Universite Saad Dahlab Blida: Pseudomonas Spp. FLUORESCENTS

UNIVERSITE SAAD DAHLAB BLIDA
Faculté Des Sciences de la Natures et de la Vie

Département de Biologie et Physiologie Cellulaire
Laboratoire de Protection et Valorisation des Ressources Agrobiologiques
(LPVRAB)
THESE DE DOCTORAT
En Biologie
Spécialité : Microbiologie
ETUDE DE QUELQUES CARACTERES PHENOTYPIQUES ET

GENOTYPIQUES DU METABOLISME SECONDAIRE LIE AU
BIOCONTROLE ET LA PHYTOSTIMULATION CHEZ LES
Pseudomonas spp. FLUORESCENTS.
Par :
Nacéra BENOUSSAID
Devant le jury composé de :
Dj. GUITARNI Professeur, USD Blida 1 Président

S.A SNOUSSI Professeur, USD Blida 1 Examinateur
Y. KACI Professeur, USTHB Bab Ezzouar- Alger Examinateur
M. MEFTI Maître de conférences, ENSA - El Harrach Examinateur
M. BENCHABANE Professeur, USD Blida 1 Directeur de thèse
Ph. THONART Professeur, U. Gembloux, Belgique Co-directeur de thèse
Décembre 2018
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS .......................................................................................................
RÉSUMÉ .......................................................................................................................
LISTE DES TABLEAUX ...............................................................................................
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................
LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................................
INTRODUCTION GÉNÉRALE .................................................................................... 1
CHAPITRE I : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................... 5

I.1. Introduction au genre Pseudomonas ................................................................ 5
I.2. Evolution de la taxonomie du genre Pseudomonas......................................... 6
I.3. Les Pseudomonas spp. fluorescents ................................................................ 8
I.3.1 Les Pseudomonas spp. fluorescents Phytobénéfiques .................................... 8
I.3.2. Métabolites secondaires phytobénéfiques .................................................... 12
I.3.3. Quorum sensing (QS) et métabolisme secondaire........................................ 23
I.4. Bioformulations microbiennes phytobénéfiques ........................................... 25
I.4.1 Marché des biopesticides ............................................................................... 26
I.4.2. Limites des biopesticides .............................................................................. 27
1.4.3. Conception de bioformulations microbiennes .............................................. 28
CHAPITRE II. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE PSEUDOMONAS SPP.

FLUORESCENTS. .................................................................................................... 33
II.1. Introduction ...................................................................................................... 33
II.2. Matériel et Méthodes ........................................................................................ 34
II-2.1. Echantillons de sol ....................................................................................... 34
. II-2.2. Isolement des souches bactériennes ......................................................... 34
II-2.3. Identification taxonomique ........................................................................... 35
II.2.4. Sélection et caractérisation des souches ..................................................... 38
II .3. Résultats .......................................................................................................... 44
II.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas spp. fluorescents ........................ 44
II-3.2. Identification spécifique ................................................................................ 45
II-3.3. Identification infraspécifique ......................................................................... 46
II.3.4. Distribution des souches selon les biotopes................................................. 47
II.3.5. Essai d’antagonisme in vitro......................................................................... 48
i
II.3.4. Caractérisation des profils trophiques (BIOLOG) ......................................... 50
II.3.5.Séquençage de l'ADNr 16S et étude phylogénétique ................................... 52
II.4.DISCUSSION ...................................................................................................... 56
CHAPITRE III : MÉTABOLITES SECONDAIRES .................................................... 62

III.1. Introduction ..................................................................................................... 62
III.2. Matériel et Méthodes ....................................................................................... 63
III.2.1. Matériel biologique ...................................................................................... 63
III.2.2. Production de siderophores ........................................................................ 63
III.2.3. Production de l’acide indole acétique (AIA) ................................................. 63
III.2.4. Phosphatases ............................................................................................. 64
III.2.5. Pectinases................................................................................................... 64
III.2.6. Lipases ........................................................................................................ 64
III.2.7. Protéases .................................................................................................... 64
III.2.8. Chitinases ................................................................................................... 65
III.2.9. Cellulases.................................................................................................... 65
III.2.10. Amylases................................................................................................... 65
III.2.11. Production de NH3 .................................................................................... 65
III.2.12. Production de cyanure d’hydrogène (HCN)............................................... 65
III.2.13. Production de Phénazines (PHZ) .............................................................. 66
III.3 Résultats ......................................................................................................... 71
III.3.1. Métabolites secondaires ............................................................................. 71
III.3.Discussion ........................................................................................................ 82
CHAPITRE IV : FORMULATION DE RHIZOBACTÉRIES PAR LYOPHILISATION 90

