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Microbilogie Des Aliments

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Cours Hydro-Bromatologie 5eme Année Pharmacie 2022-2023

LA MICROBIOLOGIE DES ALIMENTS


INTRODUCTION
Les produits alimentaires destinés à la consommation humaine peuvent, dans la plupart des cas,
renfermer de nombreux germes dont certains possèdent un redoutable pouvoir pathogène pour
l’Homme ou induisent des modifications indésirables résultant d’une intense prolifération
microbienne.

Il faut donc que ces bactéries ne soient pas présentes dans nos aliments, ou si elles le sont, que
leur nombre soit tel que l’aliment ne soit pas dangereux. Et d’où la nécessité de procéder à des
analyses permettant de contrôler l’absence/présence de certains micro-organismes dangereux
et de compter le nombre de germes tolérables qui ne doit pas dépasser certaines limites fixées
par la réglementation.

I. GENERALITES

I.1. Définition de l’aliment

On peut appeler aliment tout ce qu'on ingère et qui peut être assimilé par l'organisme pour
répondre à ses besoins énergétiques et physiologiques.

I.2. Origine des microorganismes des aliments

Les micro-organismes des aliments ont trois origines possibles :


- Ils préexistent dans la matière brute ou l’aliment avant toute manipulation ou
transformation (endogènes).
- Ils sont apportés accidentellement lors des manipulations ultérieures de l’aliment
(matériel, personnel, l’environnement : air, sol et eau, les insectes...).
- Ils sont ajoutés volontairement (ex : les ferments lactiques pour la fabrication des
yaourts).
I.3. Facteurs favorisants le développement des microorganismes
✓ Facteurs extrinsèques

Dr. Rezak Hadda Yasmine


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a) Température de conservation
C'est un des facteurs les plus importants agissant sur le développement des microorganismes.

Chaque microorganisme a la possibilité de se développer dans un intervalle de température


caractérisée par une limite inférieure, un optimum et une limite supérieure au-delà de laquelle
la mort survient (à quelques degrés près).

Germes Minimale Optimale Maximale


Thermophiles Clostridium 35-45 55-75 60-90
Mésophiles Tous germes pathogènes se 5-10 30-45 35-47
développant à 37°C
Psychrotropes Cocci et batônnets G + (-)5-(+)10 20-30 30-35
Levures et moisissures
Psychrophiles Moisissures (-)5-(+)5 12-15 15-20
Streptocoques

b) Humidité relative (HR) :

Une atmosphère ambiante très humide entraîne une prolifération des microorganismes à la
surface des aliments.

c) Les gaz environnants ou atmosphère de conservation :

Les microorganismes sont classés en fonction de leurs exigences en O2 en :

- Aérobies stricts (Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus).


- Aérobies facultatifs (Entérobactéries, Staphylococcus).
- Anaérobies stricts (Clostridium, Bactéroïdes, ...).
Un conditionnement sous vide ou une atmosphère azotée permet d’éviter des contaminations
par des microorganismes aérobies.
✓ Facteurs intrinsèques
a) La structure du produit alimentaire

Les produits alimentaires non transformés sont souvent protégés du milieu extérieur par des enveloppes
(téguments, peau, coquille, etc.) qui constituent une barrière naturelle à la pénétration des
microorganismes.

Suite aux opérations de récolte, stockage et transformation des produits alimentaires frais
(récolte mécanique, congélation-décongélation, broyage, malaxage, etc.), on assiste à la
dégradation de ces enveloppes protectrices ce qui favorise la prolifération microbienne.

Dr. Rezak Hadda Yasmine


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b) Le pH

À pH acide, le développement des levures et des moisissures est favorisé.

À pH proche de la neutralité, ce sont les bactéries qui prédominent. Il existe des exceptions,
telles les bactéries les bactéries lactiques qui supportent des pH acides.

