II.

Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules

1. Matériel cellulaire :
Les études de la composition biochimique des cellules consistent à connaître les divers
constituants organiques présents dans les cellules et leur localisation précise dans la cellule et
même dans ses organites. Selon le but poursuivi, le matériel cellulaire sur lequel sont faites
ces études peut être différent.

1.1. Cellules entières ou coupes de cellule :

Pour la localisation in situ dans la cellule de certains constituants, il faut utiliser des
méthodes qui combinent l’observation au microscope photonique ou au microscope
électronique des cellules et la détection par des méthodes biochimiques ou autres de ces
constituants. Les conditions d’observation aux microscopes à lumière ou électronique (voir
cours précédents), suggèrent qu’il est fréquemment nécessaire de préparer des coupes, les
cellules entières étant le plus souvent trop volumineuses pour être étudiées directement. C’est
donc en général sur des coupes que s’étudient ces localisations.

1.2. Broyats cellulaires :

Afin de connaître les diverses molécules qui composent les cellules, ainsi que leurs
proportions relatives, on broie les cellules par des procédés mécaniques variés : écrasement
par un piston tournant dans un tube de verre (un Potter) ; écrasement dans un mortier en
présence de particules d’alumine ; rotation d’une lame d’un mixeur. Les cellules et leurs
organites sont ainsi brisés et le broyat cellulaire obtenu servira pour diverses analyses.

1.3. Fractionnement cellulaire :

Le fractionnement cellulaire vise, après avoir détruit la membrane cytoplasmique et

désorganisé la cellule de façon suffisamment douce, à séparer les organites les uns des autres
et à les obtenir aussi purs que possible dans des tubes à essais distincts.
Cette technique ouvre des possibilités expérimentales considérables, tant au plan de la
biochimie : identification des molécules propres aux organites, qu’à celui de l’étude des
fonctions qu’ils assurent.
Ces fonctions peuvent alors être analysées in vitro de façon plus simple que lorsque les
organites font partie de l’ensemble hautement intégré que représente la cellule.

1
 Cette technique s’applique à des populations cellulaires aussi homogènes que
possible : tissus animaux ou végétaux (foie, muscle, feuilles…), cultures de cellules ou de
micro-organismes…
Elle implique deux étapes :
- Le broyage des cellules, ou homogénéisation, qui dissocie les organites et les
suspend dans un milieu approprié ;
- la séparation des organites en fractions pures, au moyen de centrifugations.

1.3.1. Homogénéisation :

Cette première étape, qui conduit à un homogénat cellulaire ou lysat (voir figure 1),
doit conserver autant que possible l’intégrité structurale, biochimique et physiologique des
organites des cellules étudiées. Les détériorations pouvant survenir au cours du broyage sont
d’ordre mécanique, chimique ou osmotique ; les milieux et les méthodes de broyage doivent
en tenir compte.
Les méthodes d’homogénéisation sont de type :
- mécanique : pistons et cylindres plus ou moins serrés, ou mixers ;
- physique : hautes pressions ou ultra-sons ;
- chimique : destruction des membranes par des détergents et des parois (cas des cellules
végétales ou des bactéries) par des enzymes appropriées (cellulases, lysozyme…).

Les milieux de broyage répondent à des exigences chimiques et osmotiques :

- leur pH est neutre et leur composition ionique aussi voisine que possible de celle
du cytoplasme.
- Ils sont en outre tamponnés, car la destruction de la structure cellulaire peut
conduire à la libération de produits ou à des réactions chimiques artefactuelles,
susceptibles de faire varier le pH de l’homogénat.
- Ils sont enfin osmotiquement équilibrés car de nombreux organites ou vésicules se
comportent comme des « sacs » sensibles à la pression osmotique du milieu
aqueux environnant ; leur volume doit rester constant au cours de l’expérience, ce
qui semble être une garantie de leur intégrité. On considère qu’une solution de
saccharose 0,25 M est isotonique vis-à-vis de la plupart des organites.
Selon la catégorie d’organites que l’on cherche à purifier, la nature et la concentration
des ions contenus dans le milieu varient car elles déterminent de façon importante la structure
et les propriétés physiologiques des organites isolés. Il n’existe pas de milieu général

2
d’homogénéisation ; chaque type d’organite exige un protocole spécifique établi après de
nombreux tâtonnements, et qui diffère selon l’étude envisagée.
Les conditions générales du broyage doivent enfin limiter les dégradations
enzymatiques liées, par exemple, à la destruction de certains organites tels que les lysosomes,
qui libèrent alors des hydrolases, ou les phénomènes d’oxydation par voie enzymatique,
particulièrement chez les Végétaux, riches en phénols.
Le broyage, ainsi que les opérations suivantes, sont donc effectués à basse température (0-4
°C), et le plus rapidement possible.

