Thèse Levy Caroline 2010

Ecole Doctorale
"Science des procédés-science des aliments"
Université Montpellier II
Thèse
pour obtenir le titre de
Docteur de l'Université d'Avignon et des Pays de Vaucluse

Discipline: Biotechnologie, Microbiologie
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Caroline LEVY
Principaux facteurs influençant l'efficacité de la

lumière pulsée pour la décontamination des
microorganismes pathogènes et d’altération des
denrées alimentaires
Soutenue le 17 décembre 2010 devant le jury composé de:
Rapporteurs Mme Brigitte CARPENTIER - Directeur de recherche - ANSES

M. Frank DEVLIEGHERE - Professeur - Université de Gand
Examinateurs Mme Catherine DUPORT - Professeur - Université d’Avignon

M. Christophe RIEDEL - Directeur de société - CLARANOR
M. Eric METTLER - Ingénieur de Recherche - SOREDAB
Directeur de Thèse M. Frédéric Carlin - Directeur de Recherches – INRA
Université d'Avignon et des Pays de Vaucluse, UMR A408, Sécurité et qualité des produits
d'origine végétale, INRA, Avignon
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" L'homme et sa sécurité doivent constituer la première

préoccupation de toute aventure technologique."
A. Einstein
Remerciements
Je remercie Christophe N'Guyen The pour m'avoir accueillie dans son laboratoire.
Merci à Frédéric Carlin, mon maître de thèse, de m'avoir encadrée et supportée durant ces
trois années, de m'avoir appris tant de choses et de m'avoir permis d'arriver à ce niveau.
Un Merci tout particulier à Christophe Riedel, mon responsable à Claranor, pour m'avoir
engagée, soutenue et aidée à chaque moment, pour avoir cru en moi et guidée jusqu'à la fin et
même au delà.
Je remercie sincèrement les membres du jury, qui ont accepté de juger mon travail de thèse.
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Un merci particulier à tous les membres de la société Claranor, pour leur travail remarquable,
leur aide et leur bonne humeur
Un grand merci à tous mes collègues du laboratoire INRA, pour leur bonne humeur, leur aide
précieuse, leur dévouement, et leurs super gâteaux, sans oublier Aline et Claire, qui ont
grandement contribué à la réalisation de ce travail!
Je voudrais à présent remercier mes parents, sans qui je ne serais pas ce que je suis
aujourd'hui, pour leur amour et leur dévouement à chaque instant. Merci de croire en moi
aussi fort, d'effacer mes doutes et mes angoisses, et surtout de m'avoir donné une vie aussi
merveilleuse et pleine de bonheur.
Merci également à mon frère, Johann, d'avoir été un grand frère trop cool, qui m'a fait aimer
et connaître tous les jeux auxquels on joue tout le temps, et qui m'a supportée (plus ou moins
facilement) depuis 28 ans!
François, merci pour ton soutien et pour ta façon parfois très spéciale de m'aimer et de me
comprendre. Merci pour ton attention et ton écoute, je sais que parfois il faut travailler dur!!!
Et puis merci à toute ma famille, pour être toujours présents pour moi, et puis ma belle
famille, pleine d'attention et de gentillesse...
Un grand merci à mes amis, Karine, David, Guigui, ma Juju, Doudou, Franck, Charlotte,
Minus...et j’en oublie… pour tout ce qu'ils m'apportent au quotidien, pour les soirées, cinés,
week-ends en vadrouille...
Je voudrais enfin remercier ma perle noire, Gaïa... une petite merveille qui fait les meilleurs
câlins du monde!
Table des matières
Table des matières
Avant propos .............................................................................................................................. 1

Etude bibliographique ................................................................................................................ 2
1. Introduction .................................................................................................................... 2
2. Le traitement thermique ................................................................................................. 3
1) Principe....................................................................................................................... 3
2) Mécanismes d'inactivation des microorganismes ...................................................... 6
3) Efficacité microbiologique du traitement thermique ................................................. 7
4) Equipements industriels ........................................................................................... 11
5) Avantages du traitement thermique, limites, produits cibles ................................... 13
3. Techniques non thermiques alternatives ...................................................................... 14
1) Hautes Pressions Hydrostatiques (HPH) et Hautes Pressions à Dioxyde de Carbone
(HPDC) ............................................................................................................................. 14
a. Principe............................................................................................................... 14
b. Mécanismes d'inactivation des microorganismes .............................................. 15
c. Efficacité microbiologique ................................................................................. 16
d. Equipements industriels ..................................................................................... 18
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e. Législation .......................................................................................................... 19
f. Avantages de la technologie, limites, produits cibles ............................................ 20
2) Champs électriques pulsés (CEP) ............................................................................ 21
a. Principe............................................................................................................... 21
b. Mécanismes d'inactivation ................................................................................. 22
e. Législation .......................................................................................................... 25
3) Irradiations ............................................................................................................... 26
a. Principe............................................................................................................... 26
e. Législation .......................................................................................................... 30
4) UV continus.............................................................................................................. 34
a. Principe............................................................................................................... 34
e. Législation .......................................................................................................... 39
4. La lumière pulsée: ........................................................................................................ 41
1) Principe..................................................................................................................... 41
2) Mécanismes d'inactivation ....................................................................................... 42
3) Efficacité microbiologique ....................................................................................... 44
4) Equipements industriels ........................................................................................... 49
5) Législation ................................................................................................................ 50
6) Avantages de la technologie, limites, produits cibles .............................................. 51
7) L'étude approfondie de la lumière pulsée présente-t-elle un réel intérêt par rapport
aux autres techniques physiques de décontamination? .................................................... 52
Table des matières
Présentation du travail de thèse ................................................................................................ 55

1. Objectifs scientifiques et technologiques ..................................................................... 55
2. Démarche expérimentale .............................................................................................. 56
1) Réalisation d’un pilote afin de déterminer l'efficacité de la lumière au niveau
microbiologique ............................................................................................................... 56
2) Influence de la méthode d’inoculation et de la surface ............................................ 57
3) Principaux facteurs influençant l'efficacité germicide de la lumière pulsée ............ 58
4) Une application industrielle...................................................................................... 59
Résultats ................................................................................................................................... 60
1. Un équipement de lumière pulsée délivrant une fluence homogène pour la
décontamination de larges surfaces expérimentales ............................................................. 60
Article 1 .................................................................................................................... 62
Perspectives issues du travail présenté dans l’article 1 ............................................ 81
2. Une méthode d'inoculation par spray pour étudier la décontamination de surfaces par
la lumière pulsée................................................................................................................... 85
Article 2 .................................................................................................................... 87
Données complémentaires...................................................................................... 101
3. Décontamination des microorganismes par lumière pulsée: importants facteurs
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influençant l'efficacité germicide. ...................................................................................... 106

Article 3 .................................................................................................................. 108
Influence du stade de culture de cellules ou du milieu de sporulation sur la
résistance de B. subtilis à la lumière pulsée ........................................................... 129
4. Décontamination de sirop de sucre par lumière pulsée. ............................................. 134
Article 4 .................................................................................................................. 136
Etude d'un équipement pilote industriel de lumière pulsée pour la décontamination
de sirop de sucre en dynamique sur ligne............................................................... 148
Discussion générale ................................................................................................................ 150
Références bibliographiques: ................................................................................................. 156
Valorisation du travail de thèse .............................................................................................. 173
Avant propos
Avant propos
Le développement de nouveaux procédés technologiques visant à l’amélioration de la

sécurité sanitaire des produits alimentaires et de leur durée de vie présente un réel intérêt pour
le secteur agroalimentaire. Dans un contexte actuel qui tend vers une responsabilisation
environnementale des industries, la société CLARANOR met au point des solutions de
décontamination des surfaces sans produits chimiques et sans consommation d’eau, mettant
en œuvre la technologie de la lumière pulsée. Etudiée en laboratoire depuis les années 80, la
technologie a manqué jusqu'à récemment de fondements scientifiques solides permettant
l'obtention de résultats fiables et satisfaisants pour des applications industrielles. Afin de
combler ces lacunes et d’être en mesure de garantir l'efficacité de la technologie aux
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utilisateurs industriels, CLARANOR a mis en place une stratégie de recherche et

développement visant à consolider les connaissances scientifiques concernant la lumière
pulsée. La maîtrise de la technologie nécessite en particulier l'étude des phénomènes
physiques qui interviennent lors du procédé, et des mécanismes microbiologiques s'y
rapportant. Dans l’optique de corréler les paramètres de l’émission lumineuse constituant le
traitement et l’efficacité de décontamination microbienne, un projet de recherche a été initié
par CLARANOR au sein d'un laboratoire spécialisé en microbiologie, en collaboration étroite
avec l'équipe de physiciens de CLARANOR. Cette thèse CIFRE (soutenue par l'Association
Nationale de la Recherche et de la Technologie) a pour but d'établir les bases scientifiques de
l'effet de la lumière pulsée CLARANOR, afin d'évaluer l'efficacité décontaminante de la
technologie sur des microorganismes d'intérêt industriel.
Etude Bibliographique
Etude bibliographique
1. Introduction
La conservation des aliments est un combat constant contre les microorganismes

d'altération ou les pathogènes de l'homme. Depuis longtemps le coût des produits, leur qualité,
mais surtout la sécurité sanitaire des aliments ont été les principaux centres d'intérêt des
industriels. A l'heure actuelle, la chaîne alimentaire est devenue plus complexe, multipliant les
possibilités de contamination et de développement des agents pathogènes (Codex
Alimentarius, 2003). Aux Etats-Unis, environ 76 millions de cas de toxi-infections
alimentaires (TIA) sont estimés chaque année, menant à 325000 hospitalisations et 5000
décès (Keklik & Demirci, 2009). Selon le rapport de l'INVS (Institut de Veille Sanitaire)
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(INVS, 2009), 1124 foyers de TIAC (Toxi-infections Alimentaire Collectives) ont été
déclarés en France en 2008, avec 12549 personnes contaminées, dont 5 décédées. Les
techniques de décontamination sont très étudiées et présentent un intérêt central dans les
industries agroalimentaires au niveau mondial. D'un autre côté, il faut faire face à une
demande croissante des consommateurs de produits frais, sains et satisfaisants sur le plan
organoleptique, avec une durée de conservation de plus en plus longue. Nous sommes tournés
vers une alimentation qui allie qualités gustatives et nutritionnelles. C'est pourquoi l'industrie
alimentaire est sans cesse à la recherche de nouvelles techniques de conservation, visant à
préserver la qualité des aliments, tout en optimisant au maximum la durée de conservation.
De nombreuses techniques sont étudiées, visant dans l'idéal l'obtention d'un produit
microbiologiquement maîtrisé, sans altération de saveur, se rapprochant le plus possible du
produit original. Il est cependant très difficile de concilier sécurité microbiologique et qualités
organoleptiques, du fait de la grande variabilité existante, tant au niveau biologique (aliments
crus, microorganismes différents), qu'au niveau pratique (temps de stockage, températures,
vie des produits chez le consommateur...). De nombreuses espèces microbiennes peuvent être
à l'origine d'altérations des aliments ou encore de toxi-infections alimentaires. Parmi elles, les
spores bactériennes sont souvent le problème le plus difficile à résoudre pour la conservation.
En effet, les spores sont connues comme une des formes de vie les plus résistantes (Nicholson
et al., 2000) et leur inactivation complète est souvent impossible sans altérer la qualité de
l'aliment (Smelt et al., 2008). Les traitements thermiques, très utilisés en industrie
(Spilimbergo et al., 2002), sont des méthodes physiques sûres, et bénéficient d'une image
2
nettement plus positive que les traitements faisant intervenir des composés chimiques. Mais
ils altèrent parfois fortement les qualités organoleptiques des aliments. Il y a donc un réel
besoin de trouver des traitements alternatifs, moins dénaturants, mais permettant la même
efficacité de décontamination microbiologique.
Parmi les technologies innovantes, les techniques dites "athermiques" présentent une
alternative séduisante. Les techniques physiques, visant à remplacer les additifs chimiques,
offrent une meilleure image (préservation du naturel). Ces techniques physiques regroupent,
entre autres, les hautes pressions, les champs électriques pulsés, l'irradiation (Rayons X,
Rayons γ), les UV continus, la lumière pulsée... Certaines d'entre elles, comme les
ultraviolets, sont de bons candidats pour l'utilisation en industrie, en tant que techniques
athermiques d'inactivation microbiologique (Koutchma, 2009). Il est important de connaître
les principes de ces différentes méthodes, mais également les limites qu'elles peuvent
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présenter, dans le but de déterminer les applications possibles, et les intérêts industriels de ces
nouvelles technologies.
Afin de mieux cibler les besoins et les problèmes rencontrés, il est indispensable d'avoir
un certain recul sur les traitements appliqués. Le traitement thermique, encore reconnu
comme référence dans ce domaine, sera étudié dans une première partie. Quelques unes des
nouvelles technologies athermiques les plus utilisées seront détaillées et comparées dans une
seconde partie. Enfin, le nouveau procédé de décontamination par lumière pulsée, sujet
principal de cette étude, fera l'objet d'une troisième partie. Nous expliquerons pourquoi cette
technologie se distingue des autres, et quelle pourrait être sa place dans le secteur industriel
actuel.
2. Le traitement thermique
1) Principe
Le traitement thermique est aujourd'hui la technique de décontamination la plus

communément utilisée en industrie agroalimentaire (Farkas, 2007). En termes de sécurité
alimentaire, il a pour objectif de détruire ou d’inhiber totalement, d’une part les enzymes, et
d’autre part les microorganismes et leurs toxines, dont la présence ou la prolifération pourrait
altérer la denrée considérée ou la rendre impropre à l’alimentation humaine (Décret n°55-241,
1955). Les premiers procédés industriels de traitement thermique datent de 1809, avec
3
Nicolas Appert (1749-1841). Ce dernier a mis au point une méthode de conservation des
aliments en les traitant par la chaleur dans des bouteilles en verre hermétiquement scellées
(Appert, 1810; Gaillard, 2003). Mais ses travaux ne se limitent pas à la conservation; il
découvre le procédé de chauffage du lait à une température proche de 70°C permettant une
conservation limitée dans le temps, qu’il applique également au vin et à la bière, procédé dit
maintenant « pasteurisation ». Soixante ans plus tard, Pasteur (1822-1895) expliquera
scientifiquement le processus et reconnaîtra en Appert un précurseur. Par la suite, il mettra au
point la méthode permettant de réduire le niveau de contamination d'un milieu grâce à un
chauffage de quelques minutes entre 55°C et 60°C en l'absence d'air.
Depuis cette époque de nombreuses études ont été menées sur le traitement thermique,
dans le but d'optimiser les procédés pour allier le mieux possible sécurité et conservation des
aliments. De nos jours, on utilise plusieurs procédés, selon le couple temps/température
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appliqué. La pasteurisation nécessite un chauffage généralement inférieur à 100°C et la

stérilisation, un couplage temps/température plus élevé.
La pasteurisation est un traitement thermique modéré permettant la destruction des
microorganismes pathogènes et d’un grand nombre de microorganismes d'altération. La
température du traitement est généralement inférieure à 100°C et la durée, de quelques
secondes à quelques minutes. Ce traitement thermique doit être suivi d'un brusque
refroidissement afin de ralentir le développement des germes encore présents. Les aliments
pasteurisés sont ainsi habituellement conservés au froid. En dehors de la réfrigération, d'autres
moyens de conservation peuvent être utilisés parallèlement pour contrer le développement des
microorganismes survivants: ajout d'agents chimiques de conservation, emballage sous vide,
réduction de l'activité de l'eau (aw),… La pasteurisation reste néanmoins inefficace pour
détruire les spores bactériennes, beaucoup plus résistantes à la chaleur que les cellules
végétatives. La technique est spécifique au produit traité, chacun d'eux possédant un barème
de pasteurisation (table 1). La durée de conservation des aliments pasteurisés est tout de
même limitée.
4
Table 1: Exemple de barèmes de pasteurisation, établis pour différents produits alimentaires

(Leyral & Vierling, 2007)
Exemple de barème de pasteurisation
Produits Température pasteurisation Durée traitement
62°C 30 minutes
Lait
72°C 15 secondes
71°C 30 minutes
Crème/crème dessert
82°C 16 secondes
Jus de pomme en 77°C 30 minutes
bouteille
Boissons gazeuses à base 66°C 30 minutes
de jus de fruit
Bière 82-88°C 1 à 2 minutes
La stérilisation est un traitement thermique qui a pour finalité de détruire toute forme
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microbienne vivante. Le traitement à ultra haute température (UHT) consiste à chauffer le

produit à une température assez élevée, entre 135°C et 150°C, pendant un temps très court, de
1 à 5 secondes. Le produit stérilisé est ensuite refroidi puis conditionné aseptiquement. Ce
procédé est utilisé par exemple pour la stérilisation des produits liquides (lait, jus de fruits…)
ou de consistance plus épaisse (desserts lactés, crèmes, jus de tomate, soupes…).
L’appertisation (Appert, 1810) consiste à stériliser par la chaleur des denrées périssables dans
des contenants hermétiques (boîtes métalliques, bocaux). Sont considérées comme conserves
les denrées alimentaires, d’origine animale ou végétale périssables, dont la conservation est
assurée par un procédé associant le conditionnement dans un récipient étanche à l’eau, aux
gaz et aux microorganismes, à toute température inférieure à 55°C et un traitement par la
chaleur (Décret n°55-241, 1955). L’appertisation est largement utilisée aujourd’hui pour la
conservation à long terme des denrées alimentaires pouvant aller de plusieurs mois à quelques
années.
De nombreux progrès ont été faits depuis les travaux de Nicolas Appert. En effet, depuis
la découverte de l'efficacité de la chaleur, diverses études ont permis de sélectionner et
d'optimiser des techniques en fonction des produits à traiter (Cerf, 1987), afin de trouver le
meilleur compromis entre qualité et sécurité. Dans les années 1920, on s'intéressait déjà à la
résistance de différents microorganismes sur des produits alimentaires (Bigelow, 1921).
Chaque année, les travaux scientifiques centrés sur les traitements thermiques se comptent
en centaines, voire en milliers d'articles. Sur les 10 dernières années, des journaux tels que
5
Journal of Food Protection (JFP), Applied and Environmental Microbiology (AEM),

International Journal of Food Microbiology (IJFM), Journal of Applied Microbiology (JAM)
ou encore Food Microbiology (FM), font état de plus de 600 publications concernant les
applications de traitements thermiques sur des aliments, des liquides, ou même des
emballages alimentaires.
2) Mécanismes d'inactivation des microorganismes
La chaleur humide tue le microorganisme par dénaturation des acides nucléiques, des
protéines de structure et des enzymes (Farkas, 2007). D'une façon générale, la stabilité
thermique des ribosomes correspond à la température maximale de croissance d'un
microorganisme. Les membranes cytoplasmiques semblent être les sites majeurs de
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dommages causés par la chaleur humide. Les microorganismes y sont plus sensibles qu'à la
chaleur sèche, du fait de la forte influence de l'activité de l'eau (Lund et al., 2000). En effet, la
chaleur sèche nécessite de plus hautes températures et des temps de chauffage plus longs pour
arriver au même taux de destruction. Les spores bactériennes sont, de manière générale, plus
thermorésistantes que les cellules végétatives. En effet, la spore est une structure déshydratée,
et la teneur en eau est directement corrélée à la thermorésistance (Nicholson et al., 2000).
Ainsi, des spores produites à haute température, ayant une teneur en eau plus faible que les
spores produites à plus basse température, présentent une résistance accrue à la chaleur. Ceci
est vrai jusqu’à un certain point. En effet, la thermorésistance des spores augmente jusqu’à
une température optimale de sporulation, puis diminue ensuite. Le taux et le type d'ions
minéraux contenus dans le cœur de la spore jouent également un rôle de protection, tout
comme la saturation de l'ADN par les SASP (small acide soluble proteins). Les spores sans
acide dipicolinique (DPA) sont également plus sensibles que celles à forte teneur en DPA
(Setlow, 2006). En revanche, les protéines HSP (Heat shock proteins) ne semblent jouer
aucun rôle dans la thermorésistance des spores (Melly & Setlow, 2001), contrairement aux
cellules végétatives Le rôle précis de ces protéines n'est pas clairement défini, même si l'on
sait que chez la plupart des microorganismes leur synthèse est induite après un choc
thermique. Les mécanismes de développement de la thermotolérance ne sont pas précisément
identifiés. En effet, il est fréquent qu'un stress environnemental imposé par les procédés
industriels induise des réponses protectrices chez les microorganismes (Farkas, 2007).
6
3) Efficacité microbiologique du traitement thermique
Le traitement thermique est caractérisé par le couple temps/température. Les premiers

travaux de thermorésistance microbiologique se sont focalisés sur l'expression de la réponse
des microorganismes. L'expression de la cinétique de destruction en base décimale a permis
d'introduire le terme de "durée de réduction décimale". Cette durée, appelée D, correspond au
temps nécessaire (en minutes) pour réduire la population d'un facteur 10, à une température
donnée (Katzin et al., 1942). La cinétique de destruction des microorganismes est, dans la
grande majorité des cas, décrite par l'équation suivante (1):
t
log N  log N 0  (1)
D
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avec t le temps de traitement, N0 la population initiale, N la population survivante au temps t

et D la durée de réduction décimale (Gaillard, 2003).
Un autre paramètre, appelé paramètre de thermorésistance z, correspond à l’élévation de
température nécessaire pour réduire au dixième la durée de réduction décimale. Cette
cinétique d'inactivation est encore actuellement la plus utilisée, et sert de référence au
traitement thermique, ainsi qu'à la classification des espèces microbiennes. Pourtant, ces
mesures mathématiques ont des limites. En effet, on considère souvent la réduction
logarithmique comme (log) linéaire (figure 1A), qui sous-entend que toute la population
microbienne de la solution testée présente la même thermorésistance. Mais des courbes de
survie non linéaires, sont fréquemment rencontrées (figure 1B). Dans ce cas, le concept
classique de modélisation log linéaire ne convient plus à ajuster les courbes, et les valeurs de
D et z ne sont plus suffisantes.
Plusieurs modèles non linéaires sont disponibles pour ajuster des courbes de destruction
présentant différentes allures: un épaulement initial, un effet de traîne, une allure sigmoïde
(avec épaulement et traîne), une convexité ou concavité, une allure biphasique (avec 2
portions linéaires présentant des pentes différentes, ou encore avec épaulement)... (Mafart et
al., 2010). De nombreuses équations (Xiong et al., 1999) permettent une modélisation
généralement satisfaisante de courbes de destruction d'allures différentes (Geeraerd et al.,
2000). Geeraerd et al. (2005) proposent 9 modèles pouvant décrire chacune des allures
évoquées précédemment. Parmi eux, le modèle de Mafart prend en compte la diversité de
distribution au sein de la population bactérienne, inspirée de la distribution statistique de
7
Weibull (Mafart et al., 2002). Ce modèle simplifié peut s'adapter à des courbes concaves ou
convexes (équation 2).
p
 N   t 
Log     

(2)
 N0   
Avec N la population survivante après un traitement thermique de temps t, N0 la population

initiale, δ le temps de première réduction décimale, et p un paramètre de distribution de la
courbe, décrivant une courbe concave (p>1), convexe (p<1) ou linéaire (p=1).
Ce modèle présente de nombreux avantages, du fait de sa simplicité et de sa flexibilité pour
définir des régressions non linéaires.
Toujours dans le but d'améliorer l'ajustement des courbes de destruction microbiennes, un
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nouveau modèle appelé modèle de Weibull modifié est proposé par Albert et Mafart en 2005.
Ce modèle est décrit par l'équation 3:
p
 1 
 t   
     N 0  N res 10   
 N res (3)
 
avec t le temps, γ(t) la concentration bactérienne au temps t, N 0 (>0) la concentration initiale à

t0, Nres (≥0) la concentration résiduelle à la fin de l'observation, δ (>0) le temps de première
réduction décimale et p le paramètre décrivant la convexité ou la concavité de la courbe
(concave : p > 1, convexe p < 1 ou linéaire p = 1).
Ce modèle présente l'avantage de s'ajuster à une large gamme de courbes de destruction, avec
ou sans épaulement ou effet de traîne, et ainsi d'obtenir une bonne estimation des paramètres
issus des courbes (Albert & Mafart, 2005).
8
A B
Figure 1: Exemple de courbes de réduction obtenues lors d'un traitement thermique. A)

réduction log linéaire de Salmonella senftenberg W775 à 53°C (●), 55 C (▲) and 58°C (■)
(Weiss & Hammes, 2005). B) Type de courbes d'inactivation fréquemment observées: linéaire
(Δ), linéaire avec effet de traîne (x); sigmoïde (□) linéaire avec épaulement (○) (Geeraerd et
al., 2005)
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Même si de nombreux travaux définissent différents paramètres pour évaluer l'efficacité

des traitements thermiques, le modèle linéaire et les paramètres D et z sont encore largement
utilisés. De nombreuses données exploitant ces paramètres sont accessibles, aussi bien pour
des spores que pour des cellules végétatives. Les tables 2 et 3 montrent quelques uns des
exemples de valeurs de D et z rencontrés dans la littérature.
Table 2: Niveaux de thermorésistance approximatifs de cellules végétatives bactériennes

(Aguirre et al., 2009).
Microorganisme Milieu Température (°C) D (min) Z (°C)
56 22.03 6.75
Enterococcus Solution
59 7.81
faecalis saline
61 4
50 45.66 5.16
Solution
Listeria innocua 54 6.61
saline
57 2.03
45 54.9 4.19
Pseudomonas. Solution
47 18.2
fluorescens saline
49 6.1
50 14.1 5.74
Salmonella Solution
54 3.71
enteritidis saline
59 0.39
9
Table 3: Niveaux de thermorésistance de spores bactériennes (Farkas, 2007)

D value (min) à:
Z value (°C)
Type d'aliments et microorganismes 121°C 100°C
Aliments peu acides (pH>4.6)
Aérobie thermophiles
Bacillus stearothermophilus 4.0-4.5 3 000 7
Anaérobie mésophiles
Clostridium sporogenes 0.1-1.5 9-13
Clostridium botulinum types A et B 0.1-0.2 50 10
Clostridium perfringens 0.3-20 10-30
Aérobie mésophiles
Bacillus licheniformis 13 6
Bacillus subtilis 11 7
Bacillus cereus 5 10
Bacillus megaterium 1 9
Aliments acides (pH≤4.6)
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Aérobie thermotolérants
Bacillus coagulans 0.01-0.1
Aérobie mésophiles 0.1-0.5
Bacillus polymyxa
Les premières évaluations de la résistance de certaines espèces sont anciennes et donnent

des éléments clés pour préserver la sécurité microbiologique des aliments. Par exemple, après
l'étude de 109 souches de C. botulinum, Esty et Meyer , ont conclu en 1922, que pour les
spores de ces microorganismes qui montraient la plus grande thermorésistance, les traitements
thermiques devaient être de 4 minutes à 120°C, 10 minutes à 115°C, 33 minutes à 105°C et
330 minutes à 100°C (Lund et al., 2000).
Divers facteurs (composition du milieu environnant pendant ou après traitement,

caractéristiques du traitement, facteurs propres au microorganisme...) peuvent fortement
influencer la thermorésistance des microorganismes. Certains peuvent agir à plusieurs
niveaux. Ainsi, un pH acide (pH = 4) du milieu lors du traitement va provoquer une résistance
thermique plus faible de spores de B. coagulans, comparé à un pH neutre (Palop et al., 1999).
Un pH acide lors de la sporulation peut, selon le microorganisme, avoir un effet sur la
thermorésistance. Les spores de B. cereus ATCC 4342 ont montré une résistance plus faible
lorsque le pH de sporulation était de 5.5, par rapport à un pH égal à 7. En revanche, la souche
B. cereus ATCC 7004 n'a montré aucune différence de thermorésistance en fonction du pH de
10
sporulation (Mazas et al., 1997). L'activité de l'eau est, tout comme le pH, un élément
essentiel dans la détermination de la thermorésistance des microorganismes. Une faible aw
lors du traitement provoquera une augmentation de la résistance à la chaleur (Kaur et al.,
1998). En revanche, une faible activité de l'eau (<0.98) du milieu de récupération a montré
une inhibition de la germination et de la croissance de spores de B. cereus (Martinez et al.,
2007). La faible teneur en eau du cœur des spores et la forte minéralisation favorisent leur
thermorésistance. Une haute température appliquée lors de la sporulation entraînera une faible
teneur en eau du cœur, et ainsi une forte thermorésistance. Des spores de B. subtilis produites
à 48°C ont montré une résistance beaucoup plus importante à un traitement thermique que
celles produites à 22°C (Melly et al., 2002), résultat corrélé à l'hydratation du cœur, s'élevant
à 39% dans les spores obtenues à 22°C, contre 34,25% dans celles obtenues à 48°C. Un choc
thermique lors de la formation des spores de B. subtilis a également induit une augmentation
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de leur thermorésistance (Movahedi & Waites, 2000). La composition du milieu de reprise ou

de traitement ont fait l'objet de diverses études. De manière générale, la thermorésistance des
microorganismes est plus importante lorsque le milieu de traitement est riche en matières
grasses (Kaur et al., 1998). En revanche, l'addition de calcium (100 ppm) ou d'amidon dans le
milieu de reprise a entraîné une plus forte reprise de croissance des spores de Geobacillus
stearothermophilus préalablement chauffées à 120°C (Lopez et al., 1997). La présence ou non
d'oxygène dans le milieu après un traitement thermique peut aussi être déterminante pour la
reprise de croissance des microorganismes. Par exemple, la croissance d'E. coli O157:H7
après un choc thermique est plus importante en anaérobiose qu'en aérobiose, ce qui démontre
ici, une augmentation de leur sensibilité au stress oxydant provoquée par la chaleur (George &
Peck, 1998). Il est important de connaître l'influence de chaque facteur, mais aussi les
possibles interactions existantes, afin d'optimiser les traitements thermiques en fonction de
l'aliment traité mais aussi du microorganisme.
4) Equipements industriels
Les équipements de chauffage ohmique, de micro-ondes, les autoclaves, sont quelques uns
des nombreux exemples de procédés de traitements thermiques. Il existe ainsi une très large
gamme d'équipements industriels, plus ou moins coûteux selon leur taille et leur
consommation d'énergie. Par exemple, les systèmes d'autoclave (figure 2) sont utilisés depuis
plus de 100 ans pour stériliser les aliments peu acides au delà de 100°C (Lund et al., 2000).
11
Le premier autoclave fût mis au point par Denis Papin (qui inventa également le premier
moteur à vapeur). Le procédé fut ensuite breveté en 1820 par Pierre-Alexandre Lemare. Il
sera amélioré par Nicolas Appert pour l'adapter à la conserve. L'autoclave (traitement
discontinu) fonctionne en 3 phases: la montée en pression et en température (injection d'air
comprimé et de vapeur surchauffée dans la chambre hermétique), le palier (maintien des
pressions et température pendant un temps donné) et la descente en pression et en température
(évacuation de l'air et projection d'eau froide).
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Figure 2: Deux exemples de stérilisateurs statiques (Exapro, 2010; Steriflow thermal

processing, 2010).
L'autoclave n'est qu'un des nombreux exemples d'équipements utilisés pour les traitements
thermiques. Des systèmes continus d'échangeurs (à plaque, à spirale...) sont fréquemment
utilisés pour la pasteurisation de liquides. Le produit circule parallèlement à un fluide
thermique, généralement à contre courant (Tobaly, 2002). Les deux fluides sont séparés par
une surface d'échange, pouvant être une plaque, une spirale, ou encore un tube. Certains
peuvent couvrir des débits de plusieurs milliers de litres de produits liquides par heure (par
exemple jusqu'à 30000 L/h pour certains jus de fruits).
Le traitement thermique permet de décontaminer des produits avec leur emballage (cas de
l'autoclave). Il faut pour cela que ledit emballage soit résistant à la chaleur et n'entraîne
aucune migration indésirable au sein de l'aliment. Dans d'autres cas, ils peuvent être traités
séparément. Certains emballages thermoformés acquièrent leur géométrie finale par chauffage
12
rapide et à forte température. Ce procédé combine à la fois fabrication et décontamination.