Micro-organisme pH pH optimum Exemple

Bactéries Entre Neutre proche de Vibrio cholerae (bactérie


3,8 et 9 7 basophile) : pH optimum 9
E. coli prolifère à des pH
entre 4,4 et 9

Champignons, levures Entre Légèrement acide Micromycètes


et moisissures (3 - 3,5) et 9 (5,5 - 6)

c) L’activité de l’eau (aw)

Plus l’eau est disponible en grande quantité, plus il sera facile de coloniser un aliment.
C’est pourquoi on limite cette eau disponible en séchant les aliments par le séchage, la
lyophilisation et la déshydratation.

Activité de l’eau Aw Type d’aliment Micro-organisme développé


Aussi élevé Les produits frais (fruits et Les micro-organismes en
légumes)… générale
Plus basse Les Fromages secs, les margarines, Levures
Entre 0,9 et 0,87 les charcuteries sèches…
Entre 0,87 et 0,80 Les laits concentrés, les farines, riz Staphylococcus aureus
et légumes secs… Moisissures
Entre 0,80 et 0,5 / Moisissures
En dessous de 0,5 Les pâtes, les laits en poudre, … Le développent fortement
ralenti ou arrêté

e) La composition en nutriments
Les micro-organismes ont besoin de certains nutriments de base tels que l'azote, les vitamines
et les minéraux pour la croissance et le maintien des fonctions métaboliques.
f) Les substances antimicrobiennes

Les inhibiteurs de la croissance des microorganismes sont des molécules antimicrobiennes qui
se trouvent naturellement dans certains aliments, ou ajoutées volontairement par l’homme pour
la conservation des aliments (additifs).

Dr. Rezak Hadda Yasmine


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Les exemples incluent de nombreuses huiles essentielles, tanins, glycosides et résines, qui
peuvent être trouvés dans certains aliments, des lysozymes dans les œufs et le lait…

I.4. Les principaux microorganismes des produits alimentaires

Les effets des microbes sur les aliments sont : les maladies alimentaires, les altérations
alimentaires.

a) Les bactéries

On distingue :

- Les bactéries saprophytes : La plupart des aliments ont toujours une certaine quantité
de germes qui restent non nocifs (dans la mesure où ils ne se développent pas de façon
importante).
- Les bactéries utiles : comme les Bactéries Lactiques pour la fabrication du Yaourt.
- Les bactéries putréfiantes : comme les bactéries protéolytiques : attaquent les
protéines des aliments. Sont concernés les aliments riches en protéine telle que la
viande, les œufs, les poissons et les produits laitiers. La dégradation des protéines, induit
la libération de dérivés soufrés, ammoniaqués, qui donnent une odeur caractéristique «
d’œuf pourri ».
Les bactéries cellulolytiques et glucidolytiques. Ces bactéries vont attaquer les sucres
des fruits et légumes : la cellulose et les amidons sont hydrolysés, provoquant le
ramollissement puis le pourrissement des aliments.
- Les bactéries pathogènes : Elles se développent dans les aliments entraînant deux types
de maladies alimentaires (Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus
aureus ) :
✓ Les toxi-infections alimentaires
✓ Les maladies infectieuses alimentaires.

b) Les virus

Les virus sont aussi présents sur de nombreux produits alimentaires mais les études qui leur ont
été consacrées sont peu nombreuses. La transmission est principalement oro-fécale. Comme
exemples de virus : le virus de la poliomyélite, le virus de l’hépatite A, les Adénovirus.

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c) Les levures et moisissures

En générale, les levures ne sont pas pathogènes (sauf Candida albicans, Cryptococcus
neoformans ou Saccharomyces neoformans) mais peuvent produire par leur développement
dans les aliments des altérations de qualité marchande par formation de troubles (cellules de
levures) d’odeurs ou de goût annexes anormaux (éthanol) ou par gonflement des produits ou de
leur emballage (CO2).

Certaines moisissures élaborent des toxines (mycotoxines) qui diffusent dans l’aliment et
peuvent provoquer si elles sont en quantité suffisantes des intoxications alimentaires.

II. ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS

Les analyses microbiologiques sont des moyens d’autocontrôle pour vérifier la conformité de
l’hygiène des aliments par rapport à la règlementation en vigueur.

