REPUBLIC OF CAMEROON

RÉPUBLIQUE DU CAMEROUN
Peace-Work-Fatherland
Paix-Travail-Patrie
*******
*******
MINISTRY OF HIGHER EDUCATION
MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT
*******
SUPÉRIEUR
THE UNIVERSITY OF MAROUA
*******
******
UNIVERSITÉ DE MAROUA
The national advanced school of Engineering of
******
Maroua
Ecole nationale supérieure polytechniqu e de
Maroua

TRAVAIL PERSONNEL DE L’ETUDIANT

THEME : METHODES ELECTROPHORETIQUES

UE: GEN 559

NO NOMS DES PARTICIPANTS MATRICULE

1 KOKEA TIELA NATIVE EMERICK 19A0457P

2 MENGUE GEORGE CORALIE 19A0469P

3 MADJOU MAIMOUNA SOKAMTE 18A0572P

ENSEIGNANT: Pr.TCHEUMI Herve

Année académique 2023/2024

0
 TABLE DE MATIERES

INTRODUCTION ............................................................................................................... 3
I. GENERALITES ........................................................................................................... 4
A. Définition ......................................................................................................................................... 4
B. Description ...................................................................................................................................... 4
1. Ceux pouvant acquérir une charge négative :.............................................................................. 4
2. Ceux pouvant acquérir une charge positive : ............................................................................... 4
C. Principe ............................................................................................................................................ 5
D. Facteurs influençant le déplacement électrophorétique ............................................................... 6
1. Nature des molécules ................................................................................................................... 6
2. L'appareillage ............................................................................................................................... 6
3. Le courant électrique ................................................................................................................... 7
4. Le pH ............................................................................................................................................. 7
II. LES DIFFERENTS TYPES D’ELECTROPHORESES........................................... 7
A. L’électrophorèse libre, en veine liquide selon Tisélius (1937), ....................................................... 7
B. L’électrophorèse sur supports poreux (électrophorèse de zone) ................................................... 8
1. Électrophorèse sur papier ............................................................................................................ 9
2. Électrophorèse sur acétate de cellulose ...................................................................................... 9
3. Électrophorèse sur gel d’amidon ............................................................................................... 10
4. Électrophorèse sur gel ................................................................................................................ 10
5. Électrophorèse sur gel d’agarose : ............................................................................................. 11
6. Sur gel de polyacrylamide .......................................................................................................... 12
a) L’électrophorèse en conditions non dénaturantes ................................................................ 12
b) L’électrophorèse en conditions dénaturantes ....................................................................... 14
c) Visualisation des protéines dans les gels ............................................................................... 16
C. Autre méthodes d’électrophorèse ................................................................................................ 16
1. Electrophorèse bidimensionnelle............................................................................................... 16
a) DIMENSION 1.......................................................................................................................... 17
b) DIMENSION 2.......................................................................................................................... 17
2. Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing) ....................................................................... 18
3. Électrophorèse en champs pulsés .............................................................................................. 19
4. Électrophorèse capillaire ............................................................................................................ 20
CONCLUSION ................................................................................................................. 22
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................ 23

1
TABLE DES FIGURES

Figure 1:principe de l'éléctrophorèse: ............................................................................................. 6

Figure 2: appareillage pour l’électrophorèse libre, en veine liquide ............ Error! Bookmark not
defined.
Figure 3 : appareillage pour l’électrophorèse sur papier. ................................................................ 9
Figure 4 : appareillage pour l’électrophorèse sur les bandes d'acétate de cellulose ..................... 10
Figure 5 : appareillage pour utilisés pour l'électrophorèse en gel d'agarose. ................................ 12
Figure 6: Structure chimique du TEMED. .................................................................................... 13
Figure 7:L’électrophorèse en conditions non dénaturantes ........................................................... 14
Figure 8:L’électrophorèse en conditions dénaturantes .................................................................. 15
Figure 9:Visualisation des protéines dans les gels ........................................................................ 16
Figure 10:Electrophorèse bidimensionnelle DIMENTION 1 ....................................................... 17
Figure 11:Electrophorèse bidimensionnelle DIMENTION 2 ....................................................... 18
Figure 12:Electrofocalisation ........................................................................................................ 19
Figure 13:Électrophorèse en champs pulsés ................................................................................. 20
Figure 14:Électrophorèse capillaire .............................................................................................. 21