C'est le cas par exemple des bouteilles en plastique ou des pots de yaourt. Différentes matières
sont utilisées, notamment des matières plastiques comme le polystyrène, le polyéthylène, le
PET (polyéthylène téréphtalate) ou encore le polycarbonate.
5) Avantages du traitement thermique, limites, produits cibles
Les techniques de décontamination par traitement thermique sont anciennes et bien

maîtrisées. Mais il faut, pour chaque produit, trouver le bon équilibre entre un chauffage en
excès (qui réduit les qualités organoleptiques et nutritionnelles et peut produire des composés
toxiques et des goûts indésirables) (Spilimbergo et al., 2002) et un chauffage insuffisant (qui
ne détruit pas suffisamment les microorganismes). Certains produits ont des contraintes
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encore plus marquées, comme par exemple la pasteurisation des œufs liquides, qui est limitée
à des températures basses (et donc des temps plus longs) à cause de la coagulation des
protéines (Huang et al., 2006).
Les traitements thermiques peuvent être appliqués dans un but de cuisson des aliments.
Tous les procédés de cuisson (grillage, fumage, rôtissage...) modifient les qualités
organoleptiques ainsi que les propriétés nutritionnelles des produits dans le but de les rendre
consommables (Fellows, 2000). Dans cette configuration où de telles modifications sont
souhaitées, il n'est pas nécessaire d'utiliser un autre moyen de décontamination. En revanche,
dans le cas où ces traitements thermiques sont utilisés seulement dans un but de stabilisation
microbiologique des produits (pasteurisation, stérilisation), l'augmentation de température (et
donc les modifications organoleptiques) peut être qualifiée d'indésirable.
D'autres traitements physiques de décontamination sont aujourd'hui connus et

utilisés, et sont une alternative très intéressante aux traitements thermiques. Tout
comme la chaleur, ces traitements physiques sont propres, c'est à dire sans nécessité
d'ajout de produits chimiques, mais ils peuvent également être athermiques, ce qui
permettrait, dans le cas du traitement d'aliments, de préserver les qualités
organoleptiques et nutritionnelles des produits.
13
3. Techniques non thermiques alternatives
"En raison d'une part de la demande croissante pour des produits possédant d'excellentes
qualités sanitaires, organoleptiques et nutritionnelles, et d'autre part de l'importance de la
réduction de l'impact énergétique et environnemental des procédés de transformation ou
d'entreposage des aliments, il est probable que les professionnels de l'alimentation feront de
plus en plus appel à des techniques limitant l'usage des traitements thermiques [...]. Diverses
techniques ou "nouvelles technologies" sont actuellement proposées." Avis du conseil national
de l'alimentation sur le développement des nouvelles technologies dans la fabrication, le
conditionnement et la conservation des denrées alimentaires, 10 juin 2009.
1) Hautes Pressions Hydrostatiques (HPH) et Hautes Pressions à Dioxyde de

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Carbone (HPDC)
a. Principe
Le procédé des hautes pressions consiste à soumettre un produit alimentaire liquide ou
solide, avec ou sans emballage, à des pressions comprises entre 100 et 800 MPa (Devlieghere
et al., 2004), à température ambiante ou inférieure à 50°C. La durée de traitement est
généralement comprise entre 5 et 30 min. Contrairement aux traitements utilisant la
température, la pression est transmise instantanément et uniformément à travers le produit,
indépendamment de sa taille, forme et composition (la montée en pression est généralement
de 200 MPa/min). La pression étant la même dans toutes les directions, elle est qualifiée
d'hydrostatique. Cela permet de conserver la forme d'origine du produit (Goodridge et al.,
2006). Même si la taille, la forme et la composition de l'emballage ne sont pas importants, il
doit comporter une partie flexible, pour éviter tout risque de rupture. Durant le traitement, le
volume du produit diminue en fonction de la pression qui lui est imposée (environ 5% pour
100 MPa) et une expansion équivalente se produit durant la décompression. La compression à
laquelle l'aliment est soumis, provoque une augmentation de sa température, dépendante de sa
composition (Chéret, 2005), Cette augmentation est en moyenne de l'ordre de 3°C pour 100
MPa, mais la paroi de l'enceinte de l'appareil évacue une partie de cette chaleur.
Une autre technique de décontamination par haute pression, appelée HPDC, qui utilise le
CO2, présente de nombreux avantages (Garcia-Gonzalez et al., 2007). En effet, les pressions
14
nécessaires à l'efficacité bactéricide sont moins élevées que dans le cas des HPH. Les
pressions utilisées sont généralement situées en dessous de 20 MPa, le traitement est donc
plus facile à contrôler (Spilimbergo et al., 2002). De plus, le CO2 est non toxique. La
technique consiste à placer le produit au contact de CO2 sub ou supercritique sous pression.
Le point critique correspond à l'équilibre des phases gazeuse et liquide qui sont, pour le CO2,
une température de T = 31.1°C et une pression de P = 7.38 MPa. A température et pression
inférieures à celles du point critique, le CO2 est dans un état dit "subcritique"; et à l'inverse, à
température et pression supérieures à celle du point critique, le CO2 est dans un état dit
"supercritique". Le CO2 a un effet inhibiteur sur la croissance bactérienne. L'avantage du CO2
supercritique est qu'il a une viscosité proche de celle des gaz, une densité proche des liquides,
et une diffusivité élevée. Il peut ainsi diffuser à travers les solides comme un gaz et dissoudre
les matériaux comme un liquide (Garcia-Gonzalez et al., 2007). Le CO2 a été comparé à
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d'autres gaz sous pression (N2, Ar, Tetrafluoroethane...) mais aucun n'a montré de meilleure
efficacité.
b. Mécanismes d'inactivation des microorganismes

Le mode d'action va dépendre du niveau de pression. Les hautes pressions hydrostatiques
entre 30 et 50 MPa peuvent avoir une influence sur l'expression des gènes et la synthèse
protéique. A des pressions d'environ 100 MPa, la membrane nucléaire des levures est affectée,
et à 400-600 MPa, d'autres altérations sont visibles dans les mitochondries et le cytoplasme
(Buzrul, 2008). L'inactivation due à la pression est accompagnée d'une augmentation de l'ATP
extracellulaire, ce qui prouve une altération de la membrane (Smelt, 1998).
Chez Saccharomyces cerevisiae soumise aux hautes pressions, la diffusion de certains
ions et solutés internes (Na+, K+, Ca2+, glycérol endogène) montre que l'inactivation des
levures peut être causée par la perméabilisation de la membrane induite par le traitement
(Perrier-Cornet et al., 1999). On observe donc une augmentation de la perméabilité des
membranes et une possible inhibition des enzymes indispensables à la survie et la croissance
des cellules bactériennes.
L’observation en microscopie électronique à balayage (figure 3) de spores d'Aspergillus
niger traitées révèle qu’une pression de 200 MPa (conditions sublétales) provoque de fortes
déformations ou ruptures des conidies (85% de la population), démontrant l'altération de la
structure des microorganismes (Tribst et al., 2009). L’application de pressions sublétales peut
au contraire induire l’expression de gènes codant pour des protéines de choc thermique
15
(HSP). Ces protéines synthétisées vont pouvoir prévenir les dommages ou aider à la
réparation des cellules, ce qui provoque une résistance accrue aux hautes pressions (Aertsen et
al., 2004). Les SASP joueraient également un rôle de protection des spores de B. subtilis aux
très hautes pressions (Wuytack et al., 1998).
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Figure 3: Observations microscopiques (MEB 20 kV), de spores d'A. niger non traitées (A) et
traitées par Hautes Pressions à 200 MPa (C)- échelle 10µm. (Tribst et al., 2009)
c. Efficacité microbiologique
Hautes pressions hydrostatiques:
Les bactéries à Gram+ semblent plus résistantes que les Gram-. Les cellules en phase de
latence ou stationnaire présenteraient une plus grande résistance que les cellules en phase
exponentielle. Les spores bactériennes sont également plus résistantes que les cellules
végétatives. La décontamination des spores nécessite le plus souvent de combiner pression et
augmentation de température (Wimalaratne & Farid, 2008). De plus, une alternance entre
faibles pressions (initiant la germination) et pressions élevées (germicides) est une technique
pouvant être utilisée pour le traitement de spores bactériennes fortement thermorésistantes
comme G. stearothermophilus (Farkas, 2007). Goodridge et al. (2006) démontrent qu’un
traitement d'environ 400 MPa à 25°C pendant 5 minutes est suffisant pour éliminer
totalement Salmonella Enteritidis d'une culture liquide (soit une réduction de 7.5 unités
logarithmiques). Un traitement de 15 minutes à 600 MPa, 20°C appliqué à des graines de
luzerne a permis une décontamination de plus de 5 cycles logarithmiques d’E. coli O157:H7,
sans affecter la germinabilité des graines (Neetoo et al., 2009). Huang et al. (2006) testent les
traitements haute pression visant à éliminer Salmonella Enteritidis dans l'œuf liquide. Un
16
traitement de 138 MPa à 20°C durant 8 minutes en continu permet une réduction
logarithmique de 0.4 unités. Mais la méthode d'application a un effet important sur l'efficacité
décontaminante: le même traitement en discontinu (2min + 2min + 4min) permet une
réduction logarithmique de 2.2 unités sur le même produit. On peut supposer qu'une
succession de pression/dépression facilite la rupture des membranes cellulaires et peut ainsi
causer la mort du microorganisme. Ainsi, des pressions plus faibles appliquées de manière
discontinue pourraient avoir la même efficacité qu'un traitement continu à pression plus
élevée.
Devlieghere et al., en 2004, considèrent que les données sont encore insuffisantes pour
introduire cette technique en industrie (2004). L'application d'une technique en milieu
industriel nécessite systématiquement des données quantitatives sur l'inactivation de
microorganismes d'altération ou pathogènes, ainsi que des informations sur l'influence de la
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composition de l'aliment et des propriétés de la matrice. Dans le cas des hautes pressions, les
informations systématiques sur la résistance microbienne sont limitées du fait des différentes
conditions et méthodologies utilisées. Ainsi, seule la sensibilité des différents
microorganismes au sein d'une même étude peut être comparée.
Hautes pressions à dioxyde de carbone:

Ishikawa et al. (1997) ont comparé les HPDC au traitement thermique, pour les spores de
3 espèces bactériennes. Un traitement de 60 minutes à une pression de 30 MPa et une
température de 50°C a permis une réduction des spores de B. cereus de 6 cycles
logarithmiques, alors qu'un traitement thermique de 60 minutes à 100°C a seulement permis
une réduction de 4.6 cycles logarithmiques. Le même traitement thermique appliqué à B.
polymyxa a réduit la population de seulement 0.85 unités logarithmiques. Dans ce cas, un
traitement en HPDC de 15 minutes à 31°C, 30 MPa s'est révélé plus efficace. L'étude de
nombreux facteurs d'influence sur l'inactivation de Pseudomonas fluorescens par HPDC a
révélé que des éléments environnementaux, comme une forte concentration en sel (2%), un
pH acide (4-4,5) ou la présence de Tween 80 (0.5%) pouvaient augmenter l'efficacité
bactéricide de façon significative. A l'inverse, la présence d'huile de tournesol (entre 10 et
30%), un pH basique (pH=9) ou une augmentation de la viscosité du milieu peuvent diminuer
l'efficacité. Enfin, l'ajout d'amidon n'a pas montré d'influence, et ce, quelle que soit la
concentration (Garcia-Gonzalez et al., 2009). La composition des aliments est dans tous les
cas un élément important pouvant expliquer certains problèmes d'efficacité du traitement.
17
d. Equipements industriels
L’introduction des hautes pressions pour la conservation des aliments date du début des
années 90 (Aertsen et al., 2009). Dans le cas des HPH, les équipements industriels utilisés
sont dits discontinus (en batch de 10 à 500 L) pour les solides et visqueux ou particulés, ou
bien semi continus (de 1 à 4 tonnes/h) pour les liquides (Devlieghere et al., 2004). Le système
batch utilise une pompe qui envoie un fluide de pressurisation (généralement de l'eau) dans
une enceinte close. Pour empêcher le contact avec le fluide de compression, le produit est
obligatoirement traité dans son emballage hermétiquement clos. C'est pour cette raison que le
procédé est discontinu, il faut charger ou décharger les aliments emballés dans l'enceinte dont
le volume est réduit à environ 75% du volume interne. Dans le cas des produits liquides ou
pâteux, le procédé semi continu peut être appliqué. Le procédé est appelé semi continu
lorsque les dispositifs sont composés d'une suite de plusieurs enceintes qui fonctionnent de
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façon décalée. La pression est générée par un piston au contact du milieu, qui réduit le volume
de l'enceinte. Le produit doit ensuite être conditionné aseptiquement. Devlieghere et al., en
2004 estimaient le prix de 10 à 15 centimes d'euro par kg de produit (incluant l'investissement
ainsi que les coûts de fonctionnement).
Thermocouple
appareil de
chauffage
Pompe
haute
Liquide pression
-CO2
Récipient sous
pression
Figure 4: Représentation schématique d'un équipement HPDC (Watanabe et al., 2003)
18
Figure 5: Exemple d'équipement haute pression industriel (NC Hyperbaric, 2010)
Table 4: Exemple de prix des équipements HPH (Meyer et al., 2000)

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Capacité 215-L
690 MPa (100,000 psi)
Equipements 100°C
Temps de mise sous pression: 90 sec minimum
Temps de dépressurisation:30 sec minimum
coût: 3,5 millions de $
Temps du cycle 6-8 min
Hypothèse: Cinq unités 215-L, traitement de 196 162 kg/jour, 330 jours/an, 90% du
Capacité temps, pour un total de 67.500.000 kg/an. Produit préemballé, 75% de taux de
remplissage
Dépréciation 10 ans
Equipements, 17.500.000 $
Coûts Autres (structure, supports) 10.500.000 $
Total: 28.000.000 $
Main d'oeuvre: 0.018 $/kg
Coûts par kg Maintenance: 0.036/$kg
Dépréciation: 0.037 $/kg
Total: 0.091 $/kg
e. Législation
Dans les 2 cas, en Europe, les hautes pressions hydrostatiques sont soumises à la
législation Novel Food (Novel Food, 1997). Aux Etats-Unis, il n'y a cependant pas de
législation particulière concernant les produits traités par hautes pressions.
Le règlement européen n°258/97, communément appelé "Novel food" et datant du 27

janvier 1997, s'applique entre autre aux aliments ou ingrédients auxquels a été appliqué un
procédé de production qui n'est pas couramment utilisé, lorsque ce procédé entraîne dans la
19
composition ou dans la structure des aliments ou des ingrédients alimentaires des

modifications significatives de leur valeur nutritive, de leur métabolisme ou de leur teneur en
substances indésirables. Dans le cadre de ce règlement, une nouvelle technologie est donc une
technologie qui n'était pas couramment utilisée pour la production de denrées alimentaires
avant le 15 Mai 1997.
f. Avantages de la technologie, limites, produits cibles

Les hautes pressions n'altèrent pas les liaisons covalentes. Les vitamines et composés
aromatiques, essentiellement stabilisés par ce type de liaisons, ne sont donc pas endommagés.
Cette propriété permet la conservation des qualités nutritionnelles et organoleptiques de
l'aliment. En revanche, les liaisons de faible énergie des macromolécules telles que les
protéines, les polysaccharides et les acides nucléiques peuvent être modifiées parfois de façon
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irréversible après dépressurisation. De nombreux facteurs peuvent affecter la qualité finale du

produit: l'étape de préchauffage, la température initiale, le temps de pressurisation du
récipient, le temps nécessaire à la dépressurisation ainsi qu'au refroidissement après
dépressurisation. Par exemple, privilégier l'augmentation de la pression au profit de la
température initiale du produit peut prévenir des dommages causés par la chaleur lors du
préchauffage ou du refroidissement. (Meyer et al., 2000). Cependant, une température trop
basse est défavorable au traitement par hautes pressions (Huang et al., 2006), tout comme une
diminution de l'activité de l'eau (Goodridge et al., 2006). Afin d'obtenir une décontamination
microbiologique plus élevée, un couplage des hautes pressions avec un autre traitement tel
qu'un préchauffage doux permet une meilleure efficacité (Neetoo et al., 2009). En effet, dans
le cas de décontamination de spores bactériennes, certaines souches peuvent résister à des
pressions supérieures à 1000 MPa à température ambiante. Le préchauffage peut ainsi
provoquer la germination des spores qui deviendront donc plus sensibles aux hautes pressions
(Wei et al., 2009). Dans certains cas, des cellules bactériennes peuvent devenir résistantes,
lors de traitements successifs appliqués (Devlieghere et al., 2004). Une augmentation de
température et de pression peut donc être nécessaire pour les éliminer (Garcia-Gonzalez et al.,
2010).
Dans le cas des HPDC, le CO2 pressurisé ne doit pas être utilisé à des couples
pression/température trop éloignés du point critique, car de fortes températures peuvent altérer
l'aliment et provoquer une moins bonne solubilisation du CO2 (Garcia-Gonzalez et al., 2007).
20
De nombreuses études ont montré l'application possible des hautes pressions sur des
produits alimentaires tels que les confitures, les jus de fruits, les amandes (Goodridge et al.,
2006), les graines, les sauces... (Devlieghere et al., 2004). La pressurisation peut provoquer
des effets bénéfiques sur les aliments, comme par exemple sur le brocoli (Bartlett, 2010). En
effet, la pression peut permettre une augmentation de sa teneur en sulforaphane, un
isothiocyanate retrouvé dans les légumes crucifères, et possédant des propriétés antitumorales.
En revanche, le traitement du lait par hautes pressions s'est révélé être une alternative peu
intéressante à la pasteurisation (Smiddy et al., 2007). De plus, l'environnement
physicochimique complexe du lait (sans autre précision) semble exercer un effet protecteur
sur les microorganismes (Devlieghere et al., 2004). Bien que le traitement des jus de fruits
(Buzrul et al., 2008; Campos & Cristianini, 2007) par HPH montre une réelle efficacité
décontaminante, il reste un traitement semi-continu, pouvant donc présenter un frein en terme
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de rendement industriel (Devlieghere et al., 2004). Les aliments peu acides restent en général
de bons candidats à ce type de traitements. Pourtant, une étude menée sur les oignons (Butz et
al., 1994) à permis une réduction considérable des microorganismes par hautes pressions,
mais s'est avéré totalement inapproprié, du fait des modifications trop importantes sur le goût
et la stabilité du produit.
Les jus de fruits traités par HPH sont commercialisés au Japon depuis 1990 (Farkas,
2007). Le traitement peut s'effectuer sur des aliments déjà emballés. Dans ce cas, il n'y a pas
de risques de contamination post-traitement.
2) Champs électriques pulsés (CEP)
a. Principe
Un générateur haute tension est utilisé pour charger des condensateurs (Gongora-Nieto et
al., 2002) ou une ligne de transmission (Kolb et al., 2006). Un switch haute tension permet de
décharger rapidement l’énergie stockée. Le signal ainsi généré a une forme carrée avec des
fronts de montée de l’ordre de la nanoseconde, une durée de quelques dizaines de
nanosecondes et une amplitude de plusieurs kilovolts. L’aliment est placé entre deux
électrodes. La distance entre électrodes vaut quelques centaines de micromètres ce qui permet
de générer des champs de plusieurs dizaines de kV/cm. L'intensité du champ électrique
appliqué est généralement comprise entre 2 et 87 kV/cm, mais les taux d'inactivation efficaces
21
sont généralement obtenus avec des champs d'intensité comprise entre 20 et 50 kV/cm (Heinz
et al., 2001). Les temps de traitement sont généralement exprimés en micro ou millisecondes.
b. Mécanismes d'inactivation
Cette technologie utilise la propriété d’une membrane de devenir perméable sous l’effet
d’un champ électrique. Cette propriété est traditionnellement utilisée pour transférer des gènes
ou des molécules dans des cellules (Widera et al., 2000). Dans ce cas, les impulsions de
tensions ont une durée de l’ordre de la microseconde et une amplitude de l’ordre du kilovolt
(effet réversible). Cependant, en réduisant la durée des impulsions à quelques dizaines de
nanosecondes et en augmentant leur amplitude pour atteindre plusieurs kilovolts, l’effet
devient irréversible. Cette propriété est donc utilisée pour la décontamination (Frey et al.,
2006). Il a été démontré qu'un traitement de 64 impulsions à 60 kV/cm et à 13°C augmentait
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l'espace entre la membrane externe et la membrane plasmique chez E. coli. Chez S. aureus, ce
même traitement a entraîné une rupture de la paroi et une fuite du matériel cellulaire (Knorr et
al., 1994) clairement visible par microscopie électronique à transmission (grossissement
X23000). Ces phénomènes ont aussi été observés sur la levure S. cerevisiae, avec une
augmentation de l'espace entre la membrane plasmique et la paroi cellulaire, une fuite du
matériel cytoplasmique, ainsi qu'une perturbation des organites (noyau, mitochondries,
ribosomes).
Les mécanismes conduisant à l’inactivation de la cellule ne sont à ce jour pas encore
compris et différentes hypothèses existent. La formation des pores de dimension de l’ordre du
nanomètre permettrait à des ions de sortir de la cellule ce qui modifierait sa conductivité (Hu
et al., 2005). La membrane de la cellule est influencée de manière asymétrique selon sa
position relative par rapport à l’anode et à la cathode (Mehrle et al., 1989). Ceci conduirait à
une différence de potentiel à la surface de la cellule induisant des phénomènes de transport de
particules chargées ou neutres (Frey et al., 2006). La formation des pores permettrait au
champ de pénétrer à l’intérieur de la cellule (Schoenbach et al., 2004) et ainsi d’agir sur le
matériel intracellulaire.
Les endospores des bactéries, tout comme les ascospores des moisissures, semblent
résistantes aux CEP. La germination des spores (souvent utilisé comme moyen permettant
22
leur destruction) n'étant pas initiée par ce procédé, il est plus efficace d'utiliser les CEP pour
stériliser des milieux en les combinant à un traitement induisant la germination des spores.
L'efficacité des CEP dépend de nombreux facteurs dont le type de microorganisme, leur
état physiologique et leur concentration initiale. Les bactéries à Gram- semblent ici, comme
pour les hautes pressions, plus sensibles au traitement que les Gram+, et les cellules en phase
de croissance semblent également les formes les plus sensibles. Des facteurs
environnementaux semblent aussi jouer un rôle important: la force ionique du milieu, le pH,
l'activité de l'eau, la viscosité, la présence de particules solides ou de gouttes d'huile... En
effet, une faible force ionique du milieu pourrait augmenter l'efficacité du traitement. En
revanche, l'augmentation de la concentration en protéines et lipides permet une plus grande
résistance microbienne. Les protéines contenues dans le lait absorberaient les radicaux libres
ainsi que les ions nécessaires à la destruction des cellules. Les lipides contenus dans du lait
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pourraient quant à eux modifier la conductivité du milieu, et ainsi protéger les

microorganismes des CEP (Barsotti & Cheftel, 1999).
Les paramètres physiques des CEP entrent également en jeu, comme l’amplitude du
champ, la fréquence des impulsions et le temps de traitement. La température est aussi un
facteur important mais ses effets sont plus complexes. Une plus grande sensibilité des
bactéries est observée à des températures de l'ordre de 50-60°C par rapport à 10-30°C,
certainement à cause de l'augmentation de la fluidité et donc de la fragilité des membranes à
plus haute température. Il a été démontré qu'un traitement de 30 pulses de 56,7 kV/cm à 20°C
n'a aucun effet sur Salmonela Enteritidis présente dans de l'œuf liquide (Huang et al., 2006).
Un traitement plus fort de 50 pulses à 55°C et 56,7 kV/cm n'a pas non plus montré d'effet sur
les œufs liquides (la viscosité des œufs serait la raison de la mauvaise efficacité du
traitement). D'autres tests ont révélé une efficacité bien meilleure. Un traitement de 30 pulses
à 50 kV/cm et 20°C a permis une réduction de 1,8 cycles logarithmiques de B .cereus
NCTC11145, et de 3,4 cycles logarithmiques de B. subtilis ATCC6633 (Marquez et al.,
1997). Vingt impulsions supplémentaires ont permis une réduction logarithmique supérieure à
5 unités pour B. cereus. L'intervalle de temps entre chaque pulse peut également jouer un rôle:
une décontamination de 2.1 cycles logarithmiques a été obtenue sur des spores de B. cereus
avec un traitement de 30 pulses à 35 kV/cm avec un intervalle de 5 à 6 seconde entre chaque
pulse. Le même traitement avec un intervalle de temps plus court (2 à 3 secondes entre chaque
impulsion) a entraîné une réduction de seulement 1.2 unités logarithmiques. Cette différence
peut s'expliquer par la polarité des pulses et le temps de pénétration des ions dans le cœur des
23
spores (Marquez et al., 1997). Comme dans le cas des HPH, l'efficacité des CEP peut être
améliorée en couplant les traitements (utilisation de nisine, augmentation de la température...).
Table 5: Décontaminations microbiologiques par CEP

Champ
Nombre Durée des Réduction
Microorganisme milieu électrique T° Référence
de pulses pulses (µs) logarithmique
(kV/cm)
Spores B. subtilis Suspension 15 0.2 (Marquez et
50 2 25°C
ATCC6633 (0.15%NaCl) 30 3.4 al., 1997)
Spores B. cereus Suspension 30 1.8 (Marquez et
50 2 25°C
NCTC11145 (0.15%NaCl) 50 >5 al., 1997)
25 150 1.8 (Sobrino-
S. aureus
lait 8 25°C Lopez et al.,
CECT240 35 150 4.3
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2006)
42°C 0.9 (Wu et al.,
Levures Jus de raisin 80 20 2
50°C 3.9 2005)
L. monocytogenes 35°C <1 (Fleischman
lait 20 10 3.25
ATCC19115 55°C 4.5 et al., 2004)
24
Courant alternatif - 110 V
Transformateur
Convertisseur
Résistance Condensateur
6 MΩ 0,12 µF
Courant continu haute tension
Aliment Oscilloscope
Résistance
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Circuit de 40 kΩ
Thyratron
déclenchement
générateur
d'impulsions
Terre
Figure 6: Schéma d'un équipement CEP (Wu et al., 2005)
Les équipements sont chers, rares, et de capacité limitée. Leur prix (estimation début des
années 2000) pouvait aller de 40 000 à 500 000 dollars US, avec un coût de fonctionnement
estimé à 0.2 dollar/L (Gongora-Nieto et al., 2002). Aux Etats-Unis, PurePulse Technologies
propose des équipements pour traiter des aliments liquides à 35-45 kV/cm avec un débit allant
de 3000 à 8000 L/h, depuis 1996.
e. Législation
En ce qui concerne le traitement d'aliments acides (pH<4.5) comme les jus de fruits, la
FDA a répondu à une évaluation de la pasteurisation par CEP par une lettre de non objection
(Barsotti & Cheftel, 1999). Mais il reste nécessaire de démontrer pour chaque application
l'absence de composés chimiques formés en grande quantité dans les produits alimentaires.
25

Aucune différence sensorielle n'a été observée entre un traitement par CEP et une
pasteurisation sur du lait, des œufs liquides et de la soupe de pois. En revanche, la même
comparaison sur du jus de pomme a montré une meilleure conservation des qualités
organoleptiques lors du traitement par CEP. Le taux de vitamine C contenu dans le jus de
raisin ne semble pas être modifié par les CEP (Wu et al., 2005). Les pulses étant de courte
durée, ils n'entraînent pas d'augmentation significative de température. Mais la formation
possible de radicaux libres dans l'aliment doit être étudiée. Dans le cas des champs électriques
pulsés, un procédé continu est possible, mais limité à des produits liquides (Devlieghere et al.,
2004). La conductivité du milieu à une influence non négligeable sur l'efficacité des CEP. De
plus, à l'heure actuelle, peu de résultats microbiologiques sont accessibles. Des pulses répétés
appliqués aux aliments fluides contenant des protéines provoquent des dépôts au niveau de
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l'anode, certainement dus à l'insolubilisation et à l'agrégation de ces protéines. Un lavage

fréquent du dispositif est donc nécessaire afin de maintenir des champs électriques pulsés
uniformes (Barsotti & Cheftel, 1999). Les CEP appliqués au jus de raisin ont démontré une
haute efficacité germicide, tout en préservant les qualités nutritionnelles. Le traitement de jus
de canneberge (Sen Gupta et al., 2005) ou encore d'orange ou de citron (Cserhalmi et al.,
2006) a également mené à la même conclusion. De bons résultats (avec une réduction allant
jusqu'à 4.5 cycles logarithmiques) ont été obtenus sur S. aureus traité dans du lait mais aucun
effet protecteur des matières grasses n'a été mis en évidence (Sobrino-Lopez et al., 2006). En
revanche, dans le cas de la bière, les migrations significatives des composants des électrodes
(Fe, Cr, Zn, Mn) peuvent provoquer une perte de saveur au delà d'une certaine dose.
3) Irradiations
a. Principe
La décontamination par irradiation fait référence à trois types de phénomènes physiques :
le rayonnement gamma, le rayonnement X et les faisceaux d’électron.
Le rayonnement γ correspond à l’émission spontanée de photons par le noyau d’un isotope
radioactif. Sa longueur d’onde est en général inférieure à 10 pm. Ce phénomène a été
découvert par Paul Villard en 1900. Les rayons X sont des ondes électromagnétiques émises
par les couches électroniques profondes des atomes. Leur longueur d’onde est comprise entre
26
0,01 et 10 nm. Cette partie du spectre électromagnétique a été identifiée par Wilhelm Röntgen
en 1895 (Stanton & Rontgen, 1896). Les faisceaux d’électrons font référence à un
déplacement d’électrons créés à partir d’une source. Les tubes à vides permettant de créer les
faisceaux d’électrons ont été inventés dans leur forme moderne par Karl Braun en 1897
(Braun, 1897). L'irradiation des aliments a commencé avec le programme "Atoms in peace"
du Président Eisenhower au début des années 1950.
Les techniques d’irradiation ont l’avantage de pouvoir traiter le produit en surface et en
volume. Les rayons X durs et gamma sont très pénétrants donc il est possible de traiter des
produits ayant un volume important. Les temps d’exposition sont de l’ordre de l’heure (Satin,
2002). Les faisceaux d’électrons pénètrent moins profondément dans la matière mais
suffisamment pour traverser des films ou des emballages. Ainsi l’avantage des faisceaux
d'électrons est le fait que les aliments peuvent être traités à travers leur emballage, et même
congelés ou réfrigérés (Farkas, 1998). Il est à noter qu’un traitement de forte énergie donne
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des résultats satisfaisants sur des épaisseurs allant jusqu'à 3,5 cm (Satin, 2002).
Pour ces types de rayonnements, la dose est généralement exprimée en Gray. Un Gray
correspond à une énergie absorbée d'1 joule par kg de produit traité. Les doses habituellement
utilisées sont comprises entre 0.01 et 10 kGy. Ces types de radiations ont été choisis car ils
produisent les effets désirés sur l'aliment, sans induire de radioactivité au sein du produit ou
de l'emballage et permettent une utilisation industrielle en matière de quantité et de coût de
fonctionnement (Farkas, 2007). Le terme "radapertisation" est employé pour décrire
l'ionisation appliquée aux aliments préemballés dont les enzymes ont été inactivées, à des
doses déterminées pour qu'aucune altération ou toxicité ne surviennent quelles que soient les
conditions et durées de stockage (en l'absence de contamination post-process). Le traitement
par irradiation peut être un réel avantage en matière de sécurité alimentaire. Le New York
Times et le Wall Street Journal ont même publié en 1994 des éditoriaux favorables aux
irradiations (Crawford & Ruff, 1996).
Diverses modifications peuvent être induites dans la structure de l’ADN par un
rayonnement ionisant : oxydation du désoxyribose et libération d’une base par hydrolyse,
pontage entre bases d’un même brin ou entre bases appartenant à deux brins
différents, hydroxylation des bases et en particulier de la thymine, avec formation de
peroxydes en présence d’oxygène. Mais les altérations les plus fréquemment observées sont
27
des ruptures monobrin entre la base et le sucre d’un nucléotide, essentiellement produites par
action des radicaux hydroxyles. Lorsqu’il y a cassures simultanées des brins à des distances
très voisines dans l’ADN, ces ruptures double brins (10 fois moins probables que les ruptures
simple brin) ont des conséquences beaucoup plus dramatiques pour la survie de la cellule.
Les spores sont plus résistantes à l'irradiation que les cellules végétatives. Les raisons de
cette grande résistance ne sont pas clairement identifiées, mais la faible teneur en eau du cœur
de la spore pourrait être un facteur important, réduisant par exemple la capacité des rayons γ à
générer des radicaux hydroxyles. Ceci n'est qu'une hypothèse, car il n'existe pas d'étude
systématique sur la relation entre teneur en eau et résistance aux rayons γ. Contrairement au
cas des traitements thermiques, les SASP (Small Acide Soluble Proteins) ne semblent pas être
impliquées dans la résistance aux rayons γ (Nicholson et al., 2000).
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Les bactéries Gram- sont ici encore plus sensibles que les Gram+ et les spores toujours
plus résistantes que les cellules végétatives, bien que quelques espèces se soient avérées très
résistantes dans leur forme végétative (exemple de Deinococcus radiodurans). Les virus sont
quant à eux très résistants aux irradiations (Farkas, 2007). De nombreux facteurs influencent
fortement l'efficacité de ces traitements: la composition du milieu, l'activité de l'eau, la
température lors du traitement, la présence d'oxygène (qui augmente la sensibilité), la
congélation (la dose nécessaire pour l'inactivation de 90% de la population est 2 à 3 fois plus
élevée dans les aliments congelés que dans les aliments frais).... Des doses de 5 à 7 kGy se
sont avérées efficaces contre les levures, moisissures et spores (Mittendorfer et al., 2002).
Une réduction logarithmique de 2 unités sur des moisissures a été observée sur des grains de
café avec une dose de 5 kGy. Thayer et al. (2003), grâce à une source de Césium 137 à une
dose de 0.1 kGy/min, ont déterminé qu'un traitement de 2.8 kGy sur des graines de luzerne
permettait une réduction supérieure à 3 cycles logarithmiques de Salmonella Mbandaka. Ils
évaluent une destruction de 5 cycles logarithmiques pour une dose de 4,05 kGy.
28
Table 6: Résistance de quelques microorganismes aux irradiations dans des aliments frais ou
congelés (Farkas, 2007)
D10 (kGy)*
microorganismes Aliments frais Aliments congelés
Vibrio spp 0.03-0.12 0.11-0.75
Yersinia enterocolitica 0.04-0.21 0.4
Pseudomonas putida 0.06-0.11
Campullobacter jejuni 0.08-0.20 0.21-0.32
Shigella spp 0.2-0.4
Aeromonas hydrophila 0.14-0.19
Bacillus cereus (cellules) 0.17
Proteus vulgaris 0.2
E. coli 0.23-0.35 0.3-0.6
E. coli O157:H7 0.24-0.27 0.31-0.44
S. aureus 0.26-0.6 0.3-0.45
Brucella abortus 0.34
Salmonella spp 0.3-0.8 0.4-1.3
L. monocytogenes 0.27-1 0.52-1.3
Lactobacillus spp 0.3-0.9
Streptococcus faecalis 0.65-1
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C.perfringens (cellules) 0.59-0.83

C.botulinum type E (spores) 1.25-1.4
B.cereus (spores) 1.6
C.sporogenes (spores) 1.5-2.2
C.botulinum types A et B (spores) 1-3.6
Deinococcus radiodurans 5-3.1
Deinobacter spp 5.05
*D10 : dose de réduction décimale
Les équipements peuvent être relativement peu encombrants (faisceaux d'électrons
accélérés), ou très imposants (rayons γ). Le coût des machines est très élevé, et varie selon la
puissance et le type de rayonnement. Sadat, en 2004, donne des exemples d'équipements
allant de 3,1 à 5,6 millions de dollars US, avec un prix de fonctionnement variant entre 1 et
1,4 cent ($) par 500g de produit (Sadat, 2004).
29
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Figure 7: Principe d'une unité de traitement des aliments aux rayons γ (Ferrandon, 2008)
e. Législation
Dans l'agroalimentaire, les irradiations sont limitées par la règlementation à des énergies
de 5 MeV pour les rayons X et γ, et de 10 MeV pour des faisceaux d'électrons (Codex
Alimentarius, 2003).
Les premières autorisations accordées par la FDA concernent le blé et la farine en 1963
(en vue d'éliminer les insectes) et les pommes de terre en 1964 (pour inhiber leur germination
et prolonger leur durée de vie). En 1965, selon une étude de l'US army, il a été conclu que les
aliments irradiés avec des doses allant jusqu'à 56 kGy étaient sans danger pour la santé. En
1980, le "Joint FAO/IAEA/WHO Expert Comittee on Wholesomeness of irradiated food" a
conclu que les aliments irradiés étaient sans risque jusqu'à des doses de 10 kGy. La dose de
10kGy a donc ensuite été prise comme limite de traitement des aliments irradiés (Radomyski
et al., 1994). La plupart des études ayant mené à ces conclusions étaient basées sur des tests
concernant des chiens, rats et souris nourris avec du poulet irradié. Cependant l’autorisation
sur les doses utilisables varie selon les pays
En 1997, la FDA a approuvé l'irradiation de viande rouge et en Février 2000, le food
safety and inspection service de l'USDA a permis l'utilisation des radiations ionisantes sur les
produits réfrigérés ou congelés crus pour réduire le taux de pathogènes. Actuellement, dix
30
catégories de produits sont autorisées pour l'irradiation aux Etats-Unis, comme par exemple la
volaille non cuite, le bœuf, l'agneau, le porc... (Satin, 2002). En Europe, la règlementation
repose sur 2 textes principaux: La "directive cadre n°1999/2/CE du Parlement Européen et du
Conseil relative au rapprochement des législations des états membres sur les denrées et
ingrédients alimentaires traités par ionisation" du 22 Février 1999, à laquelle s'ajoute une
"directive de mise en œuvre n°1999/3/CE du Parlement Européen et du Conseil établissant
une liste communautaire de denrées et ingrédients alimentaires traités par ionisation" de
même date. La législation permet uniquement l'irradiation d'herbes aromatiques, épices,
légumes de saison, à des doses inférieures à 10 kGy. Trente huit pays dont la Belgique, le
Bangladesh, la France ou encore la Chine, ont approuvé l'irradiation pour de nombreux
produits (farine de blé, pommes de terre blanches, épices, légumes déshydratés, fraises, porc
et volaille). Le Canada est un des principaux fabricants d'irradiateurs. L'irradiation y est
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utilisée depuis plus de 40 ans et environ 0.1 % des aliments sont irradiés. En 2001, on estimait
à plus de 250 000 tonnes les aliments irradiés par année dans le monde (Fournier, 2003). Dans
les dix pays européens possédant des irradiateurs en 2004, environ 15000 tonnes de produits
ont été traitées. 3004 tonnes d'aliments ont été irradiés en France, ce qui place le pays en
troisième position derrière la Belgique (6000 tonnes) et les Pays Bas (5000 tonnes) (Afssa,
2007).

