tonnes de pertes
(Fogue et al., 1998). Ces pertes sont liées à plusieurs facteurs :
- les attaques parasitaires (mouches Tifridili), champignons (Aspergillus), insectes (fourmis) ,
(Dodd et al., 1998 ; Vayssieres et al., 2004);
- la mauvaise conservation : altérations physiologiques et mécaniques, microbiennes,
enzymatiques et non enzymatiques ( De Laroussilhe et al.,1980) ;
- les mauvaises techniques de conditionnement qui accroissent les pertes lors des transferts des
mangues sur les marchés.
Les infections fongiques latentes retrouvées dans la mangue sont celles causées par:
Alternata Alternaria (Prusky et al., 1983), Colletotrichum sp. (Peterson, 1986), Dothiorella sp.
(Johnson et al., 1991) et Subglutinans Fusarium (Ploetz, 1994), lequel est présent dans la pousse
penche et dans les différentes parties du panicule (Kumar, 1983). Ces contaminants latents
peuvent altérer des parties cellulaires de tissu de la plante tel que le cortex, le phloème, le xylème
et la moelle du parenchymateuse. Ils affectent la survie de la culture en diminuant la perméabilité
de la membrane (Kumar, 1983).

3. Description générale du fruit (mangue)

La mangue est le fruit du manguier Manguifera indica L., un des arbres fruitiers les plus
anciennement cultivés (De Laroushile, 1980).
Le manguier est une plante de la famille des Anacardiacées appartenant à l‟ordre des Sapindales
et qui serait originaire de l‟Asie du Sud ou de l‟archipel Malais (De Laroushile, 1980).
Selon De Laroushile (1980), la mangue est une drupe (fruit charnu), plus ou moins aplatie
latéralement selon la variété. Sa forme est très variable (oblongue, réniforme, elliptique, ovoïde,
cordiforme ou aplatie) avec à l‟extrémité un bec qui peut être de différentes formes. Certaines
variétés donnent des fruits qui peuvent avoir moins de 100 g pendant que d‟autres donnent des
fruits atteignant 1 kg. Des fruits de taille moyenne sont toutefois plus recherchés pour la
commercialisation.
De l‟extérieur vers l‟intérieur, la mangue comporte plusieurs parties qui sont la peau ou
épicarpe, la pulpe ou mésocarpe et le noyau ou endocarpe (Figure2).

8
 La peau est assez mince chez les variétés cultivées et son épaisseur est généralement
inférieure à 1 mm. Elle est de couleur verte, devenant jaune à jaune-verdâtre chez certaines
variétés ou rouge-violacé, soit sur la totalité du fruit, soit par plage sur fond souvent jaune ou
orange. Elle présente des lenticelles plus ou moins apparentes.
La pulpe ou mésocarpe est de couleur jaune-orangée, avec une fermeté variable selon la
variété. L‟endocarpe ou noyau est plus ou moins garni de fibres extérieures qui peuvent pénétrer
dans la chair. Celles-ci sont plus ou moins nombreuses, dures et résistantes suivant les variétés.
La figure 2 illustre les différentes parties de la mangue. La condition recherchée chez les variétés
à grande valeur commerciale, est que même si les fibres se prolongent dans la chair, elles ne
doivent pas constituer une gêne à la consommation.
A maturité, les mangues de certaines variétés dégagent une odeur marquée, leur chair est
sucrée, très légèrement acidulée, avec une saveur variable. Les mangots (fruits des manguiers
sauvages) sont en général très fibreux et ont un goût nettement prononcé de térébenthine. Malgré
cela, ils sont très appréciés des populations locales. Ce goût de térébenthine persiste parfois
quoique atténué chez certaines variétés sélectionnées.

Figure 2 : Différentes parties d‟une mangue (De Laroushile, 1980).

9
 3.1 Caractéristiques des variétés
Selon Guira (2003), six variétés de manguiers greffés sont essentiellement cultivées dans
les vergers du Burkina Faso. Il s‟agit des variétés Amélie, Brooks, Kent, Keitt, Lippens et
Springfield.
 Amélie est une variété à port ramassé en boule et à nouaison bonne et très étalée. C‟est
une variété de pleine saison. Ses fruits de forme arrondie ont un poids variant entre 300 et 600 g.
Leur peau est de coloration vert-orange pendant que la chair de coloration orange-foncée est
molle, fondante.
 Brooks est une variété à port étalé. Elle donne de fortes récoltes avec une nouaison
abondante et groupée. C‟est une variété tardive dont les fruits oblongs de 450 à 910 g, sont sans
bec. La peau du fruit de couleur vert-jaunâtre, avec des lenticelles de taille moyenne, blanchâtres
est résistante et épaisse. La chair de couleur jaune-brillant est ferme, moyennement aromatique et
légèrement acidulée.
 Keitt est une variété tardive à production bonne et régulière. Les arbres de cette variété
ont un port étalé avec de longues pousses. Ses fruits ovales, sont sans bec avec des poids moyens
de 500 à 700 g. Cueillis à demi-coloration, ils mûrissent en 10 jours.
La peau du fruit, à fond jaune-orange est colorée en rose-carminé sur le coté au soleil avec de
nombreuses lenticelles jaune-pâles à roux et une assez forte pruine lavande. Epaisse et assez
résistante, la peau ne se sépare pas aisément de la chair qui est de couleur orange à jaune-foncée.
La chair est relativement ferme, avec un nombre important de fibres de longueur moyenne près
de la base du noyau, mais fines et non gênantes.
 Kent se caractérise par son port dressé à étalé avec des branches érigées peu ramifiées.
Variété de fin de pleine saison, elle donne régulièrement de bonnes récoltes. Ses fruits ovoïdes
sont sans bec, avec des poids moyens variant entre 440 et 740 g. La peau colorée de rouge-foncé
cramoisi en plein ensoleillement avec une légère pruine grisâtre, a une coloration à fond jaune-
verdâtre. Elle est épaisse et résistante et se sépare facilement de la chair. De couleur jaune intense
à jaune-orange, la chair est de consistance moyenne, sans fibres avec une saveur moyennement
aromatique.
 Lippens a un port étalé parfois érigé, avec un développement végétatif moyen et un
feuillage peu épais. C‟est une variété de saison qui a un bon rendement avec des fruits
légèrement aplatis, avec un bec arrondi. Leur poids moyen est compris entre 200 et 350 g.

10
La peau est de coloration jaunâtre et la chaire juteuse. Les photos présentent un manguier (a) et
les différents types de mangues (b).

a b

Photos 1: Manguier (a) et fruits (b) ( Banfora, Mai 2008. Prises par SOMDA K. Marius)

3.2 Composition et usage des mangues

La chair de la mangue contient de l‟eau, des glucides (amidon, sucres, cellulose, pectines),
des substances minérales, des lipides, des protéines et des esters. Elle contient aussi les vitamines
A et C; sa valeur diététique est due essentiellement à sa teneur en sucres et en vitamines.
L‟amidon se transforme en sucres au cours de la maturation du fruit et il en reste peu dans le fruit
mûr. Le tableau 1, établi par De Laroushile (1980), donne la teneur moyenne des différents
éléments constitutifs de la chair de la mangue ainsi que sa valeur nutritive.
Les mangues sont consommées vertes ou mûres pour leurs propriétés nutritionnelles.
Les mangues vertes sont utilisées pour la fabrication de condiments comme le « chutneys » et les
« pickles » très connus en Afrique australe et en Inde (De Laroushile, 1980). Les fruits mûrs sont
utilisés comme desserts, sorbets ou entrent dans la préparation de boissons et confitures.
Compte tenu de l‟importance des pertes annuelles des fruits sur les exportations de mangue et au
niveau des exploitations (baisse de la quantité et de la qualité de la production), un meilleur
système d‟exploitation serait nécessaire pour mieux gérer le secteur fruitier.

11
En effet, la valorisation des résidus de mangue constitue un enjeu primordial dans un pays
comme le notre où la production agricole est concentrée sur des courtes périodes de récolte.

Tableau 1: Composition de la pulpe de mangue

Constituants Teneur moyenne
Mangue verte Mangue mûre

Eau (%) 90,0 86,1

Protéines (%) 0,7 0,6

Lipides (%) 0,1 0,1

Glucides (%) 8,8 11,8

Fibres (%) 1,2 1,1

Matières minérales (%) 0,4 0,3

Calcium (%) 0,01 0,01

Phosphore (%) 0,02 0,02

Fer (% mg/g) 4,5 0,3

Vitamines A (UI) 150 4800

Riboflavine (mg/100 g) 0,03 0,05

Thiamine (mg/100 g) 0,04

Vitamine C (mg/100 g) 3 13

Acide nicotinique (mg/100 g) 0.3

Valeurs en calorie pour 100 g 30 50 - 60

Source : (De Laroushile, 1980)

Par ailleurs, des techniques de conservation et de transformation ont été développées par
certaines structures telles CEAS (Centre Ecologique Albert Schweitzer), STATION MAYA etc.,
afin de mieux valoriser ce fruit. Mais cela s'avère insuffisant compte tenu du faible taux
d'exportation. Environ 3000 tonnes de mangues fraîches ont été exportées vers l'Europe en 2002,
sur une production annuelle d'environ 150000 tonnes dont 1/3 de pertes (Rey et al., 2004).

12
Ainsi les résidus de mangue considérés comme déchets agro-industriels, peuvent constituer une
importante source de biomasse pour la production de bioéthanol.

II. BIOMASSE ET BIOETHANOL

1. Définition et sources de biomasse

La biomasse est l'ensemble de la matière organique d'origine végétale, animale ainsi que
les sous-produits de transformation (Beer et al., 2006).
Dans le domaine de l'énergie, le terme de biomasse regroupe l'ensemble des énergies
provenant de la dégradation de la matière végétale. Le terme «biomasse» désigne également l'énergie
récupérable à partir de différentes matières organiques (bois, déchets, cultures), par combustion ou par
tout autre procédé (http://www.actu-environnement.com,2011). La biomasse est une énergie
renouvelable tant que sa consommation ne dépasse pas l'accroissement biologique.
Cette biomasse d‟origine végétale provient initialement de l‟activité photosynthétique nécessitant
de l‟énergie :

Photosynthèse aérobie : nCO2 + nH2O + Lumière (h ) (CH2O)n + nO2

Photosynthèse anaérobie : nCO2 + 2nH2S + Lumière (h ) (CH2O)n + nH2O + 2nS

avec ΔGo’= 2870 Kj/mole (www.biologie.univ-mrs.fr,2011).

En effet la biomasse formėe par photosyntėse peut constituer une fraction biodégradable
générant à nouveau de l‟énergie :

On distingue trois constituants principaux, auxquels correspondent des procédés de valorisation

spécifiques :

• La biomasse lignocellulosique, ou lignine, constituée par : le bois et les résidus verts, la paille,
la bagasse de canne à sucre, le fourrage. La valorisation se fait plutôt par des procédés par voie
sèche, dits conversions thermochimiques.

13
• La biomasse à glucides, riche en substances glucidiques facilement hydrolysables : céréales,
betteraves sucrières, cannes à sucre, résidus agro-industriels. La valorisation se fait plutôt par
fermentation ou par distillation dits conversions biologiques.

• La biomasse oléagineuse, riche en lipides : colza (Brassica napsus), palmier à huile (Eleae
guineensis) dont la valorisation se fait par extraction.
(http://www.biomassenergycentre.org.uk,2011)

2. BIOETHANOL

2.1 Définition et historique

Le bioéthanol se définit comme de l‟alcool produit par synthèse chimique à partir

d‟hydrates de carbones, ou par fermentation à partir de la biomasse. Seule cette deuxième façon
de procéder mérite l‟appelation bioéthanol (Perréon-Delamette, 2004). Le bioéthanol connaitra
un essor avec le développement de l‟automobile. Ainsi lorsque Henry Ford conçut son modèle T
de véhicule au début du 20ème siècle, il pensait que l‟éthanol, produit à partir de matières
biologiques renouvelables, serait la principale source d‟énergie dans les transports. Après la
première guerre mondiale et jusqu‟en 1944, la consommation de bioéthanol comme carburant a
été significative et comprise entre 1 million et 2 millions d‟hectolitres par an, avec un pic à 4
millions d‟hectolitres en 1936 (Pasty, 2004).
Aujourd hui, d‟excellentes perspectives sont notées pour le bioéthanol suite aux soucis de
la dégradation de l‟environnement et celui de l‟épuisement des énergies fossiles comme le pétrole
ou le gaz. Il est probablement la source d‟énergie alternative la plus utilisée au monde (Agores,
2001). Le Brésil a decidé de produire un combustible à base de canne à sucre. En Amérique du
Nord le bioéthanol est utilisé comme agent améliorant l‟indice d‟octane pour l‟essence (Oestling,
2001).

2.2 Production de bioéthanol par voie fermentaire

La production d‟éthanol est controlée par différents facteurs qu‟on peut regrouper en trois
catégories : la maitière première ; les microorganismes et les technologies de mise en œuvre.

14
*La matière première : elle doit être un substrat riche en sucres susceptibles d‟être fermentés
(saccharose, glucose, fructose ou des composés cellulosiques ou amylacés).

Industriellement, les principales sources de matières premières les plus utilisées sont : les jus de
betterave, les mélasses de canne à sucre ou de bétterave, les égouts de sucrerie et les jus
d‟hydrolyse de diverses céréales (blé, maïs, riz et seigle).

*Les microorganismes: plusieurs micoorganismes interviennent dans ce processus de production

de bioéthanol. Ce sont les levures et bactéries des genres tels que : Saccharomyces, Candida,
Kluyveromyces, Brettanomyces, Hansenula, Pichia, Bacillus. Parmi les levures utilisées dans ce
processus de fermentation figure l‟espèce Saccharomyces cerevisiae.

*La fermentation : c‟est un processus de transformation biochimique au cours duquel un substrat

organique subit des changements chimiques, provoqués par l‟action des enzymes produit par les
micro-organismes (Jay, 1996). A partir de cette opération biochimique, l‟éthanol va être fabriqué.
Cette opération de fermentation est l‟étape la plus importante dans le procédé de production du
bioéthanol. Cette fermentation est ettayée par l‟équation de fermentation du glucose suivante :

C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 56Kcal

*La distillation : elle consiste à récupérer du milieu réactionnel, l‟alcool qui s‟y trouve. C‟est
l‟étape la plus coûteuse dans la fabrication de l‟alcool et qui permet de récupérer l‟éthanol
provenant de la fermentation (Cardona et Sanchez, 1997).

2.3 Utilisation du bioéthanol

L‟alcool d‟origine agricole (par voie fermentaire) est largement utilisé dans l‟industrie
agro-alimentaire, dans les industries chimiques, pharmaceutiques et parapharmaceutiques
(parfumérie). Egalement il peut être utilisé sous forme d‟éthanol hydraté, éthanol anhydre en
mélange avec l‟essence, le diesel, l‟ETBE (étyl-tertio-butyl-éther) ou l‟estérol.

15
Actuellement, les principaux pays producteurs d‟alcool sont le Brésil, les Etats-Unis et la France
(Fargione et al., 2008). Le tableau 2 présente la production du bioéthanol et autres formes de
biocarburant.

Tableau 2 : Différents types de biocarburant et leur production sur le plan international

Carburant Régions Sous- Production Rendement Production Gain

dominantes produits brute PB énergétique nette GES
de base, biomasse
(tep/ha) (tep/ha)
RE= PN/PB (%)

Ethanol

Canne à sucre Brésil Bagasse 2,28 a, c 0,81 e 1,8 87h

Betterave Europe Pulpes 2,53 a, c 0, 23 f 0,6 32h

Blé Europe Drèches 0,48 a, c 0, 23 f 0,1 30h

Maïs Etats-Unis Drèches 0,98 a, c 0, 20 g 0,2 12g

Huiles

Colza Europe Tourteau 0,98 b,d 0, 60 f 0,6 39h

Soja Etats-Unis, Tourteau 0,43 a, d 0, 48 g 0,2 41g

Brésil,
Argentine

Palmier à huile Tropicales Tourteau 3, 50 a, d 0, 89 e 3,1 70j

PB : production brute d‟éthanol ou d‟huile par hectare, en valeur énergetique ; PN : production énergétique nette
par hectare (production brute diminuée de la quantité d‟énergie nécessitée, corrigée de la contribution des sous-
produits) ; tep : tonnes équivalent pétrole. Le gain en gaz à effet de serre (GES) est la diminution, exprimée en %, de
dégagement de GES quand on utilise le biocarburant au lieu d‟essence (cas de l‟éthanol) ou de gazole (huiles), sans
tenir compte du changement d‟usage des sols.
Sources d’informations : a/FAO (2008) valeurs mondiales; b/ Ballerini (2006); c/ 0,5 tep pour 1 000 litres ; d/
0,787 tep pour 1 000 litres ; e/ FAO (2008) moyenne de la fourchette; f/ Concawe et al. (2007); g/ Hill et al. (2006);
h/ Gosse (2008); i/ Fargione et al. (2008).

16
 2.3.1 Avantages de l’utilisation du bioéthanol comme biocarburant

- L éthanol en remplaçant le plomb dans l‟essence, réduit les émissions de particules, notamment
de particules fines qui constituent une ménace pour la santé des enfants, des personnes agées
ainsi que des personnes atteintes de troubles respiratoires.

- Il est également utilisé à la place du benzène dans l‟essence (produit toxique cancérigène,
extrait de l‟essence),
- L‟éthanol est non toxique, soluble dans l‟eau et rapidement biodégradable.
- La plupart des obstacles à l‟incorporation du bioéthanol dans les carburants fossiles peuvent
facilement être surmontés.

2.3.2 Inconvénients de l’utilisation du bioéthanol comme biocarburant

L‟utilisation du bioéthanol comme biocarburant présente des atouts mais également des
inconvénients en certains points de son application :

- Du point de vue écologique, le principal inconvénient des carburants additionnés de bioéthanol

est la formation accrue d‟acétaldehyde (Oestling, 2001). L‟acétaldéhyde peut contribuer à la
formation de brouillard photochimique lorsqu‟il réagit avec d‟autres substances à base de
carbone organique volatile présentes dans l‟air.
- La formation de nitrates de peroxyacétyle (PAN) moins nocifs que le formaldéhyde peut aussi
advenir lors du mélange essence /bioéthanol.
- Le mélange avec le bioéthanol est moins énergétique que les carburants provenant du pétrole ;
en plus il est corrosif (Mustafa et al., 2008).
L‟optimisation et l‟intensification de la production de bioéthanol à partir de la biomasse
végétale nécéssite la recherche de souches microbiennes performantes et mieux adaptées. A cet
effet il s‟avère nécéssaire de faire le screening des microorganismes ayant un potentiel de
biotransformation et d‟étudier leurs propriétés physiologiques.

17
III. PHYSIOLOGIE ET METABOLISME DES MICROORGANISMES IMPLIQUES
DANS LA PRODUCTION DE BIOETHANOL

1. Taxonomie et morphologie des bactéries du genre Bacillus

Ce groupe de bactéries joue un rôle important dans l‟hydrolyse des polysaccharides en

sucres simples.

Les bactéries du genre Bacillus de la famille des Bacillaceae regroupent environ 70 espèces
bactériennes. Ce sont des bacilles à Gram positif, aérobies à anaérobies. Leur culture sur milieu
solide se caractérise par des colonies polymorphes, productrices de catalase.
Ce sont des souches sporulantes dont l‟extrême résistance des spores leur confère un caractère
ubiquiste. Les espèces appartenant au genre Bacillus constituent un ensemble de souches
génétiquement et phénotypiquement très hétérogène selon Combet-Blanc (1995).
Les morphologies des sporanges et de la spore sont des critères importants du point de
vue de la systématique. Gordon et al. (1973) en fonction de ces critères; proposent de classer les
espèces appartenant au genre Bacillus en trois groupes :
 Le groupe 1 comprend les espèces dont les spores sont ellipsoïdales et ne déforment pas le
sporange, mais la cellule mère contient la spore;

 Le groupe 2 comprend les espèces dont les cellules ont également des spores ellipsoïdales
mais déformant le sporange;

 Le groupe 3 comprend les espèces dont les spores sont sphériques et déformant le
sporange. Ce classement a été en grande partie conforté par les études nutritionnelles.

Les espèces du genre Bacillus ne sporulent que dans certaines conditions physiologiques
et, d‟une manière générale, en fin de phase de croissance. De plus, la proportion des cellules
sporulées varie considérablement suivant l‟espèce et même suivant la souche. Les spores
diffèrent des cellules végétatives par leur réfringence optique, leur composition chimique et leur
résistance aux agents physiques et chimiques. Chez certaines souches, l‟aptitude à sporuler peut
être perdue après une série de repiquages successifs (Combet-Blanc, 1995).
Les bactéries du genre Bacillus produisent des α-amylases et ß-amylases permettant de
dégrader les polymères glucidiques en glucose et en des molécules voisines telles :

18
fructose, mannose, galactose, tréhalose, saccharose… (Olsen, 2001). L‟habitat primaire des
Bacillus est le sol, mais on les retrouve dans les aliments où ils jouent des rôles utiles à néfastes
(Guiraud, 1998; Buchaman et Gibbous, 1975).

2. Taxonomie et morphologie des levures

2.1 Définition et caractéristique des levures

Les levures peuvent être définies comme des champignons unicellulaires mésophiles, de forme
ovoïdes se reproduisant par bourgeonnement ou fission, douées de pouvoir fermentaire. Elles
sont capables d‟assimiler un grand nombre de substrats carbonés mais incapables d‟utiliser
l‟amidon. Elles sont aérobies et anaérobies facultatives (Kreger-Van Rij, 1984).