2
 INTRODUCTION

Des particules chargées, placées dans un champ électrique, vont migrer sous l'influence de
ce dernier. Ce phénomène de migration, en solution, est connu depuis le milieu du XIX ème siècle.
FIELD et TEAGUE, en 1907 ont isolé la toxine et l'antitoxine diphtériques en mettant à profit la
différence de leur vitesse de migration sous l'influence d'un champ électrique. L'utilisation de ce
phénomène de transport électrocinétique, à des fins analytiques, date de 1935. TISELUS .en
précise les conditions opératoires en séparant les constituants du sérum en quatre fractions par la
méthode des déplacements de frontières détectées par des méthodes de réfraction. D'une mise en
œuvre très délicate à ces débuts, la technique d'électrophorèse est maintenant très utilisée, en
particulier pour l'analyse de mélanges biologiques. Elle est appliquée à des électrolytes très divers
(colloïdes, anions et cations minéraux ou organiques) et les techniques de séparation par
électrophorèse sont devenues très nombreuses. Le développement de cette technique a permis
d'obtenir, pour l'étude des composés macromoléculaires, des avantages comparables à ceux
obtenus, pour les particules de faible poids moléculaire, par les méthodes de chromatographie.
L'intérêt de l'électrophorèse, hormis son étude théorique, réside dans le fait qu'elle a permis la
découverte et l'identification de nombreux tissus animaux et végétaux. L'application analytique
principale est l'étude des sérums pathologiques.

3
I. GENERALITES
A. Définition
Le terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence
d’un champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine « phorèse »
vient du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ». L’électrophorèse est donc une
technique d’analyse et de séparation basée sur les critères de la charge électrique et la taille des
molécules. La migration différentielle de particules chargées électriquement, se fait sous
l’influence d’un champ électrique. Seules les particules chargées positivement ou négativement
sont attirées par les pôles opposés du champ.

B. Description
La technique de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement et la migration des
particules chargées ou d'ions sous l'effet d'un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques
propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse, ces ions auront des vitesses de migration
différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.

Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se
déplacent vers la cathode (−).

Sur les acides nucléiques, les charges sont portées par les groupements phosphates du
squelette.
Sur les protéines, la situation est plus complexe et il existe différents types de groupements
ionisables :

1. Ceux pouvant acquérir une charge négative :

 Les fonctions acide carboxylique (-COOH) de l'acide glutamique, de l'acide aspartique et

de l'extrémité C terminal de la chaîne polypeptidique ;
 La fonction thiol (-SH) de la cystéine;
 Les fonctions alcool (-OH) de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine.

2. Ceux pouvant acquérir une charge positive :

 La fonction guanido d’arginine ;
 La fonction imidazole de l'histidine ;

4
  La fonction amine (-NH2) de la lysine et de l'extrémité N-terminale de la chaîne
polypeptidique ;

La charge nette d'une protéine dépend donc en général de sa composition en acides aminés
et du pH.

C. Principe
L’électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus souvent dans un but
analytique mais également parfois pour purifier des molécules solubles. Le principe consiste à
soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce qui entraîne la migration des
molécules chargées. En fonction de différents paramètres (charge, masse, forme, nature du
support, conditions physico-chimiques) la vitesse de migration va être variable, ce qui permet la
séparation des différentes molécules. A partir de ce principe général, il existe plusieurs variantes
de cette technique adaptées à différentes situations.

La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une
séparation en se basant sur cette propriété. La charge Q est fonction du pH isoélectrique de la
particule et du pH du solvant : on appelle pH isoélectrique d'une particule (phi) le pH pour lequel
cette particule ne migre pas dans un champ électrique.

La différence pH - phi détermine le signe de la charge Q d'une particule et son intensité : plus cette
différence est grande en valeur absolue, plus la charge est importante:

si pH > phi charge nette négative (anion) migration vers l'anode

si pH < phi charge nette positive (cation) migration vers la cathode

si pH = phi charge nette nulle pas de migration

5
Figure 1:principe de l'éléctrophorèse:

D. Facteurs influençant le déplacement électrophorétique

1. Nature des molécules

La taille. A charge égale les molécules les plus petites doivent migrer plus vite que les
autres. Mais, comme les ions de faibles diamètres, sont souvent solvatés et qu'il peuvent être
accompagnés de particules chargées se trouvant dans la solution d'électrolytes, leur mobilité
dépend également des autres substances dissoutes. C'est ainsi pratiquement que les petits ions
métalliques et les protéines chargées ont des mobilités du même ordre de grandeur.