La décontamination par irradiation est très étudiée, et ce depuis plusieurs années.
L'irradiation est une technique certainement aussi bien connue que le traitement thermique.
Aucune augmentation de température n'est observée, ce qui classe ce traitement en procédé
athermique (Farkas, 2007). Selon le produit, une forte dose d'irradiations (par exemple au
dessus de 6.5 kG pour l'agneau) peut altérer le goût et la couleur des aliments, notamment de
la viande (Farkas, 1998). Les polysaccharides comme la pectine peuvent être dégradés suite à
de trop fortes doses d'irradiation, ce qui peut causer une perte de fermeté des fruits et donc
une diminution de leur durée de vie (Min et al., 1996). Nemtanu (2005) évoque le fait que le
traitement par ionisation peut être un bon candidat pour la décontamination du café, car il
n'engendre pas de modification des qualités organoleptiques. En revanche, les irradiations
peuvent produire un certain nombre d'excitations, ionisations, ruptures des liaisons chimiques
et radicaux libres dans le café, pouvant conduire à des modifications des propriétés
rhéologiques causées par la dépolymérisation des constituants. Mais la présence des radicaux
31
libres induits par l'irradiation n'est sans doute pas une raison pour rejeter le traitement, car
d'autres procédés (torréfaction des grains de café) peuvent également provoquer l'apparition
de ces composés. De plus, dans le cas du café, l'analyse rhéologique et spectroscopique ne
présente pas d'importante modification, même à 40 kGy, dose bien plus forte que la dose
recommandée (10kGy) par le Codex Alimentarius (Codex Alimentarius, 2003).
Même s'il a été démontré que les produits irradiés ne peuvent en aucun cas devenir
radioactifs (car à aucun moment le produit ne rentre en contact avec la source radioactive), le
traitement par irradiation est encore difficilement accepté par les consommateurs. Des
ouvrages (Collectif contre l'irradiation des aliments, 2008), des sites internet ou encore des
reportages audiovisuels appuient la mauvaise image de l'irradiation, et certains vont même
jusqu'à remettre des pétitions contre l'irradiation des aliments au ministère de l'économie (22
décembre 2009) (Collectif contre l'irradiation des aliments, 2010). Les plus fervents
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réfractaires à l'irradiation parlent du manque d'information des consommateurs et de

l'inefficacité de la règlementation Européenne. Ils affirment que les irradiations engendrent
des mutations ou l'apparition de nouvelles molécules dans l'aliment, potentiellement
génotoxiques, cytotoxiques ou cancérigènes. Certains se basent également sur une étude
australienne, qui montre que les aliments irradiés seraient à l'origine de troubles
neurologiques chez les chats. La population associe encore l'image de la catastrophe de
Tchernobyl et affiche une certaine peur face à l'utilisation de ce type de technologie (Zyball,
1995).
De nombreuses études ont cependant noté que les arguments lancés contre l'irradiation
étaient quasiment les mêmes que ceux utilisés 100 ans auparavant lors de l'introduction de la
pasteurisation du lait pour prévenir les infections à streptocoques et la tuberculose bovine
chez les enfants (Crawford & Ruff, 1996). La controverse sur les techniques de traitement
touchant les aliments n'est certes pas un phénomène nouveau. On peut également se poser la
question sur la sécurité des utilisateurs. Dans son article, Crawford (1996) regroupe de
nombreuses données sur ce sujet et souligne que l'utilisation des irradiations en industrie
alimentaire n'est pas plus risquée que dans le secteur médical. Il énonce que des procédures
existent pour éviter les risques d'exposition aux irradiations, comme l'isolation des sources par
d'épais murs, empêchant ainsi le moindre contact avec les individus. De plus, les sources de
Cobalt 60 ne produisent pas de neutron, particules responsables de l'apparition de la
radioactivité. Depuis les 25 dernières années, quelques accidents majeurs sont survenus, mais
tous ont été causés par des personnes ayant délibérément négligé leur propre sécurité et
32
surtout les procédures de contrôles. Les radiations ionisantes vont avoir plusieurs utilisations
en fonction de la dose utilisée (figure 8).
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Figure 8: Effet des traitements ionisants en fonction de la dose appliquée (Federighi &
Tholozan, 2001)
Des essais de décontamination utilisant les rayonnements ionisants ont été menés sur de
nombreux produits tels que les viandes et volailles (Satin, 2002), les saucisses de bœuf (Badr,
2005), le soja (Kikuchi et al., 2003), le blanc de poulet (Chun et al., 2010), le thé (Thomas et
al., 2008), le café (Nemtanu et al., 2005), les graines de luzerne (Thayer et al.,
2003)....Certains aliments tels que les volailles sont soumis à d'autres traitements efficaces
comme la chloration ou l'application d'acide lactique, mais leur efficacité semble réduite
comparée à l'irradiation. L'application de faisceaux d'électrons sur du riz cru n'est
apparemment pas possible, en raison de l'oxydation des lipides et de la dégradation de
l'amidon provoquées par le traitement (Sarrias et al., 2003). Le choix d'utiliser l'irradiation se
fait en fonction de l'efficacité et du prix de fonctionnement mais surtout de la législation du
pays concerné, prenant en compte les doses maximales autorisées.(Farkas, 1998).
33
4) UV continus
a. Principe
Le traitement UV continus est une méthode athermique, non chimique et considérée
comme non ionisante (Keklik et al., 2009). L’émission UV est produite dans une lampe à
vapeur de mercure. La lampe se compose d’une enceinte en quartz dans laquelle réside un
mélange d’argon et de mercure. Deux types de lampes sont différenciés selon la pression dans
l’enceinte. La pression est inférieure à 10 Torr pour les lampes dites basse pression et elle est
supérieure à 100 Torr pour les lampes dites moyenne pression. Dans les deux cas, l’émission
est produite lors de la désexcitation du mercure préalablement chauffé puis ionisé. Le spectre
d’émission varie grandement avec la pression. Il est monochromatique à basse pression avec
un pic principal d’émission à 254 nm (il existe un pic d’émission moins intense à 184 nm
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coupé par l’enveloppe). A moyenne pression, c’est un spectre de raies présentant plusieurs
maxima (254, 365, 405, 436, 546, 578 nm). Le flux radiatif dépend grandement de la
pression. Il est de l’ordre de 0,1 W/cm2 pour les lampes basse pression et de trois ordres de
grandeur supérieur pour les lampes moyenne pression. La puissance nécessaire à
l’alimentation des lampes est de l’ordre de la centaine de Watts pour les lampes basse
pression et de la dizaine de kilowatts pour les lampes moyenne pression.
Les deux types de lampes émettent des UV dans la région 200-280 nm du spectre. Cette
région correspond communément aux UV-C. Il est à noter qu’il n’existe pas de consensus
quant à la largeur exacte de cette région. Pour certains, elle recouvre les longueurs d’ondes
comprises entre 200 et 280 nm (Yaun et al., 2003), pour d’autres elle s’étend jusqu’à 290 nm
(Coohill & Sagripanti, 2008). Les UV-C sont parfois nommé UV "germicides" (Farkas, 2007)
car ils sont responsables de l'inactivation des virus et bactéries. Les longueurs d'onde les plus
destructrices se situent entre 240 et 280 nm (Farkas, 2007). La grandeur caractérisant le flux
lumineux reçu par les microorganismes est l’éclairement (en W/cm²). La dose tient compte de
la durée d’exposition et est homogène à une fluence (J/cm²). Pour les liquides, le J/L est
également utilisé (Keyser et al., 2008). Les UV continus en tant que méthode de conservation
ont une image positive vis-à-vis des consommateurs (Bintsis et al., 2000). Les traitements
sont déjà utilisés pour décontaminer l'eau, l'air et les surfaces (Koutchma, 2009). Ainsi, aux
Etats-Unis, depuis les années 1930, les radiations UV à 254 nm sont utilisées pour réduire le
nombre de bactéries dans l'air des blocs opératoires en milieu hospitalier.
34
Les radiations UV ont un mécanisme d'action assez similaire aux irradiations: elles
causent des ruptures au sein de la molécule d'ADN, ainsi que des dimères de pyrimidine
(notamment de thymine, lésions les plus fréquemment retrouvées chez les cellules végétatives
(Coohill & Sagripanti, 2009). Ces lésions bloquent la réplication et la transcription,
compromettant les fonctions cellulaires et entraînant la mort de la cellule (Guerrero-Beltran &
Barbosa-Canovas, 2004). Cet effet est corrélé à l'absorption des UV par les acides nucléiques,
située entre 200 et 310 nm (Koutchma, 2009), avec un maximum à 260 nm.
Les systèmes de réparation de l'ADN (principalement le NER ou Nucleotide Excision
Repair, figure 9) sont des éléments mis en place par les cellules pouvant contrer les effets du
traitement UV. Dans le cas des cellules végétatives, des phénomènes de photoréactivation
peuvent se produire et également conduire à la réparation des lésions causées sur l'ADN du
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microorganisme, lorsqu'il est exposé à la lumière du soleil après traitement. En effet, une
enzyme de réparation de l'ADN, appelée ADN photolyase, peut réparer les dégâts causés par
les radiations UV. Cette enzyme est activée par les photons issus de la lumière du jour
(photons UV-A). Dans ce cas, l'effet du traitement UV peut être minimisé par l'incubation à la
lumière.
Figure 9: Action mutagène des UV (www. edu.upmc.fr)
35
Dans le cas des spores, les radiations UV génèrent principalement des dimères de 5-
thyminyl-5,6-dihydrothymine, appelés "spore photoproduct" (Setlow, 2006), formés entre 2
thymines adjacentes sur le même brin d’ADN. Cette structure potentiellement létale a été
découverte en 1970 (Setlow, 2001), et plus de 30% des groupements thymine des acides
nucléiques sont capables de former ce spore photoproduct (SP). Les spores de plusieurs
espèces du groupe Bacillus ont montré une résistance beaucoup plus élevée que celle des
cellules végétatives des mêmes espèces, avec une DL90 (dose nécessaire à l'élimination de
90% de la population) de 5 à 50 fois plus élevée. Plusieurs phénomènes permettent
d’expliquer cette affirmation. La raison majeure de la formation de SP au lieu de dimères de
thymine lors de l’irradiation UV des spores, est la forte teneur en SASP de type α/β
(représentant entre 4 et 8% des protéines totales). De plus, la faible teneur en eau du cœur de
la spore va provoquer une modification de la structure chimique de l’ADN. Ces 2
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phénomènes vont favoriser la formation de SP au détriment des dimères de thymines (Setlow,

2001). Pourtant cela ne suffit pas à expliquer la plus forte résistance des spores, car le taux de
formation de SP en fonction de la dose UV est similaire à la formation des dimères de
thymine dans les cellules végétatives. Ce sont les systèmes de réparation de l’ADN mis en jeu
qui permettent d’expliquer cette différence. En effet, un système de réparation efficace,
spécifique de la spore (appelé système SP spécifique), est capable de monomériser le SP en 2
thymines, sans clivage du brin d’ADN, et ce, en l’absence de lumière, ce qui est donc distinct
de la photoréactivation. Ces réparations sont possibles grâce à une enzyme spécifique, la SP-
lyase, produite durant la sporulation et activée lors de la germination (Nicholson et al., 2000).
La formation des SP plutôt que des dimères de thymines serait à l’origine de la plus forte
résistance des spores comparées aux cellules végétatives.
Le traitement UV est décrit comme simple, respectueux de l'environnement, et permettant
de détruire une large gamme de microorganismes dans l'eau (Bintsis et al., 2000).
De manière générale, les bactéries à Gram- sont plus facilement détruites que les Gram+,
les spores (de bactéries et moisissures) sont plus résistantes que les cellules végétatives. Les
virus sont également plus résistants aux UV que les cellules bactériennes. Farkas (2007)
considère que la résistance aux UV dépend de la présence de pigments cellulaires et fait le
lien entre les pigments noirs de certaines moisissures et leur forte résistance aux UV. En effet,
la mélanine contenue dans les spores serait un composé photoprotecteur et augmenterait la
36
survie des spores fongiques en les protégeant des radiations UV(Begum et al., 2009). Un
traitement UV basse pression sur des spores d'A. niger en suspension dans l'eau a révélé une
réduction d'environ 2 cycles logarithmiques avec 0,93 J/cm² (120 s de traitement), alors
qu'une réduction de plus de 2 cycles logarithmiques est atteinte sur Penicillium corylophilum
après seulement 60 s de traitement (0,46 J/cm² ) (Begum et al., 2009). La même étude à
montré une réduction logarithmique de 3 unités sur A. flavus avec 0,93 J/cm² (120 s). Ces
résultats ont caractérisé A. niger comme le microorganisme le plus résistant des trois.
Des spores de B. subtilis ont également été traitées en suspension liquide (Chang et al.,
1985) sur 0,5 cm d'épaisseur. Une réduction de 4 unités logarithmiques a été obtenue avec
seulement 80 mW-sec/cm2 (faisceau d'électrons collimaté). Les spores de B. subtilis ont
montré une résistance nettement supérieure aux cellules végétatives, la dose UV nécessaire à
l'élimination de 99,9% de la population étant 9 fois plus élevée dans le cas des spores
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comparé aux cellules végétatives. Dans le même ordre d'idée, il a été mis en évidence que les
doses nécessaires à la première réduction logarithmique des spores de B. anthracis et B.
megaterium sont également 5 à 10 fois plus élevées que pour les cellules végétatives
correspondantes (Coohill & Sagripanti, 2008). Yaun et al. (2003) ont démontré une plus
grande résistance de Salmonella traitée sur surface gélosée, par rapport à E. coli (Yaun et al.,
2003). En effet une réduction de 5 cycles logarithmiques est atteinte pour une dose supérieure
à 8.4 mW/cm² dans le cas d'E. coli, alors qu'il faut plus de 14.5mW/cm² pour réduire
Salmonella de 5 unités logarithmiques. Des spores de B. subtilis purifiées d'extrait d’un sol de
désert ont montré une résistance plus élevée que des spores de B. subtilis 168 produites en
laboratoire sur milieu de sporulation et purifiées dans les mêmes conditions. Ainsi, la LD90 est
environ 2 fois plus élevée pour les spores issues du milieu sol (Nicholson & Law, 1999).
Nous voyons ainsi que nombreux facteurs d'influence ont été mis en évidence. Coohill et
Sagripanti (2008) insistent sur le fait qu'un traitement doit être défini par:
 les microorganismes utilisés
 les conditions de culture
 les milieux
 la phase du cycle cellulaire
 la méthode de purification des spores
 la dose
 le type de source UV
 la méthode d'exposition
37
 le degré d'agrégation
 la présence possible des phénomènes de photoréactivation...
Nicholson et Galeano (2003), soulignent également que la méthode de préparation des

spores, les conditions d'irradiation et la méthode de dosimétrie ont une forte influence sur
l'efficacité du traitement UV. De nombreux paramètres influencent la destruction des
microorganismes. Il est ainsi légitime de se demander si ces mêmes paramètres influencent la
décontamination dans le cas de la technologie lumière pulsée. Une différence importante entre
ces deux technologies réside en effet dans la manière d’apporter l’énergie UV : une faible
quantité d’énergie accumulée pendant plusieurs secondes (UV continus) ou une importante
quantité d’énergie délivrée en quelques centaines de microsecondes (UV pulsés).
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38
Table 7: Décontaminations microbiologiques par UV continus

Milieu de Intensité UV Réduction
Microorganisme cible Ref.
traitement (254nm) obtenue (log10)
µw/cm² mJ/cm²
E. coli TSA (surface) 20 0.1
100 5
1000 6.2 (Wong et al.,
S. senftenberg TSA (surface) 20 0.1 1998)
100 7.4
1000 7.8
B. megaterium (cellules) nc 5.6 1
B. megaterium (spores) nc 29 1
nc 60 4
B. subtilis (cellules) nc 4-6 1
B. subtilis (spores) nc 26 1
60 4 (Coohill &
E.coli nc 2-4 1 Sagripanti, 2008)
5-11 4
L .monocytogenes nc 5 1
9.6 4
B. anthracis (spores) nc 27.5 1
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62 4
B. anthracis sterne (spores) Suspension 23 1 (Rose &
40 2 O'Connell, 2009)
B. subtilis ATCC6633 (spores) suspension 1.3 1 (Nicholson &
B. anthracis sterne (spores) Suspension 1.4 1 Galeano, 2003)
(Begum et al.,
A.niger Surface agar 928.8 2.5
2009)
Les sources d'UV généralement utilisées sont des lampes à vapeur de mercure basse
pression (102 à 103 Pa), basse pression à haut rendement, ou moyenne pression (104 à 106 Pa).
Le mercure (accompagné d'un gaz inerte comme l'argon) est enfermé dans un tube en silice
scellé aux deux extrémités, et connecté à des électrodes. L'émission des lampes moyennes
pression est polychromatique (250 à 600 nm), avec des énergies émises de 5 à 30 W/cm,
contrairement aux lampes basse pression qui sont monochromatiques, et dont l'énergie émise
se situe plus aux alentours des 0.5 W/cm (Koutchma, 2009). Selon Keyser et al. (2008), les
équipements sont peu chers, il y a peu de maintenance et un faible coût de fonctionnement
(Keyser et al., 2008).
e. Législation
En ce qui concerne la règlementation Européenne, il ne semble pas que de tels documents
existent à l'heure actuelle sur l'utilisation des UV en industrie agroalimentaire. En revanche,
39
bien qu'il n'y ait pas de restriction précise sur l'utilisation du mercure, l'Union Européenne
cherche à en réduire l'utilisation (Commission des communautés Européennes, 2008; Journal
officiel de l'Union Européenne, 2010)
Aux Etats-Unis, la FDA a approuvé les UV continus comme traitement alternatif à la
pasteurisation de jus de fruits frais (U.S. FDA, 2000) : en 2000, elle a modifié les régulations
sur les additifs pour permettre l'utilisation des UV visant à réduire la quantité de pathogènes
de l'homme et autres microorganismes dans les jus (en effet, les UV sont considérés comme
additifs dans le cas des traitements alimentaires (Koutchma, 2009)). La FDA n'a pas spécifié
de dose minimum ou maximum, mais a énoncé que l'utilisation des UV devait respecter les
bonnes pratiques de fabrication, et que la dose maximale utilisée pour les jus devait être
autolimitée économiquement, par les coûts de fonctionnement des UV (Koutchma, 2009). De
plus, les doses maximales utilisées pour les jus doivent être limitées par les altérations
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possibles des caractéristiques organoleptiques du jus (modifications de couleur, de goût), ce

qui pourrait mener à une diminution de la consommation.

Keyser et al. (2008) affirment qu'aucun composé ni sous produit toxique connus ne sont
formés à cause des UV, que le traitement de l'eau n'a entraîné aucune apparition de mauvais
goût ou odeur, qu'il n'y a pas de changement de couleur du jus de pomme traité, et que le
traitement nécessite peu d'énergie comparé à la pasteurisation (Keyser et al., 2008). Le
traitement UV est aussi utile pour traiter des matériaux qui ne résistent pas à l'autoclave
(Guerrero-Beltran & Barbosa-Canovas, 2004). Mai Thu Thi et Farid (2004) mettent en
évidence que la perte en vitamine c dans le jus d'orange augmente avec la dose UV-C, mais ne
démontrent aucune différence avec les traitements thermiques (Mai Thu Thi & Farid, 2004).
De plus, un traitement UV appliqué au jus d'orange n'a montré aucune modification de
couleur ni de pH du produit.
Les UV présentent une très faible capacité de pénétration, il s’agit donc le plus souvent
d’un traitement de surface sauf pour les produits transparents aux UV. En effet, 90% des UV
sont absorbés sur 1mm de jus de fruit et la faible pénétration est d'autant plus accentuée que le
liquide est opaque (Guerrero-Beltran & Barbosa-Canovas, 2004).
Le facteur limitant le plus évident de ce traitement est sans aucun doute l'effet d'écran. La
faible pénétration des UV permet uniquement une application en surface, et le traitement sera
inefficace sur des microorganismes disposés en amas ou biofilms, ou protégés par de la
40
matière organique (Coohill & Sagripanti, 2008). Le traitement par émissions continues d'UV
est certes un traitement respectueux de l'environnement, car aucun composé chimique n'est
utilisé et aucune source radioactive n'est nécessaire. En revanche, le mercure contenu dans les
lampes pose des problèmes environnementaux lors de leur élimination. C'est pour cela que
l’Europe s’est engagé à limiter l’utilisation de mercure dans les appareils électriques et
électroniques à partir du 31 décembre 2011 (Journal officiel de l'Union Européenne, 2010).
Les applications les plus courantes sont la désinfection de l'air, des surfaces, des
emballages (boîtes, bouchons, bouteilles, cartons, tubes, films, opercules...) et de l'eau. Les
liquides transparents seront des cibles plus faciles que les liquides opaques, grâce à une
pénétration des UV sur une épaisseur plus importante. Cependant, les liquides clairs peuvent
eux-mêmes poser certains problèmes, du fait de la présence de particules de petite taille, mais
plus grosses que les microorganismes et provoquant encore une fois des effets d'écran.
L'application des UV montre une efficacité significative uniquement sur des œufs dits
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"propres", c'est à dire non recouverts de résidus de terre, plumes, ou fientes qui font écran et
empêchent le rayonnement d'atteindre la surface de la coquille (De Reu et al., 2005). Il a
également été confirmé que les radiations UV sont incapables de traverser la coquille, et donc
qu'aucune réduction de la contamination interne de l'œuf n'est possible.
Le traitement UV continu est applicable à l'industrie agroalimentaire dans le cas :
 des décontaminations de surfaces d'aliments et d'emballages, ou de liquides
traités sur de très faibles épaisseurs.
 où il est possible d’appliquer des durées d’exposition de plusieurs secondes.
Le traitement aux UV reste une alternative peu séduisante pour résoudre des problèmes de
forte contamination, entraînant une répartition des microorganismes en amas, et diminuant
ainsi la probabilité de chaque germe d'être directement soumis aux UV.
4. La lumière pulsée:
1) Principe
Les premiers travaux de désinfection (Japon) datent de la fin des années 70 (Wekhof,
2000), et le premier brevet de 1984 (Hiramoto, 1984). La lumière pulsée se définit par des
impulsions ou flashes de lumière produits par une lampe à arc au xénon. Le spectre
41
d’émission de la lampe couvre le domaine en longueurs d’ondes s’étendant entre 200 et 1300
nm. La durée des flashes varie entre la microseconde et la milliseconde. L'énergie nécessaire à
l’allumage de l’arc est accumulée dans un condensateur puis déchargée dans la lampe. La
décharge est possible à la condition que le gaz soit préionisé. La préionisation est obtenue
grâce à un signal dit trigger (haute tension et faible courant). Elle permet d’initier l’avalanche
électronique nécessaire pour rendre le gaz conducteur (phénomène de claquage). L’énergie
électrique accumulée dans le condensateur est libérée dans le canal conducteur. Les atomes de
xénon sont excités et ionisés lors du passage du courant (plusieurs centaines d’ampères). Le
phénomène de passage à l’arc permet de libérer toute l’énergie électrique stockée. La
décharge se coupe ensuite. Le retour à l’état fondamental des atomes de xénon se fait par
l’émission de photons dont la longueur d’onde varie entre l’UV et l’infrarouge. Le spectre
produit dépend des paramètres électriques du circuit de décharge. Comme pour les lampes
utilisées dans le cas des UV continus, l’enceinte dans laquelle se trouve le gaz est en quartz.
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La dose reçue par le produit est généralement décrite par la fluence (J/cm²), représentant
l'énergie reçue par unité de surface de la cible (unité également utilisée dans le cas des
traitements par UV continus). Mais le traitement est caractérisé par d'autres paramètres
physiques :
 la tension appliquée aux bornes des lampes (V) qui en plus d'avoir une
influence sur la fluence (plus la tension est élevée, plus la fluence du flash est
élevée) détermine la qualité du spectre émis (% d'UV)
 l’éclairement crête (W/cm²) représente la puissance maximum sur 1cm² de la
surface pendant la durée d'un flash
 la fluence (J/cm2), qui représente l’énergie accumulée sur 1cm2 de la surface
pendant la durée du traitement (un ou plusieurs flashes)
 le nombre de flashes émis.
2) Mécanismes d'inactivation
Deux types de mécanismes sont décrits dans la littérature pour expliquer l’inactivation due
à la LP :
 l'action photochimique des longueurs d'onde UV
 l’action photothermique du spectre entier.
42
L’action photochimique, mécanisme d'action également retrouvé dans le cas du traitement

UV continus (cf. 4.b), aurait un effet direct sur la molécule d'ADN. En effet, les UV-C (200-
280 nm) provoqueraient la formation de dimères de pyrimidine (en particulier de thymine),
inhibant la formation de nouveaux brins d'ADN dans le processus de réplication et entraînant
la mort du microorganisme (Gomez-Lopez et al., 2007). Cet effet germicide des UV serait
aussi responsable de la destruction de spores bactériennes par formation de "spore
photoproduct" ou 5-thyminyl-5.6-dihydrothymine, ainsi que de ruptures simple et double brin,
et de dimères de cyclobutane-pyrimidine (Slieman & Nicholson, 2000). De nombreuses
études définissent l'absorption des UV comme la cause majeure d'inactivation des
microorganismes par lumière pulsée, signifiant dans ce cas que l'unique différence de cette
technologie par rapport à une émission continue d'UV serait la réduction du temps de
traitement.
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Un deuxième mécanisme est parfois décrit comme intervenant dans l'efficacité germicide
de la lumière pulsée: le mécanisme photothermique. Wekhof (2000), énonce qu'avec une
fluence supérieure à 0.5 J/cm², la désinfection est provoquée par rupture des membranes, du
fait de la brève mais intense élévation de température au niveau du microorganisme. Des
résultats obtenus par MEB montrent que des spores d'A. niger traitées par lumière pulsée
(figure 10) présentent des sévères déformations (Wekhof et al., 2001). Il est à noter que, dans
cette référence, la fluence appliquée aux spores est supérieure à 6 J/cm². Dans le cas de spores
de B. subtilis et pour les mêmes conditions expérimentales de telles déformations ne sont
cependant pas observées (Wekhof et al., 2001).
L'origine photochimique et/ou photothermique de l'efficacité de la lumière pulsée est un
sujet encore à l’étude. Certains s'accordent à soutenir que les deux effets peuvent intervenir, et
que l'influence relative de l'un ou l'autre varie en fonction du microorganisme et de la fluence.
Wuytack et al. (2003) évoquent des dommages causés sur l'ADN comme la raison majeure de
l'inactivation de Salmonella. Les dommages causés aux membranes n'auraient qu'un rôle
mineur dans le processus.
43
A B
Figure 10: Microscopie électronique à balayage (x10 000) de spores d'A. niger A) non
traitées B) Traitée avec 2 flashes à 33 kW/cm² (Wekhof et al., 2001).
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3) Efficacité microbiologique
Les spores de moisissures semblent être plus résistantes que les bactéries à Gram +, elles-
mêmes plus résistantes que les Gram- (Rowan et al., 1999). Pourtant, après l'étude de 27
souches différentes (bactéries, moisissures et levures), Gomez-Lopez n'a mis en évidence
aucun principe général concernant la sensibilité entre les différents groupes de
microorganismes (Gomez-Lopez et al., 2005b). La table 8 regroupe quelques résultats
démontrant l'efficacité microbiologique de la lumière pulsée sur différents microorganismes.
44
Table 8: Décontaminations microbiologiques par lumière pulsée
Nombre Distance Réduction

Microorganisme Milieu de Fluence Epaisseur
de lampe/cible (log10) Référence.
cible traitement (J/cm²) du produit
flashes (cm) maximale
Surfaces (Woodling &

L. innocua 1 à 12 1.27 5.08 / 3.5
métalliques Moraru, 2005)
(Ozer &
E. coli 0157:H7 Filets de 1.1
45 à 180 5.6 3-5-8 Demirci,
L .monocytogenes saumon 1,0
2006)
Suspension 45-90- 0.4 log par (Wang et al.,
E. coli
aqueuse 135 mJ/cm² 2005)
(Sharma &
Graines de
E. coli O157:H7 15 à 270 5.6 3 à 13 1.02 à 6.25 4.8 (totale) Demirci,
luzerne
2003)
L. monocytogenes (Gomez-
50 à
P. phosphoreum légumes 8,4-12.8 1.7 Lopez et al.,
2700
C. lambica 2005a)
Suspension
7.5 (Krishnamurth
S. aureus surface 3 à 90 5.6 8 /
8.5 y et al., 2004)
gélosé
(Jun et al.,
A. niger maïs 60 à 300 5.6 3-13 4.9
2003)
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(Hillegas. &
C. sporogenes miel 15 à 540 5.6 8 à 20 2à8 5.7 Demirci,
2003)
(Gomez-
Surface
L. monocytogenes 50 6 et 13 3.6 Lopez et al.,
gélose
2005b)
Coupons (Woodling &
L. innocua 1 à 12 0 à 12 5,08 5.3
métal Moraru, 2005)
0.23 et (Takeshita et
S. cerevisiae Suspension 1à5 5.0
0.7 al., 2003)
E. coli 7.0 (MacGregor et
Suspension 0 à 512 4.5
L .monocytogenes 6.0 al., 1998)
L. monocytogenes
E. coli
Surface 100 à (Rowan et al.,
P. aeruginosa 6.0
gélosée 300 1999)
S. aureus
S. cerevisiae
Cependant cela regroupe des résultats obtenus pour des conditions expérimentales
différentes. La question de l’influence de chaque facteur se pose donc comme un préalable à
la lecture d’une telle table. Parmi ces facteurs nous pouvons différencier les facteurs liés au
système d’éclairage (lampe et réflecteur) de ceux liés à la cible (microorganisme et support) :
Facteurs liés au système d’éclairage :
 la fluence reçue au niveau du microorganisme
 la tension appliquée aux bornes des lampes
 le type et la forme des réflecteurs qui déterminent les angles d’incidence du
rayonnement sur la surface.
Facteurs liés à la cible :
 le microorganisme cible
45
 la nature et la rugosité de la surface traitée

 la densité de population dans le cas des traitements de volumes de liquide
 la composition des aliments
 l'épaisseur de la cible.
 Influence des facteurs liés au système d’éclairage étudiés dans la littérature

Comme dans chacun des traitements, il est nécessaire de définir une grandeur permettant
de caractériser la dose décontaminante. La littérature a retenu la fluence comme dose
caractéristique pour la technologie lumière pulsée. La fluence est l’éclairement énergétique
d’une surface, c’est-à-dire le flux incident par unité de surface intégré temporellement. Cette
grandeur caractérise le flux sur une surface quelles que soient les conditions d’éclairage : la
source peut-être collimatée, diaphragmée, hémisphérique… Donc cette grandeur ne
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caractérise pas une source. Il ne faut pas confondre la fluence avec les grandeurs liées à la
source que sont la luminance ou l’excitance (W/cm²). Pour manier correctement cette
grandeur quelques précautions sont nécessaires.
Les travaux décrivant l’effet des radiations lumineuses montrent que certaines longueurs
d’ondes (UV par exemple) ont une efficacité décontaminante plus élevée que d’autres. Le
spectre émis par une lampe flash au xénon est :
 continu : le spectre est continu en longueurs d’ondes, contrairement aux lampes à
vapeur de mercure moyenne pression, qui émettent un spectre de raies présentant des
maxima d’intensité pour certaines longueurs d’ondes.
 large : l’émission s’étend sur un large domaine en longueur d’onde (200-1300nm).
Ainsi la fluence peut exprimer une valeur intégrée sur tout le spectre ou au contraire une
valeur intégrée sur un domaine réduit en longueur d’onde (par exemple le domaine 200-400
nm pour les UV seuls). Il est donc important de connaître le domaine en longueur d’onde pour
lequel est exprimée la fluence. La fluence est une valeur intégrée dans le temps. Ainsi, elle
peut être grande car :
 la fluence produite par un flash est grande (influence de l’éclairement crête)
 la fluence de plusieurs flashs est additionnée (influence du nombre de flashs).
La LP est un traitement lumineux, tout comme le traitement par émission continue d'UV.
Mais ces deux dernières caractéristiques sont spécifiques à la LP, et il est nécessaire d'étudier
leur rôle.
46
La tension appliquée aux bornes de la lampe est la tension de charge des condensateurs.
Elle influence ainsi :
 l’intensité émise par la lampe sur tout le spectre
 l’intensité relative émise pour chaque longueur d’onde du spectre (composition du
spectre lumineux).
Si les UV ont un rôle fondamental pour la décontamination, la proportion relative des UV du
spectre est un facteur déterminant pour l’évaluation de la décontamination. Dans un article
concernant la désinfection des fruits par lumière pulsée, Lagunas-Solar et al. (2006)
soulignent le fait que les UV continus, de par leur faible intensité, causent des dommages
réparables par rapport à l'énergie apportée par UV pulsés. Wekhof (2000) évoque également
le fait que certains microorganismes, habituellement résistants aux UV (Cryptosporidium,
A.niger, spores de B.subtilis) sont inactivés par lumière pulsée (Wekhof, 2000).
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Etudier la dose UV émise par les lampes délivrant la lumière pulsée nécessite ainsi de
connaître plusieurs paramètres. Réduire l'efficacité de la LP par seule action de la dose d'UV,
souvent décrite comme la fraction la plus efficace (Woodling & Moraru, 2007) ne semble pas
suffisant. L’éclairement crête du flash semble être un élément non négligeable (Luksiene et
al., 2007). On peut également se poser la question de l'influence de la répartition de la dose
sur les microorganismes. En effet, qu'en est-il d'une même fluence totale appliquée en un ou
plusieurs flashs? Dans la littérature il existe des différences importantes : le nombre de flashs
peut aller de 1 (Woodling & Moraru, 2005) à plus de 2000 dans certains cas (Gomez-Lopez et
al., 2005a). L'impact de chaque paramètre physique qualifiant la dose n'est pas forcément
disponible. Certains travaux qualifient la dose par l'intensité (fixe) du flash émis par la lampe,
ainsi que la distance lampe-échantillon (variable). Le nombre de flashs est parfois exprimé par
la fréquence et le temps de traitement (Krishnamurthy et al., 2004), parfois directement. Les
divers équipements expliquent sans doute cette variabilité. De plus, la tension appliquée aux
bornes des lampes n'est pas nécessairement indiquée (Uesugi et al., 2007).
 Influence des facteurs liés à la cible étudiés dans la littérature

Des données de décontamination sont disponibles pour de nombreuses espèces
microbiennes :
 des bactéries (B. subtilis, L. monocytogenes, L. innocua, E.coli, S. aureus...)
 des levures (S. cerevisiae, C. albicans...)
 des moisissures (A. niger, B. cinerea...)
47
 des virus (poliovirus, rotavirus...).

