Microbilogie Des Aliments
Microbilogie Des Aliments
Microbilogie Des Aliments
Il faut donc que ces bactéries ne soient pas présentes dans nos aliments, ou si elles le sont, que
leur nombre soit tel que l’aliment ne soit pas dangereux. Et d’où la nécessité de procéder à des
analyses permettant de contrôler l’absence/présence de certains micro-organismes dangereux
et de compter le nombre de germes tolérables qui ne doit pas dépasser certaines limites fixées
par la réglementation.
I. GENERALITES
On peut appeler aliment tout ce qu'on ingère et qui peut être assimilé par l'organisme pour
répondre à ses besoins énergétiques et physiologiques.
a) Température de conservation
C'est un des facteurs les plus importants agissant sur le développement des microorganismes.
Une atmosphère ambiante très humide entraîne une prolifération des microorganismes à la
surface des aliments.
Les produits alimentaires non transformés sont souvent protégés du milieu extérieur par des enveloppes
(téguments, peau, coquille, etc.) qui constituent une barrière naturelle à la pénétration des
microorganismes.
Suite aux opérations de récolte, stockage et transformation des produits alimentaires frais
(récolte mécanique, congélation-décongélation, broyage, malaxage, etc.), on assiste à la
dégradation de ces enveloppes protectrices ce qui favorise la prolifération microbienne.
b) Le pH
À pH proche de la neutralité, ce sont les bactéries qui prédominent. Il existe des exceptions,
telles les bactéries les bactéries lactiques qui supportent des pH acides.
Plus l’eau est disponible en grande quantité, plus il sera facile de coloniser un aliment.
C’est pourquoi on limite cette eau disponible en séchant les aliments par le séchage, la
lyophilisation et la déshydratation.
e) La composition en nutriments
Les micro-organismes ont besoin de certains nutriments de base tels que l'azote, les vitamines
et les minéraux pour la croissance et le maintien des fonctions métaboliques.
f) Les substances antimicrobiennes
Les inhibiteurs de la croissance des microorganismes sont des molécules antimicrobiennes qui
se trouvent naturellement dans certains aliments, ou ajoutées volontairement par l’homme pour
la conservation des aliments (additifs).
Les exemples incluent de nombreuses huiles essentielles, tanins, glycosides et résines, qui
peuvent être trouvés dans certains aliments, des lysozymes dans les œufs et le lait…
Les effets des microbes sur les aliments sont : les maladies alimentaires, les altérations
alimentaires.
a) Les bactéries
On distingue :
- Les bactéries saprophytes : La plupart des aliments ont toujours une certaine quantité
de germes qui restent non nocifs (dans la mesure où ils ne se développent pas de façon
importante).
- Les bactéries utiles : comme les Bactéries Lactiques pour la fabrication du Yaourt.
- Les bactéries putréfiantes : comme les bactéries protéolytiques : attaquent les
protéines des aliments. Sont concernés les aliments riches en protéine telle que la
viande, les œufs, les poissons et les produits laitiers. La dégradation des protéines, induit
la libération de dérivés soufrés, ammoniaqués, qui donnent une odeur caractéristique «
d’œuf pourri ».
Les bactéries cellulolytiques et glucidolytiques. Ces bactéries vont attaquer les sucres
des fruits et légumes : la cellulose et les amidons sont hydrolysés, provoquant le
ramollissement puis le pourrissement des aliments.
- Les bactéries pathogènes : Elles se développent dans les aliments entraînant deux types
de maladies alimentaires (Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus
aureus ) :
✓ Les toxi-infections alimentaires
✓ Les maladies infectieuses alimentaires.
b) Les virus
Les virus sont aussi présents sur de nombreux produits alimentaires mais les études qui leur ont
été consacrées sont peu nombreuses. La transmission est principalement oro-fécale. Comme
exemples de virus : le virus de la poliomyélite, le virus de l’hépatite A, les Adénovirus.
En générale, les levures ne sont pas pathogènes (sauf Candida albicans, Cryptococcus
neoformans ou Saccharomyces neoformans) mais peuvent produire par leur développement
dans les aliments des altérations de qualité marchande par formation de troubles (cellules de
levures) d’odeurs ou de goût annexes anormaux (éthanol) ou par gonflement des produits ou de
leur emballage (CO2).
Certaines moisissures élaborent des toxines (mycotoxines) qui diffusent dans l’aliment et
peuvent provoquer si elles sont en quantité suffisantes des intoxications alimentaires.