L’intérêt de ce control est d :


- Vérifier la qualité sanitaire et commerciale du produit par identification des
microorganismes et quantification du nombre de colonies.
- Apporter aux producteurs de denrées une information sur la stabilité et la qualité
technologique de son produit et le respect des bonnes pratiques d’hygiène tout au long
de la production.

II.1. Les niveaux de contrôle microbiologique

L’analyse bactériologique est de 3 types :

✓ Analyse complète des produits finis : Assurée par le laboratoire officiel de contrôle
(ex: IPA) ou le laboratoire de l’industrie.
But : - Vérifier la conformité d’un produit à des critères microbiologiques.
- Garantir la qualité hygiénique donc la santé du consommateur.
✓ Analyse du produit en cours de fabrication : Assurée par le laboratoire de l’industrie,
ou son laboratoire conseil,
But : - Contrôle des bonnes pratiques de fabrication.
- Assurer au produit une bonne qualité et une bonne conservation.
Peut être réalisée de façon systématique (contrôle périodique) ou à partir de cas précis
(produits suspects, cas cliniques, accident de fabrication).

✓ Analyse de la matière brute.

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II.2. Prélèvements, transport et préparation des échantillons


II.2.1. Prélèvements
Le laboratoire doit disposer d’environ 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant
être fournis par une ou plusieurs pièces. Ces prélèvements doivent avant tout respecter des
règles d’asepsie et de représentativité.

Pour les conserves, l’échantillon doit être réparti, au moins, en six (6) unités issues d’un même
lot.

Cas de produit solide :

- Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits


mous) ou à la pipette harpon.
- La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement.
- Si le produit est hétérogène (plats cuisinés et conserves) il faut s’assurer de la bonne
représentativité du prélèvement.

II.2.2. Transport des échantillons

Les échantillons prélevés doivent faire l’objet d’un étiquetage en mentionnent toutes les
indications nécessaires à la bonne exploitation des résultats d’analyses :
- Numéro d’ordre
- Date, heure, lieu du prélèvement
- Conditions de prélèvement : Température ambiante, température du produit, pH du produit
- Nom de l’opérateur.
Les échantillons doivent alors être acheminés au laboratoire dans des conditions assurant la
stabilité de la microflore d’origine.

II.2.3. Préparation des échantillons

Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à
partir d’une suspension.

Après ouverture aseptique, l’échantillon sera “homogénéisé” (liquide) ou broyé dans un volume
connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution.

A- Produits liquides : (ou semi-liquides) une agitation manuelle rigoureuse en présence


de billes de verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante. C’est la suspension mère.

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- La prise d’essai pour une analyse bactériologique classique : à partir de cette suspension mère
(+1) que l’on prépare les dilutions décimales par le diluant, selon le protocole suivant :

✓ Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE


✓ Mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE,
✓ Mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE
- La prise d’essai pour les recherches des Salmonella et de Listeria monocytogenes : prélever
2×25 ml de la suspension mère :

✓ Introduire 25 ml de la suspension mère dans un flacon de bouillon FRASER


✓ Introduire 25 ml de la suspension mère dans un flacon d’Eau Peptonée Tamponnée (EPT)

B- Produit solide : Peser dans 03 sachet stérile 3 × 25 gr du produit à analyser (Parties


superficielles et profondes) aseptiquement :
- La 1ère pesée servira au contrôle bactériologique.
- La seconde servira à la recherche de Salmonella.
- La troisième servira à la recherche de Listéria.
- La prise d’essai pour une analyse bactériologique classique :

✓ Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser ;


✓ Broyer l’aliment (manuelle ou mécanique par un broyeur STOMACHER) selon la
texture du produit 2 à 5 minutes ;
✓ Verser le contenu dans le flacon de TSE C’est la suspension mère 10-1
✓ A partir de cette suspension mère (10-1), préparer les dilutions décimales suivent le
protocole précédemment décrit.

- La prise d’essai pour la recherche des Salmonella et des Listeria monocytogenes :

✓ Verser l’Eau Peptonée Tamponnée (Salmonella) et le bouillon Fraser (Listéria) dans le


sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser ;
✓ Broyer l’aliment 2 à 5 minutes ;
✓ Verser le contenu dans les flacons respectifs (contenant chacun 225 ml).