Ces données concernent des cellules végétatives et des spores de bactéries. Pourtant,
comme dans le cas des hautes pressions, les informations systématiques sur la résistance
microbienne sont limitées par la diversité des équipements utilisés. Ainsi, seule la sensibilité
des différents microorganismes au sein d'une même étude peut être comparée.
Bien que la mise en parallèle des résultats ne soit pas encore réalisable, du fait du manque
de recul sur l'expression de la dose de LP, certains résultats concernant l'importance de
paramètres environnementaux ou physiologiques sont disponibles. Les facteurs
environnementaux importants sont sans aucun doute l'épaisseur de la cible et les irrégularités
des surfaces. Krishnamurthy et al. (2004), démontrent une meilleure efficacité de la LP pour
les traitements de surface comparés aux suspensions, du fait de la faible capacité de
pénétration des UV pulsés (Krishnamurthy et al., 2004). Woodling et Moraru (2005) ont testé
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l'influence de différentes surfaces sèches sur l'efficacité décontaminante de la lumière pulsée

(Woodling & Moraru, 2005) : la rugosité va influencer la décontamination, notamment par
effet d'écran dû aux irrégularités. Mais la topographie ne suffit pas à expliquer les différences
obtenues. En effet, les surfaces lisses peuvent parfois être plus difficilement décontaminées
que certaines plus irrégulières. Plusieurs hypothèses évoquent la répartition de l'inoculum,
avec des spots plus difficiles à étaler sur surface lisse, difficulté accrue en cas
d’hydrophobicité de la surface, mais aussi les propriétés réfléchissantes, qui semblent évacuer
la lumière plus vite que les surfaces rugueuses, et empêcher l'absorption par les
microorganismes.
Wekhof et al. (2000), relient également l'effet photothermique au milieu environnant.
Selon eux, l'échauffement des bactéries lors du flash dépendrait fortement du milieu
environnant, du fait des transferts de chaleur plus rapides dans l'eau que dans l'air, et donc du
refroidissement instantané plus efficace dans les milieux humides. Dans certains cas, lorsque
le refroidissement n'est pas suffisant, la température des bactéries peut monter jusqu'à plus de
100°C. Ils démontrent ceci en traitant des spores d'A. niger étalées sur une surface PET. La
présence de cratères autour des spores de moisissures montre un échauffement microscopique
supérieur à 120°C (correspondant à la température de fusion du PET) (Wekhof et al., 2001).
De plus, Fine et Gervais (2004) ont testé la lumière pulsée sur de la farine et du poivre noir en
poudre et ont constaté une modification de la couleur des poudres (par colorimétrie), avant
même d'atteindre une décontamination totale. Ce changement de couleur se produit plus
rapidement dans le cas du poivre noir que de la farine, et pourrait s'expliquer par une
48
augmentation de température combinée à des phénomènes d'oxydation (Fine & Gervais,

2004).
De nombreuses surfaces alimentaires ont aussi fait l'objet de tests. La composition de la
matrice, outre sa teneur en eau, est un facteur d'influence retrouvé dans tous les traitements de
décontamination. Il est donc important d'avoir pour chaque microorganisme testé, l'influence
de l'aliment ou du support ciblé.
Même si l'effet des UV-C sur l'ADN ne semble pas être le seul mécanisme d'action de la
lumière (Gomez-Lopez et al., 2007), il reste quand même très important, et les mécanismes de
photoréactivation mis en place par les microorganismes (Cleaver, 2003) pourront, comme
dans le cas des UV continus, permettre une réparation des dommages au sein des cellules.
Gomez-Lopez et al.(2005) parlent justement de l'effet photochimique des UV qui peut être
réversible par une illumination après flash, avec de la lumière visible (Gomez-Lopez et al.,
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2005b). Ainsi, ils mettent en évidence des différences significatives de l'efficacité du

traitement LP lorsque les échantillons traités sont incubés dans le noir immédiatement après
flash, par rapport à ceux laissés 4h à la lumière du jour.
4) Equipements industriels
Les équipements de lumière pulsée varient d'un équipementier à l'autre, mais le système
reste le même. L'énergie électrique est stockée dans un condensateur. Un signal va déclencher
la décharge de l'énergie électrique sur une ou plusieurs lampes à xénon. Les lampes sont le
plus souvent équipées de systèmes de refroidissement par eau et sont protégées par des tubes
en quartz. Les lampes sont équipées de réflecteurs (en aluminium poli) de formes différentes
selon la géométrie du produit à traiter. Le design des réflecteurs est un élément clé,
responsable de la focalisation des rayons lumineux sur la cible. Ainsi, les équipements vont
être différents (nombre de lampes, forme des réflecteurs), selon le produit traité. Le traitement
par lumière pulsée peut être discontinu ou bien continu avec des cavités adaptées aux lignes
de production.
49
Cavité optique (inox) 4

Dimensions: H: 600mm, L: 300mm,
P: 600mm
Indice de protection: IP 65
Poids: 12 kg
Baie électronique (acier peint)

2
Dimensions: H: 1200mm, L: 600mm, P:
600mm
3
Indice de protection: IP 20
Poids: 150 kg 1
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Figure 11: Schéma d'un équipement de lumière pulsée CLARANOR (traitement industriel de
films et laizes de thermoformage). 1- produit traité (film) 2- cavité optique (lampes et réflecteur) 3- Baie
électronique générant les impulsions de haute puissance 4- Tiroir de commande destiné à synchroniser le
traitement à la vitesse de la ligne
Le prix des équipements varie en fonction de la complexité de la machine et surtout du

nombre de lampes nécessaires. L'avantage de la technologie est également en termes de coût
de fonctionnement. En effet, la consommation d'électricité est faible et les opérations de
maintenance se limitent le plus souvent au changement des lampes usagées. L'encombrement
des machines est limité, avec une adaptation très simple sur les lignes de production,
nécessitant le plus souvent une cavité de quelques dizaines de centimètres de large.
5) Législation
Aux Etats-Unis, la FDA a approuvé l'utilisation de la lumière pulsée comme traitement de

décontamination des aliments (U.S. FDA., 2005) avec les conditions suivantes:
 La lumière est émise par des lampes à xénon, avec des longueurs d'onde allant de 200
à 1300 nm, et une durée du flash n'excédant pas 2 millisecondes
 Le traitement est utilisé pour l'élimination des microorganismes de surface
 Les aliments doivent recevoir la dose minimale nécessaire à la décontamination
50
 La dose totale reçue ne doit pas excéder 12 J/cm².

En Europe, cette technologie est soumise à la législation "Novel Food" (Novel Food, 1997).
L'AFSSA a publié en 2009 (Afssa, 2009) un avis concernant l'utilisation de la lumière pulsée
comme procédé de décontamination microbiologique de surface des produits de panification.
Elle en conclut, aux vues des évaluations précédentes (démontrant l'efficacité
microbiologique du procédé et à l'équivalence substantielle en lipides et vitamines dans les
produits finis), que les produits de panification issus d'un traitement de 3 J/cm² ne présentent
pas de risques sanitaires pour le consommateur.
Il est à noter que l'évaluation des nouvelles technologies physiques est soumise en France
à l'évaluation de l'AFSSA qui repose sur 6 points:
- l'évaluation de l'efficacité antimicrobienne (résistance, persistance de toxines, sporulation...)
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- l'étude de la composition chimique et nutritionnelle de l'aliment traité

- l'étude de l'apparition de métabolites ou substances indésirables
- l'absence d'altération de l'emballage, de migration ou de produits néoformés si nécessaire
- les risques liés à l'exposition du consommateur au "nouveau produit"
- le bilan des expériences antérieures d'utilisation.
(Conseil National de l'Alimentation, 2009)
6) Avantages de la technologie, limites, produits cibles
Le traitement LP, du fait de la durée des flashes (200 µS), est un traitement rapide
(souvent quelques secondes) (Wang et al., 2005). Travailler avec de la lumière (comme le
traitement UV continus), ne nécessite l'utilisation d'aucun produit chimique. Il n'y a donc
aucun composé résiduel à éliminer. De plus, les lampes, contrairement aux lampes utilisées
pour l’émission continue d’UV, ne contiennent pas de mercure. Lors des traitements
impliquant un grand nombre de flashes, un échauffement de la cible peut se produire. Il est
également possible qu'un dégagement d'ozone ait lieu (Gomez-Lopez et al., 2007). Les
sources lumineuses (UV comme lumière pulsée) restent sensibles aux effets d'écran. Tout
élément pouvant ainsi s'interposer entre le rayon lumineux et le microorganisme, le protègera
de la destruction. Il sera donc impossible d'utiliser la lumière pulsée sur de grandes épaisseurs.
Les traitements de surfaces seront à l'inverse tout à fait accessibles à la technologie. Les
surfaces plus irrégulières au niveau microscopique seront en règle générale plus difficiles à
51
traiter. Les traitements plus invasifs, sur des suspensions liquides par exemple, ne pourront se
réaliser que sur des liquides clairs et sur de faibles épaisseurs. Ces phénomènes expliquent
que la totalité de la zone à traiter doit être exposée à l'illumination et que les phénomènes
optiques jouent un rôle important dans la caractérisation du traitement et la conception des
machines. Le traitement de plusieurs épaisseurs de miel révèlent une corrélation négative
entre l'épaisseur traitée et l'efficacité germicide (Hillegas. & Demirci, 2003). Même si le
traitement par LP est adapté à la décontamination de surfaces, il reste dépendant des
caractéristiques physiques et de la topographie de la cible, (Woodling & Moraru, 2005). Outre
le fait de sa topographie, la composition de la cible peut se révéler problématique. Les
aliments riches en protéines et acides gras ne sont pas de bons candidats pour le traitement,
car les protéines et l'huile, ajoutées au milieu de culture des microorganismes, diminuent
l'efficacité de la lumière pulsée. En revanche, les fruits ou les légumes seront des cibles
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
adéquates, du fait de leur composition (Gomez-Lopez et al., 2005a). Cependant l'altération de

certaines propriétés physiologiques des aliments (et notamment des légumes) peut être
provoquée par la LP tout autant que par les UV continus (Gomez-Lopez et al., 2007).
7) L'étude approfondie de la lumière pulsée présente-t-elle un réel intérêt par

rapport aux autres techniques physiques de décontamination?
La lumière pulsée est un traitement qui nécessite la transmission de la lumière UV.

L'illumination de la totalité de la zone à traiter est nécessaire à son efficacité. Un système de
réflexion, parfois complexe, peut être mis au point pour optimiser l'illumination de chaque
cible. S'il reste des zones d'ombre, la décontamination pourra être fortement réduite. La
lumière pulsée est adaptée au traitement en surface. Contrairement au traitement thermique,
aux hautes pressions ou encore à l'irradiation, la lumière pulsée ne peut convenir au traitement
de produits opaques aux UV. Cependant, il est possible de décontaminer aux travers de
solides transmettant une grande proportion des UV (PET) ou de solides transmettant
partiellement les UV si l’épaisseur est de quelques centaines de micromètres. On peut traiter
les liquides pour lesquels le coefficient d’absorption dans l’UV et le débit du liquide sont
adaptés. La lumière pulsée entre dans les nouvelles perspectives concernant le traitement des
aliments. En effet, les technologies athermiques et propres sont un sujet de développement
très prometteur et donc très étudié. Le fait d'éliminer totalement l'utilisation de produits
chimiques est un avantage à la fois économique et environnemental. L'absence
52
d'échauffement des aliments préserve les qualités organoleptiques et nutritionnelles, sujet

fondamental à l'heure actuelle. La technologie, probablement moins coûteuse à mettre en
place industriellement que l'irradiation, transmet aussi une image beaucoup moins négative
auprès des consommateurs, la lumière n'étant pas un procédé émettant ou utilisant de la
radioactivité. Les temps de traitement sont généralement très courts (Rajkovic et al., 2010b;
Turtoi & Nicolau, 2007), ce qui est un avantage certain pour l'installation sur les chaînes de
production. La possibilité d'appliquer des traitements par LP en mode continu est également
un atout par rapport à d'autres traitements appliqués préférentiellement de manière
discontinue (en batch ou semi batch par exemple), ou nécessitant de faibles volumes. En
comparaison aux autres traitements cités, la lumière pulsée permet une décontamination
efficace sans qu'il soit nécessaire de coupler le procédé avec un traitement thermique, même
faible.
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Le recensement d'articles scientifiques publiés dans IJFM, AEM, JAM, FM et JFP

considérant les traitements thermique ("heat"), la lumière pulsée ("pulsed light"), les champs
électriques pulsés ("pulsed electric field"), les hautes pressions ("high pressure) les UV
continus ("UV or uv or ultraviolet") et les irradiations ("irradiations or γ rays or X rays or
electron beam") a été effectué. Il fait état de la quantité d'articles disponibles sur chacune des
technologies présentées ici, et leur évolution depuis 1980 (figure 12). Comparée au traitement
thermique, la lumière pulsée est beaucoup moins représentée en termes de quantité de
données. Le nombre d'articles consacrés à la lumière pulsée représente moins de 2% du
nombre total d'articles recensés sur les dix dernières années dans les 5 journaux ciblés.
53
350
300
250
nombre d'articles
200
150
100
50
0
1980-1985 1986-1990 1991-1995 1996-2000 2001-2005 2006-2010
Figure 12: recensement bibliographique concernant le nombre d'articles disponibles sur les 6
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
différents traitements, selon 5 journaux scientifiques (JAM, IJFM, AEM, JFP, FM), depuis
1980. (Source WOK). Traitements thermiques, Hautes Pressions, irradiations,
UV continus, Champs électriques pulsés, Lumière pulsée
54
Présentation du travail de thèse
1. Objectifs scientifiques et technologiques
Les domaines d’application des techniques de décontamination des aliments sont

déterminés par de multiples études expérimentales qui permettent de dégager les grands
principes conditionnant leur efficacité et les aliments qui peuvent être traités avec profit pour
l’industrie et pour les consommateurs. A ce titre certains procédés bénéficient d’un historique
riche et d’applications validées par l’expérience de plusieurs dizaines d’années sur des
volumes d’aliments plus que significatifs. Par contraste, la lumière pulsée est une technique
encore jeune, connue depuis de nombreuses années mais encore peu utilisée en industrie. Les
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
premiers travaux scientifiques sur l'application de la LP pour inactiver les microorganismes

datent des années 1980 (Hiramoto, 1984). Les équipements n'étaient alors pas suffisants pour
permettre une utilisation efficace de la technologie d'un point de vue microbiologique. Leur
développement technologique nécessitera par la suite un savoir partagé entre physique et
microbiologie. Après une longue période d'absence, elle fait désormais l'objet de nouvelles
recherches, et s'étend dans le secteur industriel. De nombreuses données sont encore
incomplètes par rapport à des traitements comme la pasteurisation ou l'irradiation. Il existe
une hétérogénéité des équipements utilisés, d'où une grande diversité de doses, et des données
souvent insuffisantes pour déterminer des traitements standards. La plupart des résultats sont
donnés en fonction d'un type précis de machine. Mieux comprendre les caractéristiques du
traitement, les facteurs d'influence, et établir des relations dose/réponse sont déterminants
pour appliquer la technologie à l'industrie agroalimentaire.
Il est à souligner que les applications de la lumière pulsée ne sont pas forcément les
mêmes que pour les autres techniques. En effet, les applications de LP concernent
principalement les surfaces d'emballages, les liquides clairs traités sur de faibles épaisseurs, et
les surfaces de produits alimentaires. Les choix de la méthode se portent à la fois sur le type
de produit à traiter, sur la décontamination attendue, ainsi que sur les contraintes imposées et
le prix de revient.
L'objectif de ce travail est de mesurer l'effet de la lumière pulsée sur les microorganismes,
afin de trouver un modèle, voire des lois générales de leur destruction, sur un mode semblable
à ce qui peut exister pour les traitements thermiques. Le but est de déterminer des courbes
55
doses réponses en fonction de la fluence et non en fonction d'un nombre de flashes ou de la

distance à la source, qui sont en réalité des paramètres dérivés et ne reflètent pas la dose et la
composition de la lumière reçue. Pour cela, la première étape sera de caractériser un pilote de
lumière pulsée fabriqué par la société CLARANOR S.A., au niveau des propriétés physiques
et des doses réelles de lumières mises en jeu sur le microorganisme. L'évaluation de
l'efficacité décontaminante de la lumière pulsée sur divers microorganismes, et l'influence de
paramètres physiques (longueurs d'ondes, fluence, tension...), environnementaux (surfaces
sèches, milieux gélosés), ou encore physiologiques (spores, cellules végétatives, phases de
croissance...) sera réalisée. L'utilisation des données obtenues par l'étude du pilote permettra
une application au niveau industriel.
2. Démarche expérimentale
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1) Réalisation d’un pilote afin de déterminer l'efficacité de la lumière au niveau

microbiologique
L'étude de la lumière pulsée s'inscrit dans les objectifs de développement de la société

CLARANOR, visant à caractériser et perfectionner les équipements spécifiques à l'entreprise.
Un équipement de laboratoire pilote, utilisant la technologie de lumière pulsée CLARANOR,
a été réalisé, afin de déterminer l'efficacité de la lumière au niveau microbiologique.
L’avantage de cette méthode est de pouvoir contrôler les différents paramètres évoqués dans
la section 4.3. De plus, l’éclairement homogène de la surface d'une boîte de Petri standard (9
cm de diamètre) fut la première condition à vérifier, pour pouvoir étudier l'efficacité
décontaminante de la LP. La réalisation de la machine a nécessité la modélisation d'un
ensemble lampes/réflecteur, par le département recherche et développement de la société. Le
premier article, "A pilot pulsed-light equipment delivering homogeneous fluence for
decontamination of large experimental surfaces" est issu de ces premières étapes. Un
équipement pilote CLARANOR équipé de 3 lampes disposées en parallèle et surmontées d'un
réflecteur en aluminium a permis d’éclairer une large surface. La répartition de la fluence a
été mesurée grâce à un joulemètre, en chaque point de la surface utile et en fonction des
distances entre les lampes et la cible.
Grâce à la caractérisation de la dose de lumière, de sa répartition ainsi que de la
composition du spectre lumineux, les premières expériences de décontamination microbienne
56
ont été possibles. B. subtilis, Bactérie Gram+ sporulante ubiquitaire, bien maîtrisée en
laboratoire, a été choisie comme premier microorganisme d'étude. Une gamme de fluences
délivrées en peu de flashes (moins de 10) s'est avérée efficace. De fortes réductions (allant
jusqu'à plus de 6 cycles logarithmiques) ont été obtenues sur un milieu riche gélosé.
Ce premier article marque la possibilité d'étudier en détails l'efficacité décontaminante de
la lumière pulsée, mais surtout de cibler les facteurs, aussi bien physiques que biologiques ou
environnementaux, pouvant influencer cette efficacité germicide.
2) Influence de la méthode d’inoculation et de la surface
C'est donc naturellement que de nombreux paramètres ont été sélectionnés, afin de
déterminer le comportement des microorganismes dans le plus de conditions possibles. Une
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forte demande d'application de la lumière pulsée sur des surfaces d'emballages alimentaires ou
encore des surfaces industrielles existe. Une des principales activités de la société est basée
sur la décontamination de bouchons plastiques, de préformes de bouteilles, ou encore
d'intérieur de pots de yaourts. L'idée de traiter des surfaces sèches et des surfaces de milieux
gélosés était présente avant même de commencer les travaux de décontamination. L'utilisation
de la lumière comme agent décontaminant a, de manière évidente, une contrainte particulière :
le traitement, que ce soit en UV continus ou en LP, est peu pénétrant. La détermination de
l'efficacité d'un tel procédé sur une surface nécessite l'élimination du biais apporté par les
dépôts de microorganismes en multicouche. Il est utile de tester ce type de traitement sur des
amas de cellules ou de spores, mais il est nécessaire d'avoir tout d'abord une idée de la
décontamination de microorganismes sur surfaces sèches lorsque ceux-ci sont effectivement
exposés au traitement.
Le second article, "Deposition of B. subtilis spores using an airbrush-spray and spots to
study surface decontamination by pulsed light." est le résultat des recherches visant à obtenir
un dépôt de microorganismes en monocouche sur des surfaces telles que le plastique, le verre
ou l'aluminium, matériaux fréquemment rencontrés dans l'industrie. Ces recherches ont
nécessité des tests de différents sprays, dans le but d'obtenir une répartition microscopique en
monocouche. L'article décrit l'utilisation d'un aérographe (pistolet à peinture équipé d'une
buse de sortie de l'ordre de 0.3 mm) comme répondant à la problématique initiale. La
répartition à la fois homogène et en monocouche a été démontrée par des études de
dénombrement, de reproductibilité et de visualisation microscopiques des ensemencements.
57
Les données concernant l'efficacité de la lumière pulsée sur des surfaces plastiques,
aluminium ou verre ont ensuite été exposées, en utilisant une fois de plus les formes sporulées
de B. subtilis.
Les 2 principaux résultats de l'étude ont été :
 la mise au point d'une méthode fiable et reproductible d'ensemencement par spray
de microorganismes sur des surfaces souvent hydrophobes
 la forte décontamination obtenue sur polystyrène par lumière pulsée sur des spores
de B. subtilis, toujours en un nombre limité de flashes (jusqu'à 2).
3) Principaux facteurs influençant l'efficacité germicide de la lumière pulsée
L'objectif général de la thèse, à savoir, évaluer de nombreux facteurs possibles influençant

tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
l'efficacité germicide de la lumière, a donc pu, grâce à ces premiers éléments, être poursuivi.
La connaissance des caractéristiques de l’équipement pilote et le savoir faire mis au point
pour ensemencer des surfaces variées, ont permis d'obtenir un grand nombre de données.
Pour cela, le comportement d'Aspergillus niger, second microorganisme étudié, à pu être
comparé à celui de B. subtilis, pour chacun des facteurs testés. Le troisième article présente
l'étude de l’influence de plusieurs caractéristiques liées au système d’éclairage (dose, quantité
d'UV, répartition de la dose, influence de différentes longueurs d'onde...) et d'éléments
environnementaux liés à la cible (surfaces). Cette étude montre également des comparaisons à
d'autres traitements comme les UV continus.
B. subtilis et A. niger, deux microorganismes très différents sur le plan biologique, et deux
cibles importantes en termes d'hygiène industrielle, ont montré des comportements très
différents. La nécessité d'avoir une vue d'ensemble sur ces facteurs d'influence a entrainé
l’étude de diverses espèces microbiennes, tant au niveau de spores que de cellules végétatives.
Une quinzaine de souches bactériennes ont été les premiers éléments de diversité. Grâce au
nombre important d'expériences découlant de ce travail, des pistes concernant les mécanismes
d'action de la LP, ou les éléments de résistance des microorganismes ont pu être mises en
évidence.
58
4) Une application industrielle
Une étude de la LP en termes de technologie décontaminante appliquée à l'industrie

agroalimentaire valorise les informations présentées dans les articles précédents. Un prototype
dynamique servant au traitement de sirop de sucre à échelle industrielle a été conçu par
CLARANOR. La validation d'un niveau de décontamination supérieur ou égal à 3 cycles
logarithmiques du sirop de sucre flashé de manière continue était nécessaire dans la démarche
commerciale de l'entreprise. La mise au point des protocoles de tests ainsi que les résultats de
décontamination de sirop de saccharose à 65° Brix ont fait l'objet d'un quatrième article:
"Decontamination of sugar syrup by pulsed light". La caractérisation d'une machine
industrielle a été rendue possible grâce à la collaboration du département physique et
microbiologie de l'entreprise, tout autant que pour le démarrage général de l'étude. Les
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
connaissances approfondies en optique et en physique des plasmas, détenues par les

physiciens, ont permis un travail rigoureux, permettant de sortir du contexte empirique,
jusque-là dominant dans la littérature.
59
Résultats: Un équipement de lumière pulsée pour décontaminer de larges surfaces
Résultats
1. Un équipement de lumière pulsée délivrant une fluence homogène

pour la décontamination de larges surfaces expérimentales
La lumière pulsée se définit par des flashes de lumière blanche, produits par une lampe
à xénon, pour décontaminer les aliments, liquides et emballages. Le domaine en longueurs
d'onde émises par les lampes, dépend de la qualité du quartz utilisée comme enveloppe. Il
s’étend depuis l’UV jusqu’au proche infrarouge. Divers articles rapportent une forte efficacité
décontaminante. Les effets de la LP ont été testés sur des aliments, des liquides et des
surfaces, comme par exemple les œufs, le lait ou encore des surfaces inox (Hierro et al., 2009;
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Krishnamurthy et al., 2007; Rajkovic et al., 2010b), ainsi que sur de nombreuses espèces
microbiennes (Farrell et al., 2009). Malheureusement, l'expression des caractéristiques du
traitement varie en fonction de l'équipement utilisé et les paramètres choisis pour définir la
dose ne sont pas systématiquement les mêmes. Les taux de destruction sont souvent exprimés
en fonction d'un nombre de flashs ou de la distance entre les lampes et l’échantillon. Ces
paramètres trop réducteurs permettent uniquement de comparer la sensibilité des différents
microorganismes au sein d'une même étude.
Le but de cet article est de qualifier un traitement de lumière pulsée en s'affranchissant le
plus possible des données empiriques spécifiques à l'équipement utilisé, c'est à dire d'exprimer
une courbe dose réponse en fonction d'une quantité de lumière déterminée quel que soit le
système utilisé. Un pilote de lumière pulsée, fabriqué par la société CLARANOR, a été utilisé
pour définir la dose reçue par une surface cible et pour mesurer son efficacité
microbiologique.
Dans un premier temps, la géométrie de la machine (surface de traitement disponible,
distances minimum et maximum entre lampes et échantillon), ainsi que les caractéristiques
intrinsèques des lampes (taille, tension applicable, spectre émis, quantité d'UV émise) ont été
décrites. La qualification des caractéristiques physiques de la machine a été réalisée grâce à
une collaboration étroite avec les physiciens du département R&D de l'entreprise. La maîtrise
des techniques de mesures a permis la réalisation d'une cartographie 3D du système, qualifiant
la répartition de la fluence (totale ou UV) sur la surface cible, pour chaque tension appliquée.
La quantité d'UV contenue dans les flashes a pu être appréciée grâce à des filtres optiques
(coupant certaines longueurs d'onde) disposés sur le capteur du joulemètre.
60
Grâce à ce travail, l'équipement pilote a été entièrement qualifié, en termes de

composition de la lumière, de répartition de fluence, et ainsi de dose reçue par la totalité de la
surface de traitement. Ces mesures ont pour but d'être transposables à tout type de machine, et
tout type de configuration. La destruction des spores de B. subtilis en fonction de la dose
déterminée par la méthode a été vérifiée pour différentes tailles de surface traitée, afin de
relier la fluence au taux de décontamination et de s'affranchir du facteur machine. La même
courbe dose-réponse a été obtenue, quelle que soit l'aire traitée de 7 à 63 cm². Une surface
plus grande a présenté une légère différence de réduction logarithmique, mais finalement peu
marquée en termes de fluence nécessaire à la réduction de 3 cycles logarithmiques des spores
de B. subtilis. L'expression de la destruction des spores de B. subtilis a démontré une
réduction logarithmique importante (> 6) quelle que soit la taille de la surface traitée (de 7 à
63 cm²). Cette étape a permis de valider l'efficacité d'un traitement de LP et son expression en
fonction d’une grandeur physique universelle pouvant être déterminée sur chaque équipement.
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61
Article 1
A pilot pulsed-light equipment delivering homogenous fluence for
decontamination of large experimental surfaces
Article à soumettre
Abstract
Pulsed light (PL) technology uses intense flashes of broad spectrum white light to kill
microorganisms. Microbial decontamination is often expressed as a function of numbers of
flashes, or distance from the flashlamp. To define treatments and compare efficiency of
different PL equipments, the characteristics of the light flux received by microorganisms have
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to be considered rather than distance from the lamp or lamp input energy. A PL pilot
equipment designed to homogeneously treat a standard surface (3.5 cm to 9 cm diameter agar
plates, and a 10 cm x 9 cm agar surface) was qualified. This equipment allows to express a
bacterial reduction as a function of the light dose actually received by the sample, accounting
for charging voltage, % of UV, and fluence received by the PL treated micro-organism. The
decontamination treatment by the PL equipment was performed on B. subtilis DSM 402
spores spread onto agar surface. A 5-6 log10 reduction in spore counts was obtained with 1-2
flashes.
62
1. Introduction
The first historical uses of light for decontamination purpose were based on the use of
deep UV (namely UV-C) usually produced by mercury lamps. Food, liquids and packaging
decontaminations have been extensively studied since many years (Bintsis et al., 2000; Hijnen
et al., 2006). The mechanism involved in destruction of microorganisms is related to UV
absorption of DNA and cells. Pulsed Light (PL) decontamination has been more recently
discovered and found to be a very efficient process (Gomez-Lopez et al., 2007). PL uses
pulses of white light, produced by a xenon flash lamp to decontaminate food, liquids and
packaging. Wavelength are ranging from 200 to 1100 nm but several works on that topic
report that the deep UV part of the spectrum is the most effective for decontamination
(Gomez-Lopez et al., 2007). Pulses duration is usually less than 1 ms and repetition rate up to
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10 Hz. The PL treatment can last therefore less than 1 s, which presents a considerable
interest in many industrial processes. The effects of the PL have been tested on a wide range
of foods (Gomez-Lopez et al., 2005a; Ozer & Demirci, 2006), solid surfaces such as paper-
polyethylene or stainless steel (Turtoi & Nicolau, 2007; Wekhof et al., 2001; Woodling &
Moraru, 2005), and on many microbial species such as L. monocytogenes, S. aureus, or B.
cereus. (Gomez-Lopez et al., 2005b; Krishnamurthy et al., 2004; Rowan et al., 1999; Uesugi
et al., 2007). Destruction of viruses (Huffman et al., 2000; Roberts & Hope, 2003),
polioviruses and adenoviruses (Lamont et al., 2007) usually inoculated onto the food has also
been studied. PL efficiency for decontamination is rather well documented, but tests showing
PF effects are made on different equipments, and destruction rates are often expressed only as
a function of the number of pulses (proportional to the total energy received by the sample)
(Fine & Gervais, 2004) and/or as a function of the distance from the lamp (negatively
correlated to the energy) (Sharma & Demirci, 2003). Unfortunately number of pulses and
distance to the lamp are not the appropriate parameters: to determine the actual light dose
(fluence) received by the samples the measurements of the physical characteristics energy,
(peak power and emitted light spectra) have to be done. In addition enlightenment
homogeneity is seldom verified. Hence it is never certain that the energy is homogeneously
delivered on the treated surface because of an uneven distribution of light. The study of the
influence of the spectral range for the decontamination (Wang et al., 2005; Wekhof, 2000;
Woodling & Moraru, 2007) shows that the UV range is the most efficient and particularly the
UV-C range. Reliable conclusions on the effects of PL need (i) expression of microbial
63
destruction rates as a function of the received total and UV-C energy and (ii) homogeneous
delivery of PL on surfaces with some practical significance (i.e. larger than a few cm 2). In this
work we present a PL pilot equipment designed to homogeneously deliver light onto large
experimental surfaces (from 5 cm² to 90 cm²), qualified (total energy and spectrum
composition) and tested for microbial killing. Physical parameters will allow to link a fluence
to decontamination rate, which can be adapted for every PL equipment.
2. Materials and methods
1) Flash lamp operation

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PL set up is based on the use of xenon filled flash lamps (CLARANOR, Avignon, France).
Each lamp consists of a 7 mm outside diameter fused quartz tube ended with two electrodes
and filled with 1500 mbar of xenon. The gap between electrodes is 175 mm. Each lamp is
powered by its own capacitor discharging circuit with a serial trigger. Capacitor value is
adjustable, usually 66 µF, and charging voltage is adjustable also from 1000 V to 3000 V.
Consequently the maximum energy stored in the capacitor is 300 J and the optical efficiency
is of the order of 50 %. Taking into account the 250 µs pulse duration the total optical peak
power reaches 600 kW. A typical spectrum produced by these flash lamps is given in figure 1.
It shows that the spectrum is continuous between 160 and 1300 nm and is particularly rich in
UV (up to 20 % for this condition).
64
1,2
Intensity (a.u.) 0,8
0,6
0,4
0,2
0
150 250 350 450 550 650 750 850
Wavelengths (nm)
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Figure 1. Emission spectrum of the flash lamp implemented in the PL equipment - a.u.:
arbitrary units
2) Experimental PL pilot
The PL pilot consists of a stainless steel box containing a three lamps assembly with their
optical concentrating system and an adjustable lab-elevator for placing the samples below the
lamps at the desired distance. The optical system is an assembly of three polished aluminum
reflectors with calculated profile in order to insure an almost uniform fluence on a 10 cm x 10
cm square surface. The choice of aluminum as a material for these reflectors was dictated by
the necessity to have the best reflectivity in the UV part of the spectra since the germicidal
effect is supposed to be mainly related to the UV.
3) Fluence measurement
The fluence is defined as the lighting energy received by the surface unit. Total fluence was
measured with a joulemeter. A Gentec QE 12 LP, 1.1 cm edge square probe connected to a
SOLO 2 Power and Energy meter (Gentec Electro-Optics Inc, Quebec, Canada) was used.
Fluence was directly displayed in J/cm². UV fluence was calculated from the difference
between energy measurements behind colored filters. Long pass colored glass cutoff filters
65
(ORIEL, Stratford, CT, USA) were used. The tested cutoff wavelengths were 225 nm (ORIEL
51215) and 385 nm (ORIEL). The measurement uncertainty with this method is about 20 %.
4) Preparation of B. subtilis spore suspensions

A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30 % (v/v) glycerol solution of B. subtilis
strain DSM 402 (= B. subtilis 168) was inoculated into 10 ml solution of Luria Bertani broth,
and incubated for 16 h at 30°C under gentle shaking. Volumes of 200 µl of this B.subtilis
dense culture were spread on Fortified Nutrient Agar (FNA) plates (Fernández et al., 1999)
and incubated for 7 days at 30°C. After 7 days, spores were detached from FNA plates using
2 x 3 ml of demineralized sterile water. The suspension was centrifuged for 15 min at 7000 g
and the pellet was resuspended in 25 ml of sterile demineralized water. This operation was
performed 3 times. After the last centrifugation, the pellet was suspended for further
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
purification on urographin at 7000 g during 1 h, then three times centrifuged at 7000, 5000
and 4000 g for 15 min, and suspended in 25 ml sterile demineralized water. After the last
wash, the purified suspension was collected in 2 ml demineralized sterile water and stored at
4°C until use. The spore suspension was heated at 70°C during 10 minutes before being used,
to be sure that all the vegetative cells were eliminated. Spore counts were determined by
spreading 100 µl volumes of decimal serial dilutions on duplicate LB Agar plates. The spore
suspension contained 108-109 cfu/ml.
5) PL treatment of surface-spread spore suspension on agar

Volumes of 100 µL of 6-7 decimal serial dilutions of the spore suspension were spread on 9
cm diameter LB agar plates. Spread volumes were 30 µL on 5 cm plates, 15 µL on 3.5 cm
diameter Petri dishes, and 150 µL on 10 cm x 9 cm rectangle agar surface in 14 cm diameter
plates. To prevent germination, spore suspensions were kept on melting ice during
experiments, and each plate was exposed to PL in the 1-2 min following spreading. Surviving
colonies on agar plates were enumerated after 48 h incubation at 30°C. Each experiment was
done in triplicate, each time with an independently prepared spore suspension. The applied
mean fluences were between 0.3 and 1.8 J/cm², under a charging voltage of 2500 V. Multiple
flashes were emitted at one second interval.
66
6) Enumeration of survivors after incubation and determination of reduction

After incubation time, the separate colonies were enumerated, (up to 200 colonies on 9 cm
diameter plates, 450 on 10 cm x 9 cm agar surfaces, 150 on 5 cm diameter plates and 100 on
3.5 cm plates). The threshold of detection of survivors corresponds to one cfu on the lowest
dilution plate.
The equation (1) used to calculate the reduction in spore numbers is:
 N0 
log 10
 reduction   log 10   (1)
 N 
where N is cfu count on PL flashed plates and N0 is cfu count on unflashed plates. The log10
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reduction was expressed as a function of the applied mean fluence under a charging voltage of
2500V.
7) Fitting of log10 reduction curves

A modified Weibull model was chosen to deal with microbial reduction curves (figure 2). The
model of Mafart & Albert (2004) describes sigmoïdal survival curves with a shoulder and
tailing. The equation (2) of the model is:
 
p
 F 
  1  N res  N 
 
NF  F 
log  log  x10  1
  res 
   
10 10 (2)
N0 N0   N0 
 
Where F is the fluence applied (J/cm²), NF is the number of cfu after treatment at a fluence F,
N0 is the initial number of cfu, Nres is the residual bacterial number, F1 is the fluence allowing
the first log10 reduction and p is a parameter which determines the curve convexity or
concavity (upward concavity: p<1, upward convexity: p>1). The model determines the last 3
parameters. Fluences allowing a n log10 reduction were calculated using equation (3):
67
 1

   N res  
p
 1 
 
 N0  (3)
F n  F1   log 
10 
N res 
 n
 
 10  
 
  N0 
 
F1, p and N0 were calculated using the Microsoft® Excel 2002 solver function. Comparison of
the mean of reduction parameters was performed by a one-way ANOVA, followed by a
Tuckey’s Honest Significant Difference test at P = 0.05 (SYSTAT © version 9, SPSS, Chicago,
USA).
0
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2
reduction (log)
7
0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2
mean fluence (J/cm²)
Figure 2. Inactivation of spores of B.subtilis DSM 402 (▲) spread on 9 cm-diameter LB agar
plates as a function of fluence (in J/cm²) emitted by the PL pilot equipment at a charging
voltage of 2500 V. The line represents the fitting of the experimental data (triangles) to the
model of Albert and Mafart (2005).
68
3. Results and discussion
1) Mapping of the total fluence

