République Algérienne démocratique et Populaire

Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la recherche Scientifique

Université des Sciences et de la Technologie houari Boumediene

Faculté des Sciences Biologiques

Système LMD

Biologie Cellulaire
Domaine SNV

Licence : 1ère année

Révisé en Juillet 2016

Cours illustré de Biologie Cellulaire - L1 / SNV (FSB / USTHB) Révisé en Juillet 2016

TECHNIQUES APPLIQUEES EN BIOLOGIE

CELLULAIRE

A. TECHNIQUES D’ISOLEMENT
D’ISOLEM
Techniques qui consistent à séparer les différents organites et composants cellulaires par
destruction de la membrane plasmique et désorganisation de la cellule.

I.. FRACTIONNEMENT DES CELLULES ET DES TISSUS

1. But : l’obtention d’un homogénat cellulaire par fractionnement des tissus et des cellules de
manière contrôlée.

2. Etapes
2.1. Prélèvement d’une suspension cellulaire ou tissu.
2.2. Homogénéisation : en utilisant des procédés mécaniques doux, les membranes plasmiques
des cellules peuvent être rompues, de sorte que le contenu cellulaire est libéré. Quatre procédés
sont fréquemment utilisés :
a. fractionnement
ractionnement par des ultrasons à haute fréquence,
b. utilisation d’un détergent doux pour faire des trous dans la membrane plasmique,
c. forcer les cellules à passer à travers un petit trou en utilisant une forte pression et
d. cisailler les cellules, entre un broyeur tournant étroitement adapté et les parois épaisses d’un récipient en verre.
ve

2.3. Récupération de l’homogénat cellulaire : qui contient les organites cellulaires intacts, les
grosses et les petites molécules du cytosol (enzymes, ribosomes et métabolites).

CENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE (UCD)

II. ULTRACENTRIFUGATION

L’UCD permet la purification de l’homogénat cellulaire en fonction de la taille et de la densité

de ses différents constituants. Des centrifugations répétées à des vitesses progressivement
croissantes fractionneront les homogénats cellulaires en leurs composants (organites, particules
et molécules) (figure 1).

Figure 1 : Les étapes de l’ultracentrifugation différentielle (UCD).

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III. CENTRIFUGATION PAR GRADIENT PREFORME

La centrifugation par gradient préformé consiste à déposer une mince couche d’homogénat
cellulaire au dessus de la solution de saccharose dont la concentration varie de façon régulière et
décroissante du bas vers le haut (figure 2).. Les différents constituants de l’homogénat
sédimentent tous à des vitesses différentes, on obtient ainsi différentes
différentes bandes (la couche la plus
dense étant au fond) que l’on séparera. La vitesse de sédimentation dépend de la taille des
molécules, de la forme des particules et de la densité. La vitesse de sédimentation est définie par
le coefficient de sédimentation en unité Svedberg (S).

Culot 2

Figure 2 : Séparation d’organites par

centrifugation par gradient de saccharose.

B. TECHNIQUES DE COUPES HISTOLOGIQUES

1. But : pour un examen morphologique des cellules ou d’échantillons biologiques (tissus) en
microscopie photonique, des procédés préparatoires de l’échantillon sont nécessaires.

2. Etapes : toutes les étapes

pes sont résumées dans la figure1.

2.1. Prélèvement sur le vivant:

vivant: on distingue quatre catégories majeures de prélèvement : les l
frottis (ou grattage), les biopsies (fragments
( de tissu ou d’organe), les organes en intégralité et les
liquides d'épanchement divers (pleural, sciatique, péricardique, etc.).
Il existe
te également des techniques de prélèvement plus sophistiquées : par excision, ponction ou
microdissection.

2.1. Fixation : c’est

’est l’action de tuer les cellules, en évitant tout phénomène agonique, de manière
à conserver les structures dans un état morphologique
morpholo aussi proche que possible de l’état vivant.
On peut fixer à l’aide de procédés chimiques (alcool, formol, acide acétique, ...) ou bien par des
procédés physiques, comme la congélation brusque.