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II.3. Analyse proprement dite


A. Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux
• Définition

La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) : est un indicateur sanitaire qui permet d'évaluer
le nombre d'UFC (Unité Formant une Colonie) présentes dans un produit.

Ce dénombrement se fait à 30 °C ce qui permet de dénombrer trois grands types de flore :


- La flore thermophile, température optimale de croissance à 45 °C ;
- La flore mésophile, température optimale de croissance entre 20 °C et 40 °C ;
- La flore psychrophile, température optimale de croissance à 20 °C.

• Origine : - Environnement.
- Matières premières (mauvaises qualités, chaine du froid non respectée).
- Manipulations (nettoyage inefficace ou défaut de pasteurisation).
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par incorporation.
• Milieu de culture : Gélose PCA (Plate Count Agar) : est un milieu nutritif sans
inhibiteurs.
• Volume de l’inoculum : 1ml de chaque dilution decimale : 10-1,10-2,10-3 (2 boites).
• Température / temps d’incubation : 30 °C pendant 72 h, couvercle en bas.
• Lecture et interprétation : compter les colonies en tête d'épingle qui poussent en
masse et noter les dilutions correspondantes.

N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
Ʃ C : La somme des colonies
d : Le taux de la 1ère dilution retenue.
• Intérêt d’analyse
- Ce sont des indicateurs de l’hygiène globale du process et de l’efficacité des techniques
de conservation.
- Signe de dégradation rapide de la denrée alimentaire (charge supérieure à 106 UFC/g).

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B. Recherche et dénombrement des Enterobacteriacea


• Définition

Ce sont des bacilles à gram négatif (-), oxydase négatif (-), aérobie, anaérobie facultatif et qui
fermentent le glucose.

• Origine : - Denrées souillées par des fèces : viande contaminée lors de l’éviscération ;
légumes en contact avec du fumier, eaux souillées
- Les entérobactéries proviennent souvent des matières premières ou d’une
contamination croisée durant la production.
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par incorporation.
• Milieu de culture : VRBG : gélose au cristal Violet et au Rouge neutre Biliée
Glucosée.
• Volume inoculé : 1 ml des différentes dilutions (10-1, 10-2,10-3).
• Température / temps d’incubation : 37°C pendant 24 h.
• Lecture et interprétation : Dénombrer les colonies caractéristiques de couleur rouge
qui poussent en masse, et noter la dilution correspondante

N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
Ʃ C : La somme des colonies
d : Le taux de la 1ère dilution retenue

NB: Il est impératif de retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 10 et 150
colonies.

• Intérêt d’analyse
- Indicateurs de contamination fécale (humaine ou animale).
- La présence d’entérobactéries laisse suspecter la présence possible de pathogènes
alimentaires.

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C. Recherche et dénombrement des coliformes totaux, coliformes


thermotolérants et Escherichia coli
• Définitions
1. Coliformes totaux

Les coliformes totaux sont des bactéries en forme de bâtonnet, aérobies ou anaérobies
facultatives, possédant l’enzyme ß- galactosidase permettant l’hydrolyse du lactose à 37°C avec
production de gaz. Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter,
Escherichia, Klebsiella et Serratia

2. Coliformes thermotolérants

Les coliformes thermotolérants sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de


fermenter le lactose à une température de 44°C.

3. Escherichia coli

Il s’agit là de coliformes thermotolérants qui produisent, en outre, de l’indole à partir du


tryptophane à 44°C.

La bactérie E. coli représente toutefois 80 à 90 % des coliformes thermotolérants détectés

• Origine : - Mauvaise hygiène du matériel : problème de nettoyage et désinfection des


surfaces, mains…
- Contaminations croisées.
- Traitement thermique inefficace (par exemple : lait mal pasteurisé).

• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par incorporation.