Les analyses microbiologiques sont des moyens d’autocontrôle pour vérifier la conformité de
l’hygiène des aliments par rapport à la règlementation en vigueur.
✓ Analyse complète des produits finis : Assurée par le laboratoire officiel de contrôle
(ex: IPA) ou le laboratoire de l’industrie.
But : - Vérifier la conformité d’un produit à des critères microbiologiques.
- Garantir la qualité hygiénique donc la santé du consommateur.
✓ Analyse du produit en cours de fabrication : Assurée par le laboratoire de l’industrie,
ou son laboratoire conseil,
But : - Contrôle des bonnes pratiques de fabrication.
- Assurer au produit une bonne qualité et une bonne conservation.
Peut être réalisée de façon systématique (contrôle périodique) ou à partir de cas précis
(produits suspects, cas cliniques, accident de fabrication).
Pour les conserves, l’échantillon doit être réparti, au moins, en six (6) unités issues d’un même
lot.
Les échantillons prélevés doivent faire l’objet d’un étiquetage en mentionnent toutes les
indications nécessaires à la bonne exploitation des résultats d’analyses :
- Numéro d’ordre
- Date, heure, lieu du prélèvement
- Conditions de prélèvement : Température ambiante, température du produit, pH du produit
- Nom de l’opérateur.
Les échantillons doivent alors être acheminés au laboratoire dans des conditions assurant la
stabilité de la microflore d’origine.
Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à
partir d’une suspension.
Après ouverture aseptique, l’échantillon sera “homogénéisé” (liquide) ou broyé dans un volume
connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution.
- La prise d’essai pour une analyse bactériologique classique : à partir de cette suspension mère
(+1) que l’on prépare les dilutions décimales par le diluant, selon le protocole suivant :
La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) : est un indicateur sanitaire qui permet d'évaluer
le nombre d'UFC (Unité Formant une Colonie) présentes dans un produit.
• Origine : - Environnement.
- Matières premières (mauvaises qualités, chaine du froid non respectée).
- Manipulations (nettoyage inefficace ou défaut de pasteurisation).
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par incorporation.
• Milieu de culture : Gélose PCA (Plate Count Agar) : est un milieu nutritif sans
inhibiteurs.
• Volume de l’inoculum : 1ml de chaque dilution decimale : 10-1,10-2,10-3 (2 boites).
• Température / temps d’incubation : 30 °C pendant 72 h, couvercle en bas.
• Lecture et interprétation : compter les colonies en tête d'épingle qui poussent en
masse et noter les dilutions correspondantes.
N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
Ʃ C : La somme des colonies
d : Le taux de la 1ère dilution retenue.
• Intérêt d’analyse
- Ce sont des indicateurs de l’hygiène globale du process et de l’efficacité des techniques
de conservation.
- Signe de dégradation rapide de la denrée alimentaire (charge supérieure à 106 UFC/g).
Ce sont des bacilles à gram négatif (-), oxydase négatif (-), aérobie, anaérobie facultatif et qui
fermentent le glucose.
• Origine : - Denrées souillées par des fèces : viande contaminée lors de l’éviscération ;
légumes en contact avec du fumier, eaux souillées
- Les entérobactéries proviennent souvent des matières premières ou d’une
contamination croisée durant la production.
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par incorporation.
• Milieu de culture : VRBG : gélose au cristal Violet et au Rouge neutre Biliée
Glucosée.
• Volume inoculé : 1 ml des différentes dilutions (10-1, 10-2,10-3).
• Température / temps d’incubation : 37°C pendant 24 h.
• Lecture et interprétation : Dénombrer les colonies caractéristiques de couleur rouge
qui poussent en masse, et noter la dilution correspondante
N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
Ʃ C : La somme des colonies
d : Le taux de la 1ère dilution retenue
NB: Il est impératif de retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 10 et 150
colonies.
• Intérêt d’analyse
- Indicateurs de contamination fécale (humaine ou animale).
- La présence d’entérobactéries laisse suspecter la présence possible de pathogènes
alimentaires.
Les coliformes totaux sont des bactéries en forme de bâtonnet, aérobies ou anaérobies
facultatives, possédant l’enzyme ß- galactosidase permettant l’hydrolyse du lactose à 37°C avec
production de gaz. Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter,
Escherichia, Klebsiella et Serratia
2. Coliformes thermotolérants
3. Escherichia coli
• Lecture et interprétation
✓ Pour les coliformes totaux
- Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 10 et 150 UFC.
- On doit confirmer les colonies atypiques par repiquage en milieu VBL+ cloche.