Les champignons levuriformes sont des protistes eucaryotes unicellulaires, capables de se

développer en saprophytes ou en parasites sur presque tous les milieux, tout comme certaines
bactéries. Ce sont des micro-organismes hétérotrophes et l‟absence de chlorophylle, les
différencie à la fois des algues et des végétaux (Guiraud et al., 1984; Konlani et al., 1996).

Les cellules végétatives sont polymorphes et leur taille varie selon les espèces. Certaines
espèces peuvent former des associations cellulaires (pseudo mycélium) ou se présenter sous
forme de filaments (mycélium) à un certain stade de leur vie, elles sont ubiquistes dans la nature
et la majorité est non pathogène (Larpent et Larpent, 1990).

Les levures sont des micro-organismes chimio-organotrophes à métabolisme respiratoire

et fermentaire ; capables de se développer dans des conditions extrêmes. (Leclerc et al., 1995).
Elles se multiplient par un processus asexué (mitose) qui s‟effectue par bourgeonnement dans la
plupart des cas ou par scissiparité pour quelques espèces (Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe) ou encore par un processus intermédiaire de sporulation (Larpent
et Larpent, 1990).
Les caractéristiques les plus importantes pour les levures d‟après Bouix et Leveau (1993) sont:

- une fermentation rapide mais sans excès de croissance en biomasse ;

- une bonne conversion du glucose en alcool (éthanol);

19
- une résistance à la pression osmotique;

- un caractère floculant et éventuellement une bonne stabilité génétique dans le temps.

2.2 Classification des levures

Les levures appartiennent au groupe des champignons supérieurs et se répartissent

essentiellement en trois classes : les basidiomycètes, les ascomycètes, les deutéromycètes.
La classification de référence est celle de Lodder (1971) et Kreger Van Rij (1984). Elle est basée
sur les caractères morphologiques, physiologiques, biochimiques et nutritionnels des levures.

2.3 Multiplication des levures

La reproduction végétative des levures se déroule généralement par bourgeonnement ou

scissiparité (processus asexué) et dans certaines conditions une reproduction sexuée peut être
induite avec alternance d‟un cycle sporal, c'est-à-dire une phase haploïde et une phase diploïde,
(Leclerc et al., 1995).

2.3.1 Multiplication végétative asexuée

A l‟exception de quelques genres, les bourgeons apparaissent dans des zones à proximité
des extrémités des grands axes des cellules. Certaines espèces de levures sphériques sont
caractérisées par un bourgeonnement multilatéral. Il ne se produit pas deux bourgeonnements au
même site, exception faite du bourgeonnement bipolaire (Leclerc et al., 1995).

2.3.2 Reproduction sexuée

Lorsque le milieu devient défavorable (peu de nutriments) les levures cessent de se

multiplier par bourgeonnement et sporulent. Les levures sont des eucaryotes diploïdes donc
présentent les caractéristiques de la division cellulaire mitotique. Seule la membrane nucléaire
persiste, ce qui aboutit à la formation de l‟asque contenant les ascospores. Ces ascospores sont de
deux types « a ou α », chacun d‟entre eux après libération de l‟asque peut se développer en
cellule haploïde par bourgeonnement.

20
 La fusion d‟une cellule a avec une cellule α conduit à la formation d‟un zygote qui est
diploïde aα. Ce dernier peut à son tour se multiplier par bourgeonnement ou sporuler selon les
conditions du milieu (Leclerc et al., 1995).

3. Aspects physiologiques et métaboliques

Les levures ont un métabolisme de type fermentatif ou oxydatif selon l‟espèce considérée
et les conditions de culture. La première étape de transformation du glucose suit la voie
d‟Embden Meyerhof Parnas (EMP) aussi appelée glycolyse.
Cette étape qui se déroule dans le cytosol est commune pour la respiration et la fermentation. Elle
comprend une série de dix réactions, chacune catalysée par une enzyme spécifique.
La glycolyse conduit à la formation de deux molécules de pyruvate à partir duquel les voies de
respiration ou de fermentation seront activées.

3.1 La glycolyse

La glycolyse est la séquence de réactions enzymatiques conduisant à la transformation

dans le cytosol, du glucose en pyruvate. La première étape de la glycolyse chez la levure S.
cerevisiae implique le transport du glucose du milieu extérieur à travers la membrane. Ce
transport se fait par diffusion facilitée c'est-à-dire qu‟il se fait selon le gradient de concentration à
l‟aide d‟une perméase. L‟étape de transport exerce un niveau important de contrôle sur le flux
glycolytique chez cette levure et est extrêmement complexe. Au moins 17 gènes HXT (hexose
transporter) ont été identifiés (Kruckeberg, 1997). Ils codent pour des transporteurs qui ont des
affinités différentes pour le glucose avec un transport régi cinétiquement par des caractéristiques
enzymatiques. Ainsi par exemple les HXT 1et 3 auraient une faible affinité pour le glucose et
interviendraient lorsque la concentration en glucose dans le milieu serait élevée alors que les
HXT 6 et 7 auraient une forte affinité et interviendraient quand la concentration en glucose serait
faible. HXT4 aurait une affinité intermédiaire et HXT 2 une affinité dépendante des conditions de
croissance.
Toutefois la procédure expérimentale pour mesurer et interpréter les cinétiques de
transport du glucose reste encore le sujet d‟un débat continu (Teusink et al., 1999).

21
Le glucose est dégradé par la voie de la glycolyse ou encore voie d‟Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP) caractérisée par un intermédiaire qui est le fructose-1,6-biphosphate (FBP). La synthèse
de cet intermédiaire nécessite 2 ATP (voire figure 3).
Une aldolase rompt ensuite la molécule de FBP en deux trioses phosphate : le D-glycéraldéhyde-
3 phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP) en équilibre l‟un avec l‟autre grâce
à la triose-phosphate-isomérase.
La partie suivante comporte une oxydation et deux étapes formatrices d‟ATP. Elle
transforme le G3P en 1,3-bisphosphoénolpyruvate et du pyruvate. La transformation du G3P en
acide pyruvique engendre 2 ATP.
Comme chaque molécule de glucose donne deux trioses phosphate, sa transformation en deux
molecules de pyruvate produit 4 ATP, soit un gain net de 2 ATP. Le bilan énergétique est positif
même si les oxydations s‟arrètent au stade du pyruvate ; cependant 2 molécules de NAD+ ont été
transformées en NADH au cours de l‟oxydation catalysée par la glycéraldéhyde-3 phosphate
déshydrogénase et doivent être régénerées.
Il s‟agit d‟un des impératifs des cellules : outre faire de l‟ATP et récupérer des intermédiaires
utiles aux synthèses (6 précurseurs métaboliques sont synthétisés au cours de la glycolyse : G6P,
F6P, PEP, pyruvate, DHAP et PGA), la cellule doit reoxyder tous ses coenzymes réduits. Cela se
déroule dans la chaîne respiratoire dans le cas d‟un métabolisme oxydatif et grâce à la réduction
du pyruvate en éthanol dans le cas d‟un métabolisme fermentaire en anaérobiose. La figure 3
illustre les différents mécanismes.

22
Figure 3 : Schéma métabolique de la glycolyse et du cycle de Krebbs (Poilpré, 2002).
3.2 Le métabolisme oxydatif

Le métabolisme oxydatif du glucose aboutit à son oxydation comlpète en H2O et CO2 au

travers de la glycolyse, du cycle de krebbs et de la phosphorylation oxydative. Le bilan
énergétique s‟écrit ainsi :

C6H12O6 + 6 O2 6H2O + 6CO2 + (4+12 P/O) ATP

Avec P/O nombre de moles d‟ATP formées par atome d‟oxygène consommé.

23
 Le rendement de la conversion du glucose en biomasse en métabolisme oxydatif dépend
de la souche. Guillou (1996) a fourni une équation permettant de calculer les besoins théoriques
de l‟anabolisme pour la synthèse de 1 g de cellules d‟après la composition de la levure en
protéines, en acides nucléiques, en lipides et en hydrates de carbone :

7,6 10-3 C6H12O6 + 14,5 NAD+ + 7,9 NH3 + NADPH 1gX + 4,7 CO2 + 14,5 NADH + 7,9 NADP+

Le rendement théorique limite correspondant à cette équation est Yx/s = 0,73 gxg-1. Cependant
les rendements pratiques les plus élevés obtenus sont de l‟ordre de 0,5 gxg-1.
La régénération des coenzymes réduits NADH et FADH2 produits dans la voie de la
glycolyse et le cycle de Krebs se fait dans la chaîne respiratoire.
L‟éfficacité de la chaîne respiratoire est illustrée par le rapport P/O qui représente le nombre de
moles d‟ATP formées par atome d‟oxygène consommé.
Il est également variable selon la souche de levure considerée. La valeur du rapport P/O
est fréquemment sujette à discussion. Pour Saccharomyces cerevisiae, un nombre inférieur à 2 est
souvent rapporté (Bruinenberg et al., 1985).

3.3 Le métabolisme fermentaire

En anaérobiose la cellule est privée d‟un excellent accepteur d‟électron : l‟oxygène. En

l‟absence de celui-ci, la cellule utilise d‟abord un accepteur intermédiaire d‟électrons autre que
le NAD+ qui est transformé en NADH. Elle doit cependant pour régénerer les NAD+, fabriquer
son accepteur final qui dérive du substrat de départ.

Il s‟agit prinicipalement de l‟éthanol pour la levure. La réduction finale de l‟acétaldéhyde en

éthanol permet ainsi de maintenir l‟équilibre de la balance redox en réoxydant les NADH
produits au cours de la glycolyse.

L‟éthanol est rejeté dans le milieu. Le glucose est utilisé comme source d‟énergie puisque
de l‟ATP est formé en excédent. Mais le rendement est médiocre car chaque molécule de
glucose aboutit à la formation de 2 molécules d‟ATP alors que son oxydation complète en CO2
et H2O par le métabolisme oxydatif aboutit à presque 19 fois plus d‟ATP (Cette voie est fonction
du type de cellule inpliquée).

24
 La fermentation est en fin de compte le compromis trouvé par la cellule, moyennant des
oxydations incomplètes et une perte de matière carbonée tout en régénérant leurs NAD+. Le
bilan énergétique de la transformation du glucose en éthanol s‟écrit :

1 Glucose + 2 Pi 2 Ethanol + 2 CO2 + 2 ATP

Le rendement théorique limite Yp/s de cette conversion est de 0,51 gramme d‟éthanol par
gramme de glucose.
Ce rendement ne tient pas compte du fait qu‟une partie du glucose est convertie en anaérobiose
et transformée en biomasse (environ 0,1 g/g d‟après Kapelli, 1986). Les rendements pratiques Y
p/s sont en général moins élevés de l‟ordre de 0,4 g/g.
D‟autres produits secondaires sont aussi formés au cours de la fermentation comme
l‟acétate, le succinate et surtout le glycérol. La formation de ce dernier semble illogique d‟un
point de vue énergetique puisqu‟elle dévie une partie du flux de carbone de la portion de la voie
EMP productrice d‟énergie. Schulze (1995) explique la synthèse par le déséquilibre que crèe
l‟anabolisme sur la balance redox. Car si les NAD+ consommés dans la voie EMP, est équilibrée
par la réaction finale de formation de l‟éthanol à partir de l‟acétaldéhyde, la consommation des
intermédiaires pour l‟anabolisme déséquilibre la balance vers une acccumulation NADH.
La production de glycérol permettrait d‟oxyder les coenzymes réduits et d‟équilibrer la
balance redox au détriment d‟une dissipation d‟énergie.
La production de l‟acétate et du succinate accentue également le déficit de la balance redox et
leur production serait également à l‟ origine de la production d‟une partie du glycérol (Schulze,
1995). Le glycérol produit aurait en outre un rôle protecteur et osmorégulateur dans la cellule
(Mager et Varela, 1993).

3.4 Le métabolisme oxydo-réductif

Ce type de métabolisme engendre souvent la production d‟éthanol en présence d‟oxygène et

celle-ci, peut avoir plusieurs explications :

25
- Effet Crabtree observé sur les levures Crabtree positives. Une levure sera considérée comme «
Crabtree positive » si on observe pour de fortes concentrations de glucose une répression de son
métabolisme oxydatif et donc une formation d‟éthanol.
- En culture continue, Fiechter et al. (1981) ont demontré qu‟il existait chez Saccharomyces
cerevisiae un taux de dilution critique au-delà duquel la levure commence à produire de
l‟éthanol. Ce taux dépend fortement de la souche utilisée et du mode opératoire utilisé;

- Bardford en 1990 attribue le passage du métabolisme oxydatif au métabolisme oxydo-réductif

à une capacité respiratoire limite des microorganismes;

- Lei et al. (2001) fournit une autre interprétation du shift du métabolisme des levures (oxydatif /
oxydo-réductif) basée sur le phenomène d‟overflow au niveau des nœuds pyruvate et
acétaldéhyde. Au niveau du nœud pyruvate, l‟enzyme pyruvate désydrogénase à une affinité
plus forte pour le pyruvate que l‟enzyme pyruvate décarboxlyase, mais sa vitesse maximale est
plus faible. Aux faibles flux glycolytiques, le pyruvate est converti via la pyruvate
désydrogénase vers le cycle de krebbs. Quand le flux glycolytique dépasse une valeur critique,
la pyruvate désydrogénase est saturée et l‟acétaldéhyde est formé. Il en est de même au niveau
du noeud acétaldéhyde. Celui-ci est préférentiellement converti en acétate mais lorsque
l‟acétaldéhyde déshydrogénase est saturée, l‟acétaldéhyde serait transformé en éthanol. La
figure 4 illustre les voies métaboliques de respiration et de fermentation.

26
 Figure 4 : Schéma recapitulatif des voies métaboliques (respiration et fermentation) et
voies annexes pouvant conduire à la production des sous-produits

(Castro-Martinez, 2007).

3.5 Voie des pentoses phospates

La voie des pentoses phosphates illustrée dans la figure 5 part du glucose-6-phospate avec
deux oxydations successives aboutissant au ribulose-5-phosphate. A partir de celui, il se
produit deux isomérisations qui fournissent les intermédiaires essentiels que sont le ribose-5-
phosphate et le xylulose-5-phosphate. Une succession d‟échanges de chaînons carbonés a lieu
à partir du ribose-5-phosphate et du xylulose-5-phosphate, catalysés par des transaldolases et
transcétolases et aboutissant au fructose-6-phosphate et à un triose-3-phosphate.

L‟intérêt de la voie des pentoses phosphates pour le microorganisme est la fabrication de

deux métabolites essentiels :

Le ribulose-5-phosphate (matière première pour la synthèse des acides nucléiques également

intermédiaire essentiel chez les organismes photosynthétiques qui fixent le CO2 par le Cycle de
Calvin) et l‟érythrose-4-phosphate (précurseur du noyau aromatique dans les acides aminés
aromatiques : phenylalanine, tyrosine et tryptophane). Cette voie est également la source de
NADPH, agent réducteur requis pour certaines synthèses (exemple : les lipides).

27
 Figure 5 : Schéma métabolique simplifié de la voie des pentoses phosphates.
(Ben-Chaabane, 2006).

4. Besoins nutritionnels

Les levures nécessitent différents substrats pour leur développement. Ces substrats selon
leur concentration dans le milieu de culture et leur nature vont avoir un effet activateur ou
inhibiteur sur la croissance.

4.1 Assimilation de sources de carbone

Les composés carbonés représentent la source de carbone et d‟énergie pour les

microorganismes. Les fermentations alcooliques se font sur des milieux riches en sucres.
Les levures du genre Brettanomyces peuvent fermenter le glucose, le saccharose, le maltose, le
tréhalose, le cellobiose et le lactose (Smith et Van Grinsven, 1984).

28
Par contre, le genre Saccharomyces n‟a pas la capacité à fermenter le lactose, le melibiose, la
cellobiose, ni les sucres à 5 atomes de carbone comme la xylose ou l‟arabinose (Jones et al.,
1981). Ces deux genres de levures peuvent assimiler l‟éthanol, l‟acide lactique, l‟acide
succinique, entre autres.
En ce qui concerne les mécanismes d‟assimilation des sucres, selon Gaunt et al. (1988),
chez certaines levures comme Brettanomyces anomalus le glucose pénètre par transport actif;
alors que pour Gancedo et Serrano (1989) le transport du glucose se fait par diffusion facilitée
comme chez Saccharomyces. Géros et al. (1997) ont mis en évidence deux types de transporteurs
du glucose chez les levures (précisement Dekkera anomala): un transporteur de faible affinité qui
accepte aussi le fructose et un transporteur à haute affinité qui accepte le galactose, mais pas le
fructose.
Les levures du genre Saccharomyces peuvent également croître en présence de l‟éthanol
comme source de carbone, mais il faut d‟abord transformer l‟éthanol en acétate. Elles peuvent
aussi utiliser l‟acide acétique comme source carbonée jusqu‟à 3% v/v pour des valeurs de pH
comprises entre 3 à 6 (Géros et al., 2000).

4.2 Assimilation des sources d’azote

L‟azote représente environ 10% du poids sec de la cellule. Il joue un rôle capital car il
entre dans la constitution de molécules simples (acides aminés, nucléotides, vitamines et
coenzymes) essentielles au fonctionnement cellulaire.
Les études menées par Ribérau-Gayon et al. (1998) sur Saccharomyces ellipsoideus ont
montré que plus les levures sont riches en azote, plus forte est leur activité fermentaire et au
contraire plus faible est leur activité respiratoire. Cela pourrait s‟expliquer par la forte synthèse
d‟enzymes impliquées dans le processus de fermentation. L‟azote peut être utilisé par les levures
sous plusieurs formes (inorganique ou organique).
Les levures comme Brettanomyces bruxellensis et B. intermedius ont la capacité d‟utiliser les
nitrates contrairement aux genres Saccharomyces, Kluveromyces, Pichia… pour lesquels la seule
source d‟azote inorganique assimilée est l‟ion ammonium (Larpent, 1991).
L‟espèce Brettanomyces anomalus possède les enzymes nitrate réductase et nitrite
réductase. Cependant, ces enzymes sont inhibées par un excès d‟ammonium, ce qui favorise
l‟utilisation de sources d‟azote organique plutôt que minéral.
29
 En règle générale, le sulfate d‟ammonium et le phosphate di-ammonique sont les sels les
plus utilisés comme source d‟azote, puisqu‟ils apportent en même temps le soufre et le phosphore
nécessaire à la cellule (Brock, 1970). Enfin, l‟utilisation et l‟assimilation de l‟azote ammoniacal
et de l‟azote aminé varient selon la levure utilisée et sont affectées par de nombreux facteurs à
savoir, l‟aération, la concentration de substrat carboné, ainsi que par la propre concentration de la
source azotée.
Les études réalisées par Aguilar-Uscanga et al. (2000) sur les besoins nutritionnels de
Saccharommyces cerevisiae, et de Brettanomyces bruxellensis ont mis en évidence que le sulfate
d‟ammonium a une influence significative sur la consommation de glucose, la croissance et la
production d‟éthanol. Dans leurs conditions expérimentales, ces auteurs ont observé un effet
inhibiteur sur la croissance de ces levures lorsque la concentration en sulfate d‟ammonium
excède 2 g/L.

4.3 Assimilation du phosphore

Le phosphore est nécessaire pour la croissance de la levure et pour la fermentation. Il est

assimilable par la levure sous forme de phosphate par un mécanisme de transport actif (Jones et
al., 1981). Le rôle du phosphore est de maintenir l‟intégrité de la paroi cellulaire; il participe
aussi dans la synthèse de lipides et carbohydrates.
L‟ion phosphate n‟apparaît pas généralement comme limitant pour le développement de
Saccharommyces cerevisiae. Il semble que cet ion soit apporté en quantité suffisante dans les
milieux de fermentation « naturels » ou par l‟extrait de levure dans les milieux synthétiques.
Ainsi, Saccharomyces cerevisiae peut être considérée comme une levure peu exigeante sur le
plan nutritionnel (Aguilar-Uscanga et al., 2000).

4.4 Utilisation des oligo-éléments, vitamines et facteurs de croissance

Les oligo-éléments sont essentiels pour la cellule, puisqu‟ils réagissent comme cofacteurs
de diverses enzymes impliquées dans le métabolisme microbien. Ils sont nécessaires en très
petites quantités mais un excès peut provoquer une dénaturation d‟enzymes, une perturbation de
la morphologie et de la physiologie cellulaire, ainsi que de la vitesse de croissance (Blackwell et
al., 1995).

30
Par rapport aux facteurs de croissance, la plupart des levures sont considérées comme auxo-
autotrophes, puisqu‟il a été montré qu‟elles peuvent toujours avoir une croissance en l‟absence
complète de vitamine. Cependant la présence de ces vitamines est positive. Par exemple, en
milieu carencé en thiamine, la population levurienne finale est très faible (10% de la population
normale) et la transformation des sucres est extrêmement lente. De même en ce qui concerne la
biotine, Castro-Martinez (2007) a montré que son absence retarde beaucoup plus la fermentation
de sucre que la croissance.