• Milieu de culture : VRBL (Gélose Lactosée Biliée au cristal Violet et au Rouge
Neutre).
• Volume inoculé : dans 02 séries des boites de pétri 1 ml des différentes dilutions.
• Température/temps d’incubation
- 1ere série : à 37°C pendant 24 h pour la recherche des coliformes totaux ;
- 2ème série : à 44°C pendant 24 h pour la recherche des coliformes thermotolérants et
E.coli.

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• Lecture et interprétation
✓ Pour les coliformes totaux

- Dénombrer les colonies typiques (0.5mm de diamètre) et atypiques (<0.5 mm de diamètre) de


couleur rouge qui poussent en masse, parfois entourées d'une zone rougeâtre due à la
précipitation de la bile, et noter la dilution correspondante.

- Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 10 et 150 UFC.

- On doit confirmer les colonies atypiques par repiquage en milieu VBL+ cloche.

Test de confirmation

- Repiquer des différentes colonies atypiques dans chaque tubes VBL+ cloche.
- Chasser le gaz présent dans les cloches avant l’incubation.
- Incuber les tubes à 24h à 37°C.
- Noter le nombre de tubes positifs.
- Calcul :

C1 = b x c
A
C1 : Nombre de coliformes identifiées ;
b : Nombre de colonies atypiques positives
c : Nombre total de colonies atypiques
A : Nombre de colonies atypiques repiqués
Ainsi, le nombre des coliformes totaux est :
N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
Ʃ C : La somme des colonies typiques et atypiques confirmées.
d : Le taux de la 1ère dilution retenue

NB: Il est impératif de retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 10 et 150
colonies typiques et atypiques.

✓ Pour les coliformes thermotolérants

- Dénombrer les colonies de couleur rouge qui poussent en masse et noter la dilution
correspondante.
- Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 10 et 150.

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N= Ʃ C /gr ou ml
1.1 x d
N : nombre de coliformes thermotolérants /gr ou ml
Ʃ C : C1 + C2 (la somme des colonies de la 1ère et 2ème dilutions)
d : Le taux de la 1ère dilution retenue

NB: Il est impératif de retenir 2 boites de dilutions successives (les plus fortes dilutions)
contenant entre 10 et 150 colonies .

✓ Recherche d’Escherichia coli

- Repiquer 5 colonies des coliformes thermotolérants sur le milieu urée indole.


- Incuber le milieu Urée Indole ensemencé 24h à 37°C.
- Après l’incubation, rajouter dans chaque tubes 02 gouttes de réactif Kovacs.
- Noter le nombre des tubes positifs dans lesquelles un anneau rouge se forme lors de l’ajout du
réactif de Kovacs.
- Calcul :

C1 = b x c
A
C1 : Nombre de coliformes identifiées ;
b : Nombre des tubes positifs
c : Nombre total de colonies.
A : Nombre de colonies repiqués
• Intérêt d’analyse :
- E. coli est le meilleur indicateur de contamination fécale.

- Sa présence est généralement associée à un manque d’hygiène du personnel, ou à une


contamination croisée (par exemple : salade souillée par des matières fécales).

D. Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux


• Définition
Sont des bactéries sphériques (cocci), en paire ou en chaîne, à Gram positif, catalase négative
et anaérobies facultatives.
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par étalement en surface.
• Milieu de culture : Gélose BEA (gélose à la bile, à l’esculine, à l’azide de Na et citrate
de fer ammoniacal)

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• Volume étalé : 1ml des différentes dilutions.


• Température / temps d’incubation : 37°C pendant 24- 48h.
• Lecture : dénombrer les colonies grises entouré, d’une auréole noire : esculine +
(l’esculine forme un complexe noir en présence des ions ferriques apportés par le citrate
de fer).
• Intérêt de la recherche : indice d’une contamination d’origine fécale de l’aliment. Ils
ne sont qu'exceptionnellement pathogènes.

E. Recherche et dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs à 37°C


• Définition

Les ASR sont des bacilles à gram positives, anaérobies strictes et qui ont la capacité du réduire
les sulfites en sulfures.

• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par incorporation en


profondeur.
• Milieu de culture : Gélose viande foie (VF) additionnée d’une ampoule d’alun de fer
et une ampoule de sulfite de sodium.
• Volume inoculé : 1ml de la dilution (10-1 ou 10-2) dans un tube stérile. (après
destruction de la forme végétative par chauffage à 80°C/10 min).
• Lecture et interprétation :
- Effectuer la 1ère lecture après 16h d’incubation puis après 24 et 48h.
- La présence de spores de bactéries sulfito-réductrices se traduit par des colonies
blanches entourées d’un halo noir de 5 mm de diamètre qui poussent en profondeur.

Ʃ𝑪
𝑵= / 𝒈𝒓 𝒐𝒖 𝒎𝒍
𝟐. 𝟐 × 𝒅

ƩC : la somme des colonies


d : le taux de la 1ère dilution retenue
NB : retenir les tubes de dilutions successives contenant moins de 30 colonies.

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F. Recherche et dénombrement de staphylococcus a coagulase positive


• Définition :

Ce sont des cocci à gram positif de forme sphérique, halophiles c'est-à-dire cultivent en
présence de 5 % de NaCl et qui possèdent une catalase

• Origine : - Présente sur la peau et les muqueuses de l’homme et des animaux.


- Elles sont capables de se multiplier dans des salaisons, ou en surface de
poissons salés.
- Certaines espèces psychrotrophes se développent sur des aliments
réfrigérés.
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par étalement en surface.
• Milieu de culture : gélose Baird Parker + une solution jaune d’œuf au tellurite de
potassium.
• Volume étalé : 0,1 mL des dilutions 10-1,10-2et 10-3.
• Température/temps d’incubation : couvercle en bas 48h à 37°C .
• Lecture et interprétation : Staphylococcus aureus est caractérisé par la formation de
colonies noires, brillantes, convexes, entourées d’un halo clair
➢ Test de confirmation :

Pour confirmer qu’il s’agit bien de colonies de Staphylococcus aureus, effectuer des tests
biochimiques rapides (catalase et coagulase).

C’est uniquement sur les colonies catalase positif qu’on effectue le test coagulase, et on note le
nombre de colonie(s) à catalase et coagulase positif.

A. Test catalase :

- Prélever une moitié de la colonie et la déposer sur une lame propre, puis déposer sur cette
demi- colonie une goutte d’eau oxygénée (H2O2).

- S’il y’avait un dégagement des bulles gaz, cela signifie que la bactérie est Catalase positive.

B. Test coagulase :

- La moitié de chaque colonie ayant la catalase positive est repiquée dans un bouillon cœur
cervelle (BHIB). Les tubes sont incubés ensuite 24h à 37°C.

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- Mélanger 0.1 ml du bouillon BHIB avec 0,3 ml avec le plasma du lapin dans un tube stérile
et incuber les tubes à 37°C pendant 24h ou bien au bain marie 37°C pdt 30min. Faire des
lectures durant les 1ères heures d’incubation et laisser 24h si le résultat est négatif.

- Le résultat est positif si le plasma de lapin se coagule et si le coagulum occupe + des ¾ du


volume du liquide initial.

G. Recherche des salmonelles dans les denrées alimentaires


• Définition

Les salmonelles sont des bacilles à gram négatif, de la famille des entérobactéries ; Mobile
(ciliature péritriche), aéro-anaérobie facultatif, oxydase (-), lactose (-) et fermentatives du
glucose. Responsable de toxi-infection alimentaire.

1. Préparation de l’échantillon
2. Etape de pré-enrichissement : Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée
Tamponnée 16-20 h à 37 °C.
3. Etape d’enrichissement : A partir du pré-enrichissement on effectue un enrichissement sur
bouillant SFB D/C (double concentration). Incuber pendant 18-24h à 37°C.
4. Etape d’isolement : C’est seulement à partir des flacons qui présente un virage vers le
rouge brique qu’on va faire l’isolement sur Hektoen. Incuber à 37°C pendant 18-24h.

Req : au cours de cette étape, effectuer également un deuxième enrichissement dans lequel
rajouter à un tube contenant 10ml du bouillant SFB et 02 disques d’additif SFB + 10ml d’EPT
pré-enrichie, et incuber 18- 24h à 37°C.