2.2. Déshydratation : pour

our déshydrater les tissus, on les plonge dans des alcools à degré croissant
(70°, 80°, 90° et 100°) pendant le temps nécessaire à l'équilibre des concentrations.

2.3. Inclusion : laa coupe ne peut être pratiquée que dans une substance assez dure ; c’est
pourquoi
ourquoi on imprègne les tissus d’une substance d’enrobage, en général la paraffine. Celle-ci
n'est pas miscible à l'eau, la pièce anatomique doit être entièrement déshydratée avant l'inclusion
dans la paraffine.

Cette dernière n'est pas non plus soluble dans l'alcool utilisé pour la déshydratation. A la dernière
étape on remplace
place l'alcool par du toluène (substitution),
(s on plonge le tissu déshydraté dans la
paraffine maintenue liquide à l'étuve entre 50 et 60°C. On refroidit alors et on obtient un bloc de
paraffine durcie contenant le tissu à examiner.

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2.4. Réalisation de Coupes : le bloc de paraffine est découpé en tranches minces à l’aide d’un
microtome, appareil permettant de découper les blocs de paraffine en coupes de quelques
microns à quelques dizaines de microns sous forme de ruban de coupes sériées. On les recueille
sur des lames en verre autrefois enduites d'une solution d'ovalbumine qui les colle sur la lame en
séchant. Actuellement on utilise des verres traités chimiquement.
2.5. Réhydratation : les coupes collées sur la lame de verre sont déparaffinées à l'aide d'un
solvant organique et ramenées à l'eau par des bains d'alcools de concentrations décroissantes.
Cela permet de les colorer, car la majorité des colorants sont solubles dans l'eau ou dans l'alcool.
2.6. Coloration : les lames de verre contenant les coupes à observer sont plongées dans un
colorant. On dispose de nombreux colorants naturels (ex. le vert de méthyle colore en vert la
chromatine, l'hématoxyline colore les noyaux cellulaires en bleu violacé, l’éosine colore le
cytoplasme en rose et autres : bleu de méthylène et bleu de toluidine.
2.7. Observation au microscope photonique

Figure 1 : Les différentes étapes de la technique histologique.

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C. TECHNIQUE DES COUPES MINCES OU CYTOLOGIQUES

1. But : obtenir à partir d'un échantillon parfaitement conservé de coupes suffisamment minces
(500 à 700Å) pour être transparentes aux électrons, et suffisamment contrastées, pour donner une
image nette à l’écran (ou la micrographie).

2. Etapes
2.1. Fixation : la fixation a pour but la conservation (après la mort) des ultrastructures cellulaires
sans altération (c’est à dire aussi proche du vivant). On fixe les cellules in vivo à l'aide de
produits chimiques (tetroxyde d'osmium : OsO4 ou du glutaraldéhyde : C5H8O2) ou d’agents
physiques (propane liquide à -196°, l’hélium liquide à -272°). Il s'agit d'une étape critique qui
conditionne le succès de l'étude cytologique.

2.2. Rinçage: le rinçage à l’eau permet d’éliminer le fixateur en lui substituant une solution de
même pH. Il faut effectuer plusieurs rinçages successifs.

2.3. Déshydratation : elle permet de débarrasser les pièces de leur eau en les plongeant dans des
bains d'alcool à concentration croissante ou dans de l'acétone. Le dernier bain se fait à l’oxyde de
propylène.

2.4. Inclusion : favorise le durcissement des échantillons, en remplaçant le milieu intracellulaire

aqueux par un milieu solide tel que la résine.

2.5. Confection de coupes ultraminces ou ultrafines : découper le fragment en coupes de 500 à

700Å d'épaisseur. Les blocs obtenus sont taillés, les coupes sont effectuées à l’aide d’un ultra-
microtome, et recueillies sur une grille métallique couverte d'un film de collodion.