Fig. 1: préparation de l’homogénat cellulaire

1.3.2. Séparation des différentes catégories d’organites et structures cellulaires :

Les différentes classes d’organites se distinguent par leur taille, leur forme et leur
densité ; les variations des deux premiers paramètres peuvent être très grandes (les noyaux
atteignent 10 μm de diamètre tandis que les ribosomes mesurent 15- 20 nm) alors que celles
relatives à la densité restent faibles (de 1,1 environ pour les mitochondries, les lysosomes ou
les peroxysomes, à 1,6 pour les ribosomes).
Dans le champ de gravité terrestre, ces organites ou structures restent spontanément en
suspension au sein de l’homogénat et on n’obtient aucune séparation en fractions distinctes.
Si l’on augmente artificiellement la valeur de ce champ par centrifugation, ces
particules se sédimentent avec une vitesse accrue et différente selon leurs caractéristiques
hydrodynamiques, de sorte que l’on peut fractionner l’homogénat.
Le principal paramètre déterminant la vitesse de sédimentation est la masse, de sorte
que les particules les plus grosses et les plus denses de l’homogénat forment le premier

3
sédiment (ou culot) rassemblé au fond du tube à centrifuger, le liquide surnageant contenant
les plus petites et les plus légères. Le surnageant et le culot sont séparés par décantation ; ce
dernier peut être resuspendu dans un nouveau milieu, tandis que le surnageant peut être
soumis à une autre centrifugation qui sédimentera les particules encore en suspension.

1.3.2.1. Ultracentrifugation :

-La séparation de particules biologiques allant des petites macromolécules (protéines)

jusqu’aux gros édifices supramoléculaires (ribosomes, Virus) peut être obtenue par cette
technique. En fonction du protocole mis en œuvre, celle-ci conduit à séparer les particules
selon : pour l’essentiel, leur taille et leur forme, ou uniquement leur densité, indépendamment
de ces deux paramètres.
-Les particules les plus volumineuses sédimentent plus vite que les petites, pour une même
forme et une même densité.
-la tendance à la concentration des molécules au cours de la centrifugation est contrecarrée
par la diffusion, qui provoque une redistribution plus uniforme des molécules.
-Les ultracentrifugeuses sont des machines très sophistiquées par rapport aux centrifugeuses
classiques ; leurs rotors peuvent tourner jusqu’à près de 80 000 tours par minute, et ils
fournissent des champs de gravité atteignant 500 000 fois la gravité terrestre, ce qui est
suffisant pour contrecarrer les effets de la diffusion et entrainer la sédimentation des
macromolécules dans le fond du tube de centrifugation.
-La centrifugation s’effectue dans le vide pour réduire la résistance au frottement.
-La vitesse de sédimentation d’une molécule donnée est la vitesse à laquelle elle se déplace en
réponse à la force centrifuge dans une centrifugeuse.
-La vitesse de sédimentation se modifiant avec la force centrifuge, une molécule donnée est
caractérisée par un coefficient de sédimentation, qui est sa vitesse de sédimentation divisée
par la force.
-Le coefficient de sédimentation est proportionnel à la taille de la particule, mais la forme de
cette dernière peut moduler sa valeur ; il est exprimé en unités S (ou Svedberg, du nom de
l’inventeur de l’ultracentrifugeuse) et on parle ainsi d’ARN 18 S, 28 S, 5 S.

a) L’ultracentrifugation différentielle (UCD) :

Méthode qui repose sur le principe que, pour autant qu’elles soient plus denses que le
milieu ambiant, les particules de taille et de forme différentes vont vers le fond du tube de
centrifugation à des vitesses différentes quand elles sont soumises à une force centrifuge.
4
 Grâce à une série de centrifugations à des vitesses croissantes, de plus en plus longues,
donnant des champs de gravité de plus en plus élevés, on fractionne l’extrait initial en une
série de culots et de surnageants.
Au début, l’homogénat est soumis à de faibles forces centrifuges pendant une courte
période de manière à ne sédimenter, sous forme de dépôt (le culot), que les plus gros organites
cellulaires, les noyaux. Des forces centrifuges de plus en plus grandes permettent la
sédimentation des organites relativement volumineux (mitochondries, chloroplastes,
lysosomes et peroxysomes). En suite, pour faire sédimenter les microsomes et les ribosomes,
il faut utiliser une ultracentrifugeuse. Donc la centrifugation différentielle consiste à pratiquer
des centrifugations de plus en plus poussées des surnageants pour séparer des fractions de
plus en plus légères (voir figure 2).
Le dernier surnageant représente la phase soluble de la cellule et les particules trop
petites pour être éliminées par sédimentation.
Grâce à cette méthode, on peut obtenir rapidement des fractions relativement pures
d’organites en quantités importantes ; on parle de technique préparative.
Il faut cependant noter que les sédiments obtenus ne sont pas parfaitement purs
d’emblée car ils sont toujours contaminés par des éléments appartenant au surnageant ; on
doit donc « laver » les culots, soit en les resuspendant dans un milieu neuf et en les
recentrifugeant plusieurs fois, soit en les soumettant à un gradient de saccharose qui donne, en
une seule étape, des fractions d’une grande pureté.

