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Méthodes d’étude de la cellule 2018/2019
Introduction:
• Notion de pouvoir de résolution ou de pouvoir séparateur :
La résolution est définie comme la distance minimale séparant deux points individualisables. Chez
l’homme le PS est de 0,1mm à une distance de 25cm.
Le P.S du microscope photonique (MP) est de l’ordre de 0,2 µm
1. Description des microscopes :

A. le microscope photonique :
Voir planche 1
b. Le microscope électronique à transmission : il comprend :
• Un canon à électrons (filament de tungstène porté à une haute tension 200 000 V) ; un tube
ou une pompe à vide ; une série de lentilles électromagnétiques ; une grille porte objet ; un
écran fluorescent relié à un écran de télévision.
c. Le microscope électronique à balayage : il comprend :
• Un canon à électrons, un tube à vide, une grille porte objet ; un circuit de balayage et un
écran de tv.
2. Principe de fonctionnement des microscopes :
• Deux types d’observations sont réalisables en microscopie : l’observation par transmission

pour le MP (lentilles de verre) et le MET (lentilles électromagnétiques ) et l’observation par
réflexion pour le MEB.
S : source
L1 : lentille du condensateur
O : objet ou échantillon
L2et L3 : lentilles grossissantes
I : image
Biologie cellulaire Université Badji Mokhtar Mme Chaker

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3. Conditions d’observation en microscopie :
Pour effectuer une observation en microscopie deux conditions sont requises :
• L’épaisseur de l’échantillon : pour permettre le passage des électrons ou des photons

l’épaisseur de l’échantillon doit être de 2 à 10 µm pour le MP et de 300 à 500A, pour le ME.
• Le contraste : l’observation par transmission n’est possible que si certaines régions de la

coupe absorbent les photons ou les électrons plus que d’autres : c’est l’effet contraste.
4. Technique de coupe et de réplique :
4-1. Technique de coupe : Technique Histologique (MP) et Technique cytologique (MET) ; histo :
tissu, cyto : cellule
La technique de coupe se réalise en six étapes :
• la fixation : dans des fixateurs, ex : le formol (MP) et le tétroxyde d’osmium (MET)
• La déshydratation : par des passages successifs dans de bains d’alcool à degrés croissant.
• L’imprégnation : remplace progressivement le solvant par le milieu d’inclusion : la paraffine

(MP) ou la résine (MET).
• L’inclusion : enrober l’échantillon dans le milieu d’inclusion pour confectionner un bloc (MP)
ou une gélule (ME) et le couper.
• La coupe : s’effectue sur un microtome (MP) ou un ultramicrotome (MET). Le contraste est

augmenté par l’utilisation de colorants spécifiques (MP) ou des contrastants tels que les sels
de métaux lourds opaques aux électrons (MET).
4-2. Technique des répliques (copie) :
• La congélation : fixation très rapide dans l’azote liquide (à – 200 °c)
• La cryofracture : l’objet est fracturé sous vide par l’action d’une lame elle-même refroidie.
• Le décapage par sublimation qui assure l’évaporation de l’eau de la surface de la fracture.
• La réplique carbonnée : une 1ère vaporisation verticale d’une mince couche de carbone

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• L’ombrage : une 2ème vaporisation oblique de platine, en produisant un effet d’ombre
• La réplique obtenue est retirée de l’enceinte sous vide après dissolution des débris
cellulaire (support organique) à l’aide d’un acide
• A l’observation au MEB, l’image observée présente des reliefs et des dépressions.
5- Techniques de contraste électronique :
5-1- Coloration négative : créer un contraste électronique sur des coupes minces aux sels de
métaux lourds opaques aux électrons (MET). Les organites sont alors colorés à différents degrés
selon leur affinité
5-2- Coloration négative : Les échantillons sont isolés par UCD ou UGD, mis dans une solution
opaque aux électrons dans une chambre aspirante pour séchage. La substance opaque aux électrons
se dépose autour de l’objet sans le pénétrer : le pourtour est donc contrasté.
5-3- L’ombrage : technique qui s’applique sur des macromolécules isolées. Pour créer une ombre de
notre échantillon, les sels de métaux lourds sont vaporisés d’une manière oblique (inclinée).
6-Technique de détection et localisation des composés cellulaires :