5. Identification :
• Lecture : Colonies typiques (forte suspicion de salmonelle) : des colonies ayant un
contour régulier, transparente (verte sur Hektoen) avec ou sans centre noir (H2S +).
• Repiquage sur TSI (Triple Sugar Iron) : qui permet de mettre en évidence la
fermentation du lactose, le glucose et le saccharose ainsi que la production du gaz et
l’H2S (hydrogène sulfuré).

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Lactose Glucose Saccharose H2 S Gaz


S.Typhi - + + + -
S.Paratyphi A - + + - +
Autres - + + + +
Salmonelles

• Une mini-galerie classique : urée-indole, ONPG, TDA. LDC

Lecture : Les salmonelles doivent être : urée -, TDA -, indole -, ONPG – (sauf S. arizonae),
LDC+
• Une galerie API 20 E
• Une confirmation sérologique par la recherche d'antigènes des salmonelles à partir des
colonies isolées.
H. Recherche de Listeria dans les denrées alimentaires
• Définition :
Les bactéries du genre Listeria sont des petits bacilles à Gram positif, à extrémité arrondie,
asporulés, mobiles à 20-25°C.
Bactérie pathogène capable de croître à 4°C (donc dans les denrées réfrigérées).
• Principe : La recherche de listéria monocytogenes se fait en plusieurs étapes :
- Enrichissement primaire dans le bouillant Fraser demi en flacon.
- Enrichissement secondaire dans le bouillant Fraser demi en tube.
- Isolement sur gélose, Oxford, Palcam, milieu chromogénique pour listéria.
- Identification biochimique et sérologique.

1ère étape : Enrichissement primaire

25 gr ou 25 ml du produit à analyser est dilué dans 225 ml de bouillon FRASER et incubé à


30°C pendant 18 à 24h.

2ème étape : Isolement primaire et Enrichissement secondaire


a - A partir de l’enrichissement primaire faire un isolement sur la gélose oxford ou palcam,
incuber à 37°c pendant 24-48h.

b - Pour l’enrichissement secondaire, mettre 0,1 ml de l’enrichissement primaire dans un tube


contenant 10ml du bouillant Fraser et incuber de nouveau à 37°C pendant 24h.

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3ème étape : Lecture des boites du 1er isolement et Isolement secondaire

a - Après 24-48 h d’incubation, forment sur gélose PALCAM des colonies d’environ 2 mm de
diamètre, de couleur gris-vert, avec un centre concave et un halo noir sur un fond rouge
cerise.

Sur la gélose Oxford, Listeria monocytogenes forme des colonies vert-olive entourées d’un
halo noir après 24h ; après 48h, elles deviennent plus foncées avec un centre noir en creux et
sont entourées de zones noires.

b - A partir de l’enrichissement secondaire faire un isolement sur la gélose oxford ou palcam


pour Listéria, incuber à 37°C pendant 24-48h.

4ème étape : Lecture des boites du 2 -ème isolement et identification

Les colonies caractéristiques des L. monocytogenes doivent être confirmées par des tests
biochimiques et immunologiques.

➢ Identification du genre Listéria par :

- Coloration de gram : bacilles à gram positives.

- Test catalase : test positif.

➢ Identification de l’espèce : Ensemencer une galerie biochimique, TSI et test mobilité

Résultat : Mannitol (-), mobilité (+), nitrate réductase (-), urée (-), indole (-), TDA (-), VP
(+), RM (+), esculine (+), TSI (glucose (+), gaz (-), H2S (-)).

- Identification immunologique : Recherche d’antigène flagellaire et pariétal

- PCR : C’est une méthode sensible, rapide et spécifique qui vise à rechercher les gènes par
hybridation et révélation.

- Elisa : Basé sur l’utilisation des anticorps monoclonaux anti-Listéria

• Intérêt d’analyse :
- Analyser pour assurer l’absence de L. monocytogenes dans tous les aliments où le
pathogène pourrait se multiplier.