5. Influence des paramètres environnementaux sur les microorganismes

La croissance microbienne est influencée par les constituants du milieu de culture et par
les facteurs physico-chimiques (température, pH, oxygène, etc…). Donc la connaissance de ces
facteurs environnementaux pour une levure donnée va permettre de connaître sa distribution
écologique et de contrôler son développement.
5.1 Effet de la température

La température est un facteur qui affecte profondément les micro-organismes, comme

tous les êtres vivants. En effet, les microorganismes sont particulièrement sensibles à la
température parce qu‟ils sont unicellulaires et que leur température varie avec celle du milieu
extérieur. Il est donc important de connaître les effets de la température sur la croissance du
microorganisme et la thermosensibilité des réactions catalysées par les enzymes. Aux faibles
températures (T< 10°C), l‟activité cellulaire microbienne peut être totalement bloquée. Par
contre, une élévation de la température (25°C < T< 37°C) va augmenter la vitesse de croissance.
En effet, on considère généralement qu‟à chaque augmentation de 10°C la vitesse de réaction
catalysée par une enzyme sera doublée (Torija et al., 2002). Alors, le métabolisme cellulaire sera
plus actif aux températures plus élevées et le microorganisme se développera plus vite.
Cependant, au-delà d‟un certain point, la croissance diminue et des températures élevées sont
létales, puisqu‟elles endommagent les micro-organismes en dénaturant les enzymes, les systèmes
de transport et d‟autres protéines. Les membranes microbiennes sont aussi détruites par la chaleur
(Converti et al., 1996).
Ainsi, même si certaines enzymes fonctionnelles sont activées à ces températures élevées,
le micro-organisme peut être tellement endommagé que sa croissance est inhibée, et ce de façon
irréversible (Prescott et al., 1995).
31
Dans le cas de faibles températures, les membranes perdent leur fluidité et les enzymes travaillent
moins rapidement. Enfin, la température optimale d‟activité est toujours plus proche de la
température maximale que de la température minimale.
La température a également une influence sur les voies métaboliques de la levure. Ainsi une
modification de la température de fermentation entraîne des différences dans la formation de
métabolites secondaires tels que le glycérol, l‟acide acétique, l‟acide succinique, etc., (Fleet et
Heard, 1993).

5.2 Effet du pH

Le pH est un autre facteur important de la croissance des levures, car il va déterminer

l‟activité métabolique des cellules. La valeur du pH a un effet sur la solubilité des nutriments et
sur la perméabilité de la membrane cellulaire (Martinez et al., 2003). Les pH alcalins sont, d‟une
façon générale, préjudiciables aux micro-organismes, la limite de leur développement se situant
pour des valeurs d‟ordre de 9 à 9,5. On observe pour les valeurs de pH entre 1 et 8 différents
types de comportement liés à l‟aptitude des microorganismes à tolérer et/ou métaboliser les
acides organiques (ou minéraux) présents dans le milieu. Ainsi, les bactéries en générale, sont
neutrophiles, présentant une meilleure croissance pour les pH voisins de 7 et sont partiellement
inhibées à une valeur de pH inférieure à 5. Au contraire, les levures et les moisissures présentent
une bonne aptitude à métaboliser les acides organiques et peuvent se développer très bien dans
une zone de valeurs de pH comprises entre 2,5 et 8,5(Martinez et al., 2003).
Contrairement à la température, le pH interne n‟est pas nécessairement égal à celui du
milieu de culture et sa valeur est proche de la neutralité dans la majorité des microorganismes.
Cette différence entre le pH interne et externe peut résulter de l‟imperméabilité de la membrane
plasmique aux protons. La concentration en ions hydrogène intracellulaire et extracellulaire n‟est
pas équilibrée et un gradient de concentration d‟ions peut être créé à travers la membrane.
Ce gradient de concentration, associé au potentiel électrique de la membrane, détermine la force
motrice des protons qui contrôle les réactions membranaires.
Le pH interne a une influence importante sur l‟activité des cellules et des systèmes
intracellulaires tels que la synthèse des protéines, les mécanismes de transport, l‟activité
enzymatique et l‟excrétion des métabolites pendant la fermentation (Liu et al., 2003).

32
Le pH externe, peut influer sur la vitesse avec laquelle les molécules sont transportées vers
l‟intérieur de la cellule et des valeurs de pH extrêmes peuvent endommager la membrane
cellulaire et provoquer la mort cellulaire (Liu et al., 2003).

5.3 Rôle de l’oxygène

L‟oxygène est une molécule nécessaire pour la biosynthèse de molécules indispensables

pour la cellule tout particulièrement celle des acides gras insaturés et des stérols qui protègent les
levures du stress alcoolique (Scheffers, 1992).
En fermentation alcoolique chez Saccharomyces cerevisiae, une faible aération est donc
indispensable pour assurer la survie des levures et l„épuisement complet des sucres en présence
de concentrations élevées en éthanol. De plus dans ces conditions, la vitesse spécifique de
production d‟éthanol est améliorée (Sablayrolles, 1992).
L‟oxygène est un “substrat” particulier puisqu‟il est difficile de le dissoudre comme
d‟autres substrats. Son apport doit donc être continu tout au long de la culture.
Cependant, lorsque la concentration levurienne dans le milieu devient importante, le transfert de
l‟oxygène dans le milieu devient limitant, les besoins de la biomasse étant supérieurs aux flux
transférés. La concentration d‟oxygène dissous dans le milieu de culture a été identifiée comme
l‟un des principaux facteurs contrôlant la capacité des levures à se développer en métabolisme
oxydatif. Par rapport à la présence d‟oxygène, les levures peuvent être aérobies strictes
(croissance en présence d‟oxygène) ou aérobies facultatives. Il n‟existe pas de levures anaérobies
strictes (Sablayrolles, 1992).

5.4 Effet des produits de fermentation et du dioxyde de soufre

En fermentation alcoolique, l‟effet des produits de la fermentation est très variable et

dépend des conditions du milieu de culture et des conditions environnementales. Dans cette
partie, nous nous limiterons aux effets liés à l‟éthanol, à l‟acide acétique et au dioxyde de soufre.

33
5.4.1 Effet de l’éthanol

L‟éthanol est le produit principal de la fermentation alcoolique. Son action est très
négative sur le développement des levures, sur la viabilité cellulaire, sur sa propre synthèse
(Charpentier, 1993). L‟inhibition de la croissance par l‟éthanol commence autour de 20 à 40 g/L
(Casey et Ingledew, 1986). Chez Saccharomyces la concentration inhibitrice (vitesse de
croissance = 0) est de l‟ordre de 70 à 110 g/L (Casey et Ingledew, 1986) selon l‟espèce. Pour la
production de l‟éthanol, la concentration inhibitrice peut aller jusqu‟à plus de 15% (v/v) pour
Saccharomyces cerevisiae (Hayashida et Ohta, 1981). Enfin, l‟effet de l‟éthanol sur la viabilité
cellulaire est moins marqué que sur la croissance elle-même (Casey et Ingledew 1986). L‟éthanol
peut aussi conduire à l‟inhibition de la fermentation (Moulin et al., 1984). Les facteurs qui ont
une influence sur la sensibilité de la levure à l‟éthanol sont la température, l‟aération et la
composition du milieu de culture.
Ainsi, plus la température de fermentation est élevée (30-40°C), plus la croissance, la
viabilité et la production d‟éthanol sont sensibles à l‟éthanol (Aldiguier et al., 2004).
L‟augmentation de l‟aération en condition de production d‟éthanol améliorerait les vitesses de
production d‟éthanol et diminuerait son effet inhibiteur sur la croissance. L‟effet inhibiteur de
l‟éthanol ajouté sur le taux de croissance et la vitesse spécifique de production dépend aussi des
conditions d‟aération. Pour ces deux paramètres, l‟effet inhibiteur de l‟éthanol diminue en
condition aérobie par rapport à l‟anaérobiose (Aguilera et Benitez, 1985).
La composition du milieu doit contenir des lipides et vitamines qui vont avoir un impact sur la
tolérance à l‟éthanol (Alfenore et al., 2002). Ces composés protégeraient la surface membranaire
de la cellule microbienne.
A ce jour les mécanismes d‟inhibition de l‟éthanol ne sont pas bien élucidés bien qu‟ayant fait
l‟objet de nombreux travaux.
Les premières études ont été faites par Nagodawithana et Steinkraus (1976) qui ont
démontré que l‟éthanol produit durant la fermentation était plus toxique pour les
microorganismes que s‟il est ajouté au milieu de culture. Par la suite, il a été montré que l‟éthanol
avait un effet inhibiteur sur les enzymes impliquées dans la glycolyse, spécialement sur
l‟hexokinase (Novak et al., 1981). On pense alors que l‟accumulation de l‟éthanol à l‟intérieur de
la cellule serait due à un problème de gradient de diffusion de l‟intérieur vers l‟extérieur.
34
 Mais cette théorie est contradictoire avec les résultats obtenus par Millar et collaborateurs
(1982) qui ne font pas état d‟effet inhibiteur de l‟éthanol au-dessous de 10%.
Strehaiano (1984) suggère que le problème d‟inhibition serait lié à d‟autres métabolites excrétés
par la levure tels que l‟acétate, les alcools supérieurs (Pampulha et Loureiro, 1989). L‟éthanol
perturbe aussi le flux transmembranaire de protons, qui tend à tamponner le pH du cytosol. Ainsi,
l‟activité ATPasique est alors activée pour rétablir un gradient électrochimique entre le milieu
cellulaire et extracellulaire, en dépensant plus d‟énergie.
Cette perte énergétique peut atteindre un niveau supérieur aux capacités cellulaires de
compensation. Le cytoplasme s‟acidifie et les perméases glucidiques deviennent inactivées c‟est
l‟arrêt de croissance (Leao et Van Uden, 1982).
Enfin, l‟explication la plus probable est donnée par Charpentier (1993). Cet auteur
explique le phénomène d‟inhibition par la présence de sites d‟action de l‟éthanol dans les sites
membranaires mitochondrial et cytoplasmique.
Ainsi, les molécules d‟éthanol pénètrent à l‟intérieur de la membrane cytoplasmique pour
s‟associer aux molécules d‟acides gras des phospholipides en se substituant aux molécules d‟eau.
Ce comportement entraîne une altération de la fluidité et de la perméabilité membranaire, causant
la mort cellulaire.

5.4.2 Effet de l’acide acétique

L‟acide acétique est un produit secondaire de la fermentation alcoolique produit en très

faibles quantités pour une fermentation classique. Cependant, il peut être produit par certains
micro-organismes (Brettanomyces) en quantités plus importantes, ce qui est une des
conséquences redoutées en cas de contamination pendant la fermentation. Maiorella et
collaborateurs en 1983 ont montré qu‟une concentration d‟acide acétique comprise entre 0,5 à 9
g/L peut affecter la morphologie des levures Saccharomyces qui deviennent irrégulières.
Plus tard, il a été montré que l‟acide acétique est un puissant inhibiteur de la croissance de
Saccharomyces sous sa forme non dissociée (toxique). Cette inhibition est plus marquée sur la
synthèse de biomasse que sur la production de l‟éthanol et indépendante du pH du milieu de
culture (Phowchinda et al., 1995). Le mécanisme d‟action de cet acide faible se situe au niveau
de l‟acidification du cytoplasme et de la modification de certaines enzymes de la glycolyse
(Pampulha et Loureiro, 1990), particulièrement l‟hexokinase.

35
 Sur l‟effet conjoint de l‟éthanol et de l‟acide acétique Pampulha et Loureiro (1989) ont
observé que le pH interne est indépendant de la concentration en acide acétique dissocié et du pH
externe. Par contre, il dépend de la concentration en acide acétique non dissociée.
De ce fait, quand le pH interne décroît, la vitesse de fermentation diminue et devient nulle pour
un pH interne de 4,8. Lorsque la concentration en éthanol est supérieure ou égale à 8%,
l‟inhibition est plus importante et elle devient complète pour un pH interne de 5,5.
D‟autres auteurs ont souligné que l‟acide acétique diminue la tolérance des levures à
l‟éthanol: Ramos et Madeira (1990), ont observé que la concentration critique en éthanol passe de
11% sans acide acétique à 0% pour 1% d‟acide acétique.

5.5 Effet du dioxyde de soufre

Le dioxyde de soufre (SO2) est le plus ancien additif utilisé en vinification. Le rôle
principal du SO2 est de sélectionner la flore fermentaire, les levures étant plus résistantes que les
bactéries. Il est aussi un antioxydant et un solvant.
Le dioxyde de soufre est une molécule qui peut se présenter sous différentes formes
chimiques en fonction du pH. Ces formes sont illustrées dans la figure 6. Des constantes de
dissociation régissent le passage d‟une forme à l‟autre.
Le dioxyde de soufre libre est la forme principale qui agit sur la croissance des micro-
organismes, ce qui fût confirmé par Ingram et Buttke (1984). Selon Macris et Markakis (1974)
seule la forme H2SO3 de la partie libre est active vis-àvis des levures. La forme HSO3-
(majoritaire dans le vin), se combine d‟autant plus que le pH est élevé.

36
Figure 6 : Les différentes formes de l’anhydride sulfureux (Castro-Martinez, 2007).

Le SO2 combiné à des concentrations supérieures à 30 mg/L prolonge la phase de latence

et limite la croissance dans le vin. A plus de 50 mg/L de SO2 combiné ou de 100 à 150 mg/L de
SO2 total, la croissance peut être complètement inhibée (Wibowo et al., 1985). Un pH bas et une
quantité élevée d‟éthanol agissent de façon synergique avec le SO2. Les levures peuvent
également produire des sulfites pendant la fermentation alcoolique. Habituellement 10 à 30 mg/L
de sulfite sont produits au maximum.
La plupart des souches de S. cerevisiae en produisent moins de 10 mg/L. Néanmoins, il
existe des souches qui produisent jusqu‟à 100 mg/L (Alexandre et al., 2004). La résistance des
souches de levures au dioxyde de soufre est connue pour être génétiquement déterminée et
transmise aux générations suivantes, même en l‟absence de dioxyde de soufre (Beech et Thomas,
1985). De plus, cette résistance va dépendre de l‟espèce et de la souche de levures. Ces auteurs
ont rapporté que Saccharomycodes ludwigii et Zygosaccharomyces bailii peuvent supporter des
concentrations en SO2 supérieures à 500 mg/L.

37
 Romano et Suzzi (1992) ont établi une liste des levures de vinification tolérantes au
dioxyde de soufre telles que : Saccharomyces, Saccharomycodes, Torulaspora,
Zigosaccharomyces et Brettanomyces/Dekkera. Concernant plus particulièrement le
Brettanomyces, son comportement varie selon l‟oxygène et la concentration du SO2 ajouté au
milieu de culture. DU-Toit et collaborateurs (2005) rapportent que des concentrations entre 0,25
et 0,35 mg/L de SO2 moléculaire inhibent la croissance de Brettanomyces bruxellensis après un
jour d‟incubation. Par contre, la présence d‟oxygène diminue l‟effet du SO2 chez Brettanomyces.
Le mécanisme d‟action antimicrobienne du dioxyde de soufre n‟est pas complètement
élucidé. En 1987, Ough et Crowell, ont proposé le mécanisme suivant: le SO2 pénètre dans la
cellule par transport actif. Après, dans le cytosol, il peut directement se lier aux molécules
carbonylées, les rendant inaptes à emprunter les voies métaboliques normales qui leur sont
destinées. Une autre possibilité du dioxyde de soufre est de s‟intégrer à la place du soufre dans
les protides soufrés, ce qui les dénature (Yang, 1973). Finalement, la forme active du SO2 diffuse
librement dans la cellule et se retrouve sous forme de HSO3- au pH interne qui est autour de 7 ce
qui s‟accompagne d‟une accumulation de sulfite chargé qui réagit avec les constituants cellulaires
et conduit à la mort cellulaire (Gunnison, 1981).
Cependant, ces mécanismes restent du domaine des hypothèses. Beech et Thomas (1985)
résument les actions intra et extracellulaires du dioxyde de soufre de la manière suivante:
limitation des substances nutritives et de l‟oxygène, adsorption, peroxydation des lipides,
inhibition de la glycolyse, destruction de la thiamine, dommages sur les protéines post-
structurelles, élimination des intermédiaires des cofacteurs et des vitamines, transformation de
l‟ADN et de l‟ARN, mutations (Dorange et Dupuy, 1972).
Au niveau métabolique, le dioxyde de soufre agit en se combinant au glucose et à la
dihydroxyacétone-P, au pyruvate et à l‟acétaldéhyde, à l‟acide oxaloacétique et à l‟acide
α-cétoglutarique.

6. Mécanismes de répression catabolique

L‟activation des voies métaboliques de la levure dépend des mécanismes génétiques de la

cellule et des facteurs physico-chimiques tels que : le pH, la température, l‟oxygène, la présence
de composés inhibiteurs et la concentration en substrats.

38
Dans ce sens, la concentration en glucose et l‟aération dans le milieu de fermentation jouent un
rôle important. Ainsi, divers mécanismes de régulation ont été décrits chez les levures
(Saccharomyces, Brettanomyces) tels que: l‟effet Pasteur, l‟effet Crabtree et l‟effet Custer.

7. Etablissement des équations cinétiques

Les équations derivent de l‟étude des paramètres cinétiques des souches.

Les étapes de la croissance microbienne

La croissance microbienne se traduit par une augmentation en taille ou en nombre des
micro-organismes. Pour provoquer une croissance microbienne dans une culture il faut fournir
aux cellules initiales les nutriments nécessaires et des conditions environnementales favorables.
Le schéma de la croissance d‟une population microbienne en culture discontinue (c'est-à-dire
milieu non renouvelé), selon Sanaa (2002) présente dans la figure 7 se décompose alors
traditionnellement en sept phases distinctes :

1) La phase de latence : elle correspond à une phase de transition entre un état

physiologique initial et un état de croissance à proprement parlé. Il s‟agit d‟une phase
d‟adaptation au nouvel environnement. Cette phase dépend soit de l‟âge de l‟inoculum, soit d‟une
adaptation enzymatique. Par ailleurs, dans certaines conditions, la concentration initiale en
cellules est si faible qu‟il est difficile de quantifier l‟augmentation du nombre d‟individus. Ce
phénomène est considéré comme une pseudo-latence. La phase de latence peut être réduite en
utilisant comme inoculum une pré-culture prélevée en phase exponentielle.

2) La phase d’accélération : elle commence à partir de l‟adaptation effective des cellules

à leurs nouvelles conditions de culture. Durant cette période, la valeur du taux spécifique de
croissance (μ) augmente, jusqu‟à atteindre sa valeur maximale (μmax).

3) La phase de croissance maximale ou exponentielle : lorsque les concentrations

microbiennes sont exprimées en coordonnées semi logarithmiques en fonction du temps, la pente
de la droite correspond au taux spécifique maximal de croissance, μmax (h-1).
Dans cette phase le taux de mortalité est nul, l‟activité métabolique est maximale et le
taux de croissance est constant.

39
 4) La phase de décélération ou phase de freinage : elle intervient au fur et à mesure que le
substrat s‟épuise ou que des produits toxiques s‟accumulent. La population continue à croître
mais le temps de génération augmente.
5) La phase stationnaire maximale : au cours de cette phase, la population microbienne
n‟évolue plus (μ=0) donc la population demeure stationnaire. Il y a un équilibre entre le nombre
de nouvelles cellules et le nombre de cellules qui meurent. Cette phase peut durer plusieurs
heures et même plusieurs jours.
6) La phase de début de décroissance : elle correspond à un début de disparition des
cellules.
7) La phase de décroissance exponentielle de la population : cette phase apparaît lorsque
le milieu devient fortement défavorable à la multiplication des micro-organismes et entraîne leur
mort rapide (Manry, 2005).

Figure 7 : Différentes phases de la croissance bactérienne en milieu liquide non renouvelé

(batch).

40
CHAPITRE II: MATERIEL ET METHODES

41
A. Matériel d’étude

1. Les zones concernées par l’étude

L‟étude s‟est intéressée aux sites de vente, de stockage et de transformation des mangues.
Pour ce faire, nous nous sommes intéressés aux régions par excellence de production de mangue
au Burkina Faso: Houet (Bobo-Dioulasso), Comoé (Banfora), Kénédougou (Orodora) et Centre
(Ouagadougou). Ces différentes régions ont des conditions agroclimatiques différentes. Les
différentes zones de production sont mentionnées dans la figure 8.

Zones de production de mangues

Figure 8 : Carte du Burkina Faso présentant les sites de prospection.

42
2. Prospections et collecte des échantillons de mangues.

Des prospections ont été conduites dans toutes les zones productrices de mangues au Burkina
Faso et dans les centres de transformation des mangues (DAFANI, CEAS). Cinq Cent Cinquante
(550) échantillons de résidus frais de mangues (peau, chaire, noyau) ont été collectés sans
distinction de variétés. Le poids moyen pour chaque échantillon est l‟ordre de 1kg.
La taille des échantillons par site a été fonction de la quantité de résidus rencontrés sur le site.
Pour ce faire, dans la zone Ouest, plus grande zone de production (75% de la production
nationale), 400 échantillons ont été retenus, dont 100 à Bobo-Dioulasso, 150 à Banfora et 150 à
Orodora.Dans la région du centre et dans les centres de transformation, respectivement 50 et 100
échantillons ont été rassemblés. Ces échantillons conditionnés dans des sacs en plastique sont
achéminés au laboratoire. Le tableau 3 présente la repartition des zones d‟échantillonnage.

Tableau 3 : Répartition des échantillons de résidus de mangue collectés par site

Site Bobo-Dioulasso Banfora Orodora Ouagadougou Unités de

transformations
Echantillons 100 150 150 50 100

B. Méthodologie

1. Traitement des échantillons

Les échantillons ont été triés par variété avant toute analyse. Une portion des résidus de
mangues ( noyau délipidé et pulpe ) est broyée séparement à l'aide d'un broyeur électrique. Les
filtrats frais obtenus sur une unité de filtration en verre à partir des broyats, sont stockés dans des
flacons de 500 ml et conditionnés à +4°C pour bloquer toute action microbienne en toute
utlisation. Ainsi la détermination des paramètres physico-chimiques et composition
macromoléculaire, portera sur les résidus de broyats frais ainsi que sur les filtrats pour
comparaison. Par ailleurs une autre portion des échantillons collectés est séchée à l‟étuve à 90°C
pendant 72 heures jusqu‟à obtention d‟un poids constant à 0,2% près.