Test de confirmation
- Repiquer des différentes colonies atypiques dans chaque tubes VBL+ cloche.
- Chasser le gaz présent dans les cloches avant l’incubation.
- Incuber les tubes à 24h à 37°C.
- Noter le nombre de tubes positifs.
- Calcul :
C1 = b x c
A
C1 : Nombre de coliformes identifiées ;
b : Nombre de colonies atypiques positives
c : Nombre total de colonies atypiques
A : Nombre de colonies atypiques repiqués
Ainsi, le nombre des coliformes totaux est :
N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
Ʃ C : La somme des colonies typiques et atypiques confirmées.
d : Le taux de la 1ère dilution retenue
NB: Il est impératif de retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 10 et 150
colonies typiques et atypiques.
- Dénombrer les colonies de couleur rouge qui poussent en masse et noter la dilution
correspondante.
- Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 10 et 150.
N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
N : nombre de coliformes thermotolérants /gr ou ml
Ʃ C : C1 + C2 (la somme des colonies de la 1ère et 2ème dilutions)
d : Le taux de la 1ère dilution retenue
NB: Il est impératif de retenir 2 boites de dilutions successives (les plus fortes dilutions)
contenant entre 10 et 150 colonies .
C1 = b x c
A
C1 : Nombre de coliformes identifiées ;
b : Nombre des tubes positifs
c : Nombre total de colonies.
A : Nombre de colonies repiqués
• Intérêt d’analyse :
- E. coli est le meilleur indicateur de contamination fécale.
Les ASR sont des bacilles à gram positives, anaérobies strictes et qui ont la capacité du réduire
les sulfites en sulfures.
Ʃ𝑪
𝑵= / 𝒈𝒓 𝒐𝒖 𝒎𝒍
𝟐. 𝟐 × 𝒅
Ce sont des cocci à gram positif de forme sphérique, halophiles c'est-à-dire cultivent en
présence de 5 % de NaCl et qui possèdent une catalase
Pour confirmer qu’il s’agit bien de colonies de Staphylococcus aureus, effectuer des tests
biochimiques rapides (catalase et coagulase).
C’est uniquement sur les colonies catalase positif qu’on effectue le test coagulase, et on note le
nombre de colonie(s) à catalase et coagulase positif.
A. Test catalase :
- Prélever une moitié de la colonie et la déposer sur une lame propre, puis déposer sur cette
demi- colonie une goutte d’eau oxygénée (H2O2).
- S’il y’avait un dégagement des bulles gaz, cela signifie que la bactérie est Catalase positive.
B. Test coagulase :
- La moitié de chaque colonie ayant la catalase positive est repiquée dans un bouillon cœur
cervelle (BHIB). Les tubes sont incubés ensuite 24h à 37°C.
- Mélanger 0.1 ml du bouillon BHIB avec 0,3 ml avec le plasma du lapin dans un tube stérile
et incuber les tubes à 37°C pendant 24h ou bien au bain marie 37°C pdt 30min. Faire des
lectures durant les 1ères heures d’incubation et laisser 24h si le résultat est négatif.
Les salmonelles sont des bacilles à gram négatif, de la famille des entérobactéries ; Mobile
(ciliature péritriche), aéro-anaérobie facultatif, oxydase (-), lactose (-) et fermentatives du
glucose. Responsable de toxi-infection alimentaire.
1. Préparation de l’échantillon
2. Etape de pré-enrichissement : Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée
Tamponnée 16-20 h à 37 °C.
3. Etape d’enrichissement : A partir du pré-enrichissement on effectue un enrichissement sur
bouillant SFB D/C (double concentration). Incuber pendant 18-24h à 37°C.
4. Etape d’isolement : C’est seulement à partir des flacons qui présente un virage vers le
rouge brique qu’on va faire l’isolement sur Hektoen. Incuber à 37°C pendant 18-24h.
Req : au cours de cette étape, effectuer également un deuxième enrichissement dans lequel
rajouter à un tube contenant 10ml du bouillant SFB et 02 disques d’additif SFB + 10ml d’EPT
pré-enrichie, et incuber 18- 24h à 37°C.
5. Identification :
• Lecture : Colonies typiques (forte suspicion de salmonelle) : des colonies ayant un
contour régulier, transparente (verte sur Hektoen) avec ou sans centre noir (H2S +).
• Repiquage sur TSI (Triple Sugar Iron) : qui permet de mettre en évidence la
fermentation du lactose, le glucose et le saccharose ainsi que la production du gaz et
l’H2S (hydrogène sulfuré).