- Notification obligatoire en cas de résultat positif.

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I. Recherche et dénombrement des levures et moisissures


• Définition

Micro-organismes capables de croître en conditions adverses (basse température, acidité, faible


humidité).

Certaines moisissures peuvent produire des mycotoxines cancérigènes.


La « levure de bière » (Saccharomyces cerevisiae) est très utilisée en brasserie et en
panification.
• Technique de recherche : ensemencement en milieu solide par étalement en surface.
• Milieu de culture : milieu Sabouraud, ce milieu est rendu sélectif par addition de
chloramphénicol ou de gentamicine.
• Volume étalé : 0,2 ml des différentes dilutions.
• Température / temps d’incubation : à température ambiante (25±1°C) sur la paillasse
pendant 05 jours couvercle en haut.

NB : Il faut faire aussi un témoin milieu et un témoin diluant (milieu sabouraud ensemencer par
0.2 ml du diluant seul (TSE : Tryptone Sel Eau) ; Dans le but de vérifier la qualité du milieu et
contrôler le TSE.

• Lecture et interprétation :
- Les levures : colonie ovalaire ou sphérique.
- Les moisissures : cellules présentent des filaments mycéliens qui sont disséminés par
l’émission de spores.
N= Σa /gr ou ml
V x 1,1 x F
Σa : la somme des colonies.
d : Le taux de la 1ère dilution retenue
V : Volume inoculé

• Intérêt d’analyse :
- Les levures et moisissures sont des agents importants d’altération. Elles dégradent :
les denrées fraiches (fruits et légumes), réfrigérées (produits de viande, fromages),
sèches (charcuteries) et même acides (jus de fruits).

- Les moisissures produisant des mycotoxines représentent un danger pour la santé du


consommateur.

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III. Critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires

Selon Arrêté interministériel du 2 Muharram 1438 correspondant au 4 octobre 2016 fixant les
critères microbiologiques des denrées alimentaires. On définit les paramètres :

n : nombre d'unité d'échantillonnage du produit examiné ;

m : nombre de germes présents dans 1 gr ou 1ml de produit analysé (25 gr pour les salmonelles);
c'est le seuil en dessous duquel le produit est considéré comme étant de qualité satisfaisante;

M : nombre de germes présents dans 1 gr ou 1 ml de produit analysé (25 gr pour les salmonelles)
il correspond à la valeur au-dessus de laquelle la qualité du produit est considéré comme
inacceptable ;

c : nombre maximale d'unités d'échantillonnage de produit analysé qui peut dépasser "m" tout
en étant inférieur à "M" sans que le lot ne soit rejeté.

En matière d'échantillonnage et d'interprétation des résultats d'analyse, on distingue :

1. Plan à trois classes : Ce plan est ainsi désigné parce que les résultats des examens interprétés
sur cette base, permettent de fixer trois classes de contamination, à savoir :

- Celle inférieure ou égale au critère « m »: qualité microbiologique du lot est satisfaisante ;

- Celle comprise entre le critère « m » et le seuil « M »: qualité acceptable ;

- Celle supérieure au seuil « M » : qualité non satisfaisante.

2. Plan à deux classes : Ce plan est ainsi désigné car les résultats des examens interprétés sur
cette base permettent de déterminer deux classes de contamination.

Ce type de plan qui n'accepte aucune tolérance, même de caractère analytique, correspondant
souvent aux expressions :

« Absence dans » : Le résultat est considéré comme satisfaisant ;

« Présence dans » : Le résultat est considéré comme non satisfaisant ; dans ce cas, le produit est
déclaré impropre à la consommation.

Le plan a deux classes repartit les unités d'échantillon en deux catégories :

Catégorie satisfaisante si le résultat d'analyse est inférieur à "m" ; le produit est propre à la
consommation.

Dr. Rezak Hadda Yasmine


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Catégorie non satisfaisante lorsque le résultat d'analyse est supérieur à "m" ; le produit est
déclaré impropre à la consommation.

Exemples de microorganismes recherchés dans quelques aliments selon le JOA.

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