43
Elle est ensuite broyée puis tamisée (tamis de maille: 2 mm) pour faciliter la conservation en vue
des essais de fermentation. La pulpe et le noyau délipidé sont traités séparement.

44
I : EVALUATION DES PARAMETRES PHYSICO-
CHIMIQUES ET MACROMOLECULAIRES
DES RESIDUS DE MANGUES

45
1. Analyses des paramètres chimiques et composition macromoléculaire des échantillons

Toutes les opérations sont réalisées en duplicata lors des analyses portant sur les résidus de
broyats du noyau délipidé et de la pulpe des échantillons de mangues frais traités séparement.

1.1 Détermination du pH

Le pH est mesuré sur 10 g de chaque échantillon de mangues, homogénéisés avec 20 ml

d'eau distillée à l'aide d'un pH-mètre (Hanna Instruments HI8418) préalablement étalonné avec
des solutions de tampon phosphate (pH7) et tampon acétate (pH4) à 25°C, selon la méthode de
Nout et al.(1989).

1.2 Détermination du taux d’humidité, de matières sèches et de cendres

Ces paramètres ont été déterminés à partir de 10 g d'échantillon frais, par pesée differentielle,
après passage à l'étuve (Heraeus T5042) à différentes températures en fonction du temps
(méthode AOAC, 1990).

Une quantité de 10 g de broyat de chaque échantillon a été pesée dans une capsule en aluminium
préalablement tarée. La capsule a été placée ensuite pendant 24 heures dans une étuve (Heraeus
T5042) à 105° C. Après refroidissement de la capsule dans un dessiccateur pendant 30 minutes,
l‟ensemble a été pesé à nouveau à la balance électronique (Denver Instrument Company).
L‟opération a été répétée jusqu‟à l‟obtention d‟un poids constant à 0,2 % près.

Les taux ou pourcentages d‟humidité et de matière sèche sont déterminés par les formules
suivantes :
% Hum (g/g) = (mo-m)/mo x 100

% Ms (g/g) = 100 - % Hum

avec : % Hum = pourcentage en humidité ; % Ms = pourcentage en matière sèche ; m = masse

du résidu à 105°C et mo = masse de l‟échantillon frais.

46
 Les cendres totales ont été déterminées par incinération. Un étuvage à 105°C pendant 24
heures des échantillons, est suivi par une calcination au four à moufle. Un creuset contenant le
résidu à 105°C est remis dans le four. La température est alors augmentée progressivement
jusqu‟à 550°C pendant 5 heures. Après refroidissement pendant 30 minutes au dessiccateur le
creuset est pesé à la balance électronique. L‟opération est répétée jusqu‟à l‟obtention d‟un poids
constant à 0,2 % près. Le taux de cendres exprimé en pourcentage en masse est donné par la
formule suivante :

% Cendres (g/g) = [(P3-P1) / (P2-P1)] x100

avec : P1 = Poids du creuset; P2 = Poids du creuset + la prise d‟essai ; P3 = Poids du creuset +

Cendres

1.3 Détermination de la teneur en glucides

Elle a été réalisée par dosage spectrophotométrique des échantillons, à l'aide d'un
spectrophotomètre lecteur de plaque couplé à un ordinateur muni d'un logiciel KC Junior intégré.
La lecture des densités optiques a été faite à 540 nm et 460 nm respectivement pour les sucres
totaux et les sucres reducteurs. Les concentrations des sucres sont calculées à partir de deux
courbes d'étalonnage établies respectivement avec du D-glucose et du maltose comme standards.
1.3.1 Dosage des sucres totaux

En milieu acide à chaud, les liaisons glycosidiques des carbohydrates sont hydrolysées.
Les oses simples ainsi libérés subissent une déshydratation intramoléculaire pour donner des
dérivés furfuraux (furfural ou hydroxyméthyl furfural). La fonction aldéhyde se condense ainsi en
milieu acide avec l‟hydroxyle d‟un composé phénolique pour donner des acétals ou hémi-acétals
de couleur rougeâtre qui absorbent dans le visible (450-500 nm). Les hexoses sont transformés en
5- hydroxyméthyl furfural, et les pentoses en furfural. Cette méthode permet ainsi de doser tous
les glucides totaux d‟un matériel biologique.

Préparation des échantillons à analyser

Dans des tubes à essais, 1 g de poudre de chaque échantillon (pulpe ou noyau de mangue)
est dispersé dans 10 ml de DMSO à 25% (v/v) dans l‟eau. Le mélange est incubé au bain-marie
bouillant pendant 15 min puis 0,1 ml du mélange est dilué dans 9,9 ml d‟eau.

47
 Une gamme de concentrations de la solution standard de D-glucose à 0,05 mg/ml (0,5 g
de glucose dans 100 ml d‟eau distillée) a été utilisée pour établir une courbe étalon des sucres
totaux. Aux différentes concentrations de glucose ont été ajoutées; 0,5 ml de phénol 5% et 2 ml
de H2SO4. Après 15 min d‟incubation au bain marie ‟ bouillant” puis 15 min d‟incubation à
l‟obscurité, on lit l‟absorbance (densité optique) à 492 nm au spectrophotomètre lecture de plaque
(type µquant) couplé à un ordinateur avec un logiciel KC junior intégré.
Pour le dosage des échantillons, 0,5 ml de phénol 5% est ajouté à 0,5 ml de l‟échantillon
préalablement préparé. Après homogénéisation, on ajoute 2 ml du H2SO4 (75%). Le mélange est
ensuite traité comme le standard ayant servi à construire la courbe d‟étalonnage. L‟essai est fait
en duplicata. La concentration des sucres totaux est déduite à partir de courbe étalon des sucres
totaux (annexe 12) avec le D-Glucose comme sucre de référence (Fox et Robyt, 1991).

1.3.2 Dosage des sucres réducteurs

Une série de concentrations de la solution standard de D-glucose à 0,05 mg/ml a été

utlisée pour établir une courbe étalon des sucres réducteurs. Un volume de 1 ml de réactif au
DNS (Acide 3,5 Dinitrosalycilique) a été ajouté aux différentes concentrations de glucose. Après
8 min d‟incubation au bain marie ‟ bouillant”, mesure l‟absorbance a été mesuré à 546 nm.
Pour le dosage des échantillons; 0,1 ml de l‟échantillon préalablement dispersé dans le
DMSO (Diméthylsulfoxyde) pour le dosage des sucres réducteurs est mélangé avec 0,4 ml d‟eau
distillée. La solution est ensuite mélangée avec 1 ml du réactif au DNS puis incubée au bain
marie comme décrit pour le standard des sucres réducteurs. Après homogénéisation, l‟absorbance
est lue à 546 nm à l‟aide du spectrophotomètre. Les concentrations en sucres réducteurs sont
calculées à partir de la courbe d‟étalonnage (annexe 13) établie avec le D-Glucose comme sucre
de référence (Miller 1958).

1.4 Détermination du taux d’amidon

1.4.1 Extraction et dosage de l’amidon total

Prendre 0,1 g des résidus bien broyé et y ajouter 5 ml de 1 N KOH. Bien homogénéiser la
solution à la température ambiante et la neutraliser ensuite avec 5 ml de 1 N HCl.

48
 Bien s‟assurer que la solution est neutre à l‟aide d‟un papier pH. Mettre ensuite le
mélange en ébullition au bain-marie pendant 15 min. Réajuster le volume du mélange à 10 ml.
Centrifuger le mélange et prendre le surnageant. Filtrer au besoin le surnageant et
l‟utiliser pour le dosage de l‟amidon. Pour le dosage prélever 0,05 ml de cette solution et ajouter
4,85 ml d‟eau distillée et 0,1 ml de réactif I2/KI puis incuber comme précédemment pendant 10
minutes avant la lecture des densités optiques à 580 nm.
La teneur en amidon a été déterminée en utilisant une courbe étalon (annexe 14) avec une
solution d‟amidon à 5 mg/ml comme sucre de référence (Jarvis et Walker, 1993).

49
II : SCREENING DES MICROORGANISMES

IMPLIQUES DANS LE PROCESSUS DE

FERMENTATION

50
1. Procédé d’isolement et de sélection des souches de levures et bactéries

1.1 Les différentes sources d’isolement des microorganismes

Les souches de levures à sélectionner ont été recherchées dans les différents milieux.
Elles sont codifiées (A1 à Ax ; B1 à Bx ; S1 à Sx ; W1 à Wx) selon la provenance. Les sources
d‟isolement utilisées sont les ferments de levures provenant de la bière locale (dolo), du vin de
palme, et des résidus de mangues. Les souches de bactéries du genre Bacillus proviennent des
échantillons de condiments fermentés (Soumbala, Bikalga). Les souches Bacillus sp1(A1M1) et
Bacillus licheniformis proviennent du laboratoire de CRSBAN (Université de Ouagadougou).

1.2 Les différents milieux de cultures

Différents milieux de culture ont été utilisés selon les objectifs poursuivis. Dans tous les
cas le pH est ajusté avant la stérilisation avec des tampons acétate (pH 4) et phosphate (pH 7),
puis le milieu de culture est stérilisé par autoclavage à 120ºC pendant 15 minutes.

1.2.1 Milieu de conservation

Les souches (levures et bactéries) ont été conservées à 4ºC et repiquées à des intervalles
réguliers (1 mois) dans le bouillon nutritif de conservation (Annexe 1). Le bouillon nutritif
additionné à du glycérol (20 % v/v) à raison de 1,5 ml par cryotube sert de milieu de conservation
des souches.

1.2.2 Milieux d’isolement des levures

L‟isolement et la sélection des souches des levures ont été effectués sur la gélose de
Sabouraud additionnée de Chloramphénicol ou Gentamicine, antibiotiques antibactériens à large
spectre. Le pH est ajusté à 6 ± 0,2 (Composition du milieu : Annexe 2). La gentamicine ou le
chloramphénicol sont ajoutés respectivement à raison de 0,40 g/l et de 0,50 g/l dans le milieu
Sabouraud après autoclavage à 121° C pendant 15 minutes et refroidissement de ce dernier dans
des conditions stériles. Le test à la cycloheximide a également été utilisé pour confirmer le genre
de levure à sélectionner.

51
 Les milieux gélose, farine Maїs et YEPD (Yeast extract Peptone Dextrose), (Annexes 3
et 4), ont servi de milieux de confirmation et de purification (par triple repiquage successif) des
souches de levures isolées sur le milieu sabouraud. Le pH est ajusté à 6 ± 0,2.
La sélection des bactéries du genre Bacillus a été conduite sur milieu PCA (Plate Count
Agar).
1.2.3 Milieu pour l’étude de la tolérance à l’alcool

Après stérilisation, le mlieu synthétique minimum (Annexe 5) a été utilisé pour cette
étude.

1.2.4 Milieu pour la mse en évidence de la production d’acétoïne

Le milieu de Clark et Lubs (Annexe 6) a été utilisé pour mettre en évidence la production
d‟acétoïne par les souches bactériennes.

1.2.5 Milieu pour la détermination du caractère amylolytique des souches

bactériennes

Le milieu gélosé amylacé à 1 % (Annexe 7) a été utilisé pour la mise en évidence du

caractère amylolytique des bactéries.

1.2.6 Milieu pour le test de sporulation des levures

Le milieu utilisé pour ce test est un milieu liquide contenant le glucose synthétique
comme source de carbone (Annexe 8).

1.2.7 Milieu de base pour l’étude de la fermentescibilité des sucres

La fermentescibilité a été realisée sur un milieu synthétique liquide contenant soit le le

glucose, le fructose, le lactose, l‟arabinose, le galactose, le mannose, le raffinose comme source
de carbone (Annexe 9-10).

1.2.8 Milieu d’isolement des bactéries

Le milieu PCA a été utilisé pour la sélection des bactéries.

52
1.3 Isolement

La technique des stries serrées a été utilisée pour l‟isolement des levures et bactéries. A
cet effet 0,1 ml de la culture pré-enrichie a été repiqué sur le milieu gélosé Sabouraud contenant
du chloramphénicol et incubé 24 à 72 heures en aérobiose à 30 °C. Les bactéries ont été isolées
sur milieu PCA. Les colonies sélectionnées au niveau du quatrième quadrant, ont été
ensemencées par stries sur un nouveau milieu gélosé.
Après croissance, les souches ont été purifiées par trois repiquages successifs par
étalement et la pureté partielle a été confirmée par l‟obtention de culture homogène et par
observation à l‟état frais et après coloration de GRAM. Les souches pures ont été réensemencées
trois fois par stries sur milieu gélosé et dans du bouillon. Les souches pures obtenues, ont été
utilisées pour les tests de caractérisation.
L‟identification partielle des souches pures a été basée sur la détermination de leurs caractères
morphologiques, culturaux, biochimiques et physiologiques.

2. Biochimie et physiologie des souches

2.1 Caractères culturaux

La morphologie des colonies a été déterminée par une observation directe des colonies sur
les milieux gélosés. La forme, la taille et la couleur des colonies ainsi que l‟aspect de la culture
en milieu liquide ont été notées.

2.2 Test de catalase

Ce test a été réalisé en utilisant de l‟eau oxygénée à 10 volumes. La présence de catalase
a été révélée par un dégagement gazeux à partir d‟une culture sur gélose nutritive où l‟on a
déposé une goutte d‟eau oxygénée (H2O2) à 10 volumes (ou 3 %). La catalase est une enzyme qui
catalyse la dégradation du peroxyde d‟hydrogène (H2O2) en oxygène et en eau selon la réaction
suivante :

H2O2 ——> H2O + ½ O2

53
 Le peroxyde d‟hydrogène formé au cours du métabolisme est un agent antimicrobien qui
exerce son activité inhibitrice sur les bactéries dépourvues de catalase ou de pseudo-catalase.
La peroxydase permet à certaines souches (levures ou bactéries) qui n'ont pas de catalase, de
tolérer l'oxygène, mais cette tolérance reste à vérifier quand au peroxyde d‟hydrogène.

2.3 Test de cytochrome oxydase

La présence de cytochrome oxydase a été mise en évidence par la technique de Kovacs
(1956). Des disques imprégnés d‟une solution de tétraméthylphénylène diamine (TMD) dans du
diméthylsulfoxyde (DMSO) à 6% ont été utilisés. En présence d‟oxydase, le
tétraméthylphénylène diamine (TMD) vire au bleu violacé. Le TMD ne vire pas si le test est
négatif. Ce test détecte un type particulier de chaîne respiratoire qui comporte en fin de chaîne,
un cytochrome C et l‟oxydase associée.

2.4 Test de sporulation

La recherche de formes résistantes des levures et bactéries a été réalisée grâce à la
technique du choc thermique. Deux tubes de culture de chacune des souches ont été portés au
bain-marie à 90 °C pendant 10 minutes. Une aliquote de chaque suspension bactérienne traitée
ainsi a été prélevée pour inoculer deux tubes de milieu neuf stérile. Ces tubes ont été réincubés à
30 °C pour suivre la croissance pendant 24 à 72 heures. Une croissance notée qui se traduit par la
turbidité de la culture montre que la souche étudiée est capable de former des formes résistantes.
Si la souche est incapable de sporuler, la culture reste limpide.

2.5 Tests au rouge de méthyle et Voges-Proskauer

Ce test est realisé uniquement pour les bactéries. Le milieu de Clark et Lubs permet de
réaliser les tests au rouge de méthyle (RM) et de Voges-Proskauer (VP) selon la technique utlisée
par Sévastianos (1977). Ces tests permettent de révéler la nature des produits issus de la
fermentation des sucres (acides organiques ou acétoïne). Ces tests ont été réalisés en cultivant 24
heures à 30 °C, la souche concernée. Pour le test VP, 1 ml de la culture a été prélevé deux fois et
transvasé dans deux tubes à hémolyse. Un volume de 0,5 ml d‟α-naphtol (1% v/v) et un volume
égal de base (KOH) concentrée (40% m/v) ont été ajoutés. Le tube est incliné pendant quelques
minutes à une heure pour pemettre une bonne oxygénation.

54
Si la réaction est positive (VP+), il se forme un anneau rouge en surface. Une réaction négative
(VP-) se traduit par un anneau jaune en surface. Les souches VP+ produisent des quantités moins
importantes d‟acides organiques et une proportion non négligeable de pyruvate est transformée
en produit neutre (l‟acétoïne est réduite en général en butanediol). C‟est la fermentation
butanediolique.

Pour le test RM, à deux tubes contenant chacun 1 ml de la culture, on ajoute deux (02) à
trois (03) gouttes de rouge de méthyle. Une coloration rouge traduit une réaction positive (RM +)
et une coloration jaune, une réaction négative (RM-). Les souches RM+ produisent des acides
organiques par la voie des acides mixtes.
Ces tests permettent de révéler la nature des produits issus de la fermentation des sucres
(acides organiques ou acétoïne). Chez les bactéries anaérobies facultatives, ces tests permettent
de mettre en évidence la fermentation acide mixte conduisant à la formation de nombreux acides
organiques et la fermentation butanediolique qui aboutit à la production de l‟acétoïne, précurseur
du butanediol.

2.6 Test de thermo-tolérance

Pour tester l‟aptitude des souches de levure à croître à 40 et à 50 °C, la croissance sur
milieu gélosé a été réalisée respectivement à 40 et à 50 °C pendant 24 heures en aérobiose. Trois
boîtes de Pétri contenant le milieu gélosé ont été utilisées pour chaque souche. La croissance ou
non est confirmée par trois (03) repiquages successifs.

2.7 Métabolisme de l’amidon par les souches du genre Bacillus

Le caractère amylolytique des souches a été testé sur milieu gélosé amylacé à 1% selon la
technique utilisée par Bengaly (2001). C‟est un milieu gélosé contenant de l‟amidon pur comme
seule et unique source de carbone. Un test positif se traduit par un halo bien visible autour de la
colonie correspondant aux zones d‟hydrolyse de l‟amidon. Pour un test négatif, le milieu vire au
bleu. La gélose a été ensemencée par touche et l‟hydrolyse de l‟amidon, révélée par vaporisation
d‟une solution d‟iode 0,1 N. Le milieu vire au bleu sauf les zones d‟hydrolyse de l‟amidon pour
lesquelles un halo bien visible se forme autour de la colonie. Trois repiquages successifs ont
permis de confirmer les résultats obtenus. Ce test est realisé uniquement pour les bactéries.

55
 2.8 Etude de la fermentescibilité des sucres
Elle a été effectuée dans des tubes de Hungate contenant le milieu de base (annexes 9-10)
stérilisé à 120 °C pendant 15 minutes. Le pH est ajusté à 7,2. Les solutions de sucres et de bleu
de bromothymol stérilisées par filtration à l‟aide d‟un filtre millipore (0,22 μm) ont été ajoutées
au milieu de base stérile de manière à obtenir une concentration finale de sucre de 5 grammes par
litre (Combet-Blanc, 1995). Les sucres testés sont le glucose, le fructose, le saccharose et le
lactose et une suspension levurienne en phase exponentielle de croissance a été utilisée. Deux
tubes ont été utilisés pour chaque sucre testé. Après inoculation, la surface d‟un des deux tubes a
été recouverte d‟huile de paraffine pour révéler la production de gaz.
Deux témoins ont été réalisés, un contenant le milieu neuf stérile et l‟indicateur coloré, un
autre contenant le milieu neuf stérile. Lorsque la souche concernée fermente le sucre testé, la
culture initialement verte vire au jaune après 24 à 72 heures. Un test négatif se traduit par une
culture bleu-verte. Trois repiquages successifs ont permis de confirmer les résultats obtenus.

2.9 Caractérisation taxonomique : Essai taxonomique

Les caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques des souches isolées
ont été comparées à celles du « Bergey‟s manual of determinative bacteriology » neuvième
édition afin de proposer une affiliation.

3. Les méthodes analytiques

3.1 Analyse de la biomasse et paramètres cinétiques

Le suivi de la biomasse a été fait par trois méthodes différentes. Ces méthodes apportent
des informations complémentaires et leur combinaison augmente la fiabilité de nos résultats. Le
suivi de la biomasse a été effectué tout au long du processus de sélection des souches.

3.1.1 Spectrophotométrie (Turbidimétrie)

La densité optique (DO) mesurée traduit le pourcentage de lumière non transmise par la
suspension de levures. L‟absorbance est proportionnelle à la quantité de biomasse présente dans
l‟échantillon. La DO a été mesurée avec un spectrophotomètre lecteur de plaque (type µquant)
couplé à un ordinateur avec un logiciel KC junior intégré.
56
Les mesures ont été réalisées dans des plaques multi-puits (96 puits). Des dilutions sont
effectuées afin de rester dans la gamme de linéarité (DO < 0,8).

3.1.2 Méthode gravimétrique (Poids sec)

Cette méthode a pour but d‟estimer la masse de levures contenue dans un volume donné
de l‟échantillon. Elle est basée sur la différence de poids sec d‟une membrane de porosité
déterminée (acétate de cellulose 0,45 μm) avant et après filtration (et séchage) d‟un volume
connu (25 et 10 ml) d‟échantillon. Les cellules levuriennes cultivées ont été recoltées par
centrifugation à 6000 tr/min pour 20 min, puis lavées deux fois avec de l'eau stérile et pesées
après 24 h de séchage à l‟étuve à 105 °C. La biomasse sèche est exprimée en g/L.
Elle a été utilisée parallèlement à la mesure turbidimétrique pour obtenir une corrélation
DO/concentration en biomasse (Poids sec), afin d‟éviter le recours systématique à cette technique
longue et peu précise pour les faibles valeurs de biomasse.
Les courbes standards de proportionnalité DO/Poids sec pour les levures ont été realisées sur
milieu minimum à 30 °C (annexe 11).