The optical cavity was designed to deliver an almost homogeneous fluence on a 10 cm x 10
cm surface. Fluence maps were made for charging voltage ranging from 1000 V to 3000 V
and distance between the cavity and the joulemeter probe ranging from 2 cm to 25 cm. A
system of Cartesian coordinates was defined with the x-axis parallel to the lamp axis and the
y-axis perpendicular to it. The point O (x = 0, y = 0, h = 0) corresponds to the center of the
optical cavity. h is the distance from the optical cavity to the point (x = 0, y = 0) (Figure 3).
Fluence measurements were done at points of different coordinates, each separated by 1 cm.
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O
O AR
A
x
x R
FL
F
y
L
h
OC
O
C SS
E
E
Figure 3. Schematic representation of the PL equipment OC: optical cavity; E: electronical

control system (60 x 78 x 60 cm); S: sample location; FL: Xenon flash lamp; AR: aluminium
reflector - x, y and h designate the axis of the system of Cartesian coordinates defining the
position of the sample. The origin O of these coordinates is at the center of the window of the
optical cavity.
69
Figure 4 shows the fluence profiles perpendicularly to the flashlamp axis measured along this
axis every 1 cm. The distance between the front of the optical cavity and the joulemeter was h
= 4 cm and the charging voltage 3000 V. For a 9 cm diameter plate placed at h = 4 cm,
fluctuation of fluence on the y-axis perpendicular to the lamps is ± 21 % and fluctuation on
the x-axis parallel to the lamp is only ± 7 %. The same profiles have been measured at h = 12
cm from the optical cavity (figure 5). The fluence is observed to be more homogenous than in
the preceding measurements. For a 9 cm diameter Petri dish, the fluctuation of fluence on the
y-axis is ± 14 % and only ± 2.5 % on the x-axis
2,5
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2
Fluence (J/cm 2)
1,5
0,5
0
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Y (cm)
Figure 4. Fluence profiles perpendicularly to the lamps (along the y-axis). The distance h
from the optical cavity was 4 cm. The capacitor charging voltage was 3000 V. Fluence
profiles have been done at different positions along the x-axis (parallel to the lamps); the
curves correspond to x = 0 (cm) (●), x = 2 (□), x = -2 (■), x = 4 (Δ), x = -4 (▲).
70
0,45
0,4
0,35
0,3
Fluence (J/cm )
2
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
X (cm)
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Figure 5. Fluence profiles parallely to the lamps (along the x-axis). The distance h from the
optical cavity was 25 cm. The capacitor charging voltage was 3000 V. Fluence profiles have
been done at different positions along the y-axis (parallel to the lamps); the curves correspond
to y = 0 (cm) (●), y = 2 (□), y = -2 (■), y = 4 (Δ), y = -4 (▲).
2) Determination of mean fluence and its standard deviation

To account for the heterogeneity of the fluence, a mean fluence and a standard deviation of
the fluence on a treated area were determined. The area is divided in 1 cm-wide strips
(corresponding approximately to the size of the joulemeter probe).
The equation (4) used to calculate the mean fluence is:
  F xA 
i i
i 1
F  (4)
At
where F is the mean fluence, Fi the fluence of the band i, Ai the area of the band i, and At
the total area of flashed area.
The standard deviation is then calculated using equation (5):
71
 A F 
n
1 2
  i 1
F (5)
Ai i 1
Then, for each charging voltage that determines the spectrum of emitted light, each treatment
will be characterized by a mean fluence, a fluence standard deviation, and minimal and
maximal fluence received by the flashed surface. Those parameters were determined for
surfaces equivalent to that of 3.5 cm, 5 cm and 9 cm Petri dishes and for 10 cm x 9 cm area
(Table 1).
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72
Table 1: Tested fluences and variability for treated areas of different sizes
PL treated Statistic of fluence Measured fluence parameter for a target test fluence (J/cm²):
agar plate parameters on the (number of flashes)
area* treated area
0.3 0.38 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.77
(1) (1) (1) (1) (1) (1) (2) (2)
Diameter Mean (J/cm²) 0,30 0,38 0,51 0,74 0,98 1,29 1,48 1,80
3.5cm Standard deviation 0,00 0,01 0,01 0,03 0,10 0,13 0,06 0,14
Minimum (J/cm²) 0,29 0,36 0,49 0,70 0,86 1,13 1,40 1,62
Maximum (J/cm²) 0,30 0,39 0,53 0,79 1,19 1,55 1,58 2,12
50 cm Standard deviation 0,01 0,01 0,01 0,03 0,11 0,17 0,06 0,13
Minimum (J/cm²) 0,29 0,36 0,49 0,70 0,86 1,08 1,40 1,58
Maximum (J/cm²) 0,30 0,40 0,53 0,79 1,19 1,51 1,58 1,92
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90mm Standard deviation 0,02 0,03 0,04 0,09 0,17 0,19 0,18 0,24
Minimum (J/cm²) 0,26 0,38 0,40 0,55 0,78 0,96 1,10 1,30
Maximum (J/cm²) 0,32 0,41 0,53 0,83 1,34 1,55 1,66 2,12
Rectangle Mean (J/cm²) 0,31 0,38 0,52 0,72 1,02 1,22 1,44 1,71
10 cm x 9 Standard deviation 0,02 0,03 0,05 0,10 0,18 0,19 0,20 0,26
cm
Minimum (J/cm²) 0,27 0,32 0,41 0,55 0,78 0,96 1,10 1,30
Maximum (J/cm²) 0,34 0,41 0,58 0,83 1,34 1,55 1,66 2,12
The center of each area is located perpendicularly to the center of the PL pilot.
3) Influence of the charging voltage and of distance from cavity upon fluence
Average fluence is shown in figure 6 and 7, either as a function of distance h from the front of
the optical cavity or as a function of input energy. The proportionality between the electrical
stored energy and the average fluence received by the treated surface is maintained whatever
the distances to the cavity were (Figure 7). In other words, and as expected, the lamp optical
efficiency does not significantly changes with the input energy. Consequently the value of the
fluence can be known at any point below the optical cavity and for each charging voltage and,
possibly, capacitor value.
73
2,5
Fluence (J/cm²)
1,5
0,5
0
0 5 10 15 20 25
Distance to the optical cavity (cm)
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Figure 6. Influence of the distance h from the optical cavity on the full spectrum fluence. The
curves correspond to charging voltages of 3000 V (■), 2500 V (Δ), 2000 V (●), 1500 V (□),
and 1000 V (▲)
1,8
1,6
Fluence (J/cm²)
1,4
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 50 100 150 200 250 300
Electrical stored energy (J)
Figure 7. Influence of the electrical stored energy on the full spectrum fluence. The curves
correspond to distance from the optical cavity of 4 cm (■), 8 cm (Δ), 12 cm (●), 18 cm (□), 20
cm (▲), and 25 cm (○)
74
4) Determination of the UV fluence

The role of UV in the decontamination process is assumed to be decisive (Wekhof, 2000).
The total UV (from 200 to 400 nm) and the UV-C (from 200 to 280 nm) content of the
fluence were therefore specifically measured as a function charging voltage and distance from
optical cavity. The light arriving onto a sample comes partly directly from the lamp and partly
from reflection on the aluminum reflectors. Since reflection on aluminum is wavelength
dependant, the UV content of the light received by any sample could depend on the ratio of
direct light over reflected light, which depends itself on the location of the sample with
respect to the lamp. Table 3 shows the total UV content of light for different distances and
locations of the detector. Accounting for the accuracy of these measurements, it appears that
this UV content does not depend of the location of the sample from 4 cm from the optical
cavity up to 25 cm from it. The role of charging voltage on the total UV content has been
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studied using a cutoff filter method (table 4). Total UV content is found to be proportional to
the charging voltage, which in turn means that this UV fluence is proportional to the cube of
the charging voltage keeping the capacitor value constant.
Table 3. Total UV content (%) as a function of sample positiona

x,y co- Total UV content as a function of the distance h to the
ordinates (cm)b optical cavity
h = 4 cm h = 12 cm h = 25 cm
(0,0) 18.5 20.5 20
(4,0) 19.5 19 19.5
(-4,0) 19.5 18.5 20
(0,-4) 20.5 20.1 20
(0,4) 20 20 20
(2,-2) 16.5 21 20.5
(-2,2) 18 19.5 19
a
The Charging voltage is 3000 V, with a capacitor value of C = 66 µF
b
The system of Cartesian co-ordinates defines the position of the sample. The x-axis is parallel to the lamps, the
y-axis is perpendicular to the lamps. The point (x = 0, y = 0) is the projection of the center of the optical cavity
on the sample plan. h is the distance from the optical cavity to the point (x = 0, y = 0).
75
Table 4: Percentage of UV (wavelength 225 nm to 385 nm) in the pulsed light delivered by
the PL equipment. The distance to the optical cavity was h = 15 cm
Charging Input Fluence<[180-1300nm]> Fluence<[225-385nm]> %UVa
voltage energy (mJ/cm2) (mJ/cm2)
(V) (J)
3000 297 630 140 22
2000 132 260 40 15
1500 74,25 130 15 11,5
1000 33 60 5 8
a
%UV = 100 x Fluence<[225-385nm]>/ Fluence<[180-1300nm]>
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5) Killing of Bacillus subtilis spores by PL treatment

The survival curve of B. subtilis spores spread on a 9 cm diameter Petri dish had a sigmoid
aspect, with a reduction greater than 5 log10 reduction as the mean fluence increased from to 0
J/cm² to 1 J/cm². There was a tailing effect between 1 and 1.77 J/cm². Similar reduction
curves were obtained with the three replicate spore preparations. Observation of 14
microscope fields at a X1000 magnification of, each covering 100 to 350 B. subtilis spores,
did not reveal any spore clump on the agar plates. Therefore the majority of spores were
directly exposed to light. The tail observed on the reduction curves may be due to cell
clumping (not detectable under the microscope) of only a small part of the bacterial
population, or to a resistant subpopulation of cells. Survival curves were performed with
spores spread on 3.5 cm and 5 cm diameter plates, and on a 10 cm x 9 cm surface (Figure 7).
76
2
reduction (log)
7
0 0.5 1 1.5 2
mean fluence (J/cm²)
Figure 7. Inactivation of B.subtilis DSM 402 spores as a function of the mean fluence
delivered on 9 cm diameter (□), 5 cm diameter (■), 3.5 cm diameter (○) and rectangular 10
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cm x 9 cm (▲) agar plates. The charging voltage was 2500V. The lines show the mean of the
reduction obtained at each fluence on n = 3 replicate experiments made with independently
prepared spore suspensions. Bars show standard deviation. See the Results and Discussion
section for calculation of the mean fluence on the treated surfaces.
The microbial inactivation curves as a function of the mean fluence for each size of agar
plates were similar to that obtained on the 9 cm diameter agar plates, following a sigmoid,
with a marked reduction as mean fluence increased from 0 J/cm² to 1 J/cm² and a tail effect
for mean fluences greater than 1 J/cm². The tail level was slightly higher on the 10 cm x 9 cm
surface. There was no significant difference (Tukey’s HST at P < 0.05) in F1 between all the
treated areas. For F3 and F5 of spores inoculated on the 10 cm x 9 cm surface were slightly
lower. However, although significant, the differences in F3 (0.53 J/cm² vs. 0.64 J/cm²) were
low (Table 5). In conclusion, the mean fluence received by the treated surface, as determined
in this work, is a relevant and satisfactory parameter to qualify the energy dose emitted by PL
pilot treatment. The efficiency and the obtained reduction do not depend on the geography of
the treated surface in a range 7 cm2 to 90 cm2.
77
Table 5: Fluences allowing 1 log10, 3 log10 and 5 log10 reduction of spores of B. subtilis DSM
402
PL treated agar plate Fluence (J/cm2) allowing a log10 reduction of:
area
1 3 5
Diameter 3.5 cm 0.28 a 0.64 a 0.98 a
Diameter 5 cm 0.25 a 0.6 ab 0.91 a

Diameter 9 cm 0.23 a 0.53 b 0.8 a
Rectangle10 cm x 9 cm 0.24 a 0.73 c 1.34 b
In each column, fluences followed by the same letter are not significantly different at p < 0.05
(Tukey’s HSD test). Experiments were performed in triplicate with independently prepared
spore preparations
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4. Conclusion
It is worth noting that the several log10 reduction obtained with PL lamps was obtained with
one or two flashes only. For example, Gomez-Lopez et al., (2005a) obtained a 5.9 log10
decontamination of B. cereus spores at a distance of 8.4 cm to the lamp, a distance close to
those applied in this work, with PL 50 flashes. This high number of flashes is quite common
in previous works (Farrell et al., 2009; Gomez-Lopez et al., 2005b) . Further comparisons
with previous works on PL efficiency are difficult: different strains tested, different light
sources, electronics, and light concentration systems are used. However the high reductions
have been obtained in one or two flashes, on surfaces convenient to perform experiments with
classical microbiology tools (i.e. standard diameter Petri dishes), independently of the area of
the treated surface, and expressed as a function of the light energy (and not of the irrelevant
distance to the lamp or number of flashes). This demonstrates that the PL pilot equipment
described in this work is particularly suitable for further investigation on PL efficiency of for
industry applications and on PL mechanisms involved in microbial decontamination.
Acknowledgements:
This work is a partial fulfillment of author’s C. Levy PhD Thesis. She has received a grant
from the Association Nationale de la Recherche et de la Technologie, Paris, France.
78
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Listeria innocua using broad-spectrum pulsed light. Journal of Food Protection 70, 909-916.
80
Perspectives issues du travail présenté dans l’article 1
Le réflecteur de la machine pilote CLARANOR utilisée dans ce travail, a été conçu et

dessiné par des méthodes graphiques traditionnelles sur la base des principes géométriques de
réflexion de la lumière. Les mesures de la fluence obtenues avec ce réflecteur ont montré que
la surface de travail était éclairée de manière relativement homogène. La décontamination
obtenue avec cette machine était indépendante de la taille de la surface traitée, dans un
périmètre défini. Ces deux résultats illustraient le bon accord entre le principe théorique de la
configuration des réflecteurs et leur efficacité réelle, malgré quelques défauts, notamment des
variations de fluence accentuées lorsque l'échantillon est près des lampes (moins de 5 cm). En
revanche, les faibles fluences, obtenues pour une grande distance lampes/échantillon,
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
montrent une meilleure homogénéité sur la surface traitée. De nouveaux outils de simulation
optique sont désormais utilisés. Deux logiciels de simulation optique, APILUX et OPTILUX,
permettent de modéliser les nouveaux réflecteurs, de calculer l’éclairement au niveau des
surfaces à décontaminer. Cet outil de prévision de la répartition de fluence a remplacé la
méthode consistant à réaliser des séries de mesures fastidieuses, limitées à la validation des
prévisions. De plus, sur la base des relations dose-réponse établies dans ce travail, le
programme informatique permet également une prévision du niveau de décontamination par
le système.
APILUX (O++, Lille, France) est un logiciel de simulation optique qui permet de calculer
l’éclairement sur une surface cible, à partir de la modélisation d'un système lampes/réflecteur.
OPTILUX utilise les courbes dose/réponse propres à un microorganisme et un type de surface
pour donner la réduction logarithmique. APILUX calcule des éclairements sur des surfaces
pour lesquelles il est possible de définir une grande résolution (dimension des pixels de
l’ordre du micromètre). OPTILUX utilise ces éclairements pondérés de manière
logarithmique afin de donner une réduction locale (une région de la surface) et globale (toute
la surface). Le processus est itératif et permet donc d’optimiser une forme de réflecteur à
partir des calculs précédents. La modélisation s'effectue selon une procédure dont les
principales étapes sont les suivantes :
 Une source lumineuse est simulée. Toutes les caractéristiques des lampes sont définies
(épaisseur du quartz, longueur de la lampe, spectre émis, énergie électrique injectée
dans la lampe).
81
 Une première forme de réflecteur est ensuite dessinée. Les propriétés optiques du
matériau constituant le réflecteur sont mesurées (coefficients de réflexion dans le
visible et dans l'UV).
 Le support de l’échantillon est modélisé. Ses propriétés optiques ont été mesurées et
sont entrées dans le programme. Il est placé à la distance spécifiée pour le traitement.
 En fonction de ces éléments, le logiciel APILUX calcule l'éclairement sur la surface.
Cela permet d'apprécier la répartition de l’éclairement reçu sur une surface cible, avant
l’optimisation du réflecteur. Le logiciel OPTILUX calcule la réduction logarithmique
pour un jeu de paramètres du réflecteur. De très nombreuses formes de réflecteurs sont
possibles. Le logiciel établira pour chaque configuration une valeur d'efficacité. Le
choix se portera donc sur la forme permettant la meilleure réduction logarithmique
théorique.
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Grâce à ces avancées, il est possible de créer des équipements de lumière pulsée,
spécifiques à la forme géométrique du produit à traiter, et d'en apprécier l'efficacité. Le
réflecteur 3 lampes utilisé en laboratoire a ainsi pu être optimisé (figure 13) et la cartographie
de fluence précisément représentée (figure 14). L'optimisation de la forme géométrique des
réflecteurs a permis une répartition de fluence très homogène, et ceci quelle que soit la
distance entre les lampes et la surface cible.
A
B
C
D
E
Figure 13: Schéma du système lampes-réflecteur optimisé: Lampes (A) Réflecteur (B) Plaque
de quartz (C), distance entre le système lampes-réflecteur et la surface cible. (variable) (D),
surface cible (E)
82
A B
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Figure 14: cartographie de fluence reçue par la surface cible pour D= 4cm (A) et D = 14 cm
(B) Les coordonnées x et y correspondent aux distances (en mm) par rapport au centre du
système 3 lampes.
La prévision d'une efficacité pour n'importe quelle surface n'est possible que si la courbe
expérimentale de réduction logarithmique a été établie en fonction d'une fluence donnée, pour
un microorganisme et une surface cible. Le travail de détermination de l'efficacité germicide
de la lumière pulsée dans les conditions maîtrisées a donc été primordial pour mettre au point
ces nouvelles techniques d'optimisation. Les données microbiologiques nécessaires au
fonctionnement de ces outils ont été réalisées sur le pilote CLARANOR, présentant des
fluctuations à fluence élevée. Cependant, le paramétrage du logiciel nécessitait de connaître la
relation dose/réponse pour des faibles énergies, c'est-à-dire des fluences inférieures à 0.5
J/cm². Pour cette gamme de fluence, la répartition de l'énergie est relativement homogène,
avec moins de 20% de variations. Néanmoins, les données microbiologiques disponibles sont
encore peu nombreuses.
Bien que ces travaux aient permis une réelle avancée en termes de développement des
équipements, ils ne sont encore que des simulations, applicables sur des surfaces à géométrie
simple. En effet, certaines formes géométriques ne permettront pas une illumination totale de
la surface, et ce quelle que soit la forme du réflecteur. De plus, ces prévisions de
décontamination considèrent une répartition homogène des microorganismes sur la surface
83
ciblée, ce qui n'est pas toujours le cas. La décontamination déterminée grâce aux logiciels
devra dans chaque cas être validée expérimentalement par des tests microbiologiques.
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84
Résultats: Inoculation par spray et décontamination de surfaces par lumière pulsée
Résultats
2. Une méthode d'inoculation par spray pour étudier la

décontamination de surfaces par la lumière pulsée
Les exigences d’hygiène des industries alimentaires ou pharmaceutiques comprennent la

décontamination des surfaces des équipements, des lieux de transformation ou des matériaux
de conditionnement. La capacité de contaminer artificiellement des surfaces de manière fiable
et reproductible est une étape importante dans la détermination de l'efficacité d'un traitement
de surface. La détection ainsi que la récupération des microorganismes inoculés sur une
surface peuvent entraîner une mauvaise estimation de l'efficacité d'un traitement. La capacité
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d'adhésion des microorganismes est un facteur réduisant l'efficacité de récupération. L'étude

de certaines technologies de décontamination de surface, telles que le laser, les UV continus,
ou la lumière pulsée, nécessite une optimisation de l'inoculation ainsi que de la récupération
des cellules après traitement. De nombreuses surfaces industrielles sont susceptibles d'être
contaminées et soumises à de fréquents contrôles. Elles peuvent avoir des propriétés ainsi que
des topographies très différentes. Ces surfaces peuvent être contaminées de différentes
manières, soit par gouttelettes, soit par aérosols.
Le but de cet article est de comparer l'efficacité d'un traitement de lumière pulsée pour
décontaminer des spores de B. subtilis sur une surface polystyrène (PS), inoculées soit par un
dépôt de gouttelettes d’une suspension bactérienne, soit par pulvérisation à l’aide d’un pistolet
à peinture miniature ou aérographe, utilisé dans le modélisme. La décontamination par
lumière pulsée sera évaluée afin de mettre en évidence l'influence du type d'inoculation sur
l'estimation de l'efficacité du traitement.
Dans un premier temps, la répartition des microorganismes (obtenue par pulvérisation ou
par dépôt de gouttelettes) a été observée par microscopie électronique à balayage. L'impact du
protocole d'inoculation par spray sur la survie des microorganismes a été déterminé, afin de
vérifier l'absence de biais dû à la méthode. L’efficacité décontaminante de la LP a enfin été
établie pour chaque méthode d'inoculation utilisée.
Une monocouche de microorganismes a été obtenue lors de l'inoculation par spray,
indépendamment de la concentration de l'inoculum, grâce à une répartition du spray sur une
large surface. L'obtention d'une monocouche lors d'une inoculation par gouttes est limitée à
85
une plus faible concentration, en particulier pour des suspensions aqueuses déposées sur une
surface hydrophobe, du fait du faible étalement de la gouttelette. La méthode d'inoculation par
spray s’est avérée simple à mettre en œuvre, capable de produire des niveaux de
contamination reproductibles, peu coûteuse et fiable.
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86
Article 2
Deposition of B. subtilis spores using an airbrush-spray and spots
to study surface decontamination by pulsed light.
Article soumis
Abstract
Microbial contamination on surfaces of food process equipments is a major concern in

industries. A new method to inoculate a single-cell layer of microorganisms onto polystyrene
was developed, using a deposition with an airbrush. A homogeneous dispersion of B. subtilis
DSM 402 spores sprayed on the surface was observed using both plate count and scanning
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electron microscopy. No cluster was found, even with a very high spore concentration (10 7
spores/inoculated surface). A similar monolayer of microorganisms was obtained after
deposition of 10 µL droplets containing 3 x 104 spores/spot on polystyrene coupons, but not at
higher concentrations. Pulsed light treatment on monolayers of B subtilis spores can lead to a
decontamination higher than 6 log reductions. As a consequence of clusters formation for
spots containing more than 3 x 105, log reductions obtained by PL were significantly lower.
The comparative advantages of spot and spray depositions are discussed.
87
1. Introduction
Microbial contamination on surfaces of food process equipments is a major concern, for

food industry, catering companies and domestic hygiene. Surface contamination can lead to
cross-contaminations of foods with pathogenic or spoilage microorganisms (Kusumaningrum
et al., 2003). Major foodborne pathogens, such as B.cereus, E.coli, L. monocytogenes, have
pronounced abilities to adhere to equipment surfaces and their survival can be influenced by
the physical and chemical properties of the surface (Barnes et al., 1999; Faille et al., 2002;
Peng et al., 2001). Microbial decontamination of surfaces using varied technologies, such as
application of chemicals, laser, UV, or Pulsed light (PL) treatment has been extensively
studied (Bloomfield & Scott, 1997; Christofi et al., 2008; Watson et al., 2005; Woodling &
Moraru, 2005). Some of these technologies such as UV and pulsed light are non penetrating
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and the experimental assessment of their decontamination efficiency requires the production
of a single-cell layer (monolayer). The deposition of single-cell layers has been performed
with aerosol chambers (Brown et al., 2007), or a dry aerosol deposition device (Heimbuch et
al., 2009). Most of the experiments use spot depositions and recovery methods to remove
microorganisms from the surface after the tested treatment (Brown et al., 2007; Horneck et
al., 2001; Turtoi & Nicolau, 2007; Watson et al., 2005; Woodling & Moraru, 2005). The aim
of this work was to compare the PL decontamination obtained on a polystyrene (PS) surface
using a droplet deposition (spot) method (quite commonly used) and an airbrush spray
deposition method (expected to create an homogeneous monolayer of microorganisms on the
target surface). Then a Pulsed Light treatment was performed to compare the surface
decontamination rate of Bacillus subtilis spores deposited using the spray and the droplet
methods.
2. Materials and methods:
1) Preparation of B. subtilis spore suspensions

A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30 % (v/v) glycerol solution of B. subtilis
strain DSM 402 (B.subtilis 168) was inoculated into 10 mL solution of Luria Bertani (LB)
broth, and incubated for 16 h at 30°C under gentle shaking. Volumes of 200 µL of this B.
88
subtilis culture were spread on Fortified Nutrient Agar plates (Fernández et al., 1999), then
incubated for 7 days at 30°C. After 7 days, spores were detached from FNA plates using 2 x 3
mL of demineralised sterile water. The suspension was centrifuged for 15 min at 7000 x g and
the pellet was resuspended in 25 mL of demineralised sterile water. This operation was twice
performed. Then, the pellet was resuspended and twice centrifuged at 5000 x g and twice at
4000 x g for 15 min. After the last wash, the purified suspension was collected in 2 mL of
demineralised sterile water, stored at 4°C and pasteurised (70°C-10 min) then spore counts
were determined by spreading 100 µL volumes of decimal serial dilutions on duplicate LB
Agar plates. The spore suspension contained 108-109 cfu/mL.
2) Spray inoculation on dry surfaces with the airbrush

The spray inoculation was performed with a Mecafer AG-1 airbrush (MECAFER SA,
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Valence, FRANCE), connected to a compressor delivering compressed air at 2.5 x 105 Pa (the
working pressure recommended by the manufacturer is between 2 x 10 5 Pa and 3 x 105 Pa).
The airbrush is equipped with a 2 mL tank. The liquid flow is adjusted in varying nozzle
opening. The tank was filled with 100 µL of the spore suspension. Volumes of 100 µL of 2-
fold or 10-fold serial dilutions of a spore suspension initially containing 108-109 cfu/mL were
sprayed on empty Petri dishes placed vertically and perpendicularly to the spray direction.
The serial dilutions were sprayed from the most diluted to the less diluted. As a polystyrene
surface the bottom of a 9 cm diameter Petri dish was used. The airbrush was placed at about
20 cm from the Petri dish, and the liquid was sprayed as a fog (manual spraying). Flow rate
was adjusted to obtain the thinnest possible fog (at the limit of detection by eye). The 100 µL
spore suspension contained in the tank was sprayed onto the bottom of one Petri dish. After
use, the airbrush was autoclaved, and changed after 20 autoclaving cycles before corrosion
onset.
3) Spots inoculation of dry surfaces

Volumes of 10 µL of 10-fold dilutions of a B. subtilis spore suspension in sterile distilled
water or in a sterile hydro-alcoholic solution (ethanol 50 %, v/v) were placed as single spots at
the center of a 1 cm diameter PS coupon. The diameter of the spots made with the water
suspensions was measured under the microscope (Olympus BX50 Rungis, France). Each
covered approx.0.09 cm2. The tested concentrations of the spots varied from approximately 3
89
x 106 to approximately 3 x 104 spores per spot, i.e. from 3 x 107 to 3 x 105 spores/cm2). The
deposited suspension was dried during 24 h under a laminar flow hood.
4) Scanning electron microscopy

B.subtilis spores were spread (by spray or spots) on 1.2 cm diameter PS coupons, and dried
during 24 h at room temperature under a laminar flow hood. The coupons were then pasted on
a metallic support, and gold plated before being observed by scanning electron microscopy at
10 kV.
5) Recovery procedure and enumeration of microorganisms

After spray inoculation, plates were dried for 24 h at room temperature then filled with 20 mL
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of molten LB agar at approx. 50°C. Plates were incubated during 48 h at 30°C before colony
counting.
In order to detect an eventual effect of drying time on Bacillus subtilis recovery, spores were
sprayed on the PS plate surface, then dried during 1 h and 24 h before addition of molten LB
agar. Counts of spores sprayed on LB agar plates, sprayed and dried on PS plates during 1 h
or 24 h before addition of molten LB agar, were not different in three independent
experiments, each performed with at least three replicated plates for each test condition (data
not shown). The addition of molten agar at approx. 50°C had also no effect on the
cultivability of the B. subtilis spores (data not shown). The coupons inoculated by spots were
individually placed in sterile tubes containing 2 mL of sterile water, then vigorously shaken
by vortexing during one minute at room temperature to detach spores from the coupons.
Volumes of 100 µL of serial decimal dilutions of this recovery solution were spread on LB
agar plates. The plates were then incubated at 30°C during 48 h before colony counting. The
percentage of recovery was equal to (N0/N) x 100 where N0 is the count of deposited spore
and N the count of spores recovered after detachment
.
6) Pulsed Light treatment

PL was delivered by a lab-scale PL pilot equipment (CLARANOR SA, Avignon, France).
Short pulses (duration 250 µs) of broad spectrum (200-1100 nm) white light rich in UV (200-
400 nm) are produced by xenon flashlamps. The PL fluences (PL doses) were from 0.3 J/cm²
90
to 1.25 J/cm² (delivered in 1 flash) and 1.8 J/cm² (delivered in two flashes at 1 s interval).
Unflashed samples were used as controls. For the tested plates or coupons, the PL treatment
was performed immediately before the media addition (spray method) or the recovery step
(spot method) used to determine the number of surviving B. subtilis spores. The reduction was
expressed as log10 N0/N, where N0 is the initial concentration of the sprayed or spotted spore
suspension and N the number of surviving spores, as a function of the applied fluence. The
threshold of detection of survivors corresponds to one CFU on the lowest dilution plate.
7) Statistical analysis
The mean values and standard deviation were calculated from data obtained from at least
three independent experiments (different dates, different B. subtilis spore preparations).
Means were compared by Student's t-test or by Tukey's Honest Significant Difference test
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(SPSS Systat version 9, Chicago, USA).
3. Results
1) Surface dispersion of sprayed and spotted B. subtilis spores

Visual observation of colonies formed after spraying of LB agar plates and scanning electron
microscopy of spores sprayed on polystyrene both showed a homogeneous dispersion of
spores on the sprayed surface (Figure 1). Spores are often side by side on all observed sprayed
areas, representing several hundreds of sprayed spores, and are deposited in a single-cell layer
(monolayer). This monolayer distribution was found on all observed areas (13 observed
fields, from 100 to 330 spores per field). Spores being in the shade of other spores have never
been detected among the 2857 observed spores. Consequently most sprayed spores should be
directly illuminated by PL. Figure 2 shows the dispersion of spotted B. subtilis spores in a
water suspension, at different concentrations, on PS surface. A 10µL spot containing about
106 bacterial spores clearly shows a non homogeneous dispersion, with large spore clusters
especially in the outline of the spot. A 10 µL spot containing about 105 spores also shows
large clusters in the outline of the dried drop (not shown). A spore monolayer of spotted
spores was observed only with 10 µL spots containing about 104 spores and in this case no
cluster was observed.
91
A B
A B
C D
D
C
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Figure 1. Dispersion of spores of B. subtilis sprayed on polystyrene Petri dishes.