La charge. Outre la nature des molécules, le milieu environnant intervient sur leur degré
d'ionisation par son pH, sa force ionique ou sa composition. En effet, certains composés présents
dans les solutions peuvent former des complexes ou des associations de charges opposées. Par
exemple, les ions CT s'associent aux ions Hg en formant du chiorure mercurique non chargé ou en
présence de sels ferriques plusieurs espèces diversement chargées selon la valeur du pH peuvent
coexister en équilibre FeCP, FeCI, FeCl, FeCI,

2. L'appareillage
Le support. Quelle que soit sa nature, le support possède un pouvoir adsorbant capable de
ralentir les migrations et d'entrainer un élargissement des zones se traduisant par des trainées sur
l'électrophérogramme.

Ce pouvoir adsorbant est lié à la présence à la surface du support de groupements

fonctionnels capables de former des liaisons avec les molécules du solvant et les substances à
séparer (liaisons ioniques, hydrogène, de Van der Waals, etc.).

6
 3. Le courant électrique
En dehors de tout autre facteur, le déplacement electrophorétique d est proportionnel à la
mobilité de la panicule considérée, au champ électrique E et au temps r pendant lequel ce champ
est imposé.La mobilité, est tout autre condition définie, une caractéristique de la parti- cule
considérée. Il convient donc de déterminer les valeurs de E et de r qui permettent la meilleure
séparation.

4. Le pH
Les acides forts, les bases fortes et les sels correspondant étant totalementionisés en
solution aqueuse, le pH de la solution d'électrolytes est pratiquement sans influence sur leur
migration. Par contre, pour certains complexes minéraux ou pour les composés organiques ayant
des groupements acides faibles ou bases faibles l'influence du pH est prépondérante. Il en est de
même pour les composés amphotères dont la migration n'est possible que si le pH de la solution
d'électrolytes a une valeur différente de celle du point isoionique.

En provoquant l'apparition de charges positives ou négatives le pH peut limiter les

phénomènes d'adsorption. Mais, de plus, en imposant le degré d'ionisation il modifie la mobilité
des composés. La vitesse de migration étant proportionnelle au degré d'ionisation, il est nécessaire
de le maintenir constant et par conséquent d'opérer à un pH stable et bien déterminé ce qui est
obtenu en utilisant des solutions tampons

II. LES DIFFERENTS TYPES D’ELECTROPHORESES

Le choix du support est dicté par la nature des molécules à séparer et selon le support on
distingue deux types d’électrophorèse

A. L’électrophorèse libre, en veine liquide selon Tisélius (1937),

Elle est réalisée dans un tube en U de section carrée (ceci afin de pouvoir réaliser des
mesures optiques au travers du tube, comme avec une cuve de spectrophotomètre) : la séparation
n'est pas totale, mais les frontières qui se forment sont mises en évidence par des méthodes optiques
(absorption UV, indice de réfraction, fluorescence...). Cette méthode est utilisée en recherche pour
mesurer la mobilité électrophorétique et pour vérifier la pureté des protéines.

7
Figure 2 : appareillage pour l’électrophorèse libre, en veine liquide

B. L’électrophorèse sur supports poreux (électrophorèse de zone)

Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide. Le support doit
être homogène, poreux et inerte. Différents types de support peuvent être utilisés.

Différents supports d’électrophorèse de zones :

Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de
support :

 Papier
 Acétate de cellulose
 Semi-solide (gels)

Différents types d’électrophorèse sur gel:

 Électrophorèse sur gel d’agarose

 Électrophorèse en champ pulsé
 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
 Électrophorèse bi-dimensionnelle
 Les électrophorèses peuvent aussi être réalisées en conditions dénaturantes (détergents type
SDS ou urée).