Lecture : Les salmonelles doivent être : urée -, TDA -, indole -, ONPG – (sauf S. arizonae),
LDC+
• Une galerie API 20 E
• Une confirmation sérologique par la recherche d'antigènes des salmonelles à partir des
colonies isolées.
H. Recherche de Listeria dans les denrées alimentaires
• Définition :
Les bactéries du genre Listeria sont des petits bacilles à Gram positif, à extrémité arrondie,
asporulés, mobiles à 20-25°C.
Bactérie pathogène capable de croître à 4°C (donc dans les denrées réfrigérées).
• Principe : La recherche de listéria monocytogenes se fait en plusieurs étapes :
- Enrichissement primaire dans le bouillant Fraser demi en flacon.
- Enrichissement secondaire dans le bouillant Fraser demi en tube.
- Isolement sur gélose, Oxford, Palcam, milieu chromogénique pour listéria.
- Identification biochimique et sérologique.
a - Après 24-48 h d’incubation, forment sur gélose PALCAM des colonies d’environ 2 mm de
diamètre, de couleur gris-vert, avec un centre concave et un halo noir sur un fond rouge
cerise.
Sur la gélose Oxford, Listeria monocytogenes forme des colonies vert-olive entourées d’un
halo noir après 24h ; après 48h, elles deviennent plus foncées avec un centre noir en creux et
sont entourées de zones noires.
Les colonies caractéristiques des L. monocytogenes doivent être confirmées par des tests
biochimiques et immunologiques.
Résultat : Mannitol (-), mobilité (+), nitrate réductase (-), urée (-), indole (-), TDA (-), VP
(+), RM (+), esculine (+), TSI (glucose (+), gaz (-), H2S (-)).
- PCR : C’est une méthode sensible, rapide et spécifique qui vise à rechercher les gènes par
hybridation et révélation.
• Intérêt d’analyse :
- Analyser pour assurer l’absence de L. monocytogenes dans tous les aliments où le
pathogène pourrait se multiplier.
NB : Il faut faire aussi un témoin milieu et un témoin diluant (milieu sabouraud ensemencer par
0.2 ml du diluant seul (TSE : Tryptone Sel Eau) ; Dans le but de vérifier la qualité du milieu et
contrôler le TSE.
• Lecture et interprétation :
- Les levures : colonie ovalaire ou sphérique.
- Les moisissures : cellules présentent des filaments mycéliens qui sont disséminés par
l’émission de spores.
N= Σa /gr ou ml
V x 1,1 x F
Σa : la somme des colonies.
d : Le taux de la 1ère dilution retenue
V : Volume inoculé
• Intérêt d’analyse :
- Les levures et moisissures sont des agents importants d’altération. Elles dégradent :
les denrées fraiches (fruits et légumes), réfrigérées (produits de viande, fromages),
sèches (charcuteries) et même acides (jus de fruits).
Selon Arrêté interministériel du 2 Muharram 1438 correspondant au 4 octobre 2016 fixant les
critères microbiologiques des denrées alimentaires. On définit les paramètres :
m : nombre de germes présents dans 1 gr ou 1ml de produit analysé (25 gr pour les salmonelles);
c'est le seuil en dessous duquel le produit est considéré comme étant de qualité satisfaisante;
M : nombre de germes présents dans 1 gr ou 1 ml de produit analysé (25 gr pour les salmonelles)
il correspond à la valeur au-dessus de laquelle la qualité du produit est considéré comme
inacceptable ;
c : nombre maximale d'unités d'échantillonnage de produit analysé qui peut dépasser "m" tout
en étant inférieur à "M" sans que le lot ne soit rejeté.
1. Plan à trois classes : Ce plan est ainsi désigné parce que les résultats des examens interprétés
sur cette base, permettent de fixer trois classes de contamination, à savoir :
2. Plan à deux classes : Ce plan est ainsi désigné car les résultats des examens interprétés sur
cette base permettent de déterminer deux classes de contamination.
Ce type de plan qui n'accepte aucune tolérance, même de caractère analytique, correspondant
souvent aux expressions :
« Présence dans » : Le résultat est considéré comme non satisfaisant ; dans ce cas, le produit est
déclaré impropre à la consommation.
Catégorie satisfaisante si le résultat d'analyse est inférieur à "m" ; le produit est propre à la
consommation.
Catégorie non satisfaisante lorsque le résultat d'analyse est supérieur à "m" ; le produit est
déclaré impropre à la consommation.