Colonies were formed after 24 h incubation at 30°C from a spore suspension sprayed on the dish, dried for 24 h,
and covered with molten LB agar. Volumes of 100 µL of the 10-3 (A) 10-4 (B) dilutions of a spore suspension
containing 108 B. subtilis spores/mL were sprayed. The pictures C and D show the Scanning Electron
Microscopy of 100 µL of B.subtilis spores at a concentration of 108 spores/mL sprayed on polystyrene surface at
X 500 (C), and X 20000 (D) magnifications
92
A A B
B
C D
C D
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Figure 2. Scanning Electron Microscopy pictures of 10 µL spots of a B. subtilis suspension in

sterile distilled water containing 106 spores/spot at X 100 (A), and X 8000 (B) magnifications
, and 10 µL spots containing 104 spores/spot at X 100 (C) and X 8000 (D) magnifications
2) Reliability of the enumeration of sprayed and spotted B. subtilis spores

Volumes of 100 µL were sprayed on agar plates and on PS Petri dish. The comparison
between counts made with deposited and rake spread 100 µL volumes, and sprayed 100 µL
volumes showed that only approx. 20 % of the sprayed volume actually comes into contact
with the target surface (the agar plate or the Petri dish) (data not shown). However, despite
this loss due to spray dispersion, replicate sprays with a given spore suspension gave a
consistent number of colonies: the percentage standard deviation on several (5 to 10) replicate
log10-transformed colony counts comprised between 10 and 450 colonies per agar plate was
always lower than 8 %. In addition the spore loss by spray dispersion is independent on the
spore suspension concentration: There was a linear relation between the log 2 dilution of the
B.subtilis suspension sprayed on plates and the log2 of the concentration evaluated by plates
count. The slope of the linear regression curve was -1.05, which is not different from -1 at P >
0.9 according to its confidence interval.
For the spot method, drops of 10 µL of the B. subtilis spore suspensions in water at mean
concentrations of 3 x 106, 3 x 105 and 3 x 104 spores per spot were deposited onto the surface
93
of polystyrene 1 cm diameter coupons. The percentage of recovery of the spot-deposited and

detached spores were 94.2 %, 89.1 % and 70.4 % for 3 x 106, 3 x 105 and 3 x 104 spores per
spot respectively. These % of recovery of B. subtilis spores are in the higher range of the % of
recovery obtained after detachment of B. atrophaeus spores from different surfaces and using
different methods (Edmonds et al., 2009). The variability in the % of spore recovery was
markedly higher when deposited at the lowest concentration tested (Table 1).
Table 1: % of recovery of B. subtilis spores deposited on polystyrene coupons

Initial concentration % Recovery Reproducibility
a
B. subtilis spores / 10 µl spot Mean (SD) CV (%)
3 x 106 94.2 (2.3) 2.4
5
3 x 10 89.1 (1.4) 1.6
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4
3 x 10 70.4 (10.6) 15.1
a
n = 10
b
coefficient of variability
3) Pulsed Light efficiency

Figure 3 shows the survival curves of B.subtilis spores sprayed on polystyrene surface using
the spray method with spore suspension at two concentrations (approximately 5 x 107
spores/ml and 5 x 108 spores/ml, which gave spore densities on plates of 1.5 x 10 4 spores/cm2
and 1.5 x 105 spores/cm2). A log reduction higher that 5, was obtained with a single flash at
0.75 J/cm². There was no significant difference at all tested fluences in the log reductions
obtained from the two inoculum concentrations (Student's t-test, p<.0.05). Consequently the
PL inactivation was independent of the inoculum concentration, when sprayed.
94
2
Reduction (log)
3
7
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Fluence (J/cm²)
Figure 3. Inactivation of spores of B.subtilis DSM 402 sprayed on 9 cm diameter polystyrene

Petri dishes as a function of fluence (in J/cm²) emitted by the PL pilot equipment. The curves
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correspond to the quantity of spores sprayed on the dish: about 10 7 spores per plate (●) and
about 106 spores per plate (□).
Figure 4A shows a comparison between the inactivation rate of B. subtilis spores inoculated
on LB agar by the spray method and the inactivation rate obtained by the manual rake
spreading. Both log reduction curves of B.subtilis spores were almost identical, showing that
there were fully independent on the inoculation method of the treated surface (no significant
difference at all tested fluences; Student's t-test, p > 0.05).
Using the deposition on PS coupons by spots (figure 4B), log10 reduction of B.subtilis spores
in water suspension was lower than 2 at the maximal tested fluence (1.8 J/cm2) and with a
spore concentration of 3 x 106 spores per spot, close to 4 with a spore concentration of 3 x 104
spores per spot (significant differences for all tested fluences, Tukey's HSD P < 0.05) .The log
reduction obtained with the intermediate spore concentration (3 x 105 spores per spot) did not
exceed 3. The inactivation by PL of spores deposited in spots was much lower (maximum 4
log reduction instead of nearly 6 log reductions) and much more variable (markedly higher sd
on the reduction at each tested fluence) than the inactivation obtained with sprayed spores
(Figure 4A). SEM indicated a high number of spore clusters at concentrations of 3 x 106
(Figure 2) and 3 x 105 spores per spot (NOT SHOWN). At a concentration of 3 x 104 spores
per spot, SEM images did not reveal any cluster formation. The log reduction is totally
dependent on the spot concentration and was found between the 3 curves.
95
1
A
2
reduction (log)
3
7
0 0.5 1 1.5 2
Mean fluence (J/cm²)
0
B
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
1
Reduction (log)
5
0 0.5 1 1.5 2
Mean Fluence (J/cm²)
Figure 4. Inactivation of spores of B.subtilis DSM 402 suspended in water inoculated on LB

Agar media, by the spray method (●) and the manual spreading method with rakes (○) (A),
and inoculated by spot at concentrations of 3 x 106 (●), 3 x 105 (□) and 3 x 104 (▲) spores per
10 µl spot on a polystyrene surface (B), as a function of fluence (in J.cm-²).
Spotting spores in a hydro-alcoholic suspension allowed the formation of a cell monolayer at

spot concentrations of 5 x 104 and 5 x 105 spores per 10 µL spot. Consequently, the
inactivation by PL of spores deposited in spots in a hydro-alcoholic solution was very similar
for both concentrations (and not different to the decontamination of spots in a water solution
at a concentration of 3 x 104 spores per 10 µL spot, Student t-test, P > 0.05). The inactivation
96
by PL of spores deposited in a hydro-alcoholic solution was significantly lower (Student t-

test, P < 0.05) for spot concentration of 5 x 106 and SEM images showed a pronounced
cluster formation (data not shown).
4. Discussion
Both spot and spray inoculation techniques allowed a rather satisfactory spreading, i.e. a B.
subtilis spore deposition as a monolayer. However, using the spot inoculation, a spore
monolayer was successfully obtained only with a spore suspension containing 3 x 10 4 spores
per 10 µL spot; there were clusters of several layers of spores with 10 fold and 100 fold
higher spot concentrations. In contrast, with the spray technique, a concentration of up to 10 7
spores per sprayed area gave a spore monolayer on a hydrophobic material. The spray
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inoculation technique allows a better estimation of the PL treatment efficiency, because

survival was followed on at least a 6 log reduction. Despite the fact that microbial
contaminations encountered in the food industry are not necessarily as cell monolayers, such a
spray spreading method is necessary to evaluate the decontamination efficiency of some
poorly penetrating treatments, such as UV or PL. In particular, the spray method allows to
focus on the interactions between adhering cells and surfaces, which may have different
optical properties (reflectivity, absorbance) determining the decontaminating effect of the
treatment (Woodling & Moraru, 2005). Spot deposition has shown some limitations. Because
of cluster formation the evaluation of the efficiency of a PL treatment will not be independent
of the spot concentration. The polarity of the spore suspension liquid and the hydrophobicity
properties of the surfaces may influence the spreading of high concentrated spots. This was
shown for instance in this work using spore suspensions in a hydro-alcoholic solution instead
of a water solution. However, in poorly favourable situations (water on polystyrene),
spreading with a spray deposition as a homogeneous monolayer was successful on a large
surface.
Airbrush is cheap and easy to purchase. The one used in this work was bought in a do-it-
yourself centre. Despite an inoculation performed by hand, the concentrations of the sprayed
inoculums have been consistently found to be reproducible. In addition spore counts have
been performed by direct spreading of molten agar onto the sprayed and PL treated surface.
This avoided a time consuming and tedious detachment procedure, which lowers the
sensitivity of the enumeration method because of a partial recovery of deposited spores. The
97
ability of some spores to attach to the surface (Faille et al., 2002; Peng et al., 2001) could
explain the difficulties to detach them from polystyrene. Survivors counts without detachment
can circumvent growth alterations of the treated surface by PL which could lower spore
detachment. Such alterations have been shown for instance on PET coupons inoculated with
A.niger spores, displaying craters around spores due to PET melting after PL application
(Wekhof et al., 2001). A spraying method should be highly recommended when cells have to
be inoculated as a monolayer on large surfaces of food industry equipment or packaging. This
has been shown in this work to be particularly determinant in the assessment with a high
sensitivity (up to 6 log reductions) of the efficiency of decontamination by PL on surfaces.
In conclusion the challenge tests of microorganisms deposited onto surfaces and treated by PL
can be satisfactorily performed using both inoculations by spots and by spray. Nevertheless,
the assessment of the actual decontamination rate strictly due to PL is strongly dependant on
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
the quality of the dispersion of the inoculum on the surface. The spray inoculation, in addition
to the relative convenience of use, has been consistently shown to be more sensitive and
reliable.
Acknowledgements:
This work is a partial fulfillment of author's C.Levy PhD Thesis. She has received a grant
from the Association Nationale de la Recherche et de la Technologie, Paris, France. The
authors wish to thank Claire Bérard for skilful technical assistance.
98
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99
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100
Données complémentaires
Décontamination de spores de B.subtilis inoculées sur polystyrène par la méthode de spots

alcooliques
Les résultats concernant la décontamination par lumière pulsée de spores de B. subtilis

inoculées par spots hydro-alcooliques sur polystyrène sont présentés ici. L’utilisation de
solutions hydro-alcooliques pourrait optimiser l’étalement du spot, en raison de
l’hydrophobicité de la surface. Le pourcentage de récupération des spores déposées par spots
de 10µL en solution hydro-alcoolique a donné sensiblement les mêmes résultats que dans le
cas des spores en suspension dans l'eau pour les fortes concentrations. En revanche, pour un
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
ensemencement à 5 x 104 spores par spot, le pourcentage de récupération est plus élevé dans
le cas des spots hydro-alcooliques que des spots aqueux (table 9). Les courbes de réduction
logarithmique des spores en solution hydro-alcoolique déposées par spots en fonction de la
fluence moyenne appliquée sont similaires aux spots en solution aqueuse pour les
concentrations de 5 x 106 par spot et 5 x 104 par spot. En revanche, la réduction logarithmique
obtenue sur des spots hydro-alcooliques de concentration 5 x 105 est supérieure à celle
obtenue dans le cas des spots aqueux, et se rapproche de la forte efficacité obtenue dans le cas
des spots peu concentrés, présentant un étalement des spores en monocouche (figure 15).
Aucune différence significative (P > 0.05) n'a été mise en évidence pour les valeurs de F3
entre les spots chargés à 5 x 105 ou 5 x 104 spores par spot, ni entre les valeurs de F3 des spots
de concentration 3 x 104 (solution aqueuse) ou 5 x 104 (solution hydro-alcoolique) (table 10).
Table 9: pourcentage de récupération des spores déposées par spots (solution aqueuse ou
alcoolique) sur polystyrène en fonction de la concentration.
Concentration du spot (spores/spot de 10µL)
Solution aqueuse Solution hydro-alcoolique 50% (v/v)
6 5 4
3 x 10 3 x 10 3 x 10 5 x 106 5 x 105 5 x 104
Pourcentage de
94.2 (2.28) 89.1 (1.38) 70.4 (10.63) 92.1 (0.9) 92.4 (0.8) 92.1 (1.39)
récupération (σ)
Coefficient de variabilité
2.42 1.55 15.11 0.98 0.88 1.5
(%)
101
1
Reduction (log)
5
0 0.5 1 1.5 2
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Fluence (J/cm²)
Figure 15: Inactivation des spores de B.subtilis DSM 402 inoculées par spots de 10µL (50%
éthanol) sur surface polystyrène, en fonction de la fluence moyenne (J/cm²). Les courbes
correspondent aux concentrations approximatives de 5 x 10 6 spores/spot (●), 5 x 105
spores/spot (□) et 5 x 104 spores/spot (▲).
Table 10: Valeurs de F3 (fluences nécessaires à une réduction de 3 log) en fonction de la

concentration du spot. (test statistique de Student)
F3 (J/cm²)
Concentration approximative (spores/spot de Spots en solution Spots en solution hydro-
10µL) aqueuse alcoolique
6 a
3 à 5 x 10 >1.76 >1.76a
3 à 5 x 105 >1.76a 0.76b
3 à 5 x 104 0.53b 0.63b
Une suspension hydro-alcoolique de spores permet de traiter des spots environ dix fois
plus concentrés, grâce au meilleur étalement du spot sur polystyrène, surface très hydrophobe.
Cela reste néanmoins limité, car une trop forte concentration des spots entraînera à nouveau
des amas cellulaires, empêchant ainsi la pénétration des rayons lumineux, et provoquant une
102
faible efficacité germicide de la lumière. Il est à noter qu'une variabilité relativement élevée
est obtenue lors du traitement des spots. La variabilité existe également au niveau de la
récupération, et ceci d'autant plus que la concentration est faible.
L'utilisation du spray, pour inoculer de manière homogène et reproductible des

monocouches de microorganismes sur des surfaces même hydrophobes, se révèle être une
méthode plus simple que la méthode par dépôt de gouttelettes et très fiable, surtout lorsqu'il
est nécessaire d'avoir une répartition des spores sur une large surface de traitement. La mise
au point et les résultats déterminés par cette méthode vont permettre l'étude de l'efficacité
décontaminante de la lumière pulsée sur différents types de surfaces d'intérêt industriel, afin
d'avoir des courbes utilisables pour la modélisation des réflecteurs et la validation du
traitement par LP d'emballage, ou de support industriel.
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Etude de la résistance à la LP de différentes souches déposées sur polystyrène par la

méthode de spray
L'étude de l'efficacité décontaminante de la lumière pulsée sur une surface polystyrène

hydrophobe a été menée sur les spores de deux espèces bactériennes supplémentaires, en
utilisant la méthode d'inoculation des microorganismes par spray. Les courbes de réduction
logarithmiques en fonction de la fluence appliquée sont présentées ci-après, pour B.
atrophaeus (figure 16) et G. stearothermophilus (figure 17)
103
1
Reduction (log)
7
0 0.5 1 1.5 2
Fluence (J/cm²)
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Figure 16: Inactivation de spores de B.atrophaeus inoculées sur polystyrène par spray, en
fonction de la fluence moyenne (J/cm²). La concentration moyenne de l'inoculum est ici de 4
x 106 spores/surface inoculée
1
Reduction (log)
5
0 0.5 1 1.5 2
Fluence (J/cm²)
Figure 17: Inactivation de spores de G. stearothermophilus inoculées sur polystyrène par

spray, en fonction de la fluence moyenne (J/cm²). La concentration moyenne de l'inoculum est
ici de 5 x 104 spores/surface inoculée.
104
Les vérifications d'étalement et de dénombrement ont été effectuées selon les mêmes
méthodes appliquées pour B.subtilis. Aucun effet de la concentration de l'inoculum n'a été mis
en évidence pour ces deux nouvelles souches. Les observations microscopiques ont montré,
dans chaque cas et quelle que soit la concentration de l'inoculum (jusqu'à 107 par surface
traitée), une répartition homogène et en monocouche sur la surface ensemencée.
Une forte décontamination a été observée dans les deux cas. Les fluences permettant
d'atteindre une réduction de 3 cycles logarithmiques sont de 0.51 J/cm² et 0.6 J/cm² pour
B.atrophaeus et G. stearothermophilus respectivement.
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105
Résultats: Décontamination des microorganismes par lumière pulsée
Résultats
3. Décontamination des microorganismes par lumière pulsée:

importants facteurs influençant l'efficacité germicide.
Les nouvelles techniques de conservation des aliments tendent à minimiser voire à

supprimer totalement l'utilisation des agents chimiques. L'efficacité décontaminante de la LP
ne fait plus aucun doute (Elmnasser et al., 2007b). Il est difficile de relier l'efficacité de la
technologie CLARANOR avec les données déjà existantes, du fait des expressions différentes
des doses de lumière appliquées. La détermination des paramètres physiques du traitement
ainsi que l'acquisition de méthodes d'inoculation de différentes surfaces nous a permis d'aller
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
un peu plus loin dans la compréhension de l'effet de la LP sur les microorganismes. Deux
mécanismes d'action sont évoqués dans la littérature. Le principal mécanisme se réfère à
l'effet des longueurs d'onde UV sur l'ADN. Le second mécanisme appelé photothermique
expliquerait l'action des rayons lumineux par échauffement au niveau du microorganisme
entraînant une altération des membranes. L'impact de chacun est encore assez mal défini.
Nous avons tenté de répondre à plusieurs questions afin de trouver des pistes permettant de
déterminer les éléments entrant en jeu dans l'inactivation des germes, ainsi que ceux
responsables de leur résistance.
Les spores de B. subtilis et A. niger ont été traitées. L'efficacité du traitement a été évaluée
sur quatre surfaces; un milieu nutritif gélosé, pour reproduire la surface humide d’un aliment,
et trois surfaces d'intérêt industriel: polystyrène (PS), verre et aluminium. Afin de mettre en
évidence des altérations possibles des structures externes après traitement thermique, des
observations en microscopie électronique à balayage ont été faites sur les spores des deux
microorganismes, déposées sur coupons PS et traitées par LP. L'importance de la composition
du spectre de LP a été étudiée par plusieurs techniques. L'impact de différentes parties de la
lumière émise a été déterminé, soit en coupant certaines longueurs d'ondes grâce à des filtres
optiques, soit en modifiant la tension appliquée (qui modifie le pourcentage d'UV), soit en
comparant la LP à un traitement UV continus basse pression. La comparaison LP/UV
continus a également permis d'apprécier l'impact de la puissance du flash. Le fait de connaître
avec précision les fluences émises par flash nous a mené à étudier l'influence de la répartition
de la fluence en un ou en plusieurs flashes. Ce travail donne des réponses particulièrement
106
intéressantes pour discuter le choix de certaines expériences sur l'expression de la dose en

termes de "nombre de flashes". Enfin, plusieurs espèces microbiennes d'intérêt industriel
(agents pathogènes ou d'altération des aliments, souches particulièrement résistantes à certains
traitements) ont été choisies, et traitées par lumière pulsée. La variabilité interspécifique des
souches ainsi que les différences entre spores et cellules végétatives d'un même germe ont été
définies.
Une décontamination logarithmique de plus de 5 unités a été obtenue sur des spores de B.
subtilis déposées aussi bien sur agar, PS ou aluminium, avec une fluence de seulement 1.24
J/cm² (délivrée en 1 flash). Aucune différence de résistance des spores n'a été constatée sur
ces trois surfaces. La décontamination sur verre est plus difficile, avec une réduction
maximum de 4 cycles logarithmiques. Les spores d'A.niger sont beaucoup plus sensibles
lorsqu'elles sont traitées sur PS, par rapport à la surface gélosée. La différence de résistance
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
de B. subtilis et A. niger sur PS est beaucoup moins prononcée que sur milieu gélosé. Les
observations par microscopie électronique à balayage des spores après un traitement affectant
la viabilité de plus de 99.99% des cellules n'a montré aucune altération visible de la structure
des spores de B. subtilis et A. niger. La fraction UV-C de la lumière pulsée est essentielle pour
l'inactivation de spores de B. subtilis et joue un rôle majeur dans le cas d'A. niger: couper la
fraction UV-C de la LP provoque une perte totale de l'efficacité sur les spores de B. subtilis,
mais uniquement une forte diminution de l'efficacité dans le cas d'A. niger. De plus, aucune
décontamination des spores d'A. niger n'a été obtenue avec un traitement UV continus basse
pression, contrairement aux spores de B. subtilis, ce qui montre que la dose UV-C n'est pas
suffisante pour expliquer la destruction des spores d'A. niger. Une grande variabilité
interspécifique est visible en ce qui concerne la résistance à la LP. Les spores des espèces
testées sont ici toujours nettement plus résistantes que les cellules végétatives. Enfin, aucune
corrélation n'a été mise en évidence entre thermorésistance et résistance à la lumière pulsée.
107
Article 3
Relevant factors affecting microbial decontamination by pulsed

light
Article soumis
Abstract
Pulsed Light (PL) uses intense flashes of white light rich in UV for decontamination. A log-
reduction higher than 5 was obtained in one flash and at fluences lower than 1.8 J/cm2 on a
range of spore-forming bacteria, of nonspore-forming bacteria and on yeasts spread on agar
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media. Vegetative cells were more sensitive than spores. The inactivation by PL of Bacillus
subtilis, B. atrophaeus, B. cereus, Geobacillus stearothermophilus, and Aspergillus niger
spores sprayed on polystyrene was similar. The inactivation by PL of B. subtilis and A. niger
spores sprayed on glass was slightly lower than on polystyrene. No alteration of the spore
structures was detected by scanning electron microscopy for both PL treated B. subtilis and A.
niger spores. The inactivation of B. subtilis, B. atrophaeus, B. cereus, B. pumilus and by PL
or by continuous UV-C at identical fluences was not different, and was much higher by PL for
A. niger spores. Increasing the input voltage of the lamps, which also increases the UV-C %,
resulted in a higher inactivation. There was no correlation between the resistance to heat and
the resistance to PL.
108
1. Introduction
Pulsed light (PL) can replace chemicals in decontamination operations in the food
industry (Lagunas-Solar et al., 2006; Ozen & Floros, 2001; Rajkovic et al., 2010a). This has
motivated during the last decade an increasing interest in this technology. PL is a non thermal
poorly penetrating technology mostly applied for surface decontamination. PL uses intense
flashes of white light (200 nm - 1100 nm wavelengths), rich in UV (200 nm – 400 nm) and
produced by a xenon flashlamp (Wekhof, 2000). Inactivation by PL is commonly attributed to
DNA damages caused by the UV radiations. Additional mechanisms may also be involved,
such as membrane disruption and vacuole extension on yeast cells (Takeshita et al., 2003).
The ability of PL to kill micro-organisms is well documented (Bialka & Demirci, 2007;
Uesugi & Moraru, 2009). Krishnamurthy et al (2004) obtained a 7-log reduction of S.aureus
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cells in a water suspension with a 5 s treatment (Krishnamurthy et al., 2004). Fernandez et al.
(2009) observed a 5 log reduction of L. monocytogenes on plastic films with a fluence of
0.175 J/cm² (Fernandez et al., 2009). Diverse applications have been considered on food
(Gomez-Lopez et al., 2005a; Ozer & Demirci, 2006; Sharma & Demirci, 2003), surface of
equipment (Ozen & Floros, 2001; Rajkovic et al., 2010b), packaging materials (Dunn et al.,
1995; Turtoi & Nicolau, 2007) or liquids (Sauer & Moraru, 2009; Smith et al., 2002).
Microbial targets (bacteria, moulds, yeasts, spores, vegetative cells...) (Gomez-Lopez et al.,
2005b; Luksiene et al., 2007; MacGregor et al., 1998), treated products (Fine & Gervais,
2004; Jun et al., 2003; Krishnamurthy et al., 2007), and pulsed light equipments (Gomez-
Lopez et al., 2005a; Uesugi et al., 2007; Wekhof, 2000) are also very diverse. Some PL
equipments require more than 50 flashes to achieve a significant inactivation, and other only 1
or 2 flashes (Rajkovic et al., 2010b). Consequently, the evaluation of the PL requires a
comprehensive study of the factors actually involved in the treatment efficiency. Inactivation
of bacterial spores requires higher heat, continuous UV, irradiation and PL treatments than
vegetative cells (Farkas, 2007). Moreover, fungal spores, such as A. niger, are known to have
a high resistance to UV. The objective of this work is to evaluate the influence of physical
(light dose, input voltage, and UV content), biological (microbial strains, spores, vegetative
cells) or environmental (quality of surfaces) factors on PL efficiency. A detailed evaluation
will be performed on the bacterium B. subtilis and on the mould A. niger. The work will be
enlarged to various microorganisms of interest for food safety and quality. A comparison with
a continuous UV treatment and with a heat treatment at 90°C will also be presented.
109
2. Material and methods
1) Microbial strains and preparation of cells cultures

Tested microbial species and strains, culture media and incubation temperature used in this
study are summarized in table 1. A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30 % (v/v)
glycerol solution of each bacteria and yeast strain was inoculated into 10 ml solution of the
appropriate broth, and incubated for 16 h, under gentle shaking. A loopful of this culture was
then inoculated into 100 ml of the appropriate broth to have an A600 of approx. 0.01. The
culture was then incubated at temperatures and for times indicated in Table 1 and shaken at
200 rpm. After a A600 determination the culture was immediately used for further tests.
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110
Table 1. Origin and culture conditions of the tested microorganisms.
Species Strain designationa Growth Sporulation Incubation Incubation

mediab mediab temperature time of cell
(°C) cultures (h)
Bacillus subtilis DSM 402 (168) LBB, LBA FNA 30 16
B. cereus ATCC 14579 LBB, LBA FNA 30 16
B. cereus CIP 391.98 LBB, LBA FNA 30 16
B. cereus INRA KBAB4 LBB, LBA FNA 30 16
B. pumilus CIP 77.25 LBB, LBA FNA 30 16
B. licheniformis CIP 52.71 LBB, LBA FNA 30 16
Geobacillus
CIP 66.23 T LBB, LBA FNA 55 16
stearothermophilus
B. megaterium DSM 32 T LBB, LBA FNA 30 16
B. subtilis
CIP 77.18 LBB, LBA FNA 30 16
(atrophaeus)
Alicyclobacillus
ATCC 49025 OSB, OSA OSA 45 ?
acidoterrestris
Escherichia coli ATCC 25922 LBB, LBA 30 16
E. coli K12 LBB, LBA 30 16
Listeria innocua CIP 80.12 LBB, LBA 30 16
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Salmonella enteritidis CIP 82.97 LBB, LBA 30 16

DSM 1988 (ATCC
Aspergillus niger MEA YGC 30
16404)
Saccharomyces
W 303 PDB, PDA 30 48
cerevisiae
Candida albicans UMIP 118.079 PDB, PDA 30 48
a
DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Germany; ATCC, American Type Culture
Collection, Manassas, VA ; CIP Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France ; INRA, Institut national de la
Recherche Agronomique, Jouy-en-Josas, France ; UMIP, Collection des Champignons de l’Institut Pasteur,
Paris, France.
a
: LBB, LBA, Luria Bertani broth and agar; OSA, OSB, Orange Serum broth and agar (Murray et al., 2007);
MEA, Malt Extract agar; PDB, PDA, potato dextrose broth and agar (Daryany et al., 2008); FNA: Fortified
Nutrient Agar (Fernandez et al., 1999); YGC, Yeast Extract Chloramphenicol (Muranyi et al., 2007)
2) Preparation of spore suspensions

A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30 % (v/v) glycerol solution of bacterial cells
was inoculated into 10 ml of the appropriate nutrient broth, and incubated under gentle
shaking at temperatures and for times indicated in Table 1. Volumes of 200 µl of this culture
were spread on sporulation agar, and then incubated at the appropriate temperature (Table 1).
After 7 days, all tested strains showed by microscope examination a > 90 % sporulation and
were detached from agar plates using 2 x 3 mL of demineralized sterile water. The suspension
was centrifuged for 15 min at 7000 x g and the pellet was suspended again in 25 ml of sterile
demineralized water. This operation was twice performed. Then, the pellet was resuspended
and twice centrifuged at 5000 x g and twice at 4000 x g for 15 min. After the last wash, the
purified suspension was collected in 2 mL of demineralised sterile water, stored at 4°C and
heated at 70°C for 10 min to inactivate vegetative cells. Spore counts were determined by
111
spreading 100 µL volumes of decimal serial dilutions on duplicate LB Agar plates. The spore
suspensions contained from 106 to 109 spores cfu/mL.
The suspensions of purified A.niger spores in sterile water were prepared as previously
described (Muranyi et al., 2007) and were received from the Fraunhofer-Institut für
Verfahrenstechnik und Verpackung (IVV), Freising, Germany. The spore suspensions
contained approx. 107 A. niger spores cfu/mL.
3) Inoculation methods
Agar surfaces were inoculated with spore or vegetative cell suspensions. Polystyrene (PS),
glass, and aluminum surfaces were inoculated with spore suspensions. Volumes of 100 µL of
6-7 decimal serial dilutions of a spore or cell suspensions were spread with a rake on 9 cm
diameter agar plates. To prevent spore germination, suspensions were kept on melting ice
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during experiments. The spray inoculation of spores on PS, glass or aluminum was performed
with a Mecafer AG-1 airbrush (Mecafer SA, Valence, France), connected to a compressor
delivering compressed air at 2.5 x 105 Pa, as recommended by the manufacturer. Volumes of
100 µL of 6-7 decimal serial dilutions of a spore suspension containing from 106 to 109
cfu/mL were sprayed on empty polystyrene (PS) Petri dishes, on glass Petri dishes, or on 9 cm
diameter aluminum coupons placed on the bottom of PS Petri dish. Petri dishes and
aluminium coupons were placed vertically and perpendicularly to the spray direction. The
serial dilutions were sprayed from the most diluted to the less diluted. The inoculation and
enumeration method were previously checked and showed a reproducible monolayer
distribution on the inoculated surfaces, with no observable clusters, and a reliable
enumeration of the spores (Levy et al., 2011). A monolayer has also been observed on the
agar surface. After spray inoculation, plates were dried for 24 h under a laminar flowhood at
room temperature. PL treated inoculated plates were filled with 20mL molten agar media at
45-50°C. All plates were incubated at the appropriate temperature (Table 1) before colony
counting.
112
4) Scanning electron microscopy

Spores of B.subtilis and A.niger were sprayed on 1.2 cm diameter PS coupons, and dried for
24 h at room temperature under a laminar flow hood. The coupons were then pasted on a
metallic support and gold plated before observation by scanning electron microscopy at 10
kV.
5) Pulsed light treatment

Pulsed Light was delivered by lab-scale PL equipment (CLARANOR SA, Avignon, France).
This equipment and the physical characteristics of the emitted light were previously studied
(Levy et al., unpublished data). Briefly pulses (duration 250µs) of broad spectrum (200-1100
nm) white light rich in UV (200-400 nm) were produced by a xenon flashlamp. The PL
fluences (PL doses) were from 0.17 J/cm² to 5.28 J/cm² and were measured using a joulemeter
Gentec QE 12 LP, with a 1.1 cm edge square probe connected to a SOLO 2 Power and
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Energy meter (Gentec Electro-Optics Inc, Quebec, Canada). Those fluences were delivered in
one to 10 flashes at 1 s interval, depending on the input voltage. Variations in fluences were
obtained in changing the distance between the light source and the samples. The fluence
applied to A. niger was delivered in one flash, except otherwise specified. Unflashed samples
were used as controls. For the PS, glass and aluminium surfaces, the PL treatment was
performed just before the addition of the molten agar. For agar surface, the PL treatment was
performed in the 1-2 min following spreading. The reduction was expressed as log N0/N,
where N0 is the initial concentration of the spread suspensions and N the number of survivors
as a function of the applied fluence. The % of UV-C contained in PL decreased by a factor 2
as input voltage between 1 kV and 3 kV decreased by a factor 2 (CLARANOR SA,
unpublished data). PL treatments without UV-C radiations were performed in placing optical
filters above the agar plates. These filters were two pass band filters cutting off wavelengths
below 225 nm and 280 nm (ORIEL, Stratford, CT, USA) or a PS Petri dish lid cutting off
wavelengths below 300 nm (spectrophotometric data not shown). The transmitted fluences
under the filters were measured as previously described.
6) Continuous UV-C treatment

An UV-C chamber was equipped with three low pressure mercury lamps. The 2.5 cm-
diameter and 43.5 cm-long glass tubes (Mazda Eclairage, Suresnes, France) were placed in
parallel at 45 cm from the target. The power delivered in experimental conditions was
113
measured with a radiometer (model VLX-3W, Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, France) and
was equal to (mean ± sd) 1.34 ± 0.046 10-3 W/cm². The lamps emitted germicidal UV-C at
254 nm. Tested UV-C fluences ranged from 25 to 1000 mJ/cm² and were obtained by times of
treatment ranging from 19 s to 12 min. Untreated samples were used as controls. B. subtilis
and A. niger spores were sprayed on PS Petri dishes. Inoculated Petri dishes were
immediately placed under the lamps for UV-C exposure then filled with molten agar. The
reduction was expressed as log N0/N, where N0 is the initial concentration of the spread
suspensions and N the number of survivors, as a function of the applied mean fluence.
7) Fitting of log reduction curves

A modified Weibull model was chosen to deal with microbial reduction curves. The model of
Albert & Mafart (2005) describes sigmoïdal survival curves with a shoulder and tailing
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
(Albert & Mafart, 2005). The equation (1) of the model is:
 
p
 F 
  1  N res  N 
 
NF F 
log  log  x10  1    res 
    N 
10 10
N0 N0   0 
  (1)
where F is the fluence applied (J/cm²), NF is the number of cfu after treatment at a fluence F,
the first 10-fold log10 reduction and p is a parameter which determines the curve convexity or
concavity (upward concavity: p<1, upward convexity: p>1). The model determines the last 3
parameters. The fluences allowing a n log reduction were calculated using equation (2):
 1

   N res  
p
 1 
 
 N0  (2)
F n  F1   log 
10  N res 
 n 
 10   
  
 N0 
  
F1, p and N0 were calculated using the Microsoft® Excel 2002 solver function.
114
8) Determination of heat resistance

Moist-heat resistance at 90°C was performed on a spore suspension in capillary tubes heated
for 5, 10, 15, 20, 30 and 60 minutes (Leguerinel et al., 2007). At each time interval, tubes
were removed and immediately cooled on ice water. For each experiment, a control sample
was submitted to a heat treatment at 70°C during 15 minutes. The time to first decimal
reduction (δ) and the curvature index p were calculated using equation (3) (Mafart et al.,
2002):
p
 t 
log N  log N 0    (3)
 
where N0 and N are the initial population and population at time t, and using the Microsoft®
Excel 2002 solver function.
The time to a 3 log reduction (t-3) was calculated using equation (4)
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
t3  x3
p
(4)
9) Statistical analysis
The mean values and standard deviation were calculated from data obtained from at least
three independent experiments done with B. subtilis and A. niger (different dates, different
cells cultures and spores preparations), and from at least two independent experiments with
others species, unless otherwise specified. Means were compared by Student's t-test or by
Tukey's Honest Significant Difference test (SPSS Systat version 9, Chicago, USA).
3. Results
1) Inactivation of B. subtilis and A. niger on different surfaces

Figure 1A shows the log reduction curves of B.subtilis spores spread on agar, PS, aluminum
and glass. The input voltage was 2.5 kV. A 3 log-reduction was obtained on all tested surfaces
with a fluence of 0.5 J/cm². A 5-log reduction was obtained on agar, PS and aluminium with a
fluence equal to 1.25 J/cm². The log reduction on glass was significantly lower (P < 0.05) for
fluences of 1.24 J/cm² and 1.76 J/cm². The figure 1B shows the log reduction curves of A.
115
niger on agar, PS or glass. The reductions are clearly dependent on the surface properties. The
lowest reduction was observed on agar and the highest on PS. On agar, the log reduction was
lower than 1 even for fluence equal to 1.25 J/cm². At the same fluence a 5 log reduction was
reached only on PS. The comparison of inactivation curves of figures 1A and 1B shows that
A. niger spores are much more resistant than B. subtilis spores when inoculated on agar.
Although F1, F3 and F5 values were significantly higher for A. niger spores when inoculated
on PS, the differences with B. subtilis spores were much less pronounced than those reported
for agar inoculation..
1
A
2
Reduction (log)
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
7
0 0,5 1 1,5 2
0
B
1
2
Reduction (log)
7
0 0,5 1 1,5 2
Fluence (J/cm²)
Figure 1. Inactivation by pulsed light of B.subtilis spores (A) and A.niger spores (B) on agar
surface (○), polystyrene (■),aluminium (Δ) and glass (▲). The input voltage was 2.5 kV. Bars
represent standard error
No test on aluminium with A. niger spores
116
2) SEM observation of B. subtilis and A. niger after a PL treatment

B.subtilis and A.niger spores were spread on a PS surface and treated by two flashes each at a
fluence of 1.8 J/cm² and under an input voltage of 2.5 kV. This treatment consistently resulted
in at least 4 log reductions in numbers of spores of both micro-organisms (Figure 1). Treated
and untreated spores looked very similar for both B.subtilis and A.niger spores (Figure 2). In
particular no disruption in spore structures, such as spore blowing, was observed. The few
altered B. subtilis spores depressed in their center were found in the same proportion in both
treated and untreated samples.
A B
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
C D
Figure 2. Scanning electron microscopy images of B.subtilis spores (A, B) and A. niger
spores (C,D), untreated (A,C) and treated (C, D) by two light pulses at 1.8 J/cm² each with an
input voltage of 2.5kV
3) Influence of the composition of the transmitted PL spectrum

Cutting off wavelengths below 300 nm corresponding to UV-C made the PL treatment mostly
ineffective (Figure 3A and 3B). The inactivation of B. subtilis spores was close to 0 for
fluences varying between 0.2 and 1.75 J/cm². With A. niger sprayed on PS some reduction in
the number of viable spores (approx. 2 log-reductions with a fluence of 1.5 J/cm2) was
117
obtained as wavelengths below 300 nm were cut-off. However, this reduction was
significantly lower than that obtained with the full spectrum, which reached at least 5 log
reductions for fluences higher than 1.5 J/cm2 (Figure 3B). Experiments on both
microorganisms illustrate the major role played by the UV-C wavelengths in the PL
treatment. In addition PL in which wavelengths shorter than 225 nm were eliminated was as
efficient as unfiltered PL on B. subtilis spores, confirming the major role played by the 225
nm – 300 nm fraction containing UV-C.
0
1
2
a
Reduction (log)
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2
0
1 b
2
Reduction (log)
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2
Fluence (J/cm²)
Figure 3. Inactivation by pulsed light of (A) B.subtilis spores on agar medium as a function of
total fluence (□), 225-1100 nm fluence (●), 280-1100 nm fluence (▲) and 300-1100 nm
fluence (Δ) and (B) A.niger spores on polystyrene as a function of total fluence (□) and 300-
1100 nm fluence. The input voltage was 2.5 kV. Bars represent standard error.
118
4) Influence of the delivery of PL energy at different input voltages

Reducing the input voltage in PL treatment reduces the % of UV-C (Schaefer et al., 2007).
The inactivation by a range of fluences obtained with input voltages of 1 kV, 1.5 kV and 2.5
kV were tested on B. subtilis spores spread on agar (Figure 4). F1, F3 and F5 values were
significantly higher (P < 0.05) when spores were treated with PL emitted under an input
voltage of 1 kV and 1.5 kV, compared with 2.5 kV
2
Reduction (log)
4
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
7
0 0.5 1 1.5 2
Fluence (J/cm²)
Figure 4. Inactivation by pulsed light delivered input voltages were 2.5 kV (■), 1.5 kV (○)
and 1 kV (▲) of B.subtilis spores spread on agar medium. Bars represent standard error.
5) Delivery of PL energy by accumulation of flashes

The delivery of fluence in one flash or in several flashes was considered. With B. subtilis and
B. cereus ATCC14579 spores and vegetative cells spread on agar, the delivery of PL in 1 or
up to 5 flashes, at a wide range of fluences comprised between 0.5 J.cm2 to 1.5 J.cm2 and
under input voltages of 2 kV, 2.5 kV and 3 kV, led to the same reductions in viable cell
counts (data not shown). For A. niger, splitting up a target fluence in several flashes had a
strong effect on the inactivation of spores sprayed on PS (Figure 5). The multiplication of
flashes, each at a fluence of 0.17 J/cm2 was almost inefficient, even as the total received
fluence reached 1.7 J/cm2. With a slightly higher fluence per flash (0.3 J/cm²) it was possible
to obtain a 2 log reduction with 3 flashes.
119
0.5
1.5
Reduction (log)
2
2.5
3.5
4.5
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Fluence (J/cm²)
Figure 5. Inactivation by pulsed light on A. niger sprayed on PS as a function of fluence

delivered in one flash (Δ) or in 1, 3 and 10 flashes at 0.16 J/cm² per flash (●) or at 0.3 J/cm²
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per flash (■). The input voltage was 2 kV. Bars represent standard error.
6) Compared inactivation of B. subtilis and A. niger spores by PL and continuous UV-C