3.2 Evaluation de l’activité amylasique et saccharification des bactéries

L'hydrolyse enzymatique de la matière première (noyau de mangue) a été menée à des

températures de 50-55 °C, avec des α-amylases produites par des bactéries du genre Bacillus.
L‟évaluation de la performance de l'hydrolyse a été basée sur le rendement de la libération des
sucres réducteurs en fonction de la biomasse.
Initialement 1 L de bouillon nutritif contenant 50 g de substrat de mangue (broyat de
noyau de mangue: 50 g/L) a été préparé et stérilisé. L‟inoculum de chaque souche de Bacillus (10
ml) a été ensemencé; puis les cultures sont placées sous agitation lente (100 rpm) pendant 4
heures. La densité optique des préparations est suivie à 600 nm sur une plaque multi-puits à
l‟aide du spectrophotomètre décrit précédemment. On effectue un dosage progressif du taux de
sucres réducteurs liberés au cours de l‟hydrolyse. Auparavant les taux de sucres réducteurs et
totaux initiaux ont été déterminés.

57
4. Traitement des données

La moyenne des valeurs numériques de la densité optique (DO) des différentes cultures
ainsi que celles des témoins a été obtenue grâce à un tableur Excel 2007.

Calcul des rendements et paramètres cinétiques

La différence entre la densité optique de la culture (DOculture) et celle du témoin (DOtémoin) a

donné la densité optique réelle (DOréelle) de la culture selon la relation suivante :

DOréelle = DOculture - DOtémoin

Le rendement YX/S (g biomasse/g substrat) en biomasse par rapport au sucre est défini par :

Yx/s = (Xf-Xo) / (So-Sf)

Xf: biomasse finale; Xo: biomasse initiale ; So: concentration initiale en sucre; Sf: concentration
finale en sucre.

Le rendement YP/S (g produit/g susbtrat) en produit (éthanol) par rapport au sucre est
défini par :

Yp/s = (Pf-Po) / (So-Sf)

Pf: concentration finale du produit (éthanol); Po : concentration initiale du produit (éthanol)

Les vitesses maximale et spécifique de croissance (µmax, μ ) sont définies par:

Log10 (DO’/DO) = µmax.t + K μ (h−1) = (1/X) x (dX/dt)

X : biomasse cellulaire; dX/dt : variation de la biomasse cellulaire en fonction du temps.

DO est la valeur de la densité optique en début de la phase exponentielle de croissance et DO’,
celle à l‟instant t durant la phase exponentielle de croissance.
K correspond à une constante = Charge cellulaire ou biomasse à l‟instant initial.

58
III: ETUDE DE L’INFLUENCE DE PARAMETRES
ENVIRONNEMENTAUX SUR LA BIOMASSE
MICROBIENNE ET LA FERMENTATION

59
 Le but de cette étude est de vérifier l‟influence des facteurs du milieu réactionnel sur
l‟évolution de la biomasse microbienne et de la fermentation.

1. Etude de la tolérance à l’alcool

La technique utilisée a été celle décrite par Obire (2005) pour étudier la tolérance à
l‟alcool de l‟espèce Saccharomyces cerevisiae isolée de différents biotopes.
Après stérilisation, des volumes appropriés d‟éthanol ont été ajoutés au milieu de culture
par filtration à l‟aide d‟un filtre millipore (0,22 μm) conduisant respectivement à des
concentrations alcooliques de 0%, 5%, 7,5%, 10%, 12% et 18% (v/v). La croissance des souches
a été réalisée pendant 24 heures à 30 °C. Des milieux alcooliques non ensemencés ont été utilisés
comme témoins et pour chaque concentration donnée, la croissance a été réalisée dans trois tubes
pour chaque souche. Un volume de 100 µl de chaque suspension bactérienne en phase
exponentielle de croissance, a été utilisé comme inoculum.
La tolérance à l‟alcool a été appréciée à travers la croissance des souches pendant 24
heures en mesurant l‟absorbance à 600 nm à l‟aide du spectrophotomètre type « µQuant » couplé
à un ordinateur équipé du logiciel KC Junior susmentionné. Les mesures ont été effectuées en
triple pour chaque souche et pour chaque mesure.
La viabilité des souches dans l‟alcool a été testée en repiquant la culture réalisée entre 10
et 15 % (v/v) d‟alcool sur milieu gélosé. Une croissance positive témoigne de la viabilité de la
souche concernée à la concentration alcoolique testée. . Les valeurs des DO liées aux différentes
concentrations d‟alcool après 24 heures ont été utilisées pour tracer une courbe de tendance afin
de déterminer l‟effet de l‟alcool sur chacune des souches retenues. La pente de ces courbes donne
l‟effet de l‟alcool sur les souches.
Le tracé de la courbe de tendance définie par log10 (DO‟/DO) en fonction du temps t a permis
de déterminer les paramètres cinétiques de croissance durant la phase exponentielle de
croissance : la vitesse maximale de croissance µmax et le temps de génération t1/2.

log10 (DO’/DO) = µmax .t + K

La pente de cette courbe de tendance correspond à la vitesse maximale de croissance µ max

et le temps de génération t1/2 a été déterminé selon la relation :

60
 t1/2 = 0,69/ µmax

DO est la valeur de la densité optique en début de la phase exponentielle de croissance et DO’,

celle à l‟instant t durant la phase exponentielle de croissance. K correspond à une constante.

L‟analyse de nos données a été basée sur la comparaison des paramètres cinétiques de
croissance déterminés durant la phase exponentielle de croissance.

2. Etude de l’effet du pH sur la croissance microbienne et la fermentation

En fermentation alcoolique le pH est un paramètre très important, réputé agir sur l‟activité
métabolique de la levure et moduler la synthèse des acides formés au cours de la fermentation. Il
nous a donc paru indispensable d‟étudier le rôle du pH sur les souches de levure sélectionnées
compte tenu des incidences possibles sur le procédé de fermentation (pertes de productivité,
modification de la composition des milieux de fermentation). Pour cela, des cultures en batch ont
été realisées à différents pH. Cette étude a été réalisée dans des fermenteurs type « Biolafite » de
500 ml de volume utile. L‟ensemencement est effectué à l‟aide au minimum d‟un inoculum de
5.105 UFC/mL à partir des souches de levures sélectionnées en fin de phase de latence. La
température de fermentation a été fixée à 30 °C, l‟agitation est de 150 tours/min. La souche de
levure a été ensemencée dans une série d‟erlenmeyers contenant le milieu synthétique avec 20
mM de glucose dont le seul paramètre variable est le pH (pH allant de 3,5 à 7,5). Ces milieux ont
été préparés avec des solutions tampons (tampon acétate de pH variant de 3 à 6 et tampon
phosphate de pH variant de 6 à 9). L‟intensité de la croissance pour chaque pH est évaluée par la
mesure de la densité optique à 600 nm au spectrophotomètre pendant 24 heures, (KONLANI et
al., 1996).

3. Influence de la température sur la croissance microbienne

L‟effet de la température sur la croissance optimale des souches a été déterminé en

mesurant directement l‟absorbance des cultures à une longueur d‟onde de 600 nm. Les souches de
levure ont été ensemencées dans une série de tubes contenant le même milieu de culture (20 mM
de glucose, pH 5,5) dont le seul facteur variable est la température d‟incubation (20 °C, 25 °C, 30
°C, 35 °C, 37 °C, 40 °C, 45 °C et 50 °C).

61
IV : PROCÉDÉ D’OPTIMISATION DE LA

PRODUCTION DE BIOÉTHANOL

62
1. Procédé simultané de saccharification et de fermentation (SSF) des résidus de mangues

1.1 Cocultures de Bacillus sp et Saccharomyces sp sur les résidus de mangues

L'hydrolyze des résidus de mangues (broyats de pulpe et noyau) et la fermentation

simultanée ont été realisées dans un Erlenmeyer de 500 ml à 10%, comme concentration en
substrat. Le milieu de fermentation contient le broyat de mangue prétraité comme substrat (200
mg/L du metabisulphite du potassium). Après liquéfaction, le pH a été ajusté à 4,5; le
metabisulphite de potassium ainsi que les inocula des souches de Bacillus (A1M 1, sp2, sp3, sp4)
et B. licheniformis ont été ajoutés à une température de 55°C pour optimiser la libération des
sucres réducteurs durant 4 heures. Après un refroidissement à 45 °C et 40 °C des inocula des
souches de levures (avec 5×105-2,5×106 cellules/ml) sélectionnées ont été ajoutés
indépendamment pour chaque balon de fermentation. Ces souches étaient thermotolérantes. La
SSF a été réalisée à 37 °C et 40 °C pour 7 jours à 150 rpm. Le rendement théorique de la SSF a
été calculé en supposant que tout le glucose potentiel dans la matière était disponible pour la
fermentation. Les expériences ont été réalisées en triplicata.
La concentration de l'éthanol a été déterminée chaque 24 heures après distillation de 50 ml
du milieu durant le processus de la fermentation. La figure 7 résume le procédé expérimental de
production d‟éthanol.

1.2 Détermination de la concentration en éthanol produit

Le distillat a été collecté à l‟aide d‟un distillateur à 78°C. L‟éthanol produit a été recolté
et son volume mesuré dans un cylindre cubique. La quantité d‟éthanol produit est déterminée en
multipliant le volume de distillat collecté à 78°C par la concentration d'éthanol (concentration
théorique : 0,8033 g/ml). La concentration en g/L est équivalente au rendement de 100 g de
substrat (Humphrey et Okafoagu, 2007). Le volume et la densité optique de l‟éthanol produit ont
été déterminés. La concentration est déterminée à l‟aide d‟une courbe standard donnant la
concentration de l‟éthanol (g/L) en fonction de la densité optique (600 nm) selon la méthode
préconisée par Humphrey et Okafoagu (2007).

63
 1.3 Détermination du pourcentage d'éthanol par spectrométrie

Une courbe standard donnant la densité optique (600 nm) en fonction du pourcentage en
l'éthanol a été realisée. Une série de pourcentages croissants de solution d'éthanol variant de 2 à
20 % (v/v) a été préparée. La densité optique pour chacune des solutions a été mesurée
permettant d‟etablir la courbe standard DO = f [% alcool (v/v)]. Le pourcentage d'éthanol
produit a été obtenu en utilisant l‟équation de la courbe standard.

1.4 Détermination du pourcentage d'éthanol par CPG

Le pourcentage en éthanol a été mesuré par chromatographie en phase gazeuse à l‟aide

d‟un chromatographe (121 DFL - Intersmat) utilisant une colone de verre remplie avec du
carbopack B 60/80 et de Carbowax 15% 20M et un détecteur à ionisation de flamme (FID). La
température de la colonne était 85°C, celle de l‟injecteur … et le gaz vecteur était l'azote. Le
méthanol a été utilisé comme étalon interne.

Figure 7 : Schéma de Fermentateur utilisant le procédé Simultanné de Saccharification et de

Fermentation (SSF).

64
2. Etude de l’effet des sels minéraux et de l’azote sur les potentialités des souches et
l’optimisation de la fermentation

Certains sels ont été retenus pour leurs effets positifs connus sur la croissance et la
production d‟éthanol. La biomasse est suivie par densitométrie à 600 nm au spectrophotomètre.
L‟acool est recueilli par distillation à 78°C. Le volume et la densité optique ont été determinés.
La concentration est déterminée à l‟aide d‟une courbe standard donnant la concentration de
l‟éthanol (g/L) en fonction de la densité optique sur la base de la méthode préconisée par
Humphrey et Okafoagu (2007). L‟étude de l‟effet des sels minéraux a été effectuée selon la
méthode de Boudjelal et Nancib (2001).

2.1 Effet de NaCl

Le milieu synthétique de fermentation (Annexe 3 sans Agar) a été utilisé comme milieu
de base pour étudier l‟effet de NaCl. Une gamme de concentrations de NaCl de l‟ordre de 2 à
20‰ (g/L) a été realisée dans des erlermeyers. Un volume de 200 µl de chaque inoculum
levurien a été ensemencé dans un milieu de 100 ml. Les cultures contenant 20 mM de glucose
sont placées sous agitation (150 rpm). La densité optique est suivie pendant 24 heures. La
biomasse ainsi que le taux d‟alcool produit sont évalués toutes les heures.

2.2 Effet de FeSO4

Les cultures levuriennes sont réalisées sur le même milieu synthétique de base. Dans ce
cas seule la concentration de FeSO4 varie graduellement de 0,01 à 0,1g/L. Les cinétiques de
fermentation et de production de biomasse ont été suivies pendant 24 heures.

2.3 Effet de MgSO4

L‟expérimentation se conduit avec le milieu synthétique de base. Les concentrations de

MgSO4 varient de 0,1 à 0,8 g/L. La fermentation et la production de biomasse ont été suivies
pendant 24 heures.

65
 2.4 Effet de KH2PO4/K2HPO4

L‟effet de KH2PO4/K2HPO4 sur la croissance microbienne (biomasse) et la production

d‟éthanol a été suivie pendant 24 heures avec des concentrations croissantes de 0,1 à 0,8 g/L. Les
mêmes types de cinétiques ont été mesurés durant 24 heures.

2.5 Effet de MnSO4

Les concentrations de MnSO4 dans le milieu de culture varient de 0,1 à 0,8 g/L. Pendant
la technique a été utilisée. Les cinétiques de fermentation et de production de biomasse ont été
evaluées pendant 24 heures.

2.6 Effet de la source d’azote (Extrait de levures)

Afin d‟améliorer la production d‟alcool par les souches levuriennes, le milieu synthétique
de base a été enrichi avec différentes concentrations en extrait de levure respectivement : 5 à 30
g/L. Le même procédé a été appliqué pour le suivi de la fermentation et de la production de
biomasse.

66
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSIONS

67
Partie 1 : Etude de la composition chimique et
macromoléculaire de la biomasse

(mangues et résidus)

68
1. Composition chimique et macromoléculaire des résidus de mangues

Le tableau 4 rapporte la composition macromoléculaire et les aspects physico-chimiques

obtenus sur les résidus de mangues. Les échantillons analysés sont regroupés par variété.

Tableau 4: Paramètres physico-chimiques des résidus de quatre (4) variétés de mangues.

Variété Zill (Z) Sauvage (S) Brook (B) Amélie (A)

Paramètre
Pulpe

pH 3,61± 0,3 4,48± 0,4 3,51± 0,38 4,71± 0,36

% Humidité (g/g) 76,36 ± 0,2 83,10 ± 0,5 76,50 ± 0,27 78,78 ± 0,29

% Matière sèche totale (g/g) 23,64 ± 0,32 16,90 ± 0,45 23,49 ± 0,35 21,22 ± 0,26

% Cendres (g/g) 2,03 ± 0,1 1,60 ± 0,3 2,71 ± 0,43 3,01 ± 0,16

% Sucres réducteurs (g/g) 2,81 ± 0,4 2,36 ± 0,38 2,82 ± 0,47 5,70 ± 0,29

% Sucres totaux (g/g) 6,38 ± 0,2 4,56 ± 0,3 6,34 ± 0,4 10,39 ±0,26

% Amidon (g/g) 0,79± 0,2 0,74± 0,11 0,65± 0,25 0,33± 0,15

Noyau

% Sucres totaux (g/g) 19,81± 0,3 20,40± 0,11 20,12± 0,13 22,62± 0,2

% Amidon (g/g) 18,22± 0,27 18,77± 0.13 18,51± 0,23 21,81± 0,18

La mesure du pH des échantillons de résidus de mangue montre que les variétés Amélie
(A) et sauvage (S) présentant des valeurs moyennes respectives de 4,48 ± 0,4 et 4,71 ± 0,36 sont
moins acides que celles de Zill (3,61± 0,3) et Brook (3,51± 0,38). Les travaux d‟Akubor (1996)
ont montré que la variété sauvage a un pH de 5,12; de même ceux de Hossain et collaborateurs
(2001) indiquent des pH compris entre 4 à 6 pour différentes variétés de mangues.

69
Le pH est lié à l‟acidité totale de la pulpe, due à la présence des acides organiques. Le taux
d‟acides organiques peut augmenter suite à une oxydation incomplète du glucose; par ailleurs une
forte proportion d‟acides organiques peut engendrer un pH acide. Ces pH acides offrent un
avantage au développement des levures et moisissures par rapport aux autres microorganismes.
Les taux d‟humidité compris entre 83,10 ± 0,5% et 76,36 ± 0,2% varient d‟une manière
inversement proportionnelle à ceux de la matière sèche totale. Les taux de matière sèche totale
obtenus dans les quatre variétés de mangue varient de 16,90 ± 0,45% à 23,64 ± 0,32%. Ces
résultats sont en corrélation avec ceux obtenus par Hossain et collaborateurs (2001) qui
indiquent que le taux de matière sèche totale pour la mangue fraîche se situe entre 17,60% à et
23,50%. D‟autres recherches antérieures menées par Colin et collaborateurs (1981) avaient
montrés des valeurs comprises entre 14,37% et 20,35%.
Les taux de cendres restent faibles avec une moyenne comprise entre 1,60 ± 0,3% et
3,01± 0,16%. Les taux de matière sèche varient de 16,90 ± 0,45 à 23,64 ± 0,32 témoignant une
forte teneur en eau, car il existe une corrélation entre ces deux paramètres. Askar et
collaborateurs (1972) ont montré que l‟augmentation de la teneur en matière sèche résulte d‟une
diminution de celle en eau et vice-versa. La teneur eau élevée prédisposérait la mangue fraîche à
une prolifération microbienne.
La teneur en sucres réducteurs de la variété Amélie double celle des trois autres variétés.
Les teneurs moyennes se situent entre 2,36 ± 0,38% et 5,70 ± 0,29% et sont proches de valeurs
présentées par Hossain et collaborateurs (2001) qui sont de 6,58% à 10,35% pour la pulpe
fraîche. Elles sont comparables également aux valeurs obtenues dans d‟autres fruits tels que la
banane, l‟orange, l‟ananas qui varient de 4 à 15 % (Akubor, 1996).
Les faibles taux de sucres réducteurs dans les mangues sont dus à leur dégradation par des
enzymes ou l‟action microbienne. Les sucres sont alors fermentés et les alcools se condensent
avec les acides pour donner des esters. La conséquence est une perte d‟eau, de sucres, d‟acides et
de saveur. Les déchets de mangues peuvent donc en même temps constituer une source pour le
prélèvement des souches de microorganismes utilisateurs de sucres.
Les pourcentages en sucres totaux varient de 4,56 ± 0,3% à 10,39 ± 0,26% pour la pulpe
et de 19,81± 0,3% à 22,62 ± 0,2% pour le noyau. Ces valeurs pour la pulpe sont faibles par
rapport à celles trouvées par Hossain et collaborateurs en 2001 (18,70% à 26,85%) et par Akubor
en 1996 (21%), tandis que celles obtenus pour le noyau sont comparables aux données des
mêmes auteurs.
70
Egalement ces valeurs de la pulpe sont également faibles comparées à celles trouvées par Traoré
et Konlani (1989) dans la mélasse (38,57%).
Le taux d‟amidon dans la pulpe varie de 0,33± 0,15 à 0,79± 0,2 et est largement inferieur
à celui contenus dans le noyau (18,22± 0,27 à 21,81± 0,18).
Les teneurs en sucres totaux dans les résidus de la pulpe révélées dans nos travaux sont
inférieures à celles du noyau. Cette différence peut s‟expliquer par la forte proportion d‟amidon
dans le noyau (difficilement dégradables).

71
Partie 2 : Isolement des souches de bactéries

et de levures et essai taxonomique

72
1. Isolement et identification phénotypique des souches levuriennes
La sélection basée sur des critères morphologiques et culturaux, a permis de sélectionner 20 souches. Les caractéristiques
essentielles des souches rétenues sont résumées dans le tableau 5.
Tableau 5 : Principales caractéristiques des souches de levures rétenues
Souches levuriennes

Caractéristiques S1 S2 S3 S4 A1 B1 W1, 2 ,5, Saccharomyces sp* Schizosaccharomyces sp*

6
Morphologie O/S O/S O/S O/S O/S O/S O/S Ovoïde/Sphérique Ovoïde/Sphérique (o/s)
Bourgeonnement/ Pseudo- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ + +
mycelium
Aéro-anaérobie facultatif + + + + + + + + +
Ascospores 8 8 4 4 4 4 4 4 8

Formation de voile blanche/ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Sédiment
Coloration de GRAM + + + + + + + +/+ +/+

Oxydase /Catalase +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
Substrats métabolisés

Acétate de sodium - - - - - - - - -
Arabinose + + + + + + + + +
Fructose + + + + + + + + +
Galactose + + + + + + + + +
Glucose + + + + + + + + +
Lactose + + + + + + + + +
Mannose + + + + + + + + +
Raffinose + + + + + + + + +
Nitrate + + + + + + + + +
Amidon - - - - - - - - -
*Lodder(1971)
73
Sur milieu solide il y‟a formation de colonies rondes, blanchâtres et mates ayant un diamètre
moyen de 2 à 4 mm avec des contours ronds. La couleur blanchâtre des colonies évolue vers le
gris au fur et à mesure que se prolonge la durée de conservation. Au microscope on observe des
cellules ovoïdes ou associées par paire formant des pseudo-mycéliums. En plus, on observe en
milieu liquide la formation d‟un voile blanchâtre avec un dépôt de sédiments au fond du tube ; le
milieu trouble s‟éclaircit au bout de 72 heures. Parmi les sources de carbone mises à la
disposition des souches, seuls l‟amidon et le lactose ne sont pas métabolisés. Les différents
examens de caractérisation ont permis de rassembler les caractéristiques essentielles afin de
regrouper et classer des souches isolées.
Les caractères des souches sélectionnnées (Tableau 5) se rapprochent de ceux publiés par
Obisanya (1987) sur les levures. Les caractéristiques obtenues des levures ont permis de réaliser
leur identification partielle par la clé dichotomique de Lodder (1971). Au regard des résultats du
tableau 5, les souches S1, S2 pourraient appartenir au genre Schizosaccharomyces et S3, S4, A1,
B1, W1, W2, W5, W6 au genre Saccharomyces.
La capacité à fermenter et la performance de ces souches ont été testées en milieu
glucosé et en milieu contenant les résidus de mangues comme hydrate de carbone. L‟article 1
(Somda et al., 2010) rapporte les détails expérimentaux, les résultats majeurs obtenus sur les
caractéristiques de 04 souches de levures sélectionnées (S1, S2, S3, S4) et la capacité à
fermenter les résidus de mangues de 02 souches de levures (S1, S3). Il en resort que les colonies
obtenues sont lisses, de forme sphéroïdes, de diamètre compris entre 2 à 5mm, et pourvues
d‟ascospores (4 et 8); pourraient appartenir respectivement au genre Saccharomyces et
Schizosaccharomyces. Elles présentent les atouts nécessaires pour leur utilisation en
fermentation. Les souches S1 et S3 rétenues, possèdent des rendements de biomasse de l‟ordre
respectif 0,36 et 0,28; ainsi que des rendements en alcool de 0,46 et 0,39.