Fig. 2: Protocole de l’ultracentrifugation différentielle

5
 b) Ultracentrifugation sur gradient de densité (UGD) :

Cette méthode s’applique aux organites cellulaires et complète efficacement la

centrifugation différentielle ; la purification se poursuit par centrifugation d’une des fractions
dans un gradient de densité. Même des particules de très petite taille et présentant de très
faibles différences dans leurs caractéristiques peuvent être séparées. Cependant, elle ne
permet de manipuler que de petits volumes de matériel biologique, et reste une technique
essentiellement analytique (par opposition aux techniques préparatives).
Cette technique utilise, dans le tube à centrifuger, une variation continue de
concentration d’un composé dont la densité décroît régulièrement du bas vers le haut. La
solution constituant ce gradient est à base :
- soit de saccharose (gradient préformé) pour séparer les organites cellulaires : dont la
concentration varie de façon régulière et décroissante du bas vers le haut du tube. Cette
variation peut être linéaire et continue ; en remplissant le tube par une solution de saccharose
de moins en moins concentrée ou bien discontinue ; en étageant dans le tube des couches
successives de solution de saccharose de moins en moins denses, dans les deux cas, la
viscosité et la densité évoluent dans le même sens que la concentration.
- soit de chlorure de césium (CsCl) (gradient autoformé) afin d’isoler les acides nucléiques.
On dépose à la surface du gradient une fine couche de l’échantillon dont on veut
séparer les constituants ; on centrifuge ensuite dans un rotor à godets mobiles, qui se mettent à
l’horizontale lors de sa rotation, pour ne pas perturber la géométrie du système. La séparation
est obtenue en une seule étape.
Le principe est, dans ce type d’expérience, que les organites ou les macromolécules se
séparent sur la base de leur seule densité. Au cours de la centrifugation, ceux-ci se
sédimentent jusqu’à atteindre le niveau du gradient où le liquide a exactement leur densité, et
ils forment une bande. Ceci réalisé, ils ne bougent plus de cette position d’équilibre, quelle
que soit la durée de la centrifugation (voir figure 3). La récolte des fractions se fait en perçant
le fond du tube et en récupérant goutte à goutte le gradient dans une série de tubes.
Remarque : si les particules ont une densité supérieure à celle de toutes les couches de
saccharose, elles les traverseront toutes et se sédimenteront finalement au fond du tube.
On peut déterminer la composition des différentes fractions par un examen
microscopique ou en mesurant la quantité de protéines particulières que l’on sait spécifiques
d’organites particuliers.

6
 Fig. 3 : Protocole de l’ultracentrifugation sur gradient de densité

2. Méthodes cytochimiques

Ces méthodes permettent de localiser les constituants biochimiques à l’intérieur des

cellules c’est à dire de repérer avec précision la place qu’occupent certains constituants
biochimiques dans la cellule. Elles nécessitent l’utilisation de réactifs, qui forment avec ces
constituants des produits de réaction détectables au microscope optique, ou au microscope
électronique.

- Dans le cas du microscope optique : il faut choisir des réactifs dont les produits de
réaction sont colorés, ce qui permet de les repérer facilement ;
- Dans le cas du microscope électronique : il faut utiliser des réactifs donnant des
produits de réaction qui diffusent fortement les électrons et qui présentent un
contraste important.

Afin que les observations soient fiables, ces conditions doivent être respectées :

- Les traitements infligés à la cellule (fixation, inclusion, confection de coupes) ne doivent pas
déplacer ni altérer les constituants biochimiques.

-Les réactifs doivent réagir qu’avec un seul type de constituant biochimique.

7
2.1. Localisation des polysaccharides :

La localisation des chaînes polysaccharidiques consiste à oxyder, par l’acide

périodique (IO4H), certaines fonctions alcool des unités glucidiques en fonctions aldéhydes
qui seront ensuite révélées par des réactifs appropriés :

 Observations au microscope optique : les groupements aldéhydiques sont mis en

évidence par la fuchsine décolorée ou réactif de Schiff. Les régions des cellules riches
en polysaccharides sont colorées en pourpre.
 Observations au microscope électronique : les groupements aldéhydiques sont
combinés à la thiocarbohydraside (TCH) dont la présence est révélée par le protéinate
d’argent ; l’argent diffusant fortement les électrons, les régions riches en
polysaccharides apparaissent sombres.

2.2. Localisation des acides nucléiques :

Pour la localisation de l’ADN, la méthode de Feulgen est la plus spécifique. Elle

consiste à démasquer les résidus désoxyriboses par hydrolyse ménagée en présence d’acide
chlorhydrique, qui rompt les liaisons N-glycosidiques des bases puriques, puis les
groupements aldéhydiques ainsi démasqués sont révélés par le réactif de Schiff (voir figure
1).

Figure 1: Localisation de l’ADN (Méthode de Feulgen)

8
 La méthode de Brachet permet de localiser les acides nucléiques. Elle est basée sur
les affinités de certains colorants pour les acides nucléiques :

- La pyronine colore l’ARN en rouge ;

- Le vert de méthyle colore l’ADN en vert.

Ces colorations n’étant pas très spécifiques, on doit vérifier leur spécificité sur des
coupes témoins dont on a solubilisé l’un des acides nucléiques (ADN ou ARN) en
l’hydrolysant en présence d’une nucléase spécifique (DNase ou RNase) (voir figure 02).

Figure 2: Localisation des acides nucléiques