A continuous UV-C treatment at 1.3 x 10-3 W/cm² with low pressure mercury lamps was
compared to PL treatment delivering the same UV-C doses. The figure 6A shows the log
reduction of B. subtilis spores, spread on agar as a function of the UV-C dose for PL or
continuous UV-C light. The differences in the log reductions between both treatments were
not significant (P > 0.1) for the lowest tested doses and were marginal for higher UV-C doses.
The time needed to obtain a 4-log-reduction of B. subtilis spores was approx. 200000 times
shorter with PL than with continuous UV-C. Similarly the inactivation of spores B. pumilus,
B. atrophaeus, and B. cereus strain KBAB4 by PL and by continuous UV-C with the same
UV-C fluence was almost identical. The inactivation of G. stearothermophilus spores was
higher with PL. The difference progressively increased as the delivered fluence increased. At
the maximal fluence tested a 2 log reduction was obtained with continuous UV-C and a 4 log
reduction was obtained with PL (data not shown). With A. niger spread on PS there was
almost no reduction with continuous UV-C (Figure 6B) and also with a 3-fold higher UV-C
dose (data not shown). In contrast there was a marked reduction with PL even with the lowest
tested fluence (Figure 6B).
120
0
1
Reduction (log) 2
3
4
5
6
7
0 2 4 6 8 10
0
1
Reduction (log)
2
3
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4
5
6
7
0 2 4 6 8 10
UV-C Fluence (a.u.)
Figure 6. Inactivation of B.subtilis spores on agar (A) and A.niger spores on polystyrene (B)
as a function of the UV-C fluence of pulsed light at 2.5 kV (●) and continuous UV-C light
(254nm) (○). Bars represent standard error. a.u.: arbitrary units.
7) Comparison of the sensitivity to PL of some relevant microorganisms to food safety

and quality
Vegetative cells of all tested bacteria species were highly sensitive to PL and showed a 5-log
reduction at doses lower than 0.5 J/cm2 under an input voltage of 2.5 kV (Table 2). Cells of
C. albicans and S. cerevisiae were slighly more resistant at a fluence of 0.3 J/cm2, which is
expressed by higher F3 values. Bacterial spores of all tested species were more resistant than
vegetative cells, despite some differences between strains (Table 2). The inactivation rates
also showed some differences between strains: for instance the highest F1 values did not
correspond to the highest F5 values. A. niger spores were the most resistant of the panel of
microorganisms tested. The PL resistance of spores of B. subtilis, G. stearothermophilus, B.
cereus strain KBAB4, B. atrophaeus and A. niger sprayed on PS was mostly lower than the
121
PL resistance of spores of the same strains spread on agar; this was particularly pronounced
for A. niger spores. There was no relation between the heat resistance expressed by the first
decimal reduction times (delta values at 90°C) or time to 3 log reduction and resistance to PL
expressed by F1 or F3. For instance the resistance to PL of B. cereus strain KBAB4 and of G.
stearorthermophilus was quite similar, while the resistance to heat was highly different. In
addition A. niger was by far the most heat sensitive, while it was the most PL resistant of the
tested micro-organisms.
Table 2. Resistance to PL of microorganisms inoculated on agar or on polystyrene and

comparison to their resistance to moist-heat
Resistance to
Resistance to Pulsed Heat resistance at
Microorganisms Pulsed Light on
Light on polystyrene 90°C
agar
δ value, t3bvalues
F1, F3, F5a (J/cm²) F1, F3, F5 (J/cm²)
(min)
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
B. subtilis DSM 402, spores 0.24, 0.53, 0.8 0.16, 0.40, 0.60 15, 34
B .cereus CIP 391.98, spores ndc, 0.44, 1.18 ntc Nt
B .cereus KBAB4, spores 0.35, 0.98, 1.66 0.03, 0.32, 1.0 0.4, 5.5
B. pumilus CIP 77.25, spores 0.2, 0.5, 0.77 nt 33, 54
B. licheniformis CIP 52.71, spores nd, 0.24, 1.96 nt 14, > 60
G. stearothermophilus CIP 66.23 T, spores nd, 1.05, 1.61 0.15, 0.60, >1.76 > 60, > 60
B. megaterium DSM 32 T, spores 0.33, 0.92, 1.62 nt 21, > 60
B. subtilis (atrophaeus) CIP 77.18, spores 0.35, 0.68, 0.91 0.27, 0.51, 0.70 Nt
A. acidoterrestris ATCC 49025 T, spores 0.53, 1.13, 1.61 nt 8.4, 27
B. subtilis DSM 402, cells nd, 0.14, 0.36 nt Nt
B. cereus ATCC 14579, cells nd, 0.02, 0.2 nt nt
B. cereus CIP 391.98, cells nd, 0.06, 0.22 nt nt
B. cereus KBAB4, cells nd, 0.07, 0.22 nt nt
B. pumilus CIP 77.25, cells nd, 0.14, 0.48 nt nt
B. licheniformis CIP 52.71, cells nd, 0.02, 0.11 nt nt
B. megaterium DSM 32 T, cells nd, 0.020, 0.48 nt nt
E. coli ATCC 25922, cells nd, 0.03, 0.15 nt nt
E. coli K12, cells nd, 0.16, 0.3 nt nt
L. innocua, CIP 80.12, cells nd, 0.22, 0.35 nt nt
S. enteritidis CIP 82.97, cells nd, 0.03, 0.11 nt nt
S. cerevisiae w303, cells 0.19, 0.34, 0.45 nt nt
C. albicans UMIP 118.079, cells nd, 0.26, nd nt nt
A. niger DSM 1988, spores 1.24, 2.24, >3.52 0.26, 0.57, 0.80 nd, <5
a
Fluence to 1 log, 3 log, and 5 log reduction. See Material and Methods for details
b
Time to first log reduction and to 3 log reduction. See Material and Methods for details
c
nd: not determined; nt: not tested
d
A.niger heat resistance tested at 60°C instead of 90°C
122
4. Discussion
The pulsed light treatment was able to achieve in only one flash several log reductions on a
wide range of microorganisms and on a range of surfaces. Tested fluences and number of
flashes were in the low range among those reported in the literature. For instance only a few
papers reports 2 or 3 log reduction on bacterial spores with the same range of fluences or the
same low number of flashes as used in this work (Elmnasser et al., 2007). Some studies may
report a high PL efficiency with a low dose on vegetative cells (Fernandez et al., 2009;
Rajkovic et al., 2010), but most of the time high inactivations are obtained with treatments
higher than that used in this work (Bialka et al., 2008; MacGregor et al., 1998; Uesugi and
Moraru, 2009). Spores of bacteria were more resistant that vegetative cells of the same
organisms. In our hands the F5 values of spores were up to 18-fold higher than F5 values of
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
vegetative cells. This is significant, but probably much lower than the difference in resistance
to moist-heat between spores and vegetative cells. Inactivation of spores requires an approx.
45°C higher temperature than inactivation of vegetative cells (Coleman et al., 2007; Warth,
1978). This means, in assuming z values of 10°C, > 1000-fold longer moist-heat treatments at
any temperature to achieve on spores the same inactivation as on vegetative cells of a given
bacterium.
High log reductions were also obtained with spores of several Bacillus spp. and of A. niger on
diverse surface materials common in the food industry, such as PS, aluminium and glass.
Inactivation on those surfaces was usually higher than on agar. Survival was depending on the
surface, as shown for instance with a better survival of B. subtilis and A. niger spores
inoculated on glass. Microscopic examinations of the tested glass plates did not reveal any
surface irregularities that could create a shading effect and the dispersion of the
microorganisms was similar to that observed on PS (data not shown). Several authors reported
possible interactions between PL or UV treated surface and inoculated microorganisms
because of reflection properties, absorbance of the material or chemical reactions of the
material (Woodling and Moraru, 2005; Zacarias et al., 2010). In the present work we are not
able to determine the origin of the better survival observed.
The UV-C radiations play a major role in the decontamination by PL for several reasons: (i)
PL was mostly inefficient on B. subtilis spores when UV-C wavelengths were cut off; (ii)
reducing the flashlamp input voltage that decreases the % of UV-C in PL significantly
lowered the efficiency of the treatment on B. subtilis spores even when the total fluence was
123
maintained; (iii) UV-C fluences delivered by UV-C lamps in a continuous treatment or by PL

had the same effect on B. subtilis, B. cereus, B. pumilus and B. atrophaeus spores. However,
our A. niger particular data suggest that a photothermal (i.e. momentaneous microscopic
overheating effect) cannot be excluded (Gomez-Lopez et al., 2007; Wekhof et al., 2001). A
blowing of A. niger spores after a PL treatment was attributed to this photothermal effect
(Wekhof et al., 2001) but this was never observed in this work on both A. niger and B. subtilis
spores. A. niger was much more resistant when PL treated on agar than when treated on PS or
glass. Considering that A. niger spores are much more sensitive to heat than spores of spore-
forming bacteria, we may hypothesize that a heat diffusion in agar higher than in a non-
aqueous dry surface is at the origin of this lower sensitivity on agar of PL treated A. niger
spores. There was also some A. niger inactivation when UV-C wavelengths were cut off.
Factors other than UV-C such as heat, UV-A and UV-B radiation may also play a role
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
(Wekhof, 2000). Effects of radiations other than UV-C will depend on the proper sensitivity
of each microorganism and of its environment at the time of the PL treatment.
In conclusion PL can be efficient on a wide range of microorganisms including highly heat
resistant species such spore forming bacteria. Decontamination by PL has to account for
possible interactions between the target surface and the microorganism. Further research on
the mechanisms of action of PL on bacteria and and on eukaryotic microorganisms (yeasts
and moulds) is needed for précising the possible applications of the technology in
decontamination processes..
Acknowledgements
This work is a partial fulfillment of author's C. Levy PhD Thesis. She has received a grant
from the Association Nationale de la Recherche et de la Technologie, Paris, France. The
authors would like to thank Isabelle Bornard for the microscopic imaging and Claire Bérard
for skilful technical assistance.
124
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tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
128
Influence du stade de culture de cellules ou du milieu de

sporulation sur la résistance de B. subtilis à la lumière pulsée
Les résultats de décontamination des cellules végétatives bactériennes ont été obtenus sur
des cultures cellulaires de 16h. Il est judicieux de se demander si le stade de croissance des
cellules végétatives peut avoir une influence sur la résistance à la LP. En effet, dans le cas des
traitements à la chaleur, plusieurs souches de S. aureus ont montré une plus grande
thermorésistance lorsque les cellules se trouvaient en phase stationnaire de croissance plutôt
qu'en phase exponentielle (Cebrian et al., 2007). L'impact de la phase de croissance des
cellules végétatives sur la résistance à la lumière pulsée a ainsi été étudié sur B. subtilis 168 et
E. coli K12, cultivées en milieu LB liquide.
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Influence du stade de culture sur la résistance à la LP de cellules végétatives de B. subtilis

et E. coli
Les cellules végétatives ont été traitées par LP à différents stades de leur croissance
(figure 17). Aucune influence du stade sur la résistance des cellules d'E. coli à la LP n'a été
mise en évidence: quel que soit leur état physiologique, elles présentent toujours une grande
sensibilité au traitement, avec une destruction très marquée (supérieure à 5 réductions
logarithmiques dès 0,3 J/cm² (figure 18)). En revanche, en phase stationnaire avancée, les
cellules végétatives de B. subtilis sont plus résistantes face à la lumière pulsée que lors des
stades précédents (figure 19).
129
3.5 4
3
2.5
3 4 5 6
2 2
DO
1.5 2
1
1
1
0.5
0
0 5 10 15 20 25 30
Temps (h)
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Figure 17: Croissance de B.subtilis (─) et E.coli (─) à 30°C. Les cultures ont été réalisées en
flacons de 500 mL contenant 100 mL de milieu LB mise en incubation à 30°C, 200 rpm. La
DO600 initiale de l’inoculum était de 0,01. Les flèches représentent les stades de croissance
auxquels les cellules ont été traitées par la lumière pulsée, après un étalement sur milieu
gélosé.
2
Reduction (log)
9
0 0.5 1 1.5 2
Fluence (J/cm²)
Figure 18: Inactivation des cellules végétatives d'E. coli traitées par lumière pulsée à
différents stades de la phase de croissance: 1-début de phase exponentielle (●), 2-milieu de
phase exponentielle (▲), 3-début de phase stationnaire (Δ), 4-phase stationnaire avancée (○)
(les stades de croissance sont représentés sur la figure 17)
130
0
1
2
Reduction (log)
3
4
5
6
7
8
9
0 0.5 1 1.5 2
Fluence (J/cm²)
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Figure 19: Inactivation des cellules végétatives de B. subtilis traitées par lumière pulsée à
différents stades de la phase de croissance: 1-début de phase exponentielle (●), 2-début de
phase stationnaire (Δ), phase stationnaire avancée: points 3 (○), 4 (□), 5 (■), et 6 (▲).
Afin de vérifier que l'augmentation de la résistance des cellules de B. subtilis n'est pas
simplement due à l'augmentation de débris cellulaires ou de macromolécules (de type
mucilage) dans le milieu extracellulaire, le traitement par LP a été testé sur des cellules de B.
subtilis préalablement lavées. La décontamination des cellules lavées est identique à celle
obtenue sur des cellules non lavées. L’ombrage créé par le matériel extracellulaire accumulé
lors de la culture est négligeable, et ne peut donc pas expliquer la plus forte résistance des
cellules en phase stationnaire avancée.
La mise en place de la sporulation chez B. subtilis pourrait avoir un lien avec les
comportements observés. En effet, l'apparition de la résistance est un phénomène qui n'a pas
lieu chez E. coli. Des expériences complémentaires de dénombrements de spores dans la
culture cellulaire, ont révélé que l'apparition des spores se faisait environ 1 à 2 h après
l'acquisition de la résistance des cellules végétatives de B. subtilis. Il est fort possible que les
mécanismes mis en place lors de la sporulation soient corrélés à cette augmentation de
résistance face à la lumière pulsée. Les différences obtenues entre B. subtilis et E. coli, ainsi
que la détection des spores dans le milieu ne permettent pas de répondre de manière précise à
la question. Il serait donc intéressant de vérifier cette hypothèse par exemple par l'étude de
131
mutants de sporulation. Un mutant par délétion du gène spo0A, gène principal impliqué dans
l'initiation de la sporulation chez B. subtilis (Fujita & Losick, 2005), pourrait être un moyen
d'étudier le lien possible entre l’apparition de la résistance à la LP et la mise en place de la
sporulation.
Influence du milieu de sporulation sur la résistance des spores de B.subtilis à la LP
Les cellules végétatives en phase stationnaire tardive présentent une résistance importante
à la lumière pulsée. Cette résistance semble même plus marquée que les spores de cette
souche produites sur milieu gélosé (une réduction maximale de 3 cycles logarithmiques pour
des cellules végétatives en phase stationnaire avancée, contre plus de 6 cycles logarithmiques
dans le cas des spores). La possible corrélation entre mise en place de la sporulation et
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acquisition de la résistance à la lumière pulsée a soulevé une nouvelle question, à savoir

l'influence du milieu de sporulation sur la résistance à la lumière pulsée. De plus, la
comparaison de la thermorésistance à une température de 90°C de spores de B. subtilis
produites en milieu 2 x SG liquide ou sur milieu 2 x SG solide (Rose et al., 2007) a montré
que les spores produites sur milieu gélosé présentent une thermorésistance plus élevée que les
spores produites en liquide. Dans un premier temps, aucune différence de résistance des
spores de B. subtilis produites sur FNA ou 2 x SG gélosé (Nicholson & Setlow, 1990) n'a été
mise en évidence. Dans un second temps les spores de B. subtilis produites sur 2 x SG gélosé
ou en 2 x SG liquide ont été traitées par lumière pulsée (figure 20).
132
2
reduction (log)
7
0 0.5 1 1.5 2
fluence (J/cm²)
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Figure 20: courbes de réduction de spores de B. subtilis en fonction de la fluence appliquée,

pour des spores produites sur milieu 2 x SG gélosé (○) ou liquide (●).
La variabilité de résistance de spores produites en milieu liquide est marquée. Pourtant il

semble quand même y avoir une différence entre les deux courbes. Les spores produites sur
surface gélosée semblent plus sensibles que celles produites en liquide (à l'inverse du résultat
obtenu dans le cas des traitements thermiques). Cette nouvelle donnée va dans le sens d'une
corrélation entre résistance et mise en place de la sporulation dans des cultures liquides de B.
subtilis.
133
Résultats: Décontamination de sirop de sucre par lumière pulsée.
Résultats
4. Décontamination de sirop de sucre par lumière pulsée.
Le sirop de sucre, largement utilisé en industrie, peut être contaminé par des bactéries
sporulantes, levures ou moisissures. Après dilution (dans les jus par exemple), ces
microorganismes peuvent se multiplier, et ainsi causer des problèmes d’altération, voire
d’intoxications. Certains microorganismes acidophiles thermophiles, et en particulier
Alicyclobacillus acidoterrestris, connus pour leur résistance à la pasteurisation, ont été
récemment responsables de problèmes d'altération de jus de fruits au Royaume Uni et en
Allemagne (Pettipher et al., 1997). La lumière pulsée est ici une alternative séduisante à la
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
pasteurisation pour décontaminer des liquides clairs, son efficacité ayant été prouvée sur des
produits comme l'eau ou le miel. Une étude a donc été menée en vue de caractériser
l'efficacité décontaminante de la lumière pulsée sur du sirop de sucre, et de déterminer les
conditions de traitement nécessaires à une décontamination suffisante du produit.
Trois types de liquides clairs ont été sélectionnés, de l'eau distillée, ainsi que du sirop de
saccharose à 65 ou 67° Brix, dans le but d'étudier la possible influence de la composition et de
la viscosité du produit à traiter. Afin d'apprécier les limites de l'efficacité de la LP, définie en
général comme peu pénétrante, deux épaisseurs de liquide ont été testées, à la fois pour le
traitement de l'eau et du sirop de saccharose à 65° Brix.
Comme pour chaque traitement, un microorganisme de référence ne peut suffire à
caractériser l'efficacité. L'efficacité de la LP appliquée au sirop de sucre a donc été évaluée
sur cinq microorganismes différents (spores d'A. acidoterrestris, B. subtilis, G.
stearothermophilus, A. niger et cellules végétatives de S. cerevisiae).
Les études préliminaires de faisabilité concernant le traitement du sirop de sucre par
lumière pulsée ont pour but une application au niveau industriel. L'application du traitement
en flux continu et la comparaison des résultats par rapport au traitement statique (discontinu)
ont donc été les éléments clés de la validation de la lumière pulsée pour décontaminer le sirop
de sucre.
Grâce à ces travaux, il a été mis en évidence que la composition du liquide, sa coloration
et sa viscosité ont une importance capitale. Le sirop de sucre est plus difficile à décontaminer
que l'eau distillée. L'épaisseur de traitement est limitée, mais une décontamination efficace (3
134
Résultats: Décontamination de sirop de sucre par lumière pulsée
cycles logarithmiques) de spores d'A. acidoterrestris a été obtenue sur des épaisseurs de sirop
jusqu'à 10 mm, dans des conditions statiques. Parmi les 5 microorganismes traités, les spores
d'A. niger semblent ici les plus résistantes au traitement. Enfin, le traitement de LP en flux
continu (traitement de liquide à hauteur de 1.5 m3/h) à révélé une efficacité identique aux
résultats statiques (pour une épaisseur donnée).
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135
Article 4
Decontamination of sugar syrup by pulsed light
Article à soumettre
Abstract
Pulsed light was applied on 65-67° Brix sugar syrups artificially contaminated with a
selection of micro-organisms. At least three log reductions of Saccharomyces cerevisiae, and
of spores of Bacillus subtilis, Geobacillus stearothermophilus and Alicyclobacillus
acidoterrestris suspended in sugar syrup with a fluence of the incident pulsed light equal to,
or lower than 1.8 J/cm2 were obtained in 3 mm thick sugar syrup, and on spores of B. subtilis
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
and A. acidoterrestris in a 10 mm thick sugar syrup. A. niger spores were less sensitive and
the maximal log reduction was close to 1 with a fluence of the incident pulsed light of 1.2
J/cm2. A flow-through system designed for PL treatment of sugar syrup allowed a 3 log
reduction of A. acidoterrestris spores with 3-4 pulses of incident light at 0.91 J/cm2 per sugar
syrup volume.
136
1. Introduction
Sugar syrups have a wide range of possible use in the food industry (Cordier, 2000). Many
microorganisms, mainly spore-forming bacteria, yeast and moulds are contaminating sugar
syrups. They will be unable to multiply because sugar syrups have a high osmotic pressure.
After dilutions in the final products, for preparation of fruit and other soft drinks for example,
they may find favourable conditions for growth, and ultimately cause the formation of off-
odours and off-flavours, particle formation, swelling of packages or in some cases an
increasing in the risk of food poisoning (Stratford et al., 2000). Clostridium botulinum has
been detected for instance in corn syrup (Lilly et al., 1991). Microbial contaminants in sugar
syrups can be eliminated by heating (Cordier, 2000). Pasteurization of the final product can
cause a decrease in enzymes, or changes of colour, flavour and other organoleptic quality of
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the drinks, and may be restricted by the high resistance of some contaminants of food (Sauer
& Moraru, 2009; Stratford et al., 2000; Tran & Farid, 2004). Pulsed light (PL) appears as an
alternative to conventional thermal and chemical decontamination processes. Pulsed light is
already used to decontaminate surfaces (Fernandez et al., 2009; Turtoi & Nicolau, 2007) and
liquids (Huffman et al., 2000) by killing microorganisms with the help of short and intense
light pulses. The current study was then carried out in order to investigate the efficiency of
pulsed light to decontaminate sugar syrup. Target microorganisms (Saccharomyces
cerevisiae, Aspergillus niger, B. subtilis, A. acidoterrestris, Geobacillus stearothermophilus)
were selected among those reported for contaminating sugar syrups and/or fruit and soft
drinks.
2. Materials and methods
1) Bacterial spores suspensions

A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30% (v/v) glycerol solution of A.
acidoterrestris strain ATCC 49025T, Bacillus subtilis DSM 402 (= B. subtilis 168),
Geobacillus stearothermophilus CIP 6623T were, respectively, spread on Orange Serum agar
(pH = 4.5) (OSA) (Oxoid, Cambridge, United-Kingdom) plates at 45°C for 72 h (Murray et
al., 2007), on Luria-Bertani (LB) agar plates at 30°C for 24h (pH = 7.0) and on Fortified
137
Nutrient agar (FNA) plates at 55°C for 24h (pH = 7.0) (Fernández et al., 1999). A colony of
each strain was picked, suspended in sterile distilled water, then volumes of 200 µl were
spread on OSA, on LB agar and on FNA for 7 days at the temperature previously indicated.
After 7 days, spores were detached from OSA, LBA or FNA plates with 3 x 1 ml of sterile
water. The suspensions were centrifuged 15 min at 7000 rpm and the pellet was then
resuspended in 25 ml of sterile water. This operation was performed twice. The pellet was
suspended again and centrifuged two times at 5000 rpm and two times at 4000 rpm. After the
last wash, the pellet was suspended in 2 ml of sterile distilled water and stored at 4°C until
use. Before use, the spores suspensions were heated 10 min at 70°C for B. subtilis and 10 min
at 80°C for A. acidoterrestris and G. stearothermophilus to eliminate vegetative cells
(Pettipher et al., 1997). Spores were kept at 4°C until use. Spores were counted by spreading
volumes of 0.1 ml of decimal serial dilutions on OSA, LBA and FNA plates. The spore
suspensions contained 107-108 CFU/ml.
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2) Aspergillus niger spores suspensions

A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30% (v/v) glycerol solution of Aspergillus
niger ATCC 9642 was spread on Malt Extract Agar (MEA) (Bonenfant et al., 2010) plates at
30°C for 5 days. Mycelium of these plates was then spread on MEA for 7 days at 30°C. After
7 days, spores were detached from the mycelium with 2 x 5 ml of a sterile tween solution
(0.1%). The spore suspension was stored at 4°C until use.
3) Saccharomyces cerevisiae vegetative cells suspensions

A loopful of a stock culture stored at -20°C in a 30% (v/v) glycerol solution of
Saccharomyces cerevisiae was, spread on MEA (Bonenfant et al., 2010) plates at 30°C for
48h. A colony was picked and then suspended in Malt Extract Broth (MEB) under gentle
shaking for 48h at 30°C.
4) Sugar syrup preparation

Different sugar syrups were tested: pure sucrose syrup at 65 and 67° Brix (sucrose from VWR
International, Leuven, Belgium), and industrial sugar syrup at 65° Brix and 67° Brix. Sterile
filtration of sugar syrups was performed using 0.22 µm pore size filter (Millipore, Bedford,
138
MA). Sugar syrups were then artificially contaminated at 10 5-106 cfu/ml for bacterial spores
and S. cerevisiae cells, and at 104 cfu/ml for A. niger spores.
5) Treatment of sugar syrup by pulsed light

Pulsed Light was delivered by lab-scale PL equipments (CLARANOR SA, Avignon, France).
Briefly pulses (duration 200µs) of broad spectrum (200-1100 nm) white light rich in UV
(200-400 nm) are produced by a xenon flashlamp. Two different syrup thicknesses were
tested: 3 and 10 mm. The lamp input voltage was 2.5 kV. Petri dishes of 5 cm diameter were
filled with 5.5 ml or 20 ml sugar syrup, giving respectively a 3 mm and a 10 mm thick layer,
respectively. The PL fluences at the top of the sugar syrup (incident fluence) were from 0 to
1.86 J/cm² (delivered in 1 or 2 flashes). Variations in fluences were obtained in varying the
distance between the samples and the lamps using an adjustable lab-elevator. Untreated
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samples were used as controls.

A flow-through system was designed for PL treatment of sugar syrup (CLARANOR,
Avignon, France). Sugar syrup ran in a 2.15 mm-wide space between an outer stainless steel
cylinder and an inner quartz cylindrical chamber containing in its center a xenon flash lamp.
The flow rate was 320 ml/min. The fluence of the incident PL was 0.91 J/cm 2/flash and the
fluence of the transmitted PL was 0.75 J/cm2. One to 4 pulses/volume were delivered. Before
and after each use, the system was cleaned with 500 ml of a bleach solution (10%), 500 ml of
hydro-alcoholic solution (25% ethanol), and 500 ml of sterile distilled water. Negative
controls were made, before and after each experiment.
6) Microbial counts
After treatment by pulsed light, decimal dilutions in sterile distilled water of the sugar syrup
samples were spread onto OSA and incubated at 45°C for 48 h when spiked with A.
acidoterrestris, spread onto MEA incubated at 30°C for 48 h when spiked with A. niger
spores or S. cerevisiae and spread onto LB agar and incubated for 24h at 30°C or 55°C
respectively when spiked with B. subtilis spores or G. stearothermophilus spores.
139
7) Experimental design and expression of microbial inactivation

Each survival experiment was at least twice and up to four times reproduced, at different dates
with independently prepared cell or spore suspensions. The reduction was expressed as log
N0/N, where N0 is the initial concentration of the spread suspensions and N the number of
survivors, as a function of the applied fluence. The modified Weibull model of Albert &
Mafart (2005) was used to fit the sigmoïdal survival curves with shoulder and tailing (Albert
& Mafart, 2005). The equation (1) of the model is:
 
p
 F 
  1  N res  N 
 
NF F 
log  log  x10  1    res 
    N 
10 10
N0 N0   0 
  (1)
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where F is the fluence applied (J/cm²), NF is the number of cfu after treatment at a fluence F,
the first log reduction and p is a parameter which determines the curve convexity or concavity
(upward concavity: p<1, upward convexity: p>1). The fluence allowing a n log reduction was
calculated using equation (2):
 1

   N res  
p
 1 
 
 N0 
F n  F1  log  (2)
 10
 n N res 
 
 10   
  N0  

 
F1, p and N0 were calculated using the Microsoft® Excel 2002 solver function. In total 22 sets
of replicate fluence allowing a 1 log reduction (F1) or 3 log reductions (F3) were obtained. The
percentage mean deviation (% difference between extreme values and the mean) was always
lower than 20 % and lower than 10 % in 17 out of 22 data sets.
140
3. Results and discussion
1) Influence of the composition of the sugar syrup.

Three log reductions of B. subtilis spores were obtained at a fluence of 1.5 J/cm 2 in 67°Brix
industrial sucrose syrup, but significantly higher log reductions of 4.2 and 4.6 were obtained
in 65°Brix pure sucrose syrup and in sterile distilled water, respectively (Figure 1). Factors
that affect the inactivation of microorganisms in liquids food include its colour, viscosity and
opacity (Guerrero-Beltran & Barbosa-Canovas, 2004; Krishnamurthy et al., 2007; Sauer &
Moraru, 2009). Decontamination in the sugar syrup was lower than that obtained in water.
These results are more likely due to the difference in UV-C absorption of industrial and pure
sugar syrup and of water, hence reducing the effective UV-C fluence after a few mm through
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the liquid (Woodling & Moraru, 2007). The decontamination was possible only with
uncoloured sugar syrups. A suspension of B. subtilis spores in a 3 mm thick layer of brown
sugar syrup at 65° Brix was unaffected by a PL treatment at 1.8 J/cm 2 (data not shown).
2
Reduction (log)
5
0 0.5 Fluence (J/cm2) 1 1.5
Figure 1. Effect of pulsed light treatment on B. subtilis spores in water (□), 65°Brix pure
sucrose syrup (●) and 67°Brix industrial sucrose syrup (Δ). The input voltage was set at 2.5
kV. The thickness of the liquid layer was 10 mm. Each symbol represents data from one
experiment. Solids lines represent the average value of experimental data obtained on spores
suspended in each of the three liquids
141
2) Effect of the thickness of the sugar syrup layer

The log-reduction achieved on A. acidoterrestris spores in a 3 mm thick sugar syrup layer was
equal to 4, while it was equal to 3 in a 10 mm thick sugar syrup layer at a fluence of 1.5 J cm 2
(figure 2). At fluences lower than 1 J/cm 2 differences in log reductions were almost not
detectable. A similar behaviour was observed with B. subtilis spores in a 3 mm and 10 mm
thick sterile water layers (data not shown). Testing higher thicknesses of the sugar syrup layer
would likely have been necessary to detect a decrease in B. subtilis inactivation: increasing
the thickness of the sugar syrup layer form 3 mm to 10 mm only did not modify the reduction
in the B. subtilis spore concentration (Figure 2). Reduction in A. acidoterrestris spores was
lower than that of B. subtilis spores at all tested fluences and for both sugar syrup thicknesses.
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1
Reduction (log)
5
0.0 0.5 1.0 1.5
Fluence (J/cm2)
Figure 2. Effect of pulsed light treatment on B. subtilis (thickness of the layer: 3 mm, □ and:
10 mm, (■) and on A. acidoterrestris spores (3 mm, Δ; 10 mm, ▲) in 65°Brix pure sucrose
syrup. The input voltage was set at 2,5 kV. Each symbol represents data from one experiment.
Solid lines represent the average value of experimental data obtained on each species and with
each thickness of sugar syrup.
142
3) Diversity of sensitivity in sugar syrup

The decontamination curves of different microorganisms treated by PL are shown in figure 3.
The highest decontamination in sugar syrup was obtained with S. cerevisiae with 4.8 log
reduction at a fluence of only 1.23 J/cm 2. The log reductions were also higher than 4 for the
spore-forming strains B. subtilis and G. stearothermophilus spores with log reductions of
respectively, 4.0 and 2.9 at 1.23 J/cm2. PL treatment of A. acidoterrestris spores achieved a 3
log reduction at 1.86 J/cm2. The most resistant micro-organism of the panel was A. niger
spores with a reduction of only 1.3 log at 1.2 J/cm2. A. niger is generally known to be among
the most resistant microorganism to UV-C irradiation (Begum et al., 2009; Guerrero-Beltran
& Barbosa-Canovas, 2004). The differences in the relative sensitivity to PL of the
microorganisms mixed to sugar syrup were in agreement with those observed after PL
treatment of the same species spread on agar (Levy et al, unpublished data, article 3).
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1
Reduction (log)
5
0 0.5 1 1.5 2
Fluence (J/cm2)
Figure 3. Effect of pulsed light treatment on A. niger spores (◊), A. acidoterrestris spores (□),
G.stearothermophilus spores (■), B. subtilis spores (Δ) and S.cerevisiae vegetative cells (▲)
in 65°Brix industrial sucrose syrup. The thickness of the sugar syrup layer was 3 mm. The
input voltage was set at 2.5 kV. Each symbol represents data from one experiment. Solid lines
represent the average value of experimental data obtained with each strain.
143
4) Inactivation of A. acidoterrestris in a flow-through PL system

Previous tests were performed in a static way. In industry PL treatment of sugar syrup has to
be performed in a continuous flow of product. The inactivation of A. acidoterrestris in the
flow-through PL system was linked to the number of pulses delivered per sugar syrup
volumes and reached 4 log reductions with three pulses/volume for instance (figure 4). This
reduction is higher than the common recommendation in commercial canning, in which sugar
syrup may be used (Silva & Gibbs, 2001). From different sources reporting A. acidoterrestris
D-values in fruit juices (Silva & Gibbs, 2001), a heat treatment of 5-20 min at 95°C would be
necessary to achieve the same log reduction. This treatment could be even longer because of a
low water activity of sugar syrup that increases the heat resistance of microorganisms.
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2
Reduction (log)
6
0 1 2 3 4
Flash/volume
Figure 4. Effect of pulsed light treatment on A. acidoterrestris spores using a flow through
system (●) in 65°Brix industrial sucrose syrup. The thickness of the sugar syrup layer was
2.15 mm. The input voltage was set at 2.5 kV. Each symbol represents data from one
experiment. The solid line represents the average value of experimental data.
144
4. Conclusion
A significant inactivation (i.e. several log reductions) of spore-forming bacteria and S.

cerevisiae was obtained in sugar syrup subjected to PL. This was obtained with a low number
of flashes (from 1 to 4) and in up to 10 mm thick sugar syrup. The same efficiency was
obtained in a continuous flow system with A. acidoterrestris. Consequently PL appears as a
promising alternative for the decontamination of sugar syrup for food industry applications.
Acknowledgements
This work is a partial fulfilment of Caroline Levy’s PhD thesis. She has received a grant from
the Association Nationale de la Recherche et de la Technologie, Paris, France
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145
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147
Etude d'un équipement pilote industriel de lumière pulsée pour la

décontamination de sirop de sucre en dynamique sur ligne.
Un pilote industriel mis au point par CLARANOR a été caractérisé en laboratoire. Le

réacteur est équipé de 4 lampes centrales autour desquelles circule le sirop de sucre dans un
tube de quartz d'épaisseur 10mm (figure 21). Le débit testé est de 1.5 m3/h. La fréquence des
flashes est ajustée en fonction du débit et des paramètres du flux, afin d'avoir des données de
dose minimale reçue par la totalité du liquide. L'ajustement des fréquences est commandé par
l'électronique du pilote.
Les courbes de destruction sont exprimées en fonction d'une fluence minimale reçue par la
cible (cf article 4). Suite aux résultats ultérieurs, deux microorganismes ont été définis: les
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spores d'A .acidoterrestris (présentant un intérêt industriel important) et d'A. niger