74
75
76
77
78
79
80
81
82
2. Sélection et identification phénotypique des souches bactériennes

Les résultats obtenus sur les bactéries et présentés dans le tableau 6 montrent que ce sont
des bacilles Gram positif ou négatif, aérobies anaérobies facultatifs, douées ou non d‟une
mobilité. Leur culture sur milieu solide se caractérise par des colonies polymorphes. Ces souches
ont un métabolisme respiratoire et fermentaire. Elles sont productrices de catalase, d‟oxydase,
mais toutes productrices d‟acétoïne. Ce sont des souches non sporulantes ou sporulantes dont
l‟extrême résistance des spores leur confère un caractère ubiquiste. A la différence des souches de
levures, elles ont la capacité ou non de métaboliser l‟amidon. La production de catalase par les
souches permet d‟exclure B. anthracis et B. cereus var. mycoïdes.
Tableau 6: Caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques des souches
bactériennes rétenues

Souches Sb1 Bacillus Sp*

Sb2 Sb3 Sb4
Caractéristiques (A1M1)
Aspect Bord Bord Bord Bord Bord régulier, Blanchâtre,
régulier, régulier, régulier, régulier,
Blanchâtre, Blanchâtre Blanchâtre, Blanchâtre, 1≤ø ≤ 2 mm

ø = 1 mm ø ≤ 2 mm ø = 2 mm ø ≤ 2 mm
Forme Bacilles Bacilles Bacilles Bacilles Bacilles
Regroupement chaînettes chaînettes Chaînettes chaînettes chaînettes
Gram + + - - +/-
Oxydase + + + + +
catalase + + + + +
Mobilité + + + + +/-
VP + + - - +/-
RM - - + + +
Sporulation + + - - +/-
Amidon + - - +/- +/-
Glucose +G +G +G +G +G
Fructose +G +G +G +G +G
Saccharose +G +g +G +G +G

83
 *Bergey manuel of determinative bacteriology

+G : Utilisation avec production de gaz ; +g : Faible production de gaz ; + : test positif ; - : test négatif

V P : test de Voges-Proskauer ; RM : test de rouge de méthyle ; ø = diamètre

Sur la base des critères définis dans le "Bergey‟s Manual of determinative Bacteriology",
les caractéristiques globales morphologiques, biochimiques et physiologiques relatives aux
Bacillus (Gram, catalase, oxydase, sporulation, respiration, mobilité) permettent d‟affilier les
souches bactériennes sélectionnées au genre Bacillus.
Ces souches peuvent être affiliées à la famille des Bacillaceae. Elles pourraient appartenir
probablement au genre Bacillus car elles possèdent des caractères retrouvés chez Bacillus
subtilis, Bacillus pumilis et Bacillus licheniformis (Buchaman et Gibbons, 1975). Les souches de
Bacillus sélectionnées ont été utilisées pour l‟hydrolyse des glucides non réductibles afin
d‟améliorer le taux de sucres réducteurs et d‟optimiser le rendement de la fermentation.

84
 Partie 3 : Etude des paramètres
environnementaux sur les potentialités
des souches isolées

85
 L‟étude réalisée sur l‟effet de différents facteurs environnementaux concernant la
croissance de souches du genre Saccharomyces a permis de confirmer que cette croissance
microbienne est influencée notamment par les constituants du milieu de culture et mais également
par les facteurs physico-chimiques (température, alcool, etc…). Parmi ces facteurs l‟influence de
la température est principale. Le tableau 7 présente l‟influence de la température sur les
performances cinétiques de deux souches de levures rétenues pour leur performance.
Tableau 7 : Paramètres cinétiques de deux souches levuriennes à 40, 42 to 45°C en présence
80g/l de glucose.
Paramètres Souches levuriennes
cinétiques W6 B1

40°C 42°C 45°C 40°C 42°C 45°C

Yx/s (g X/g S) 0,14 ± 0,03 0,12 ±0,01 0,11 ±0,01 0,17±0,04 0,1 ±0,04 0,08 ±0,04
YE/s (g E/g S) 0,35 ±0,04 0,21 ±0,01 0,18±0,01 0,30±0,04 0,24 ±0,05 0,16±0,08

Les résultats obtenus montrent que les souches sont thermotolérantes car capables de
supporter des températures variant de 40°C à 45°C et qu‟elles tolérent également des dégrés
alcooliques de 12°. Cette tolérance aux températures élevées pourrait s‟expliquer par la synthèse
de certains groupes de protéines. Hiraishi et collaborateurs (2006) ont observé ce même
phénomène de thermotolérance chez certaines levures, et ont mis en souligné l‟implication des
protéines.
Les résultats des paramètres cinétiques montrent que la souche W6 présente des
rendements de biomasse de 0,14 ± 0,03 et 0,11 ±0,01 et d‟éthanol de 0,35 ±0,04 et 0,18±0,01
respectivement à 40°C et 45°C. Quant à la souche B1, elle possède des rendements lègèrement
inférieurs de biomasse de 0,17±0,04 et 0,08 ±0,04 et d‟éthanol de 0,30±0,04 et 0,16±0,08.
L‟étude des facteurs environnementaux sur les souches a permis d‟accroître leurs
potentialités fermentaires dans le processus de fermentation simultanée. Les principaux résultats
(Somda et al., 2011a) ont montré que l‟hydrolyse enzymatique ( par la souche Sb1) des résidus
de mangues, a permis d‟obtenir 62% de conversion de substrats en sucres réductibles. A la suite
de la fermentattion simultanee, les souches levuriennes W6 et B1 ont fournis des rendements
alcooliques de l‟ordre respectif de 0,35 et 0,30 (g/g).

86
87
88
89
90
91
92
93
Partie 4 : Optimisation du procédé de
production de bioéthanol

94
 Cette étude qui venait en complément à l‟étude sur la recherche des souches thermo-
tolérantes et alcoolo-tolérantes a été réalisée dans le but d‟optimiser le rendement en bioéthanol
en utilisant un processus simultané d‟hydrolyse et de fermentation.
Le procéde d‟hydrolyse de la matière première en vu d‟accroître le taux de sucres réducteurs, a
fournit les résultats consignes dans le tableau 8.
Tableau 8 : Cinétique de l‟hydrolyse des carbohydrates des résidus de mangues et de libération
des sucres réducteurs
% sucres réducteurs
Temps d’hydrolyse B. licheniformis Bacillus A1M 1
(min) Amylase (-) Amylase (+) Amylase (-) Amylase (+)
0 2 0 0 0
20 4 8 2 5
40 5 15 3 10
60 5 19 5 17
80 5 22 6 24
120 5 49 5 46
160 5 78 6 62
200 5 78 6 62
240 5 78 6 62

Le procédé enzymatique performant pour la biotransformation des carbohydrates non

fermentescibles, a permis de libérer à partir des résidus le maximum de sucres fermentescibles
en bioéthanol. Les souches de Bacillus A1M1 et Bacillus licheniformis ont pu hydrolyser les
carbohydrates non réductibles des résidus de mangues et libérer respectivement 62% et 78% (g/g)
de sucres réducteurs. Par ailleurs en l‟absence de l‟enzyme, il n‟ya pas de différence majeure de
taux de sucres réducteurs. Ainsi les sucres libérés ont été simultanément fermentés en éthanol. Le
tableau 9 résume les concentrations respectives en éthanol obtenues suite à la fermentation par les
souches levuriennes sélectionnées.

95
Tableau 9 : Production d‟éthanol par les souches levuriennes
Souches de levures W1 B1 A1 S3
Concentration en 19-21,75 10,1 14,4 16
Ethanol (g/l)

La production d‟alcool par les souches rétenues est de l‟ordre de 10,1 à 19. Mais l‟influence
positive des élements minéraux (notamment l‟azote) aditionnés de manière controlée dans le
milieu de fermentation, a permis d‟optimiser la concentration de l‟éthanol à 21,75.
Les résultats issus du procédé d‟optimisation de la production d‟éthanol (Somda et al., 2011b),
montrent que les souches levuriennes A1 et A3 produisent des concentrations alcooliques
respectives de 14,4 g/l et 16 g/l. Quant à la souche B1, elle produit un taux nettement inférieur
aux autres souches avec une concentration de 10,1 g/l. Par ailleurs l‟introduction controlée des
sels minéraux a permis d‟accroitre la performance fermentative des souches. Ainsi l‟apport de
l‟azote dans le milieu réactionnel révèle son influence positive selonSomda et al. (2011c). Cela
s‟est traduit par la hausse de la concentration d‟alcool de 19 a 21,75 g/l au niveau de la souche
W1 (rétenue pour sa performance).

96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
Partie 5 : Discussion générale

115
1. Composition chimique et macromoléculaire des mangues et résidus

La composition des mangues et résidus est très favorable à leur valorisation. Les résidus
(pulpe et noyau) renferment 4,56% à 22,62% de glucides totaux (Tableau 4), comprenant:
amidon, glucose, fructose, cellulose, pectines. A ce titre ils constituent une excellente source de
bioénergie ou biocaburant. L‟équipe de Gopalan et ses collaborateurs en 1999 ont trouvé un taux
inférieur au nôtre dont 15,9% de carbohydrates dans les résidus de mangues. Par ailleurs Ajila et
ses collaborateurs en 2007 par l‟hydrolyse acide réalisée sur les noyaux de mangue ont obtenu
une valeur supérieure (28,2%). Ainsi la teneur en cabohydrates des résidus mangues, montre
qu‟ils peuvent constituer une source importante de biomasse au même titre que les principales
sources déjà existantes que sont les résidus de céréales (maïs, sorgho, blé, mil, riz), de tiges des
plantes (canne à sucre), de tubercules (bétterave, patate, igname) et surtout de fruits (mélasse,
papaye, orange…) mais aussi d‟herbes renpentes (Ibeto et Okpara, 2010).
Nos résidus de mangues renferment des composés difficilement métabolisables, mais
l‟hydrolyse enzymatique a permis d‟obtenir 17,46% carbohydrates bioconversibles (Somda et al.,
2011b), soit un rendement de bioconversion de l‟ordre de 0,78. Ce résultat est inferieur à celui de
Rowan et ses collaborateurs au Maryland, qui en 2009 ont pu valoriser par procédé enzymatique
le Kudzu (Pueraria montana var lobata), une plante parasite des cultures de champ en optimisant
le taux de carbohydrates utilisables à 37 %. La paille du blé contenant de l‟hémicellulose a été
analysée en Inde par Nigam (2000). Le processus d‟hydrolyse leur a permis d‟obtenir un taux de
25 % de sucres simples bioconversibles (glucose, arabinose), supérieur au nôtre. Le taux de
sucres fermentescibles obtenu dans les déchets de mangues (17,46 %) répresente une valeur
moyenne comparée aux autres types de déchets agro-industriels. En effet il varie en fonction de la
nature des résidus et du procédé de transformation utilisés. Ainsi Les travaux de Chantata et
collaborateurs en 2008, ont montré que l‟enveloppe de la pomme après extraction du jus
constituait un déchet agro-industriel valorisable, car elle répresente 15-30 % de carbohydrates
fermentescibles. Pour la rationalisation des déchets agricoles, l‟équipe de Yamaji et ses
collaborateurs (2006) ont établi un processus d‟hydrolyse enzymatique permettant d‟obtenir 30 %
de carbohydrates réductibles à partir de résidus (son) des céréales. Au Nigéria Akin-Osanaiye et
collaborateurs en 2008, ont montré que les résidus de fruit de papaye contiennent 20,82 % de
carbohydrates réductibles. Ces résidus peuvent être valorisés.

116
 En Algérie Boujelal et Nacib (2001) ont trouvé que les déchets de dattes renferment 55 %
de sucres totaux. Au Burkina Faso, Traoré et konlani (1989) ont pu montrer que les résidus de
mélasse renfermeraient plus de 25 % de sucres réducteurs.
L‟amélioration par moyen enzymatique du pourcentage de glucides fermentescibles dans
les résidus de mangues ainsi que les travaux de ces différents auteurs sur les résidus agro-
industriels, confirment que les résidus de mangues pourraient être exploités par la voie
biotechnologique.

2. Isolement et identification phénotypique des souches levuriennes et bactériennes

Les caractéristiques morphologiques et culturales des souches retenues se rapprochent de

celles citées dans la littérature sur les levures par Accolas (1984), Guiraud et collaborateurs
(1984) et Obisanya (1987). Ces souches sont immobiles. La présence des ascospores dans les
souches permet de les affilier à la classe des ascomycètes ou ascosporogènes. Ces souches
assimilent les nitrates et ne présentent pas de filamentation, contrairement à Candida albicans
(Bouchet et al., 1990). Les caractères physiologiques (assimilation et fermentation des sucres)
sont régis par la loi de Kluyver selon Bouchet et collaborateurs (1990) stipulant que toute souche
qui fait fermenter un sucre l‟assimile nécessairement. Les souches étudiées sont oxydase et
catalase positives, mais également aéro-anaérobies facultatives.
Il en résulte de l‟étude des différents critères (morphologiques, biochimiques et
physiologiques) que les souches identifiées appartiennent au groupe des levures et à la classe des
ascomycètes. Elles possèdent un métabolisme fermentaire et respiratoire et une tolérance au
milieu acide qui permet de les classer dans le genre Saccharomyces.
Les souches isolées et purifiées sont constituées de cellules ovoïdes. L‟étude des
caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques a permis de donner une approche
d‟identification des souches selon la clé dichotomique de Lodder (1971). Du fait des
antibiotiques (gentamycine ou chloramphénicol) utilisés qui inhibent spécifiquement les
procaryotes et non les eucaryotes, on peut affirmer que ces souches sont des eucaryotes. Aussi le
test au cyclohexymide confirme que les souches isolées sont du genre Saccharomyces. Les
différents résultats permettent de tirer les conclusions suivantes :

117
 Les souches appartiennent au groupe des levures, à la classe des ascomycètes, à l‟ordre
des endomycétales, à la famille des Saccharomycetaceae, à la sous famille des
Saccharomycetoideae, au genre Saccharomyces.
Les caractéristiques globales morphologiques, biochimiques et physiologiques montrent
que les souches bactériennes rétenues pourraient être affiliées à la famille des Bacillaceae. Elles
pourraient appartenir probablement au genre Bacillus car elles possèdent des caractères retrouvés
chez Bacillus subtilis, Bacillus pumilis et Bacillus licheniformis (Buchaman et Gibbons, 1975).
Les souches ayant des caractéristiques similaires à celles du genre Bacillus ont été également
isolées par certains auteurs au cours de la fermentation des graines de Parkia biglobosa (Jideani
et Okere, 1991) et de Bi-kalga (Bengaly, 2001). L‟habitat primaire des Bacillus est le sol, mais on
les retrouve dans les aliments où ils jouent divers rôles (Guiraud, 1998).
Les espèces appartenant au genre Bacillus constituent un ensemble de souches
génétiquement et phénotypiquement très hétérogène (Combet-Blanc, 1995). Les bactéries du
genre Bacillus produisent des α-amylases à action endomoléculaire leur permettant de dégrader
les polymères glucidiques en glucose et en des molécules voisines. La ß-amylase à action
exomoléculaire est excrétée par Bacillus subtilis (Bengaly, 2001). Egalement les enzymes
hydrolysant les polymères des glucides comme les amylases, sont produites par ces bactéries
(O‟Toole, 1999).

3. Etude de l’effet de paramètres environnementaux sur les potentialités des souches

sélectionnées

Les résultats obtenus, montrent l‟importance des paramètres environnementaux sur la

croissance des souches et leurs capacités de fermentation. La concentration en éthanol et la
température ont un effet significatif.
Parmi les vingt souches levuriennes sélectionnées, seules les souches (W2) et (B1, W5,
W6) respectivement croissent à 42 °C et 45 °C tout en tolérant un dégré alcoolique de 14% dans
le milieu de croissance. Le pH affecte le profil cinétique des souches. Ainsi les souches
sélectionnées ont realisé un métabolisme optimal autour d‟un pH de 4,5. Pour des températures
allant de 40 °C à 45 °C, les souches W6 et B1 ont présenté des rendements maximals en
bioéthanol respectifs de l‟ordre de 35% et 30%. Les quantités de métabolites et de biomasse
produites diminuent avec l‟augmentation de la concentration en alcool.

118
 Ces résultats mettent également en évidence une variabilité importante entre les souches
d‟un point de vue cinétique, même si les tendances sont les mêmes pour toutes. Toutes les
souches n‟ont pas la même sensibilité à l‟éthanol. L‟augmentation de la temperature, du pH et de
la concentration en alcool a un effet négatif sur la croissance et l‟activité fermentaire des souches
testées. Obire et collaborateurs (2005) au Nigeria, ont montré que la bactérie Zymomonas mobilis,
isolée du vin de palme était moins sensible à l‟alcool que Saccharomyces et que celle-ci pouvait
tolérer 15% d‟alcool dans un milieu de pH4. Des souches de Saccharomyces survivant à 55°C,
ont été obtenues par Rikhvanov et collaborateurs (2001), gràce à l‟adaptation des cellules à des
températures graduelles. Edgardo et collaborateurs (2008) ont également pu sélectionner des
souches de Saccharomyces capables de croître et de fermenter le glucose (20%) à 45°C, en
procédant à l‟adapation des ces souches.
L‟effet de l‟éthanol et du pH sur la synthèse de biomasse peut être expliqué par la
consommation de substrat pour l‟énergie de maintenance. Lorsqu‟il y a une concentration critique
d‟éthanol, le stress de la cellule augmente globalement les pertes d‟énergie observables par une
diminution de quantité de biomasse formée. Ainsi, l‟influence négative de l‟éthanol sur le
développement des micro-organismes peut s‟expliquer par une augmentation de l‟énergie de
maintenance de ces derniers (Torija et al., 2002). Cette énergie de maintenance est dépensée pour
assurer les fonctions de motilité, les régulations ATPasiques pour le maintien du potentiel
transmembranaire, les flux de relargage d‟excès de substrat (Torija et al., 2002). Cette dépense
d‟énergie pourrait conduire à ralentir ou arreter la croissance cellualire.
Par ailleurs, l‟action inhibitrice de l'éthanol pouvait être liée à la perméabilité de la membrane
des cellules modifiant la solubilité en lipides de la membrane (Leao et Van Uden, 1982).
L'éthanol peut également empêcher l‟action de l‟hexokinase et de quelques enzymes
impliquées dans la synthèse des acides aminés. Des insuffisances métaboliques sur la
reproduction peuvent alors être constatées (Nagodawithana et al., 1977). Des études réalisées sur
la tolérance de souches de bactéries lactiques ont permis d‟établir une relation entre la tolérance à
l‟alcool et la constitution lipidique membranaire (Kalmar et Lonvaud, 2001). Cette étude a
montré que la teneur en phosphore, en acides gras saturés des extraits lipidiques de la membrane
diminue quand la concentration en éthanol augmente dans le milieu de culture. En même temps,
celle des acides gras insaturés, certains glycolipides et la longueur moyenne des acides gras
totaux augmentent.

119
 Des études rapportées par Nedwell (1999) sur l‟effet de la température ont montré qu‟une
augmentation de ce paramètre favorise la croissance des microorganismes par l'augmentation de
la fluidité de membrane et donc l'augmentation du système de transport des protéines.
Des comparaisons entre les résultats obtenus dans notre étude et ceux de travaux menés
par différents auteurs ont permis de confirmer l‟importance des paramètres environnementaux sur
le développement des souches de levures.