2.6. Contraste : Il s’agit d’une imprégnation par des sels de métaux lourds (comme les sels de
plomb, d’uranyle ou de nitrate d'argent) qui augmente le contraste des structures cellulaires.

2.7. Observation directe

2.8. Observation des micrographies prises au MET

D. TECHNIQUE DE CRYODECAPAGE
1. But : le cryodécapage permet l'observation des surfaces intra et inter-membranaires, le plus
souvent appliquée en microscopie électronique à balayage (MEB). L’observation peut se faire
dans certains cas au MET (cas des répliques obtenues à partir de virus ou molécules isolées).
2. Principe : pour l’obtention d'une réplique de l'échantillon étudié.

1. Etapes
3.1. Congélation : les échantillons sont congelés à température dans l'azote liquide (à -196°C), on
obtient un bloc de glace.

3.2. Fracture du bloc : à l'aide d'une lame refroidie, le plan de fracture passe toujours par les
zones de moindre résistance qui sont en générales les espaces inter-membranaire (espace péri
nucléaire de l’enveloppe nucléaire) ou bien les régions intra-membranaires qui correspondent
aux parties hydrophobes (feuillet clair) de la bicouche lipidique, on obtient dans ce dernier cas
une hémi-membrane.

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3.3. Elimination de la couche de glace : on élimine la glace superficielle par sublimation.

sublimation

3.4. Confectionn de la réplique : elle se fait en deux temps, on dépose par vaporisation en biais
une couche de platine qui assure l'ombrage de la réplique.
réplique. On rajoute à l’aide d’une vaporisation
verticale, une couche de carbone qui servira à consolider la couche de platine.

3.5. Elimination de l'échantillon biologique qui a servi de matrice, par dissolution en utilisant un
solvant approprié.

3.6. Lavage de la réplique et observation au MEB (dans le ca général)

1 : Congélation
2 : Cryofracture

4 : Ombrage métallique
3 : Décapage ou (Platine)
sublimation

5 : Consolidation
par le carbone

6 : Réplique après
digestion par H2SO4

Figure 2 : Les différentes étapes de la technique de Cryodécapage.

E. TECHNIQUE DE L’AUTORADIOGRAPHIE

1. But et principe
- Onn fournit à une cellule vivante durant un temps très bref (en anglais pulse) un métabolite
renfermant un atome radioactif (le plus souvent le tritium : H3 ou le carbone : C14), elle l’utilise
comme l’atome non radioactif dans ses synthèses. L’atome radioactif va se retrouver incorporé
dans les constituants naturels de la cellule et va servir de traceur.

- Onn choisit comme porteur de cet atome radioactif une molécule susceptible de s'incorporer
spécifiquement
fiquement dans une macromolécule (ex. (ex. Thymidine pour l'ADN, Uridine
U pour l’ARN,
Leucine pour les protéines
éines et Glucose pour les polysaccharides). On dilue le surplus de la
radioactivité en mettant les cellules dans un milieu contenant le précurseur
précurseur non radioactif.

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- La détection de la radioactivité
dioactivité se fait par
par application d’une émulsion photographique liquide
liq
ou d'un film solide (formé de cristaux de bromure d’argent).
d’ Onn met la préparation à l'obscurité
l'
durant un certain temps (figure
figure 1).
1

- Le rayonnement ent émis par les atomes radioactifs impressionne l'émulsion et transforme
trans les
cristaux de bromure d’argent
argent en grains
grain d’argent métalliques. L’émulsion
émulsion est ensuite révélée
comme un film photographique.
photographique Les es grains d'argent métalliques sont localisés au dessus des
cellules ayant incorporé les atomes radioactifs.
radioactifs Lee nombre de grains d'argent métalliques
métallique
renseigne sur l'intensité du phénomène étudié.