Ex : La technique d’autoradiographie (voir TD1) : Cette technique permet de localiser un composé et
de suivre son cheminement dans la cellule grâce à un traceur (métabolite renfermant un atome
radioactif tel que le carbone 14) qui peut émettre un rayonnement révélé par un procédé spécifique
7- Technique d’isolement des organites :
a. l’homogénéisation : ou fractionnement cellulaire :
• Permet l’obtention d’un homogénat à partir de cellules identiques (population bactérienne,

cellules en culture, fragment d’organe…)
• Ces cellules sont placées dans des tubes à essais contenant une solution isotonique : c’est la
suspension.
• La suspension est fractionnée suite à un traitement physique (ultrasons), chimique (addition

d’un détergent acide ou basique), ou mécanique (écrasement par un piston vertical ou
tournant).
• Déchirements membranaires : les organites cellulaires et les métabolites sont alors libérés
dans la solution isotonique : c’est l’homogénat.
b. La centrifugation de l’homogénat :
• Elle consiste à séparer l’homogénat en différentes parties ; elle permet d’isoler les organites
selon leur coefficient de sédimentation.
• L’ultracentrifugation différentielle ou l’UCD, selon le coefficient de sédimentation qui

permait d’isoler des organites de plus en plus légers en augmentant la vitesse et la durée.

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• Afin de séparer les organites contenus dans un même culot (ayant le même coefficient de
sédimentation), on pratique l’ultracentrifugation sur gradient de densité ou l’UGD. Cette
dernière consiste à déposer l’échantillon (un des culots) dans un gradient de saccharose
(pour isoler les organites). Après centrifugation les organites se répartissent dans les zones
de gradient de même densité qu’eux. Les zones de gradients ou bandes finales sont
collectées en perçant le tube de centrifugation.
8. La culture cellulaire :
La culture cellulaire est un ensemble de techniques de biologie utilisées pour faire croître
des cellules hors de leur organisme (ex-vivo).
Les cellules mises en culture peuvent être:
• des micro-organismes libres (bactéries ou levures)
• des cellules « saines » prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie)
• des cellules ayant une capacité de division non limitée. Ce sont des lignées cellulaires : soit
des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines
rendues « immortelles » artificiellement, soit des cellules souches.
• Des tranches d'organes (d'épaisseur optimisée selon le tissu)
8-1 Culture primaire :
La culture primaire est le fait de mettre en culture des cellules prélevées directement de l’organisme
(voir les différentes origines des cellules : paragraphe précédent) en suspension (dans un milieu
nutritif liquide) ou sur une gélose (milieu solide).
8-2 Culture secondaire :
• Repiquage ou culture secondaire : Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire
ont poussé et couvert tout le substrat de culture disponible, elles doivent être repiquées
(pour donner de la place) c’est la culture secondaire.
Si les cellules ne sont pas isolées, il faudrait rajouter des enzymes (protéolytiques) pour rompre
les liaisons protéiques et prélever les cellules pour une culture secondaire.

Page 4

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• Notion de pouvoir de résolution ou de pouvoir séparateur :

Le P.S du microscope photonique (MP) est de l’ordre de 0,2 µm

1. Description des microscopes :

b. Le microscope électronique à transmission : il comprend :

c. Le microscope électronique à balayage : il comprend :

2. Principe de fonctionnement des microscopes :

• Deux types d’observations sont réalisables en microscopie : l’observation par transmission

L2et L3 : lentilles grossissantes

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Pour effectuer une observation en microscopie deux conditions sont requises :

• L’épaisseur de l’échantillon : pour permettre le passage des électrons ou des photons

• Le contraste : l’observation par transmission n’est possible que si certaines régions de la

4. Technique de coupe et de réplique :

La technique de coupe se réalise en six étapes :

• la fixation : dans des fixateurs, ex : le formol (MP) et le tétroxyde d’osmium (MET)

• L’imprégnation : remplace progressivement le solvant par le milieu d’inclusion : la paraffine

• La coupe : s’effectue sur un microtome (MP) ou un ultramicrotome (MET). Le contraste est

4-2. Technique des répliques (copie) :

• La congélation : fixation très rapide dans l’azote liquide (à – 200 °c)

• Le décapage par sublimation qui assure l’évaporation de l’eau de la surface de la fracture.

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• A l’observation au MEB, l’image observée présente des reliefs et des dépressions.

5- Techniques de contraste électronique :

6-Technique de détection et localisation des composés cellulaires :

7- Technique d’isolement des organites :

a. l’homogénéisation : ou fractionnement cellulaire :

• Permet l’obtention d’un homogénat à partir de cellules identiques (population bactérienne,

• La suspension est fractionnée suite à un traitement physique (ultrasons), chimique (addition

• L’ultracentrifugation différentielle ou l’UCD, selon le coefficient de sédimentation qui

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Les cellules mises en culture peuvent être:

• des micro-organismes libres (bactéries ou levures)

• des cellules « saines » prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie)

• Des tranches d'organes (d'épaisseur optimisée selon le tissu)

8-1 Culture primaire :

8-2 Culture secondaire :

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