4. Optimisation de la production de bioéthanol

La maîtrise des paramètres environnementaux a été un facteur essentiel permettant

l‟optimisation du rendement en bioéthanol. Le procédé couplant successivement une
saccharification par hydrolyse enzymatique suivi d‟une fermentation a abouti à une nette
amélioration du taux de bioconversion des résidus de mangues en alcool. Les souches de Bacillus
Sp1 (A1M1) et Bacillus licheniformis ont pu hydrolyser les carbohydrates non réductibles des
résidus de mangues et libérer respectivement 62% et 76% à 78% (g/g) de sucres réducteurs. Les
résidus de mangues renferment en plus des sucres reducteurs, des hydrates de carbone non
fermentescibles (amidon, tannins). Les souches de bacillus produisent des α-amylases et
glucoamylases capables de rompre ces ponts osidiques et de libérer ainsi des sucres simples. Les
bactéries du genre Bacillus ont été exploitées dans ce procédé d‟optimisation car elles peuvent
synthétiser une diversité de vitamines dont la thiamine, la riboflavine et la biotine. Ces vitamines
joueraient un rôle dans l‟amélioration de la tolérance alcoolique de Saccharomyces (O‟Toole,
1999).
Lagzouli et collaborateurs (2007) ont montré que Candida guilliermondii produit des
glucoamylases capables d‟hyrolyser l‟amidon. L‟activité enzymatique subit parfois une
répression catabolique du glucose libéré reduisant ainsi le rendement de l‟hydrolyse.
Des fermentations simultanées à la suite des hydrolyses enzymatiques (réalisées par des
souches de Bacillus) des résidus de mangues ont montré que les souches de Saccharomyces S3 et
B1 ont produit des concentrations alcooliques respectives de 16 et 14,4 g/L. Par ailleurs les
résultats obtenus sur l‟utilisation séquentielle des éléments minéraux dans le milieu de
fermentation, ont élucidé l‟influence de ces derniers sur la capacité fermentaire des souches
levuriennes.

120
 La souche W1 conservant sa stabilité dans l‟hydrolysat de mangues, a produit 14,2 à 17,5
g/L de bioéthanol sous l‟effet de MnSO4 et 18 g/L en présence de FeSO4. Quant à l‟azote, il a
exercé une influence plus positive sur l‟activation de la souche W1 permettant d‟obtenir une
concentrattion éthanolique de 21,75 g/L.
Le procédé SSF (saccharification simultanée et fermentation) éffectuant l‟hydrolyse
enzymatique et la fermentation éthanolique en une seule étape a montré une réduction de
l‟inhibition de l‟enzyme par le glucose qui est consommé par les micro-organismes fermentaires
au fur et à mesure de son apparition. Il en résulte souvent une augmentation des taux et vitesses
d‟hydrolyse et de production globale en éthanol. Par ailleurs, les risques de contamination
microbienne de l‟hydrolysat riche en glucose sont amoindris. Les principaux inconvénients de la
SSF sont la différence des températures optimales de l‟hydrolyse enzymatique (50°C) et de la
fermentation éthanolique (30°C à 35°C) et l‟impossibilité de recycler les levures. Le rendement
est fonction de la tolérance des souches à l‟alcool liberé dans le milieu. Pour une meilleure
tolérance à l‟alcool, la disponibilité des acides gras et leur incorporation dans des fractions de
glycolipides spécifiques au niveau membranaire seraient d‟une grande importance (Kalmar et
Lonvaud, 2001). La concentration en acide cis-vaccénique et en hopanoïdes rares dans la
membrane sont responsables de la haute tolérance à l‟éthanol. Les Hopanoïdes sont des acides
gras pentacycliques présents dans les membranes plasmiques des bactéries pour réguler leur
fluidité. Chez les eucaryotes c'est le cholestérol qui joue un rôle similaire (Buchholz et al., 1987).
Des études menées par certains auteurs tels Nigam et collaborateurs (2000) sont
parvenues à atteindre un rendement 0,41 (g/g) d‟éthanol (80,4% de rendement théorique)
supérieur au nôtre en utilisant des enzymes provenant de Pichia stipitis sur de l‟hemicellulose de
la paille de blé. Oyeleke et Jibrin (2009) au Nigeria ont pu valoriser les déchets agricoles, en
procédant simultanément à une saccharification de la paille de maïs et de mil par Aspergillus
niger suivi d‟une fermentation de Zymomonas mobilis. Des concentrations éthanoliques
respectives de 26,83 g/L et 18,31 g/L ont été obtenues sur la paille de maïs et de mil. Cette
production d‟alcool à partir de la paille de maïs est supérieure à celle issue de mangues que nous
avons enregistrée (21,75 g/L), et peut s‟expliquer selon Gunasekran et Chandra (2007) par la
présence de pyruvate décarboxylase et d‟alcool déshydrogenase chez Zymomonas mobilis,
facilitant une fermentation avec un fort taux d‟éthanol.

121
 Lekneth et collaborateurs (1994) ayant travaillé sur les sucres du sorgho, obtinrent une
concentration de 27,7 g/L, concentration supérieure à la nôtre. L‟équipe de Suresh et
collaborateurs (1999) en utilisant une hydrolyse par des α-amylases de Bacillus subtilis suivie
d‟une fermentation de S. cerevisiae, ont pu obtenir des concentrations de 34 g/L sur la paille de
blé et 27 g/L sur les résidus de tiges de sorgho.
La concentration de l‟éthanol produit à partir des résidus de mangues obtenue dans notre
étude (21,75 g/L) est nettement supérieure à celle de Palmarola-Adrados et collaborateurs (2005).
Ces auteurs ont pu produire un taux d‟éthanol de 13 g/L sur la paille de blé.

122
CONCLUSION GENERALE ET
PERSPECTIVES

123
Conclusion

La recherche de valorisation des résidus de mangues par la biotransformation a été

réalisée par des techniques biochimiques et microbiologiques. Au terme de cette étude, les
résultats obtenus confirment que les résidus de mangues constituent une source importante de
biomasse exploitable pour la production de bioéthanol.
Les objectifs qui ont suscité cette étude peuvent être considérés comme atteints, car nous
disposons en amont : de la maîtrise des paramètres environnementaux sur le potentiel des
souches ; et en aval des procédés d‟optimisation de fermentations aboutissant à des
concentrations alcooliques satisfaisantes (21,75 g/l).
Les souches de Bacillus sp1 (A1M1) et Bacillus licheniformis rétenues ont présenté une
stabilité vis-à-vis de leur capacité à hydrolyser par voie enzymatique les polymères de glucose et
les polysaccharides. Egalement les souches de Saccharomyces sélectionnées ont temoigné leur
capacité à conserver leur potentiel fermentaire et à s‟adapter aux différentes conditions de
culture (Température de 45 °C et 14 dégré alcoolique).
Le SSF a permis la réduction de l‟effet inhibiteur des co-produits de l‟hydrolyse ou de la
fermentation. Les micro-organismes, notamment S. cerevisiae, peuvent dégrader certains
inhibiteurs. Par exemple, le furfural peut être oxydé en acide furoïque.
L‟utilisation des résidus de mangues pour la production de bioéthanol présenterait de
multiples avantages :
- du point de vu environnemental à travers la valorisation des co-produits et déchets,
- du point de vu socio-économique, il n‟existe pas de compétition avec l‟usage alimentaire
ou agroalimentaire, mais un moindre coût de la matière première.
Enfin les déchets de mangues ; loin d‟être uniquement des polluants pour
l‟environnement, peuvent être valorisés par la production d‟alcool (bioéthanol) et par conséquent
contribuer à l‟assainissement de l‟environnement. C‟est assurément la solution la plus pérenne à
une extension de l‟utilisation du bioéthanol.
Différents schémas et livres de procédé existent, basés sur des expérimentations menées à
des échelles représentatives. Cependant, certaines étapes sont complexes et leur amélioration
nécessite de progresser sur des aspects cognitifs, notamment sur l‟enzymologie de la cellulolyse
et sur la physiologie des levures.

124
Perspectives
L‟implantation d‟une unité pilote de production industrielle est un enjeu majeur dont
l‟avenir repose en grande partie sur les retombées de l‟essor des biotechnologies.
Les résultats obtenus au cours de nos travaux sont encourageants et méritent d‟être
approfondis par :
- La maîtrise du comportement physiologique de la levure en condition de forte teneur en éthanol
par la quantification de l‟efficacité métabolique fermentaire;
- L‟investigation et l‟identification des phénomènes entraînant les inhibitions, toxicités et létalité
des souches;
- L‟identification des cibles moléculaires impliquées dans l‟adaptation de la levure à de fortes
teneurs en éthanol (>15%) ;
- La réalisation d‟une identification complète des souches de levures performantes obtenues
reposant sur des caractérisations génétiques et biomoléculaires;
- L‟adaptation des souches à supporter des dégrés alcooliques élevés par des transferts de gènes
de résistance à l‟alcool.

125
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

126
REFERENCES

AOAC (1990). Association of Official Analytical Chemists 930 (04). Official method of
analysis, 15th ed. Arlington, VA. pp. 40-69.
Accolas, P. (1984). Techniques d‟analyse et de contrôle dans les industries agro-alimentaires.
pp.132-144.

Agores (2001). Biofuels Market Barriers.

http://www.europa.eu.int/en/comm/dg17/atlas/html/biodbarr/html.

Aguilar-Uscanga, M. G., Della, M., Strehaiano, P. (2000). Nutritional requirements of

Brettanomyces bruxellensis: Growth and physiology in batch and chemostat cultures.
Can. J. Microbiol. 46 : 1046-1050.
Aguilera, F., Benitez, T. (1985). Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces
cerevisiae. Arch. Microbiol. 142 : 389-392.
Ajila, C. M., Bhat, S. G., Prasada-Rao, U. J. S. (2007). Valuable components of raw and ripe
peels from two Indian mango varieties. Food Chem. 102 : 1006-1011.
Akin-Osanaiye, B. C., Nzelibe, H. C., Agbaji, A. S. (2008). Ethanol production from Carica
papaya (pawpaw) fruit waste. Asi. J. Biochem. 3 :188-193.

Akubor, P. I. (1996). The suitability of african bush mango juice for wine production. Plant food
Hum. Nutri. 49 : 213-219.

Alazard-Toux, N., Ballerini, D., Dohy, M., Montagne, X., Sigaud, J. B. (2006). La place des
biocarburants dans le contexte énergétique mondial, IFP Publications - Editions Technip -
Paris, Les Biocarburants : Etat des lieux, perspectives et enjeux du développement. ISBN:
2-7108-0869-2. pp. 1-77.
Aldiguier, A. S., Alfenore, S., Cameleyre, X., Goma, G., Uribelarrea, J. L., Guillouet, S. E.,
Molina-Jouve, C. (2004). Synergistic temperature and ethanol effect on Saccharomyces
cerevisiae dynamic behaviour in ethanol bio-fuel production. Bioproc. Byosyst. engineer.
26 : 217-222.
Alexandre, H., Costello, P. J., Remize, F., Guzzo, J., Guillouxbenatier, M. (2004).
Saccharomyces cerevisiae-Oenoccoucus oeni interactions in wine: current knowledge
and perspectives. Internat. J. F. Microbiol. 93 : 141-154.

127
Alfenore, S., Molina-Jouve, C., Guillouet, S. E., Uribelarrea, J. L., Goma, G., Bendadis, L.
(2002). Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a
vitamin feeding strategy during fed-batch process. Ap. Microbiol. Biotechnol. 60 : 67-72.
Askar, A., El-Tamani, A., Raouf, M. (1972). Constituents of mango fruit and their
behaviour during growth and ripening. Germany. Mitteihungen : Rebe ,Wein , obstban
and fruchterver werting. 22 (2) : 120-125.
Bai, F.W., Aderson, W. A., Moo-Young, M. ( 2008). Ethanol fermentation technologies from
sugar and starch feedstocks. Biotechnol. Adv. 26 : 89-105.

Ballerini, D. (2006). Les biocarburants. Paris : Editions Technip.135p.

Bardford, J. P. (1990). A general model for aerobic yeast growth. Batch growth. Biotechnol.
Bioenerg. 35 : 907-920.
Beech, F. W., Thomas, S. (1985). Action antimicrobienne de l‟anydride sulfureux. Bulletin de
l‟O.I.V. 564-581,652-653.
Beer, T., T. Grant, G. Morgan, J. Lapszewicz and Anyon, P. (2006). Comparison of transport
fuels. Final Report (EV45A/2/F3C) to the Australian Greenhouse Office on the Stage 2
study of Life-cycle Emissions Analysis of Alternative Fuels for Heavy Vehicles.
http://www.environment.gov.au/settlements/transport/comparison/index.html.

Ben-Chaabane, M. F. (2006). Intensification de la production d‟ethanol biocarburant dans un

bioréacteur bi-étage avec recyclage cellulaire : modélisation et stratégie de conduite. Thèse
INSA Toulouse. 291p.

Bengaly, M. D. (2001). Etude microbiologique et valeur nutritionnelle d‟un condiment

traditionnel riche en protéines, obtenu par fermentation naturelle des graines d’Hibiscus
sabdarifa. Thèse. Université de Ouagadougou (Burkina Faso). 116p.

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1984). 1: 9th edition.510p.

Blackwell, K. J., Singleton, I., Tobin, J. M. (1995). Metal cation uptake by yeast. A review.
Ap. Microbiol. Biotechnol. 43 (4) : 579-584.

128
Boudjelal, A., N. Nancib (2001). Production d‟Acide Lactique par Lactobacillus Rhamnosus sur
Milieu à Base de Jus de Dattes. Production et Valorisation. Biomasse. Rev. Energ. Ren.
41-46.
Bouix, M., Leveau, J. Y. (1993). Les levures. Microbiologie industrielle : les microorganismes
d‟intérêt industriel. Tec. doc. Lavoisier. pp.1-10.
Brock, T. D. (1970). Biology of microorganisms. By Prentice-Hall, Inc. Englewood Cliffs,
New Jersey.
Buchaman, R. E., Gibbons, N. E. (1975). Bergey‟s manual Determinative Bacteriology.
8th ed. The William and Wilkins company, Baltimore. pp. 529-576.

Buchholz, S. E., Dooley, M. M., Eveleigh, D. E. (1987). Trends biotechnol. 5 : 199-204.

Bruinenberg, P. M., Jonker, R., Dijken, P. J., Sheffers, W. A. (1985). Utilisation of formate as
an additional energy source by glucose-limited chemostat cultures of Candida utilis CBS
621 and Saccharomyces cerevisiae CDS 8066. Evidence for the absence of
transhydrogenase activity in yeasts. Arch. Microbiol. 142 : 302-306.

Cardona, C. A., Sanchez, O. J. (2007). Fuel ethanol production: Process design trends and
integration opportunities. Bioresour. Technol. 98 : 2415-2457.

Casey, G. P., Ingledew, W. M. (1986). Ethanol tolerance in yeast. Crit. Rev. Microbiol.
13 : 219-280.
Castro-Martinez, C. (2007). Brettanomyces bruxellensis : Etude Métabolique, Cinétique et
Modélisation. Influence des facteurs environnementaux. Institut National Polytechnique
de Toulouse. Thèse. 207p.
Chatanta, D. K., Attri, C., Gopal, K., Devi, M., Gupta, G., Bhalla, T. C. (2008). Bioethanol
production from apple pomace left after juice extraction. Inter. J. Microbiol. 5 : 60-80.
Charpentier, C. (1993). Les arrêts de fermentation: rôle de l'éthanol, résistance de la levure.
R.F. d'OEnologie. 140 : 49-52.
Combet-Blanc, Y. (1995). Caractérisation physiologique d‟une nouvelle bactérie lactique de
Provence, Aix-Marseille. Thėse de doctorat. 150p.

129
Colin, M. N., Dalnic, R. (1981). Comparaison de mangues en provenance de Cote d‟Ivoire,

in : J. agrumes/mangues. Irfa. Inra. Montpellier. France. 50p.

Concawe, E. (2007). Joint Research Centre (JRC) Ispra. Well-to-Wheels Analysis of Future
Automotive Fuels and Powertrains in the European Context. Well-to-Wheels Report.
Version 2c. http://ies.jrc.cec.eu.int/WTW.
Converti, A., Bargagliotti, C., Cavanna, C., Nicolella, C., Del Borghi, M. (1996). Evaluation
of kinetic parameters and thermodynamic quantities of starch hydrolyse fermentation by
Saccharomyces cerevisiae. Bioproc. Engineer. 15 : 63-69.
Dabire, A. R. (2001). Rapport d‟activité campagne agricole 2000-2001, INERA, Programme
CMFPT, Burkina Faso. 70p.

DE LAROUSSILHE, F. (1980). Le Manguier. Techniques agricoles et productions tropicales.

Ed Maisonneuve et Larose. Paris. 312 p.

Du-Toit, W. J., Pretorius, I. S. G., Loavaud-Funel, A. (2005). The effect of sulphur dioxide
and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurians and a
strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. J. Ap. Microbiol. 98 : 862-871.

Dodd, J. C., Prusky, D., Jeffris, P. (1998). Fruits diseases.In: Litz RE, editor. The Mango-
Botany, Production and Uses. Wallingford Oxon / CAB International. pp. 257-280.

Dorange, J. L., Dupuy, P. (1972). Mise en évidence d‟une action mutagène du sulfite de sodium
sur la levure. C. R. Académie de Science. Paris, série D. 274 : 2798-2800.
Edgardo, A., Carolina, P., Manuel, R., Juanita, F., Jaime, B. (2008). Selection of
thermotolerant yeast strains Saccharomyces cerevisiae for bioethanol production. Enzy.
Microb. Technol. 43 : 120–123.
Farrell, A. E., Plevin, R. J., Turner, B. T., Jones, A. D., O’Hare, M., Kammen, D. M.
(2006). Ethanol can contribute to energy and environmental goals. Science 311: 506-508.

Fargione, J., Hill, J., Tilman, D., Polasky, S., Hawthorne, P. (2008). Land clearing and the
biofuel carbon debt. Science 319 : 1235-1238.
F.A.O. (1999). Cahier de production et protection intégrée appliquée à la culture du manguier
en Afrique soudano-sahélienne. Projet G.C.P./RAF/244/BEL. 70p.

130
FAO (2008). La situation mondiale de l‟alimentation et de l‟agriculture. Rome. 85p.
Fiechter, A., Furhmann, G. F., Kapelli, O. (1981). Regulation of glucose metabolism in
growing yeast cells. Adv. Microbiol. Physiol. 22 : 123-183.
Fleet, G. H., Heard, G. M. (1993). Yeast: growth during fermentation. Harwood Academic
Publishers, ChurSwitzerland. In: Fleet GM. Ed. Wine Microbiology and Biotechnology.
pp. 27-54.
Fogue, K. (1998). Technologie de séchage des fruits et légumes. Service d‟appui aux PME
(SAPE); CEAS Ouagadougou. Burkina Faso. pp. 51.

Fox, J.D., Robyt, J.F. (1991). Miniaturization of three carbohydrates analysis using a
microsample plate reader. Anal. Bioch. 195 : 93-96.

Gancedo, C., Serrano, R. (1989). Energy-yielding metabolism. The yeasts metabolism and
physiology. 2nd ed. Rose A. H. and Harrison J. S. Academic Press Limited. London.
3 : 205-251.
Gaunt, D. M., Degn, H., Lloyd, D. (1988). The influence of oxygen and organic hydrogen
acceptors on glycolytic carbon dioxide production in Brettanomyces anomalus. Yeast.
4 : 249-255.
Geros, H., Cassio, F., Leao, C. (1997). Glucose transport mechanism in the yeast Dekkera
anomala. 18th ISSY. Yeast Nutri. Natur. Habit. 24-29. Bled, Slovenia.
Geros, H., Azevedo, M. M., Cassio, F. (2000). Biochemical studies on the production of acetic
acid by the yeast Dekkera anomala. Food Technol. Biotechnol. 38 : 59-62.
Gopalan, C., Ramasastri, B. V., Balasubramanian, S. C. (1999). Nutritive value of Indian
foods. India: National Institute of Nutrition, ICMR. Internat. Food Microbiol. 80: 47-53.

Gordon, R.E., Haynes, W.C., Pang, C. H. N. (1973). The genus Bacillus. Handbook No. 427.
U. S. Department of Agriculture, Washington, D. C.

Gosse, G. (2008) Impacts environnementaux des biocarburants. Ecole d‟été de Sauvons le

climat, Cabourg. www.sauvonsleclimat.org/new/spip/IMG/pdf/gosse.
Guillou, V. (1996). Etude du comportement dynamique de Saccharomyces cerevisiae en culture
continue dans la région oxydative des taux de croissance. Thèse INSA Toulouse. 160p.

Guiraud, J. P., Crelzy, P., Gli, T. (1984). Analyse microbiologique dans l‟industrie agro-
alimentaire. Collection Génie alimentaire. pp. 53-61.

131
Guiraud, J. P. (1998). Microbiolgie alimentaire. Dunod, Paris. pp.79-168.

Guira, M. (2003). Rapport d‟activité campagne agricole 2002-2003, INERA, Programme

CMFPT, Burkina Faso. 55p.

Gunasekaran, P., Chandra K. R. (2007). Ethanol fermentation Technology: Z. mobilis.

Madurai Kamary University, Madurai, Indi. 1-22.
Gunisson, A. F. (1981). Sulphite toxicity: a critical review of in vitro and in vivo data. F.
Cosmetol. Toxicol. 19: 667-682.
Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., Chauhan, B. (2003). Microbial
amylases: a biotechnological perspective. Process Biochem. 38 : 1599-1611.

Hayashida, S., Ohta, K. (1981). Formation of high concentration of alcohol by various yeasts.
J. Inst. Brew. 87 : 42-44.
Hill, J., Nelson, E., Tilman, D., Polasky, S., Tiffany, D. (2006). Environmental, economic, and
energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels. Proc. Nat. Acad. Sci. USA;
103 : 11206-112110.
Hossain, M., Haque, M., Rahim, M. A., Rahman, M. A. (2001). Physio-morphological and
compositional variation in ripe fruit of three mango varieties. J. Biol. Sci. 1 (11) : 1101-
1102.
Humphrey, C.N., Okafoagu U. C. (2007). Optimization of ethanol production from garcinia
kola (bitter kola) pulp Agro Waste. Afr. J. Biotechnol. 6 (17) : 2033-2037.
Ibeto, C.N., Okpara, C. G. (2010). Nigeria‟s potentials of renewable energy sources for water
desalination with emphasis on biomass. J. Sci. Technol. Res. 9 : 66-73.

