PRÉPARATION DE L'ADN A CLONER

RAPPELS SUR L'ADN

La structure de l'ADN (acide désoxyribonucléique) est composées de groupement phosphate lié à un sucre (le désoxyribose) qui est
luimême fixé à une des 4 bases azotée, A (adénine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine). Un groupe « phosphate-sucre-base azotée » constitue
un nucléotide. Les nucléotides sont liés les uns aux autres pour former un brin d'ADN. L'ADN est donc un polymère de nucléotide. Deux brins
d'ADN interagissent entre eux par les bases azotées formant une molécule d'ADN double brin. Cette molécule est similaire à une échelle dans
laquelle les groupements phosphate-ribose constitueraient les montants et les bases azotées formeraient les barreaux. Les deux brins d'ADN dans
cette échelle sont en orientation opposées (antiparallèle). Cette échelle est torsadée donnant la fameuse forme de double hélice à l'ADN double-
brin.

La distance entre 2 résidus est de 0.34 nm. 1 tour d'hélice contient 10 paires de bases (3,4 nm). Le diamètre de l'hélice d'ADN est de 2
nm. La taille d'un génome humain est de 3.2 milliard de paires de bases par génome haploïde soit 6.4 milliard de paires de bases réparties sur les
23 paires de chromosomes. Mis bout à bout, cela donne plus de 2 mètres d'ADN par cellule I Pour empaqueter tout cet ADN dans le noyau, l'ADN
est fortement replié et compresser avec l'aide de protéines pour former la chromatine. L'empaquetage extrême de l'ADN forme les chromosomes
mitotiques.

2 nm

Extrémité Extrémité3'

b>ases azotées:

phosphòle

0,34 nm

Extrémité ExtrémitéS adénine cytosine

guanine thym
aucléoticle
adénine ne s'èppatie qu?avec la thymihe la
cytosine ne qutaVec la guanine
 Historiquement, on doit la mise en évidence d'acides nucléiques (dénommés alors nucléine) à un biologiste suisse Friedrich Miescher en
1869. Phoebus Lavene découvre dans les années 1920 que les acides nucléiques sont constitués de nucléotides et Oswald Avery en 1944

démontre que l'ADN est le support de l'information génétique. La structure de la double hélice fut découverte en 1953 par Francis Crick et James
Watson qui reçurent le prix Nobel en 1962.

Extraction et purification
L'ADN doit impérativement être purifié à partir de matériel biologiques dans des conditions optimales de qualité et de quantité.

Faire éclater les globules rouge du sang avec un choc osmotique en le mélangeant à une solution hypotonique, récupérer les globules
blancs par centrifugation, ajouter un mélange de détergeant (SDS) et de protéinase K; le détergeant détruira les membranes et la protéinase
digérera les protéines associées à l'ADN, Extraire l'ADN des protéines par un mélange phénol-ci Iloroforme. Le phénol est un excellent agent
dénaturant des protéines et il permet de séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques, il est ensuite éliminé par l'extraction avec du
chloroforme, la séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par la centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques.
Les acides nucléiques pouvant être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l'alcool éthylique absolve froide (- 20 0
C). L'ADN précipite sous forme de filaments visibles à l'œil nu qui sont récupérés par enroulement sur une baguette de verre, re-dissoudre l'ADN
dans une solution tarnponnée. L'ADN peut être ainsi conservé à 4 0C plus d'une année.

Dosage de l’ADN
 Le dosage sl effectue par spectrophotométrie dans Pultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280
nm. Cette dernière longueur d’onde permet d’estimer la contamination éventuelle de l’extrait par des protéines. L’absorption se définit par l l
unité de densité optique mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique à 260 nm correspond à l’absorption d’une solut i on d’ADN double brin
à la concentration de 50 _gg/ml ou à l’absorption d’une solution d*ADN simple brin à la concentration de 33 gg/ml ou encore à de l’ARN à 40
ug/ml.

Conservation de l’ADN

L’ADN : peut être conservé dans un tampon (10mM Tris pH=8) additionné d’EDTA (ImM) à 40 C. A pH 8, la dégradation de l’ADN est
notablement plus faible qu’à pH 7. LI EDTA permet de chélater les ions divalents (nécessaires pour les nucléases) et évitent la croissance de
microorganismes. L’ADN peut être également conservé à -200C dans le même tampon mais des cycles successifs de congélation/décongélation
entraînent des cassures des acides nucléiques de grande taille (>10kb).

La synthèse in vitro
 Dès 1955, Kornberg se penche sur la synthèse de l’acide désoxyribonucléique (ADN). À partir d’Escherichia coli, il parvient, le premier, à
isoler et purifier l’enzyme qui catalyse la formation de l’ADN à partir des désoxyribonucléotides (1958)  : cette première enzyme est baptisée APN
polymérase l. Kornberg et son groupe montrent que la réaction de condensation opérée par l’ADN polymérase I est de type semi-conservatif, car
elle nécessite un fragment d’ADN préformé servant d’amorce et de matrice à l’enzyme.

Dans son mélange réactionnel, Kornberg dispose d’ADN modèle, de précurseurs naturels, de l’ADN polymérase active, auquel il ajoute
des précurseurs radioactifs. Après la réaction, la radioactivité se trouvera partagée entre l’ADN éventuellement synthétisé in vitro (en incorporant
des monomères marqués) et l’excédent de précurseurs qui n’ont pas été incorporés. Il est donc essentiel d’éliminer tous ces précurseurs libres
pour attribuer de la radioactivité à une macromolécule. En pratique, les macromolécules sont précipitées par adjonction d’un acide organi ue et
les petites molécules « acido-solubles » (y compris les précurseurs radioactifs) sont éliminées par centrifugation. Le culot, après plusieurs lavages,
contient les macromolécules (y compris l’ADN) débarrassées de tous précurseurs non incorporé dans la chaine.

Séparation des acides nucléiques

Ultracentrifugation

La centrifugation est une technique de séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins
lourdes).

Cette technique a été mise au point par Svedberg (1932), qui l’utilisa pour déterminer des masses moléculaires. Elle fut appliquée à la
biologie par physiologiste Belge Albert Claude (Prix Nobel, 1974), qui isola grâce à elle les microsomes.

A des vitesses de l’ordre de 20 000 tours/mn, il est possible de séparer différents types d’ADN (chromosomique et plasmidique) dans un
gradient de chlorure de césium.