8
 1. Électrophorèse sur papier
Assez peu résolutive, cette technique d'électrophorèse est surtout destinée à séparer des
molécules de petite taille, dont les acides aminés. Des phénomènes d'interférence liés à la charge
des acides aminés et de la cellulose du papier interviennent de façon notable. Une goutte de
solution contenant l'échantillon à analyser est déposée sur une bande de papier, puis séchée. La
bande de papier est humidifiée avec un tampon convenablement choisi, puis les deux extrémités
de la bande sont plongées dans deux réservoirs contenant le tampon. Chaque réservoir est connecté
à une électrode. Un champ électrique continu est appliqué, et les acides aminés se déplacent en
fonction de leur charge nette. En fin d'électrophorèse, la bande de papier est séchée puis les acides
aminés sont révélés par une réaction colorimétrique telle que celle à la ninhydrine.

Figure 3 : appareillage pour l’électrophorèse sur papier.

2. Électrophorèse sur acétate de cellulose

L'électrophorèse se fait dans des conditions proches de celles de l'électrophorèse sur papier.
Les bandes d'acétate de cellulose sont fragiles, mais elles limitent la diffusion des molécules à
séparer. La révélation des protéines se fait également par une réaction colorimétrique (rouge de
ponceau par exemple). Cette technique, peu résolutive, permet de séparer grossièrement des
groupes de protéines. Elle est peu coûteuse et permet une analyse rapide des protéines sériques.

9
Figure 4 : appareillage pour l’électrophorèse sur les bandes d'acétate de cellulose

3. Électrophorèse sur gel d’amidon

L'électrophorèse sur gel d'amidon est particulièrement utile l'analyse et la séparation des
isoenzymes. Le principe de la technique repose sur une séparation électrophorétiques des protéines
sur une matrice poreuse composée d'un gel d'amidon, de pH précis. Les enzymes présentes sont
détectées en incubant le gel dans une solution contenant un substrat spécifique de l'enzyme donnant
lieu à un produit coloré. Les profils obtenus sont désignés sous le nom de zymogrammes.

4. Électrophorèse sur gel

Sous l'action d'un champ électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse(v)
proportionnelle aux champs:

V = μ E, avec μ appelée « mobilité électro phorétique »

𝑉
μ=
𝐸

μ en cm2 .s-1 .volt-1 , v en cm.s-1 et E en volt.cm-1

Le champ électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que l'on
suppose sphérique et de charge q;

10
 𝐹 =𝑄×𝐸

Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (êta) vont s'opposer à la migration de la protéine et
la freiner;

𝑓 = 6𝜋. 𝑛. 𝑟. 𝑣

Il arrive un moment où ces deux forces s'équilibrent, et la particule se déplace alors à vitesse
constante; on peut alors écrire :

𝑄. 𝐸 = 6𝜋. 𝑛. 𝑟. 𝑣

On définit pour chaque particule sa mobilité µ, de manière indépendante du champ électrique, par

𝑉 1𝑣𝑜𝑙𝑡
𝜇= (𝑣𝑖𝑡𝑒𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑔𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑜𝑢𝑟 𝑢𝑛 𝑐ℎ𝑎𝑚𝑝𝑠 é𝑙é𝑐𝑡𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑖𝑡 𝑒𝑛𝑐𝑜𝑟𝑒 𝜇
𝐸 𝑐𝑚
𝑄
= . 𝑛. 𝑟
6𝜋
Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champ uniforme dépend de 3 facteurs : q, (êta)
et r.

Elle est proportionnelle à sa charge (q), inversement proportionnelle au coefficient de

viscosité du milieu (êta) et son rayon (r). La mobilité est une caractéristique de chaque particule,
il est donc possible d’effectuer une séparation en se basant sur cette propriété.

5. Électrophorèse sur gel d’agarose :

L’électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie
moléculaire :

• Soit à des fins analytiques: pour séparer et identifier des fragments d'ADN, pour
déterminer leur taille, pour en estimer la quantité,

• Soit à des fins préparatoires, pour purifier un fragment d'ADN de taille connue. La taille
des fragments qu'il est possible de séparer est comprise entre 0,2 et 50 kb.

Les fragments d'ADN sont facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent,
le bromure d'éthidium (BEI). On peut ainsi visualiser en lumière UV des quantités très faibles
d'ADN (de l'ordre de 5-10 ng).

11
 L'électrophorèse en gel d'agarose est donc une technique très sensible; elle est de plus
rapide et simple à mettre en œuvre.

L'agarose est un polyoside hautement purifié extrait de l'agar. Ce polymère linéaire est
constitué de la répétition d'un motif de type diholoside.