Ingram, L. O., Buttke, T. M. (1984). Effects of alcohols on microorganisms. Adv. Microbiol.

Physiol. 25 : 253-300.
Jarvis, C. E., Walker, J. R. L. (1993). Simultaneous, rapid, spectrophotometric
determination of total starch, amylose and amylopectin. J. Sci. Food Agric. 63 : 53-57.

Jay, J. (1996). Modern Food Microbiology, 5th ed. London: Chapman and Hall. 661p.

132
Jideani, I. A. O., Okere, C. R. (1991). Comparative study of microorganisms and sensory
attributes of condiments from the fermentation of different seeds. Plt. Food Human. Nutrit.,
41 : 27-34.

Johnson, G. I., Mead, A. J., Cooke, A. W., Dean, J. R. (1991). Mango stem end pathogens
infection levels between flowering and harvest. Ann. Appl. Biol. 119 : 465-473.
Jones, R. P., Pamment, N., Greenfield, P. F. (1981). Alcohol fermentation by yeasts. the
effect on environmental and other variables. Process Biochem. 16 : 42-49.
JUDICOME (2004). Etude pour l‟élaboration d‟un plan de développement de la filière fruit et
légumes. Rapport intermédiaire pour l‟atelier national. Ministère de l‟Agriculture de
l‟Hydraulique et des Rressources Halieutiques (MAHRH) Ouagadougou. 125p.

Kalmar, Z., Lonvaud, A. (2001). Recherche sur la tolérance à l‟éthanol des bactéries lactiques
d‟altération des vins. Relation avec la constitution lipidique membranaire. Thèse. Université
de Bordeaux 2, Bordeaux, France. 115p.
Kapelli, O. (1986). Regulation of carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae and related
yeast. Adv. Microbiol. Physiol. 28 : 181-209.
Kim, S., Dale, B. E. (2004). Glocal potential bioethanol production from wasted crops and crop
residues. Biom. Bioener. 26 : 361-375.

Konlani, S., Degenes, J. P., Moletta R., Traoré A. S., Doh A. J. (1996). Isolation and
characterization of yeasts involved in sorghum beer production. Food. Biotech.10 (1): 29-
40.

Konlani, S., Degenes, J. P., Moletta R., Traoré A. S., Doh A. J. (1998). Optimization of cell
yield of Candida krusei S01 and Saccharomyces sp. LK3G cultured in sorghum hydrolsate.
Bioress.Technol. 57 : 275-281.

Kreger Van Rij, N. J. S. (1984). The yeast: a taxonomic study, 3rd ed. Elsevier, Amsterdam.

Kruckeberg, A. L. (1997). The hexose transporter of the family of Saccharomyces cerevisiaie.

Arch. Microbiol. 163: 283-292.

Kumar J. (1983). Studies on symptomatology, etiology and control of mango malformation.

Ph.D. thesis, G.B. Pant University of Agriculture and Technology, Pantnagar. 118p.

133
Lagzouli, M., Charouf, R., Yachioui, E. M., Ouhssine, M., Berny, E. H., Djadal, M. (2007).

Optimization of the growth and the glucoamylase extracellular production by Candida

guilliermondii. Bull. Soc. Pharm. Bordeaux. 146 : 251-270.

Larpent, G., Larpent, M. (1990). Mémento, Technique de microbiologie. 2è ed. Technique et

documentation. Lavoisier. 417 p.

Larpent, G. M., Sanglier, J. J. (1991). Biotechnologies, Principes et méthodes, Doin. Ed.

Collection Biosciences et Techniques, Paris. 668p.
Latifa, J., Khalil, E., Jamal, E.Y., Mohamed, E. (2007). Production of ethanol from starch by
free and immobilized Candida tropicalis in the presence of α-amylases. Science Direct.
Bior. Tech. 98 : 2765-2770.

Leao, C. and Van Uden, N. (1982). Effects of ethanil and other alkanols on the glucose
transport system of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioengineer. 24 : 2601-2604.
Leclerc, H., Izard, D., Husson, M., Wattre, P., Jakubczake, P. (1995). Microbiologie
générale. Ed. Doin.Paris. 363p.

Lee, C. G., Kim, C. H. Rhee, S. K. (1992). A kinectic model and simulation of starch
saccharification and simultaneous ethanol fermentation by amyloglucosidase and
Zymomonas mobilis. Bioprocess Eng. 7 : 335-344.

Lekneth, V., Christaopouls, P., Marris, B. (1994). Bioethanol technology review. J.

Biotechnol. 16: 983-988.
Lei, F., Rotboll, M., Jorgensen, S.B. (2001). A biochemically structured model for
Saccharomyces cerevisiae. J. Biotechnol. 88 : 205-221.
Licht, F.O. (2005). World ethanol and biofuels report. pp. 3-15.

Liu, S., Lin, C., Xie, L., Cao, Z. (2003). Intrecellular pH and Metabolic Activity of long-
chain dicarboxylic acid-producing yeast Candida tropicalis. J. Biosci. Bioengineer.
96 (4): 349-353.
Lodder, J. (1971). The yeast taxonomic study. 2nd ed. Amterdam, London, Holland. 275p.

134
Macris, B. J., Markakis, P. (1974). Transport and toxicity of sulfur dioxide in Saccharomyces
cerevisiae var ellipsoideus. J. Sci. F. Agricult. 25 : 21-29.
Mager, W. H. and Varela, J. C. S. (1993). Osmostress response of the yeast Saccharomyces.
Molecul. Microbiol. 10 : 253-258.

Maiorella, B., Blanch, H., Wilke, C. R. (1983). By-product inhibition effects on ethanolic
fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioingeneer. 25 : 103-121.
Makkar, R. S. and Cameotra, S. S. (2002). An update on the use of unconventional substrates
for biosurfactant production and their new applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:
428-434.

Mann, P., Siewert S., Totter, J. (2002). Fermenting potato peels and chips into ethanol.
Biocycle. Millet husk. Afric. J. Microbiol. Resear. 3 (4) : 147-152.

Manry, L. (2005). Analyse automatique d‟images de populations microbiennes. Thèse, N°

808, Toulouse. 152p.

Montesinos, T., Navarro, J-M. (2000). Role of maltose in the simultaneous-saccharification-

fermentation process from raw wheat starch and Saccharomyces cerevisiae. Bioprocess
Eng. 23 : 319-322.
Martinez, E. A., Silva, S. S., Almeida, E., Silva, J. B., Solenzal, A. I. N., Felipe, M. G. A.
(2003). The influence of pH and dilution rate on continuous production of xylitol
from sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate by C. guillermondi. Process Biochem.
38 : 1677-1683.
Milar, D. G., Griffiths-Smith, K., Algar, E., Scopes, R. K. (1982). Activity and stability of
glycolytic enzymes in the presence of ethanol. Biotechnol. Lett. 4 : 601-606.
Miller, G. L. (1958). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Anal. Bioch. 195 : 93-96.
Moulin, G., Boze, H., Galzy, P. (1984). Inhibition of alcoholic fermentation. Biotechnol. Gen.
Eng. 2 : 365-382.
Mustafa, B., Havva, B., Cahide, O. (2008). Progress in bioethanol processing. Progress Energy
Combustion Sci. 34 : 551-573.

135
Nagodawithana, T. W., Steinkraus, H. K. (1976). Influence of the rate of ethanol production
and accumulation on the viability of S. cerevisiae in rapid fermentation. Ap.
Environment. Microbiol. 31 : 158-162.
Nagodawithana, T. W., Whitt, J. T., Cutaia, A. J. (1977). Study of the feedback effect of
ethanol on selected enzymes of the glycolytic pathway. J. Americ. Soci. Brew. Chem. 35 :
179- 173.
Naim, K., Andrzej W., Gregory, P. C., Robert, J. M., Jiri E. P. (1983). Biomass,
Microorganisms for Special Applications, Microbial Products , Energy from Fenewable
Resources. Biotechnol. Chap 3a. 3 : 257-386.

Nakamura, Y., Sawada, T., Komatsu, A. (2002). Ethanol production from raw starch by
recombinant yeast having saccharification and fermentation activities. J. Chem. Technol.
Biotechnol. 77 : 1101-1106.

Nana, C. P., Brouwer, I. D., Zagré, N. M., Kok, F. J., Traoré, A. S. (2006). Impact of
promotion of mango and liver as sources of vitamin A for young children : a pilot study in
Burkina Faso. Pub. Health Nutri. 9 (6) : 808-813.

Neves, M. A., Kimura, T., Shimizu, N., Shiiba, K. (2005). Production of alcohol by
simultaneous saccharification and fermentation of low-grade wheat flour. J. Zaffius
Biotechnol. 1 (2) : 1-10.

Nedwell, D. B. (1999). Effect of low temperature on microbial growth: lowered affinity for
substrates limits growth at low temperature. FEMS Microbiol. Ecol. 30 (2) : 101-111.

Nigam, J. N. (2001). Ethanol production from wheat straw hemicelluloses hydrolysate by

Pichia stipitis. Biotechnol. 87: 17-27.
Nout, M. J. R., Rombouts, F. M., Havelarr, A. (1989). Effect of accelerated natural lactic
fermentation of infant food ingredients on some pathogenic microorganisms. Int. J. Food
Microbiol. 8: 351-361.
Novak, M., Strehaiano, P., Moreno, M., Goma, G. (1981). Alcoholic fermentation: on the
inhibitory effect of ethanol. Biotechnol. Bioengineer. 23 : 201-211.

136
Obire, O. (2005). Activity of Zymomonas mobilis species in palm sap obtained from three areas
in Edo State. Department of Applied and environmental biology. Rivers State University of
Science and technology, Nkpoh-oroworukwo.P.M.B. J. Appl. Sci. Environ. Mgt. 9 (1) : 25-30

Obisanya, M. O., Aina, J. O., Oguntimen, G. B. (1987). Production of wine from mango
(Magnifera indica L.) using Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces species
isolated from palm Wine . J. App. Bact. 63 : 191-196.
Olsen, H. S. and Andersen, E. (2001). Utilization of enzymes in agricultural product processing.
Novozymes A/S. Catalogue A-6901.35p.
Oestling, A. (2001). Carburant additionné de bioethanol Stoa. Evaluation des choix scientifiques
et technologiques. Note d‟information n° 07/2001. http://www.europa.eu.int/stoa/publi/pdf.
O’Toole, D. K. (1999). Characteristics and use of Okara, the soybean residue from milk
production: A review. J. Agric. Food Chem. 47 : 363-371.

Ouédraogo, S. N. (2002). Etude diagnostique des problèmes phytosanitaires du manguier

(Mangifera indica L.), de l‟oranger (Citrus sinensis (L.) Osbeck) et du mandarinier (Citrus
reticulata Blanco) dans la province du Kénédougou. Mémoire d‟ingénieur du
développement rural option agronomie. Université polytechnique de Bobo-
Dioulasso/Institut du développement rural. 94 p.

Ough, C. S., Crowell, E. A. (1987). Use of sulfur dioxide in winemaking. J. F. Sci. 52 (2) : 386-
393.
Oyeleke, S. B., Jibrin, N. M. (2009). Production of bioethanol from guinea cornhusk and millet
husk. Afric. J. Microbiol. Researc. 3 (4) : 147-152.
Palmarola-Adrados, B., Choteborska, P., Galbe M., Zacchi, G. (2005). Ethanol
production from non-starch carbohydrates of wheat bran. Biores. Technol. 96 : 843-850.
Pampulha, E., Loureiro-Diaz, M. C. (1989). Combined effect of acetic acid, pH and ethanol
on intracellular pH of fermenting yeast. Ap. Microbiol. Biotechnol. 31 : 547-550.
Pampulha, E., Loureiro-Diaz, M. C. (1990). Activity of glycolytic enzymes of Saccharomyces
cerevisiae in the presence of acetic acid. Ap. Microbiol. Biotechnol. 34 : 375-380.

137
Pasty, J.C. (2004). Les débouchés non alimentaires des produits agricoles : un enjeu pour la
France et l‟Union Europeenne. Avis et rapports du Conseil Economique et Social. N°
2004. 1-201.
Perréon-Delamette (2004). De l‟or noir à l‟or vert, l‟avenir industriel des bioproduits. Dossier
de presse de l‟ADEME. http://www.chanvre-infoch./info/en/article2479html.
Peterson, R. A. (1986). Mango diseases. Proceedings of the CSIRO First Australian Mango
Research Workshop. pp. 233–247.
Phowchinda, O., Delia-Dupuy, M. L., Strehaiano, P. (1995). Effects of acetic acid on growth
and fermentative activity of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 17 : 237-242.
Ploetz, R. C. (1994). Distribution and prevalence of Fusarium subglutinans in mango tree
affected by malformation. Can. J. Bot. 72:7-9.
Poilpré, E. (2002). Mecanisme d‟adaptation rapide de Saccharomyces cerevisiae en
metabolisme oxydatif : implication des sucres de réserve et de la capacité respiratoire.
Thèse INSA Toulouse. 132p.
Prescott, M., Harley, J. P., Klein, D. (1995). Microbiologie, De Boeck Université (ed),
Bruxelles. p. 1014.
Prusky, D., Fuchs, Y., Yanko, U. (1983). Assessment of latent infections as a basis for control
of post harvest disease of mango. Plant Dis. 67 : 816–818.
Romano, P., Suzzi, G. (1992). Sulfur dioxide and wime microorganismes. In: Wine Technology
and Biotechnology. G. H. Fleet. Ed. Harwood, Academic Publishers, Chur. Suisse. pp.
373-393.
Ramos, M. T., Medeira-Lopes, A. (1990). Effects of acetic acid on the temperature profile of
ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 12 : 229-234.
Rey, J. Y., Diallo, T. M., Vanniere, H., Didier, C. (2004). The mango in french-speaching West
Africa: varieties and varietal composition of the orchards. Fruits. 59 (3) : 191-206.

Ribereau-Gayon, P., Dubourdieu, D., Doneche, B., Lonvaud, A. (1998). Traité d‟oenologie -
tome 1 - Microbiologie du vin, vinification, Dunod (ed), Paris. 617p.
Rikhvanov, E., Varakina, N., Rusaleva, T., Rachenko, E., Kiseleva, V., Voinikov, V. (2001).
Heat shock-induced changes in the respiration of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Microbiol. 70 : 462-465.

138
Rowan, F. S., Heather, A. C., Danielle, A. W., Runion, G. B., Stephen, A. P., H. Allen, T.,
Richard, S., Lewis, Z. (2009). Kudzu [Puerariamontana (Lour.)Merr.Variety lobata]: A
new source of carbohydrate for bioethanol production. Biom. Bioenerg. 33 : 57-61.

Sablayrolles, J. M. (1992). Importance de l‟azote assimilable et de l‟oxygène sur le déroulement

de la fermentation alcoolique. Biolog. Og. VI (1-2). 155-160.
Sanaa, M. (2002). Microbiologie prévisionnelle : principaux modèles de croissance utilisés en
appréciation quantitative des risques. Epidémiol. Sant. anim. 41 : 169-177.

Scheffers, W. A. (1992). Contaminants in Baker‟s yeast, proceeding of the COMMET course

on Microbial Contaminants. Helsinki 1991 and 1992. Ed. By M. Korhola and V.
Bacstrom. Research. 7 : 19-36.
Schulze, U. (1995). Anaerobic physiology of Saccharomyces cerevisiae. Thesis. Department of
Biotechnology. Technical University Denmark. 140p.

Sévastianos, R. (1977). Taxonomie et écologie des bactéries sphériques hétérotrophes isolées du

milieu marin. Thèse. Université de Provence. 132p.

SICAREX (2000). Analyse institutionnelle de la filière mangue dans les départements de

Orodara et Koloko : Rapport provisoire, Bobo-Dioulasso, Burkina Faso, Organisation
Neerlandaise des Volontaires (S.N.V.). 52p.

Sree, N. K., Sridhar, M., Suresh, K., Banat, I. M., Rao, L. V. (2000). High alcohol production
by repeated batch fermentation using an immobilized osmotolerant S. cerevisiae. J. Ind.
Microbiol. 24 : 22-226.

Strehaiano, P. (1984). Phénomènes d'inhibition et fermentation alcoolique. Thèse de doctorat

de l‟institut National Polytechnique de Toulouse, France. 148p.
Suresh, K., Kiransree, N., Rao, L. V. (1999). Production of ethanol by raw starch
hydrolysis and fermentation of damaged grains of wheat and sorghum. Bioprocess Eng.
21 : 165-168.
Teusink, B., Diderich, J. A., Westerhoff, H. V., Van Dam, K., Walch, M. C. (1999).
Intracellular glucose concentration in derepressed yeast cells comsuming glucose is high
enough to reduce the glucose transport rate by 50%. J. Bacteriol. 180 (3): 556-562.

139
Torija, M. J., Rozes, N., Poblet, M., Guillamon, J. M., MAS, A. (2002). Effects of
fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. Internat.
Food Microbiol. 80 : 47-53.
Traoré, A. S., Konlani, S. (1989). Etude physiologique d‟une levure utilisée dans l‟alimentattion
humaine au Burkina Faso comme source de proteines. Abn-Symp. Biol/Food Prod. Afr.
741-747.

Vayssieres, J-F., Sanogo, F., Noussourou, M. (2004). Inventaire des espèces de mouches de
fruits (Diptera teppritidae) inféodées au manguier au Mali et essai de lutte raisonnée.
Fruits. 59 : 1-14.

Wibowo, D., Eschenbruch, R., Davis, C. R., Fleet, G. H., Lee, T. H. (1985). Occurrence and
growth of lactic acid bacteria in wine: a review. Americ. J. Enol. Viticult. 36: 302-313.
Yamaji, K., Matsumura, Y., Ishitani, H., Yamada, K., Wyman, C. E., Tolan, J. S. (2006).
Production of low-cost bioethanol to be a rival to fossil fuel.
http:www.nedo.go.jp/itd/teian/ann-mtg/fy18/project/h-03y_e.pdf.
Yang, H. Y. (1973). Deacidification of grape musts with Schizosaccharomyces pombe.
Americ. J. Enolog. Viticult. 24: 132-140.
Yeboua, A. F. (1989). Production d'éthanol par S. cerevisiae Y847NNRL, à partir d'hydrolysat
d'amidon de manioc. Abn-Sym. Biol. Food. Afri. 789-793.
Liens électroniques

1.http://www.actuenvironnement.com/ae/dictionnaire_environnement/definition/biomasse.php4.

(05/01/2011).

2. http://www.biomassenergycentre.org.uk/portal/page?_pageid=76,15049&_dad=portal&.

(05/01/2011).

3. http://www.biologie.univ-mrs.fr/upload/P251/Photosynthesis.pdf (05/01/2011).

140
ANNEXES

141
ANNEXES

Annexe 1 : Milieu de gélose de conservation

Agar-agar (Difco) 20 g
Glucose (Difco) 20 g
Extrait de levure (Difco) 10 g
NaCl (Prolabo) 10 g
Glycérol 10%
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 2 : Milieu de Sabouraud solide

Peptone (Difco) 10 g
Glucose (Difco) 20 g
Agar (Difco) 10 g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 6 ± 0,2

A ce milieu on ajoute après autoclavage et refroidissement dans des conditions stériles ; la

gentamicine ou le chloramphénicol à raison de 0,40 g/l pour la gentamicine et de 0,5 g/l
chloramphénicol. Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

142
Annexe 3 : Milieu YEPD

Yeast extract (Extrait de levure) 10 g

Peptone (Difco) 10 g
Dextrose (Difco) 20 g
Agar (Difco) 10 g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 6 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 4 : Milieu gelose farine de Maїs

Infusion de farine de Maїs 10 g

Agar (Difco) 5g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 6 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 5 : Milieu alcoolique pour l’étude de la tolérance à l’alcool

Extrait de levure 5g
Glucose 20 g
Ethanol X ml
Eau distillée qsp Y ml
pH 6 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

143
Annexe 6 : Milieu de Clark et Lubs

Peptone (Difco) 6g
Glucose (Difco) 20 g
K2HPO4 5g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 7 : Milieu pour la détermination du caractère amylolytique des souches

Extrait de levure 5g
Agar 20 g
Amidon 10 g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

Annexe 8 : Milieu pour le test de sporulation

Extrait de levure 3g
Peptone 5g
Glucose 20 g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

144
Annexe 9 : Milieu de base pour l’étude de la fermentescibilité des sucres

Extrait de levure 5g
K2HPO4 1g
MgCl2 (6H2O) 0,4 g
NH4Cl 1g
FeSO4 (7H2O) 5 mg
Solution d‟oligoéléments 1 ml
Tween 80 1 ml
Sucre 3g
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 7 ± 0,2

Le milieu est stérilisé à 121° C pendant 45 minutes.

Annexe 10 : Milieu synthétique pour la fermentation des sucres (KONLANI, 1996)

Extrait de levure 3g
Peptone 1g
(NH4)2SO4 0,4 g
MgSO4 1g
K2HPO4 5 mg
Solution d‟oligoéléments 1 ml
Eau distillée qsp 1000 ml
pH 7 ± 0,2

Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes.

145
Annexe 11 : Courbe étalon montrant corrélation entre le poids-sec et la densité optique à
600 nm pour Saccharomyces sp isolée du ferment de dolo (bière locale).

146
Annexe 12 : Courbe étalon des sucres totaux

147
Annexe 13 : Courbe étalon des sucres réducteurs

148
Annexe 14 : Courbe étalon de l’amidon total

149