(déterminées pour le moment comme les plus résistantes parmi les souches testées).
Dans le cas du traitement des spores d'A. niger, la puissance du flash a été augmentée, avec
1.5 J/cm²/ flash, contre 1 J/cm²/flash pour A. acidoterrestris (cf article 3).
b
a
A B
Figure 21: schéma en coupe transversale (A) et photo (B) de l'intérieur du réacteur
dynamique de traitement de sirop de sucre. a) lampes, b) quartz, c) sirop de sucre, d)
ensemble quartz + réflecteur + inox
148
1
Réduction (log)
4
0 1 2 3 4 5
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Fluence minimale (J/cm²)
Figure 22: Inactivation de spores d'A.niger (▲) et d'A. acidoterrestris (●) traitées par lumière
pulsée en continu (1,5 m3/h) dans 10mm de sirop de sucre. La contamination initiale était
d'environ 3 x 103 ufc/mL dans les deux cas.
Les résultats obtenus (figure 22) montrent une décontamination efficace dans les 2 cas,
bien qu'une forte variabilité et une plus grande résistance soit rencontrée pour A .niger. Pour
cette dernière, une réduction de 3 cycles logarithmiques semble être difficilement atteinte. La
lumière pulsée reste un très bon candidat pour l'élimination des spores d'A. acidoterrestris
dans le sirop de sucre.
Ces résultats sont en cours de validation sur chaîne industrielle.
149
Discussion générale
La lumière pulsée est une technologie dont l'efficacité a été clairement démontrée.
L'équipement pilote de lumière pulsée CLARANOR a révélé une très forte efficacité dès le
premier flash sur divers microorganismes. Des réductions logarithmiques supérieures à 5
unités ont été obtenues sur des spores de B. subtilis déposées en monocouche sur milieu
gélosé. Les cellules végétatives de nombreuses espèces microbiennes ont montré une
réduction supérieure à 5 cycles logarithmiques dès 0.5 J/cm². Bien qu'il y ait des différences
de résistance plus marquées pour les formes sporulées, des décontaminations supérieures à 3
cycles logarithmiques ont pu être obtenues sur un grand nombre d’espèces bactériennes (B.
atrophaeus, A. acidoterrestris, G. stearothermophilus...) en seulement un flash. L'acquisition
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d'une méthode fiable, simple et reproductible d'ensemencement par spray des spores de
microorganismes a permis de démontrer l'efficacité de la lumière pulsée sur différentes
surfaces, notamment sur une surface polystyrène, avec une réduction de plus de 5 cycles
logarithmiques obtenue sur des spores de B. subtilis. Sur du polystyrène également, la lumière
pulsée s'est avérée très efficace pour décontaminer des spores d'A. niger (réduction supérieure
à 4 unités logarithmiques), espèce par ailleurs très résistante sur milieu gélosé, et ce avec une
fluence inférieure à 1 J/cm². Il est désormais possible de qualifier le traitement sur de
nombreuses bactéries, moisissures et levures, ainsi que sur de nombreuses surfaces, grâce à la
connaissance des caractéristiques physiques de la lumière incidente et aux méthodes
d'ensemencement rapide utilisées.
Grâce à ces travaux, l'influence de certains facteurs a été clairement établie. Il est évident
que la répartition des microorganismes sur la surface de traitement est un élément primordial
à l'évaluation de l'efficacité germicide, en raison des possibles superpositions des
microorganismes protégeant les couches inférieures de la lumière. Il est également bien établi
que la fraction UV-C de la lumière a une importance capitale pour l'efficacité du traitement.
Cependant, nous sommes encore loin de comprendre tous les phénomènes concernant les
mécanismes d'action de la lumière pulsée, les mécanismes cellulaires de protection ou de
réparation des microorganismes, ou encore leurs interactions avec les surfaces de traitement.
Ce travail de recherche a permis de mettre en évidence la résistance de certains
microorganismes face à la lumière pulsée. Comprendre de manière plus précise les
150
phénomènes mis en jeu lors de l'illumination des germes est maintenant devenu une étape clé
pour mieux utiliser la technologie.
Rôle des UV
L'effet des longueurs d'ondes UV, bien qu'incontestable, suscite des interrogations. Il
semble que les différentes espèces de microorganismes ne soient pas sensibles aux mêmes
gammes de longueur d’onde de la lumière. La partie UV-C serait l'unique facteur important
pour traiter B. subtilis. Supprimer les UV-C contenus dans la LP entraîne une perte totale de
son efficacité germicide. De plus, les mêmes courbes de décontamination de B. subtilis ont été
obtenues avec un traitement UV continu ou un traitement lumière pulsée à même fluence UV-
C. Ce résultat semble montrer que toutes les longueurs d'onde UV-C sont sensiblement aussi
efficaces que le 254 nm. En revanche, la dose UV-C seule ne suffit pas à expliquer la
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destruction d'A. niger. Dans ce dernier cas la suppression des UV-C de la lumière pulsée
provoque une diminution considérable de la destruction, mais ne supprime pas totalement son
efficacité. En outre, une même dose émise par une lampe à mercure basse pression ne
provoque aucune destruction. A. niger semble répondre à la puissance du flash, et pas
seulement à la dose délivrée.
De nombreux travaux se sont intéressés à la fraction UV contenue dans la LP dans le but
de comparer les technologies LP et UV continus. Woodling et Moraru (2007) démontrent, en
utilisant des filtres optiques, que l'absence d'UV entraîne une perte quasi totale de l'efficacité
bactéricide de la lumière pulsée sur L. innocua. Ces auteurs en déduisent que les longueurs
d'onde visibles et infrarouges n'ont aucun effet germicide. Wekhof et al. (2001) soutiennent
que la partie visible de la lumière ne jouerait aucun rôle dans l'efficacité germicide. Wang et
al. (2005) utilisent un monochromateur UV pour tester l'influence des différentes longueurs
d'onde sur l'efficacité des UV pulsés pour décontaminer E. coli et ne constatent aucune
décontamination avec des longueurs d'onde au dessus de 300 nm. Ces résultats vont tous dans
le sens d'une efficacité de la LP entièrement due à la dose UV, c'est à dire un mécanisme
d'action comparable à ce qui existe déjà dans le cas du traitement par émission continue d'UV.
La puissance du flash pourrait être responsable de la meilleure efficacité de la partie UV-
C, mais pas uniquement. Wekhof (2000) souligne que la part UV de la LP est responsable de
la quasi totalité de la désinfection, mais que les UV-C ne seraient pas les seules longueurs
d'ondes actives. Les UV-A et B pourraient être impliqués dans la décontamination, en
provoquant un échauffement du microorganisme. L'existence de l'effet photothermique
151
montrerait que la LP ne se réduit pas simplement à une nouvelle technologie d'application des
UV continus.
Mécanismes d'action
Si l'on considère l'importance des longueurs d'onde UV dans l'efficacité germicide, les
mécanismes d'action de la LP peuvent être reliés aux effets déjà connus des UV sur l'ADN.
Les lésions causées au sein de la molécule d'ADN semblent être majoritairement responsables
de la destruction des germes, et en particulier des bactéries. Un travail de recherche au niveau
moléculaire, dans la même optique que ceux réalisés pour les traitements UV continus
(Setlow, 2001) pourrait permettre non seulement d'apprécier l'impact de la lumière pulsée sur
l'ADN des spores et des cellules, mais également de démontrer les facteurs de réparation mis
en jeu, en fonction de l'état physiologique des cellules (Moeller et al., 2007). Une extraction
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de l'ADN des cellules suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose pourrait mettre en
évidence, dans un premier temps, les possibles lésions de l'ADN causées par les UV pulsés
(Yang & Wang, 2008). Il serait par là très intéressant de comparer B. subtilis et d'A. niger,
afin de comprendre les différences de réaction des deux germes.
L'effet photothermique est un second mécanisme qui pourrait expliquer les différents
comportements des microorganismes. Leur plus grande sensibilité sur surfaces sèches (surtout
dans le cas d'A. niger) pourrait être due à des transferts de chaleur au milieu environnant
moins efficaces que sur milieu humide où le refroidissement est plus rapide. Wekhof et al.
(2001) présentent l'effet photothermique comme responsable de l'éclatement des spores d'A.
niger.
Au cours de la présente thèse, lors d'observations microscopiques, aucune modification de
structure n'a été constatée sur les spores d'A. niger sur surface polystyrène. La surface autour
des spores n'a pas non plus montré de déformation, contrairement à ce que l'on peut retrouver
dans la littérature (Wekhof et al., 2001). Il n'est pourtant pas exclu qu'un tel effet ait bien lieu,
c'est pourquoi des expériences supplémentaires de coloration seraient intéressantes afin de
mettre en évidence quelques possibles modifications d'intégrité des membranes causées par la
chaleur (Coleman et al., 2007). L'utilisation de colorants fluorescents spécifiques (coloration
Live/Dead Backlight) pourrait permettre d'évaluer l'intégrité des membranes des spores
(Laflamme et al., 2004).
Le comportement des microorganismes face à différentes conditions post-traitement peut

livrer des indications sur les dommages provoqués au sein d'un microorganisme (spores ou
152
cellules végétatives). Ainsi, certaines caractéristiques du milieu de récupération (pH, aw,

teneur en chlorure de sodium, nitrites......) et des conditions d'incubation (température) ou
même l'utilisation de stress après traitement par LP (choc thermique, stress osmotique,
utilisation d'antibiotiques), pourront mettre en évidence des sites possibles de lésions causées
par la LP. En effet, il a été établi que certaines réactions caractéristiques peuvent être
associées à des dommages spécifiques, tant au sein des spores que des cellules végétatives.
Par exemple, Mackey (2000) évoque la perte de la thermorésistance des spores bactériennes
après traitement ionisant comme caractéristique de dommages causés au niveau du cortex de
la spore.
La résistance d'A. niger est parfois définie comme liée à la couleur des spores (Farkas,
2007). Plusieurs études ont également démontré la capacité des pigments de mélanine à
protéger l'ADN de différents microorganismes contre les UV (Geng et al., 2008; Ruan et al.,
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2004). Des spores pigmentées d'espèces de Bacillus se sont révélées plus résistantes aux
longueurs d'onde UVA que des spores non pigmentées (Moeller et al., 2005). En revanche, la
résistance de ces différentes spores aux UV-C n'a pas prouvé de lien avec la pigmentation.
L'étude de la résistance aux UVA de 37 souches d'A. niger (divisées en 2 groupes en fonction
de la teneur en mélanine) a montré une plus forte résistance du groupe présentant des
concentrations élevées de pigments (Singaravelan et al., 2008). Le traitement de souches à
teneurs différentes en mélanine, ou de mutants non colorés d'A. niger pourrait nous permettre
de mettre en évidence l'impact de ces pigments de mélanine dans la protection des
microorganismes traités par LP.
Fractionnement de la dose
Le fractionnement de la fluence en un ou plusieurs flashes n'a montré aucun impact
négatif sur la décontamination des spores de B. subtilis. Une même fluence totale délivrée en
un ou plusieurs flashes (jusqu'à 5) a entraîné une même réduction logarithmique, quelles que
soient la fluence testée et la tension appliquée. En revanche, la multiplication des flashes de
faible fluence (0.17 J/cm² par flash) a entraîné une décontamination très faible voire
quasiment nulle des spores d'A. niger, même si la fluence totale atteignait 1.7 J/cm² (10
flashes). La méthode d'application de la dose peut avoir une importance marquée selon le
microorganisme traité. Il s'avère donc nécessaire de qualifier le traitement à la fois par la
fluence reçue, et par le nombre de flashes appliqués. Ceci peut poser des problèmes d'ordre
technique, car augmenter la fluence au delà d'une certaine valeur n'est possible qu'en
multipliant les flashes. La multiplication des flashes de faible énergie pourra ainsi entraîner
153
une décontamination plus faible que ce qu'il est possible d'atteindre avec la même énergie
mais délivrée en un seul flash.
Interactions avec les surfaces

Outre les effets de diffusion thermique, certains résultats (Woodling & Moraru, 2005)
évoquent plusieurs facteurs d'influence de la surface sur la décontamination. L'exemple de B.
subtilis traité sur polystyrène et sur verre en est une bonne illustration. En effet, d'un point de
vue microscopique, les deux surfaces présentent un profil très similaire, à savoir l'absence de
failles et rugosités. Pourtant, la résistance des spores sur le verre est supérieure à celle sur
plastique. Les propriétés optiques de la surface, peuvent avoir une incidence sur l'efficacité du
traitement. Ainsi, d’après Woodling & Moraru (2005), une surface présentant une forte
réflectivité provoquera une absorption de la lumière moins importante au niveau de la cellule.
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
En fait le problème est sans doute plus compliqué. Il faudrait aussi tenir compte de la
diffusion en surface et en volume et de la géométrie des microorganismes. L'adhésion des
microorganismes aux surfaces inertes peut dépendre de l'hydrophobicité du matériaux (Peng
et al., 2001), de la composition du milieu de suspension (Barnes et al., 1999), mais aussi du
microorganisme (Faille et al., 2002). Elle peut être différente selon la phase de croissance des
microorganismes testés, en raison des charges de surfaces différentes selon le stade (Peng et
al., 2001). L'hydrophobicité plus ou moins marquée des microorganismes peut être à l'origine
d'agrégations importantes, entraînant une meilleure protection face à l'illumination (Mamane-
Gravetz & Linden, 2005).
Applications industrielles
L'étude de la décontamination de sirop de sucre par lumière pulsée a révélé une efficacité
germicide supérieure à 3 cycles logarithmiques sur des spores d'A. acidoterrestris, agent
d'altération de jus de fruits ou encore de sodas, et ce sur une épaisseur de traitement allant
jusqu'à 10 mm. La lumière pulsée s'est également avérée efficace pour traiter le sirop de sucre
en flux continu, sur une épaisseur de 2 mm. La validation en laboratoire du procédé appliqué
en continu a permis la réalisation d'un pilote industriel de plus grande capacité, conçu pour
décontaminer du sirop de sucre sur une épaisseur de 10 mm, avec un débit continu pouvant
aller jusqu'à 5 m3/h. La mise au point d'un protocole de test a permis de valider une
décontamination des spores d'A. acidoterrestris supérieure à 3 cycles logarithmiques, pour un
flux continu avec un débit égal à 1,5 m 3/h. Le protocole appliqué en laboratoire n'est pour
l'instant qu'une étape préliminaire à la validation de l'équipement au niveau industriel. Les
154
résultats ont montré une variabilité marquée, du fait des expériences difficiles à mettre en
œuvre et des gros volumes de sirop nécessaires.
L'application de la technologie de lumière pulsée est limitée par certaines contraintes, à la
fois techniques et pratiques. Tout comme les UV continus, cela reste une technique de
décontamination de surfaces ou de produits de faible épaisseur. La plupart des produits ne
peuvent donc pas être traités au travers de leur emballage. La décontamination de liquides ne
sera possible que sur de faibles épaisseurs et qui plus est, sur des fluides transparents aux UV.
En revanche, les résultats obtenus valident la technologie en termes d'efficacité
décontaminante. Les études menées sur différents microorganismes et différentes surfaces
nous donnent des indications sur des niveaux de décontamination envisageables en industrie,
notamment grâce aux logiciels d'optimisation (APILUX, OPTILUX). Ainsi, les demandes
industrielles concernant des géométries précises de produits peuvent faire l'objet de réponses
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
spécifiques.
A l'heure actuelle, le développement de la technologie s'oriente vers l'étude d'autres
sources lumineuses. Grâce aux travaux présentés ici concernant l'efficacité des UV nous nous
sommes intéressés à une catégorie particulière de lampes UV appelées excimères. Ces lampes
émettent à haute cadence des impulsions quasi monochromatiques à différentes longueurs
d’onde dans le domaine de l’UV-C. Selon le mélange de gaz utilisé on obtient 280 nm
(XeBr), 222 nm (KrCl) ou 206 nm (KrCl). D’autres longueurs d’onde dans le domaine UVA
sont également possibles. Des expériences préliminaires d'inactivation de spores de B. subtilis
ont démontré, à fluence UV-C équivalente, une efficacité comparable à la LP ou l’UV continu
à 254 nm. Il serait intéressant de voir si ce type de lampes peut permettre une décontamination
des spores d'A. niger.
Nous sommes encore loin de maîtriser la lumière pulsée aussi bien que les traitements
thermiques. Il reste des points importants à éclaircir, afin d'avoir le recul nécessaire à la
connaissance précise du procédé. La lumière pulsée est cependant une technologie propre,
économique et compacte. Elle n'utilise aucun produit chimique, ne nécessite pas d'eau, et ses
lampes ne contiennent pas de mercure, et permettant une décontamination microbiologique
efficace applicable à plusieurs domaines industriels.
Peut-être a-t-on là le début d'un nouveau siècle des Lumières...
155
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172
Valorisation du travail de thèse

Articles scientifiques
Planchon S., Dargaignaratz ., Levy C., Ginies C., Broussolle V., Carlin F. (2010). Spores of Bacillus
cereus strain KBAB4 produced at 10 °C and 30 °C display variations in their properties. Food
Microbiology. 1-7.
Communications scientifiques
Levy C., Gatt G., Busnel M., Chemaly M., Coignard M., Valette M.A. (2009) "Décontamination des
oeufs coquilles par le procédé de lumière pulsée" (communication orale). Huitièmes journées de la
recherche avicole, St Malo, France, 25 et 26 mars.
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Levy C., Aubert X., Lacour B., Riedel C., Carlin F. (2009). "Quels sont les facteurs influençant
l'efficacité de la lumière pulsée pour l'élimination des microorganismes dans l'industrie
alimentaire?" (communication orale). Colloque de la SFM, Institut Pasteur, Paris, 5 novembre.
Levy C. (2009) "Quels sont les facteurs influençant l'efficacité de la lumière pulsée pour
l'élimination des microorganismes dans l'industrie alimentaire?" (Poster). Journées de l'école
doctorale SP-SA Montpellier II.
l'élimination des microorganismes dans l'industrie alimentaire?" (Poster). 8ème congrès national
de la SFM, Marseille, 2, 3 et 4 Juin.
Levy C., Aubert X., Lacour B., Carlin F. (2010) "Relevant factors of the decontamination by
Pulsed Light in the food industry". (communication orale). 22nd International ICFMH Symposium,
Food Micro 2010, Copenhagen
Web conference
Riedel C., Aubert X., Levy C. (2010) "Claranor sterilization purified". 14th June.
www.claranor.com
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Planchon S., Dargaignaratz ., Levy C., Ginies C., Broussolle V., Carlin F. (2010). Spores of Bacillus
cereus strain KBAB4 produced at 10 °C and 30 °C display variations in their properties. Food
Microbiology. 1-7.
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
174
Levy C., Gatt G., Busnel M., Chemaly M., Coignard M., Valette M.A. (2009)
"Décontamination des oeufs coquilles par le procédé de lumière pulsée" (communication
orale). Huitièmes journées de la recherche avicole, St Malo, France, 25 et 26 mars.
DECONTAMINATION DES OEUFS COQUILLES

PAR LE PROCEDE DE LUMIERE PULSEE
Levy Caroline1, Gatt Gérard1, Busnel Morgane1, Chemaly Marianne2,

Coignard Muriell,3, Valette Marie-Anne3
1
CLARANOR, Chemin de la Rollande, Agroparc, BP 21 531, F-84916 Avignon cedex 9, France
, 2AFSSA, UHQPAP, BP 53 22440 Ploufragan, 3ASEPT, Rue des Docteurs Calmette et Guérin - BP
2047 - 53020 LAVAL
La problématique de la contamination des oeufs par des microorganismes pathogènes est un sujet
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
sensible pour une filière à laquelle très peu de solutions technologiques sont offertes. Une étude,
menée en collaboration entre l’entreprise CLARANOR, l’AFSSA et le laboratoire ASEPT, visait à
évaluer l’efficacité d’un procédé de décontamination par lumière pulsée d’oeufs coquille calibrés (60 -
70g) et mirés mais naturellement contaminés en germes totaux aérobies mésophiles (contamination >
104 germes totaux par oeuf). La lumière pulsée est une technologie de décontamination de surface qui
met en oeuvre l’action bactéricide des rayons UV, appliqués aux surfaces sous la forme de flashs de
lumière de grande intensité. Un lot d’oeufs témoin a servi à déterminer la contamination initiale du lot.
Les oeufs présentant des salissures, souillures, ou traces de liquide séché ont été écartés, ainsi que les
oeufs fêlés, déformés, auréolés ou avec une coquille poreuse. Trois lots d’oeufs ont été traités selon
trois modalités différentes (1 flash de lumière à 3kV ; 3 flashs à 3 kV et 4 flashs à 2 kV) puis ont été
analysés pour déterminer l’efficacité du procédé. La contamination résiduelle en flore totale aérobie
mésophile a été dénombrée. L’analyse statistique des résultats a permis de montrer que les trois
traitements par lumière pulsée permettent une réduction microbienne d’au moins 2 log UFC par oeuf.
Les traitements 1 flash et 3 flashs à tension 3kV présentent une meilleure efficacité que le traitement 4
flash à 2 kV, mais ne sont pas significativement différents entre eux. Le procédé de décontamination
par lumière pulsée testé permet donc une réduction microbienne de la surface de la coquille d’oeuf de
plus de 3 Log UFC par oeuf. Suite à cette phase d’essais, un équipement industriel de traitement en
ligne permettant d’atteindre les mêmes performances de décontamination que celles obtenues lors des
essais a été mis au point. L’unité industrielle met en oeuvre 13 lampes installées en sortie de calibreuse
et permet de traiter les oeufs à une cadence de 60 000 / heure.
175
Levy C., Aubert X., Lacour B., Riedel C., Carlin F. (2009). "Quels sont les facteurs
influençant l'efficacité de la lumière pulsée pour l'élimination des microorganismes dans
l'industrie alimentaire?" (communication orale). Colloque de la SFM, les moyens de
Maîtrise des contaminants microbiologiques de la chaîne alimentaire, Institut Pasteur, Paris, 5
novembre.
Quels sont les facteurs influençant l’efficacité de la lumière pulsée pour l’élimination des
microorganismes dans l’industrie alimentaire ?
Levy Caroline1, 2, Aubert Xavier1, Lacour Bernard1, Riedel Christophe1, Carlin

Frédéric2
1
CLARANOR, Chemin de la Rollande, Agroparc, BP 21 531, F-84916 Avignon cedex 9, France,
2
INRA, SQPOV, domaine St Paul site Agroparc 84914 AVIGNON Cedex 9
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
La lumière pulsée détruit les microorganismes par l’application d’éclairs lumineux (« flashes ») de courte durée
(quelques µs), et de très forte puissance. Le spectre lumineux émis comprend des longueurs d’onde de 200 à
1100nm (UV, visible, IR). Nos travaux consistent à déterminer les bases scientifiques de l'effet de la lumière
pulsée sur les microorganismes afin d'établir un modèle, voire les lois générales de leur destruction, sur un mode
semblable à ce qui peut exister pour les traitements thermiques. L'efficacité de la lumière pulsée dépend de
nombreux facteurs, d'origine très différente. Le premier domaine étudié correspond aux qualités physiques de la
lumière. Grâce à la connaissance d'une dose de lumière maîtrisée et qualifiée pour chaque traitement, il est
possible d'exprimer la destruction microbienne en fonction d'une quantité de lumière connue. L'étude de
l'importance des UV contenus dans la lumière pulsée a mené à la conclusion que la fraction UV-C (200-280nm)
est indispensable à l'efficacité bactéricide. Comme tout traitement, l'efficacité germicide va dépendre de facteurs
biologiques et environnementaux. Etablir des lois générales de destruction par lumière pulsée nécessite l'étude
d'un grand nombre d'espèces microbiennes. Un même traitement appliqué sur différentes souches permet un
classement des microorganismes en fonction de leur résistance plus ou moins marquée à la lumière pulsée. Grâce
à cela, un parallèle avec le classement d'espèces selon leur thermorésistance a permis de constater que les
mécanismes de résistance à la lumière pulsée ne sont pas ceux mis en jeux lors de la thermorésistance. L'étude de
l'environnement dans lequel évoluent les microorganismes est également primordial et constitue un réel enjeu
notamment pour les applications industrielles. En effet, les spores bactériennes sont souvent désignées comme
sources de contamination dans les milieux industriels, du fait de leur capacité à adhérer aux surfaces et à résister
à différents traitements. Des spores de B.subtilis DSM 402 ont été traitées sur milieu nutritif et sur 3 surfaces
sèches (aluminium, polystyrène, verre). Un traitement d'un seul flash (200µs) a permis de détruire plusieurs
cycles logarithmiques, sur les 4 types surfaces traitées. Les méthodes utilisées pour tester ces différents supports
pourront également s'appliquer au traitement de spores de moisissures, elles aussi responsables de
contaminations dans le secteur agroalimentaire. Il est important d'obtenir un grand nombre de résultats de
décontamination, en fonction d'une variété très importante de facteurs d'influence, afin de cibler les domaines
d'application industrielle de la technologie.
176
l'élimination des microorganismes dans l'industrie alimentaire?" (Poster). Journées de
l'école doctorale SP-SA Montpellier II
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
177
l'élimination des microorganismes dans l'industrie alimentaire?" (Poster). 8ème congrès
national de la SFM, Marseille, 2, 3 et 4 Juin.
QUELS SONT LES FACTEURS INFLUENCANT L'EFFICACITE DE LA LUMIERE

PULSEE POUR L'ELIMINATION DES MICROORGANISMES DANS L'INDUSTRIE
ALIMENTAIRE ?
Levy Caroline1, 2, Aubert Xavier1, Lacour Bernard1, 3, Riedel Christophe1, Carlin Frédéric2
1
2
INRA,Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse, UMR 408 Sécurité et Qualité des Produits d’Origine Végétale, 84000
AVIGNON Cedex 9, 3Laboratoire de Physique des Gaz et des Plasmas, UMR 8578 CNRS & Université Paris-Sud, 91405
Orsay, France
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
La lumière pulsée détruit les microorganismes par l’application d’éclairs de lumière blanche (« flashes ») de
courte durée et de très forte puissance. Le spectre lumineux émis comprend des longueurs d’onde de 200 à
1100nm. Nos travaux consistent à déterminer les bases scientifiques de l'effet de la lumière pulsée sur les
microorganismes afin d'établir un modèle, voire les lois générales de leur destruction, sur un mode semblable à
ce qui peut exister pour les traitements thermiques. Un pilote de lumière pulsée (LP) fabriqué par la société
CLARANOR S.A. à été caractérisé, et permet une illumination homogène à la surface de boites de Petri de
diamètres compris entre 35 mm et 90 mm. Les caractéristiques physiques de la lumière incidente ont été
déterminées et la destruction microbienne a été exprimée en fonction de la fluence. La fraction UV-C (200-280
nm) est indispensable à l'efficacité bactéricide. Les endospores de plusieurs espèces bactériennes et des spores
d’Aspergillus niger ont été traitées par la lumière pulsée à des doses comprises entre 0 et 1,8 j cm -2 (soit à des
doses d’UV-C comprises entre 0 et 145 mJ/cm²) et classées. Les spores d’Aspergillus niger s’avèrent plus
résistantes que les spores des Bacillus spp. Les espèces bactériennes les plus thermorésistantes, ne sont pas les
plus résistantes à la LP. B.subtilis, B.atrophaeus et B.pumilus ont montré une destruction similaire par traitement
à des fluences équivalentes de lumière pulsée et d’UV-C à une longueur d’onde de 254 nm. Les UV-C
nécessitent un temps de traitement 50 000 fois supérieur à celui de la lumière pulsée pour permettre les mêmes
niveaux de décontamination (et délivrer les mêmes fluences). Les spores bactériennes ont également été choisies
pour tester l'efficacité de la lumière pulsée sur différentes surfaces représentatives de celles rencontrées dans
l’industrie alimentaire. Un ensemencement par spray mis au point dans le cadre de ce travail a permis d’obtenir
une monocouche de cellules sur les surfaces traitées. Un flash (200µs) a permis une réduction de plusieurs cycles
logarithmiques, sur 3 surfaces sèches traitées, ainsi que sur milieu nutritif gélosé. La méthode d’ensemencement
par spray s’est avérée beaucoup plus adaptée que la méthode d’ensemencement des surfaces par dépôts de
gouttelettes de suspensions microbiennes à l’étude de la décontamination des surfaces par des radiations
lumineuses, en raison d’un ensemencement homogène, en monocouche présentant très peu d’amas cellulaires.
Les possibilités d’application de la lumière pulsée issues de ce travail seront discutées.
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Levy C., Aubert X., Lacour B., Carlin F. (2010) "Relevant factors of the decontamination
by Pulsed Light in the food industry". (communication orale). 22nd International ICFMH
Symposium, Food Micro 2010, Copenhagen
RELEVANT FACTORS OF THE DECONTAMINATION BY PULSED LIGHT IN

THE FOOD INDUSTRY
Levy Caroline1, 2, Aubert Xavier1, Lacour Bernard1, Carlin Frédéric2

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INRA, SQPOV, domaine St Paul site Agroparc 84914 AVIGNON Cedex 9
Decontamination by Pulsed light (PL) technology uses intense flashes of broad spectrum (200 -1100
nm) white light to kill microorganisms. This work presents the relevant physical, biological and
tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
environmental factors influencing the efficiency of PL decontamination. A PL equipment allowing to

express a bacterial reduction as a function of the light dose effectively received by the sample (and not
as a function of non adequate factors such as distance to the lamp or number of flashes) was qualified.
A 5 log reduction of B.subtilis spores has been obtained with a fluence of 0.8 J/cm 2 delivered in 1
flash. The UV-C part of the light (wavelenghths between 200 and 280 nm) is essential for the
bactericidal activity. The log reductions as a function of UV-C dose of PL and the same UV-C dose
using continuous UV light (254 nm) were similar for a given UV-C fluence, and this for several
bacterial species, but with the continuous UV a treatment lasts at least 95000 times longer than the PL
treatment. Bacterial and mould spores have been tested with PL fluences from 0 to 1.8 J/cm² under an
input voltage of 2500 V (i.e. UV-C doses from 0 to 0.15 J/cm²). A high variability was found. Some
species, like B.subtilis, B.pumilus, B.licheniformis showed a high sensitivity to pulsed light, with a
5log reduction with less than 1 J/cm². Some species, such as Aspergillus niger or B.cereus showed a
higher resistance to PL. The most heat-resistant species were not necessarily the most resistant to PL.
The PL efficiency has been tested on different supports: agar plates representing a wet surface and
some dry surfaces representative of the surfaces of the food industry: polystyrene, aluminium and
glass. A monolayer (observed by scanning electron microscopy) of B. subtilis spores was sprayed
using a specifically developed method. A 3 log reduction was obtained with 1 flash only at a dose of
0.5 J/cm² whatever the surface agar, polystyrene, glass or aluminium. The spray method was shown to
be better adapted than the droplets deposition to study the pulsed light decontamination on dry
surfaces, in particular because of formation of aggregates and several cell layers. Industrial application
of PL to the food industry resulting from this work will be discussed.
180
Riedel C., Aubert X., Levy C. (2010) "Claranor sterilization purified". 14th June.
www.claranor.com
STERILIZATION PURIFIED – SECURE YOUR FILLING LINE USING PULSED

LIGHT
Date: Monday 14th June,

tel-00747302, version 1 - 31 Oct 2012
Time: 17:00 CET, 11:00 am EST

Duration: 1 hour
Pulsed light: a non chemical and dry technology to sterilize caps, closures and cups.
Sterilizing caps, closures and cups in a filling line is, most of the time, a ‘dirty’ job.
Chemicals, excessive use of water and wasting energy with heat. Until now manufacturers of
dairy and beverages did, much to their disappointment, not have any alternative. But now they
do, with pulsed light. After years of development, CLARANOR brought the pulsed light
technology to a performance level that meets industry standard. So if you want to lead as an
eco-responsible manufacturer, and improve on your cost performance: integrate CLARANOR
in your filling line. This seminar will introduce you to the revolutionary pulsed light
technology: - its perfect performance as a sterilizer;
- its cost performance benefits; and
- its environment friendly assets.
Claranor Sterilization Purified
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Ecole Doctorale

"Science des procédés-science des aliments"

Docteur de l'Université d'Avignon et des Pays de Vaucluse

Principaux facteurs influençant l'efficacité de la

Rapporteurs Mme Brigitte CARPENTIER - Directeur de recherche - ANSES

Examinateurs Mme Catherine DUPORT - Professeur - Université d’Avignon

Directeur de Thèse M. Frédéric Carlin - Directeur de Recherches – INRA

" L'homme et sa sécurité doivent constituer la première

Table des matières

Avant propos .............................................................................................................................. 1

Présentation du travail de thèse ................................................................................................ 55

influençant l'efficacité germicide. ...................................................................................... 106

Le développement de nouveaux procédés technologiques visant à l’amélioration de la

utilisateurs industriels, CLARANOR a mis en place une stratégie de recherche et

La conservation des aliments est un combat constant contre les microorganismes

Le traitement thermique est aujourd'hui la technique de décontamination la plus

appliqué. La pasteurisation nécessite un chauffage généralement inférieur à 100°C et la

Table 1: Exemple de barèmes de pasteurisation, établis pour différents produits alimentaires

microbienne vivante. Le traitement à ultra haute température (UHT) consiste à chauffer le

Journal of Food Protection (JFP), Applied and Environmental Microbiology (AEM),

2) Mécanismes d'inactivation des microorganismes

3) Efficacité microbiologique du traitement thermique

Le traitement thermique est caractérisé par le couple temps/température. Les premiers

avec t le temps de traitement, N0 la population initiale, N la population survivante au temps t

Avec N la population survivante après un traitement thermique de temps t, N0 la population

avec t le temps, γ(t) la concentration bactérienne au temps t, N 0 (>0) la concentration initiale à

Figure 1: Exemple de courbes de réduction obtenues lors d'un traitement thermique. A)

Même si de nombreux travaux définissent différents paramètres pour évaluer l'efficacité

Table 2: Niveaux de thermorésistance approximatifs de cellules végétatives bactériennes

Table 3: Niveaux de thermorésistance de spores bactériennes (Farkas, 2007)

Les premières évaluations de la résistance de certaines espèces sont anciennes et donnent

Divers facteurs (composition du milieu environnant pendant ou après traitement,

de leur thermorésistance (Movahedi & Waites, 2000). La composition du milieu de reprise ou

Figure 2: Deux exemples de stérilisateurs statiques (Exapro, 2010; Steriflow thermal

rapide et à forte température. Ce procédé combine à la fois fabrication et décontamination.

5) Avantages du traitement thermique, limites, produits cibles

Les techniques de décontamination par traitement thermique sont anciennes et bien

D'autres traitements physiques de décontamination sont aujourd'hui connus et

3. Techniques non thermiques alternatives

1) Hautes Pressions Hydrostatiques (HPH) et Hautes Pressions à Dioxyde de

b. Mécanismes d'inactivation des microorganismes

Hautes pressions à dioxyde de carbone:

Figure 4: Représentation schématique d'un équipement HPDC (Watanabe et al., 2003)

Figure 5: Exemple d'équipement haute pression industriel (NC Hyperbaric, 2010)

Table 4: Exemple de prix des équipements HPH (Meyer et al., 2000)

Le règlement européen n°258/97, communément appelé "Novel food" et datant du 27

composition ou dans la structure des aliments ou des ingrédients alimentaires des

f. Avantages de la technologie, limites, produits cibles

irréversible après dépressurisation. De nombreux facteurs peuvent affecter la qualité finale du

2) Champs électriques pulsés (CEP)

pourraient quant à eux modifier la conductivité du milieu, et ainsi protéger les

Table 5: Décontaminations microbiologiques par CEP

Courant alternatif - 110 V

Figure 6: Schéma d'un équipement CEP (Wu et al., 2005)

f. Avantages de la technologie, limites, produits cibles

l'anode, certainement dus à l'insolubilisation et à l'agrégation de ces protéines. Un lavage

C.perfringens (cellules) 0.59-0.83

f. Avantages de la technologie, limites, produits cibles

réfractaires à l'irradiation parlent du manque d'information des consommateurs et de

Figure 9: Action mutagène des UV (www. edu.upmc.fr)