L'agarose est une poudre blanche qui se dissout dans l'eau à ébullition. La solution
d'agarose reste à l'état liquide tant que la température est supérieure à 40-45 °C (surfusion) Quand
la température devient inférieure à 40°C, la solution se solidifie en un gel stable qui ne fond pas
tant que la température reste inférieure à 100 °C.

D’une manière générale, l’agarose forme des gels dont la réticulation est assez faible,
permettant la séparation de molécules de très hautes masses moléculaires. Ils sont principalement
utilisés pour séparer des molécules d’ADN ou d’ARN. Les molécules de plus petites tailles se
déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

Figure 5 : appareillage pour utilisés pour l'électrophorèse en gel d'agarose.

6. Sur gel de polyacrylamide

a) L’électrophorèse en conditions non dénaturantes
Cette technique aussi appelé PAGE (pour PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) est très
utilisée en immunologie, dans l'étude des protéines et également utilisée pour le séquençage de
l'ADN.

12
 Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par
ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant.
En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes
densités de gel.

La polymérisation est réalisée grâce à l'ajout de 2 réactifs: le TEMED (N,N,N',N'

tetraméthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions hyperactifs en
présence de lumière.

Figure 6: Structure chimique du TEMED.

Plus que le pourcentage d’acrylamide est élevé, plus que la densité des chaînes est élevée
et les mailles du réseau sont serrées. Par conséquence, plus le pourcentage d’acrylamide est élevé,
moins les molécules volumineuses peuvent migrer. Donc, plus que la masse moléculaire du
composé est élevée, plus que la migration est lente.

• Avant que le mélange réactionnel n’ait durci, il est coulé dans un récipient formé par deux
plaques de verres et polymérisera en une couche mince de gel de quelques Millimètres.

• Les échantillons sont déposés dans des puits préformés au sommet du gel.

• Le tampon est le même dans les réservoirs du haut et du bas (pH ~9 pour que toutes les
protéines aient une charge négative).

13
 • Un courant continu de 100 à 200 volts parcourt le gel pendant la durée de migration

• après migration, le gel est retiré et les bandes de protéine sont visualisées

Les protéines migreront vers l’anode (+) selon leur ratio charge/masse

Figure 7:L’électrophorèse en conditions non dénaturantes

b) L’électrophorèse en conditions dénaturantes

Une variante de cette technique consiste à utiliser du SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui
est un détergent anionique fort. Il a la propriété de défaire la structure spatiale en se fixant sur les
protéines et de les charger de la même façon permettant ainsi de les séparer uniquement en fonction
de leur masse moléculaire. Les protéines sont dites dénaturées: elles ont perdu leur structure
tridimensionnelle native.

Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du SDS, on utilise un agent

réducteur, le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des protéines les rendant ainsi sous
forme monomérique. La forte charge négative globale apportée par le SDS masque la charge
intrinsèque des protéines

14
 Par conséquence le rapport charge/masse sera le même pour toutes les protéines de même
masse et la séparation électrophorétique du gel avec du SDS dépendra uniquement du phénomène
de gel-filtration par les pores du gel.

Cette méthode donne la meilleure résolution et les bandes sont les plus résolues de toutes
les méthodes d’analyse- en utilisant des marqueurs de poids moléculaires connus.

cette méthode possède deux grands avantages par rapport à l’électrophorèse ordinaire :

• l’utilisation de SDS dissous les agrégats et les particules insolubles qui peuvent causer
des problèmes en bloquant les pores du gel

• la mobilité électrophorétique possède une relation directe avec le poids moléculaire

Xxx

Figure 8:L’électrophorèse en conditions dénaturantes

15
 c) Visualisation des protéines dans les gels
Une fois que la migration des protéines dans le gel est terminée, il faut visualiser les
bandes obtenues par les protéines

Les différentes approches sont:

• la coloration avec le bleu de Coomassie brillant

• la coloration au nitrate d’argent.

• Le bleu noir naphtol.

Une approche plus spécifique consiste à détecter la protéine d’intérêt avec un Exemple de
gel après coloration au bleu de Coomassie :

Figure 9:Visualisation des protéines dans les gels

C. Autre méthodes d’électrophorèse

1. Electrophorèse bidimensionnelle
Lorsqu'il est existé des bandes protéiques très proches, on a un chevauchement. Par les
méthodes unidimensionnelles la résolution et bon pour moins de 50 protéines. Grâce à
l'électrophorèse bidimensionnelle, on combine deux modes de séparation différents. La résolution
peut être appliquée pour plus de 1000 protéines différentes.