Figure 1:: Les

Les étapes de la technique d’autoradiographie.
d’autoradiographie
(1) Coupes de cellules marquées collées sur une lame de verre. (2) Coulage d’une émulsion photographique à l’obscurité. (3) Aspect des coupes
de cellules après développement de l’émulsion. (a), (b) et (c) : aspect en coupe des préparations 1, 2 et 3 ; (d) : secteur agrandi
a de (c).

F. TECHNIQUE DE LA COLORATION
COLORATIO NEGATIVE
1. But : observation
bservation de petits échantillons tels que les virus, bactéries et aussi macromolécules
comme l’ADN, la myosine …
2. Principe : est basé sur l'augmentation du contraste par utilisation de produits imperméables
aux électrons comme l’acide phosphotungstique.
3. Etapes
3.1. Préparation de la solution constituée par l’échantillon et l’acide phosphotungstique (2%).
(
3.2. Dépôt d’une goutte de ce mélange sur la grille porte objet recouverte d'une membrane ayant
de l'affinité avec l’acide phosphotungstique (des liaisons s'établissent
s'établissent entre la membrane et
l’acide phosphotungstique imperméable aux électrons).

3.3. Laisser
aisser sécher de manière à ce que l’acide
phosphotungstique ne se retrouve que sur la
surface de la membrane, autour de l'échantillon
mais pas au dessus de ce dernier.
3.4. À l'observation, les e- qui arrivent sur la
surface de 1’échantillon vont le traverser et
poursuivre leur trajet vers l'écran luminescent.
Les e- qui arrivent sur la surface de la membrane
recouverte d'acide phosphotungstique seront
retenus ; par
ar conséquent, l’échantillon aura un
aspect clair sur un fond très dense (figure 1).
Figure 1 : Technique de coloration négative.

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G. TECHNIQUE DE L’OMBRAGE METALLIQUE

1. But : rendre visible de très petites particules isolées et également
galement visualiser l’ADN et l’ARN
l’
et dans l’étude des surfaces (cryofracture).
2. Principe : les
es ombrages métalliques permettent d’accentuer les reliefs d’un objet en
vaporisant sous vide une très fine couche métallique avec
avec un certain angle d’incidence entraînant
la formation d’ombre portée.
3. Etapes : se déroulent dans une cloche où sous vide (figure 1).

3.1. Les molécules ou les particules, dissoutes ou

suspendues dans l’eau, sont directement étalées à
la surface d’une grille carbonée pour la
microscopie électronique.
3.2. Vaporisation d’une très fine couche
métallique (or ou platine), à la surface de la
préparation. La projection de métal est réalisée
sous un angle assez incliné par rapport au plan de
la grille celle-ci
ci conduit à une accumulation
localisée de métal qui donne un effet «d’ombre
portée» lors de l’examen en microscopie
électronique. Figure 1 : La technique de l’ombrage métallique.

H. TECHNIQUE DE L’IMMUNOFLUORESCENCE
1. Principe : c’est
est une technique d’immunomarquage qui utilise des anticorps spécifiques
spécifique à la
molécule d'intérêt
êt ainsi que des fluorochromes. Un anticorps est une protéine complexe utilisée
par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière
spécifique. Un fluorochrome est une substance chimique capable d’émettre de la lumière
fluorescente après excitation.
2. Etapes
Pour détecter une substance X dans une cellule (1 et 2), on injecte à l’animal (ex. lapin) un
antigène, celui-ci
ci réagit en fabriquant des anticorps anti X (3). Une molécule fluorochrome (ou
fluorescine) est directement fixée sur l’anticorps (3) formant
forman un complexe
lexe (Anticorps anti X-
X
Fluorochrome).
Le complexe se fixe sur la substance X (4). L’observation sous UV au microscope à fluorescence
ou confocale permet la localisation de la substance X, grâce à la fluorescence émise par la
fluorescine (5) (figure 1).

Figure 1: Les étapes de la technique de l’immunofluorescence.

l’immunofluorescence