16
 a) DIMENSION 1
Séparation des protéines en fonction de la charge par Focalisation Isoélectrique (FIE). La
migration est effectuée dans un gradient de pH, chaque molécule migre jusqu'à l’endroit où le pH
est égal à son pHi. On utilise un gel de forte porosité (polyacrylamide ou agarose), pour que la
taille n’influence pas la migration. Le gradient de pH est généré par des ampholytes, molécules
amphotères de synthèse introduites dans le gel au moment de sa fabrication : on utilise un mélange
de telles molécules, possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme large ex : 3-9, ou plus
ou moins étroite ex : 4-5 ou 5-6.5) On réalise une électrophorèse dans un tube étroit de gel
polyacrylamide où un gradient de pH est établi. On soumet alors à un fort courant électrique

Figure 10:Electrophorèse bidimensionnelle DIMENTION 1

Les protéines migrent vers la position du gradient = pHi et s’y immobilisent.

b) DIMENSION 2
Séparation en fonction de la taille des protéines : SDS-PAGE Le gel étroit de protéines
séparées par FIE est soumis à une SDS-PAGE dans une direction perpendiculaire.

17
Figure 11:Electrophorèse bidimensionnelle DIMENTION 2

2. Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing)

La focalisation isoélectrique est une méthode permettant de séparer des protéines qui ne
diffèrent que par une seule charge.

Le principe de base de la focalisation isoélectrique (FIE) est de créer un gradient de pH

dans lequel pourront se déplacer les protéines soumises à un champ électrique. Les protéines
migreront dans ce champ électrique. Arrivées au pH correspondant à leur pi, elles s'immobiliseront
puisque leur charge nette sera nulle. De cette façon, il est possible de séparer les protéines d'une
préparation selon leur pi. On peut créer un tel gradient de pH avec des polyélectrolytes portant un
certain nombre de groupes ionisables positivement ou négativement (amines, carboxyles ou
sulfates) et possédant un certain pouvoir tampon. Ces molécules sont appelées ampholytes. Si on
soumet ces ampholytes à un champ électrique borné par une solution d'un acide fort à l'anode et
par une solution d'une base forte à la cathode, ils migreront et se distribueront par ordre de pi. Leur
capacité tampon aidera à maintenir autour d'elles une petite zone de pH égal à leur pi. Une série
d'ampholytes ayant donc chacun un pi couvrant une certaine gamme de pH créera donc un gradient
continu de pH. Si on fait migrer une petite quantité de protéines dans ce système, après ou durant
sa formation, elles migreront aussi et s'immobiliseront à leur pi.

La durée de la focalisation est beaucoup moins critique que celle d'une électrophorèse
ordinaire. En effet dans une FIE les protéines ne risquent pas de sortir du gel puisqu'elles
s'immobiliseront au point où elles auront atteint leur pi. Il faut seulement que la migration dure
suffisamment longtemps pour que les ampholytes aient le temps de migrer correctement et que
protéines aient le temps d'atteindre leur pi. À 2 mA, on estime le temps requis à environ 1 heure.

18
 Les procédures de coloration sont similaires à celle d'une électrophorèse en gel de
polyacrylamide. Il faut cependant éliminer les ampholytes du gel, car elles peuvent se colorer. On
fait donc précéder la coloration par trempage dans un bain d'acide trichloracétique 5 ou 10% pour
les faire diffuser hors du gel tout en fixant
les protéines sur place.

Figure 12:Electrofocalisation

3. Électrophorèse en champs pulsés

Cette technique est utilisée pour l'électrophorèse des molécules d'ADN de haut poids
moléculaire (15 -100 kb). Le temps nécessaire à l’orientation est d’autant plus grand que la
molécule d’ADN est longue. Il devient alors possible de séparer les molécules en fonction de leur
longueur. Cette méthode s'avère très utile dans les analyses du génome des procaryotes et des
eucaryotes.

Ce type d'électrophorèse a été développé par Schwartz et Cantor en 1984 afin de séparer
les grandes molécules d'ADN (> 50 kb) que l'électrophorèse classique en gel d’agarose ne permet
pas de résoudre, même en diminuant au maximum la concentration d'agarose (en dessous de 0.4%
les gels sont impossibles à manipuler).

La porosité d'un gel d'agarose classique est inférieure au micron alors que la longueur d'une
molécule d'ADN de 50 kb complètement étirée est d'environ 18 microns.

Le principe de l'électrophorèse en champ pulsé consiste à alterner l'orientation du champ

électrique au cours du temps. Chaque changement de champ électrique réoriente la molécule
d’ADN dans le gel augmentant ainsi la probabilité que la molécule d’ADN soit orientée de façon
à passer à travers les mailles du gel.

19
 Pour ce type d'électrophorèse, il n'est pas possible d'utiliser des ADN purifiés par les
techniques classiques, car ces techniques les cassent en fragments d'une taille inférieure à 100 kb.
Pour éviter la cassure mécanique des molécules d'ADN, les cellules sont incluses dans des blocs
d'agarose. La cartographie de restriction à grande échelle nécessite des enzymes qui coupent
rarement l’ADN et le fractionnement des grands fragments de restriction par électrophorèse sur
gel en champ pulsé

Figure 13:Électrophorèse en champs pulsés

4. Électrophorèse capillaire
C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre essentiellement les
avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la très grande sensibilité de la
détection.

En électrophorèse traditionnelle, les éléments chargés électriquement se déplacent dans le

liquide conducteur sous l'influence d'un champ électrique. Introduite dans les années 1960, la CE
a été conçue pour séparer des espèces chimiques selon leur rapport charge / taille à l'intérieur d'un
petit tube capillaire rempli d'un électrolyte

L'électrophorèse capillaire représente une famille de techniques qui utilisent des capillaires
étroits (diamètre interne de 10 à 200 mm) pour réaliser avec une très grande efficacité la séparation
électrophorétique de molécules de tailles très variables. Le domaine d'application de cette
technologie est très vaste et elle permet d'analyser des macromolécules complexes telles que les
protéines et les acides nucléiques ou des solutés de petite taille comme les médicaments
organiques, les anions et cations inorganiques. Des voltages très importants (plusieurs dizaines de
kV) sont utilisés pour séparer les molécules sur la base de leur différence de rapport charge/taille.

20
L'instrumentation est relativement simple et comporte les éléments principaux suivants : un
générateur de haut voltage, deux réservoirs de tampon et un capillaire que traverse un système
optique de détection relié à un module d'acquisition des données (figure 1). L'ensemble de
l'instrument est contrôlé par un ordinateur.

Figure 14:Électrophorèse capillaire

21
 CONCLUSION

Nous avons principalement décrit les méthodes électrophorétiques propres à l'analyse dont
les possibilités sont regroupées dans le tableau ci-contre. Certaines d'entre elles, nous l’avons vu,
sont extrapolables à l'analyse préparative et même à la séparation "industrielle" des protéines dans
les mélanges. Cependant; elles sont beaucoup moins résolutives qu'à l'échelle analytique.
L'électrophorèse est une méthode très fine d'analyse des macromolécules ionisées. L'analyse
s'effectue en plusieurs étapes (contrairement à la chromatographie, par exemple, où toutes les
étapes se déroulent dans le même appareil). Séparation des constituants du mélange ; révélation ;
identification et/ou quantification.

Le temps d'analyse varie de quelques heures à quelques jours.

Le choix de la solution tampon dans laquelle s'effectue la séparation est essentiel.

Selon que Je mélange à analyser est formé de substances "connues" ou "inconnues" ; la

méthode à employer sera différente:

 l'analyse du sérum humain est par exemple automatisée et s'effectue en électrophorèse de

zone sur acétate de cellulose.
 pour les mélanges dont les constituants sont inconnus, on pourra avoir recours à
l'électrophorèse sur gel ou à l'isofocalisation qui ; avec son grand pouvoir de résolution,
permet d'obtenir les constituants dans des zones très étroites et sous forme concentrée

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE
 Gwenola Burgot, Jean-Louis Burgot. Méthodes instrumentales d’analyse chimique et
application 2011, (185-200p)
 Hubert H. Girault, Electrochimie physique et analytique 2007 (155-170p)
 Francis Rouessac, Annick Rouessac, Analyse chimique : méthodes et techniques
instrumentales modernes 1998 (98-100p)

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