IV.1. Introduction ..................................................................................................... 90
IV.2. Matériel et méthodes ...................................................................................... 91
IV.2.1.Test de résistance à la température ............................................................ 91
IV.2.2. Analyse des acides gras par Chromatographie gaz - liquide ...................... 91
IV.2.3. Procédé de formulation ............................................................................... 92
IV.2.4. Viabilité des bactéries ................................................................................. 92
IV.3. Résultats ........................................................................................................ 93
IV.3.2. Analyse des acides gras cellulaires (AGC) ................................................. 94
IV.3.3. Viabilité des lyophilisats bactériens ............................................................ 95
IV.3. Discussion ..................................................................................................... 100
ii
CHAPITRE V : BIOCONTRÔLE DE LA FUSARIOSE VASCULAIRE DE LA
TOMATE ................................................................................................................. 108
V.1. Introduction .................................................................................................... 108
V.2. Matériel et méthodes ..................................................................................... 110
V.2.1. Agent phytopathogène ............................................................................... 110
V.2.2. Inoculats bactériennes ............................................................................... 110
V.2.3. Matériel végétal ......................................................................................... 111
V.2.4. Sol ............................................................................................................. 112
V.2.5. Antagonisme in vitro .................................................................................. 112
V.2.6. Antagonisme in situ .................................................................................... 113
V.2.9. Paramètres de croissance ......................................................................... 118
V.2.10. Analyse statistique ................................................................................... 119
V.3 Résultats .......................................................................................................... 119
V.3.1. Antagonisme in vitro .................................................................................. 119
V.3.2. Test de pathogénicité ................................................................................ 120
V.3.3. Biocontrôle de la fusariose vasculaire de la tomate ................................... 120
V.3.4. Observation microscopique ....................................................................... 126
V.3.5 Colonisation rhizosphérique........................................................................ 128
V.3.6 Phytostimulation ......................................................................................... 128
V.4. Discussion ...................................................................................................... 130
DISCUSSION GÉNÉRALE ..................................................................................... 141
CONCLUSION GÉNÉRALE ................................................................................... 147
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................... 151
ANNEXES ............................................................................................................... 185
iii
Remerciements
Cette thèse est une œuvre collective et sa réalisation n’aurait pas été possible
sans la générosité, l’hospitalité et le support de plusieurs personnes qui ont contribué
à sa réalisation. C’est avec une profonde gratitude que je les remercie…
J’adresse mes plus sincères et chaleureux remerciements à mon Directeur de
thèse, Monsieur le Professeur Messaoud BENCHABANE, sans qui ce travail
n’aurait pas vu le jour. Je lui suis également reconnaissante pour sa disponibilité
même dans les périodes difficiles, ses qualités humaines, pédagogiques et
scientifiques. Sa présence, son écoute et ses conseils avisés m’ont énormément
aidé à m’affirmer et à évoluer en tant que chercheur. Je lui adresse ici toute ma
reconnaissance et mon admiration. Il me faudrait rédiger tout un manuscrit de thèse
supplémentaire pour dresser le bilan de tout ce que vous m’avez apporté tant sur le
plan scientifique en termes de rigueurs, efficacité et concepts généraux que
personnel.
Mes vifs remerciements vont également à mon co-directeur de thèse, Monsieur
le Professeur Philippe THONART professeur à l’Université de Liège - ulg- Gembloux
Agro-Bio Tech, qui a rendu possible la réalisation de cette thèse; pour l’accueil
chaleureux qu’il m’a réservé au sein de son équipe et de mettre à jour mes
connaissances dans le domaine. J’ai apprécié sa disponibilité, l’autonomie et la
confiance qu’il m’a accordées; un grand merci pour son aide scientifique et ses
orientations.
Mes remerciements et mon profond respect vont à Monsieur DJ. GUITARNI,
Professeur à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie (département de
Biologie) de l’Université Blida 1, d’avoir accepter la charge de présider le jury de
cette these. Je tiens également à exprimer mes vifs remerciements et ma gratitude
aux membres du jury pour la confiance qu’ils m’ont témoigné et l’honneur qu’ils m’ont
fait en acceptant de juger ce travail : Monsieur S. A.SNOUSSI, Professeur à la
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie (département de Biotechnologies) de
l’Université Blida 1, Monsieur Y.KACI Professeur à l’USTHB Bab Ezzouar- Alger et
Monsieur M.MEFTI , Maître de conférences à l’Ecole Nationale Supérieure
Agronomique d El Harrach à Alger.
iv
Ce fut un privilège de travailler dans un cadre aussi chaleureux et propice au
travail en équipe que l’a été le Laboratoire de Protection et Valorisation des
Ressources Agrobiologiques (LPVRAB). Un grand merci à toute l’équipe :
Professeur BENCHABANE.M qui m’a permis d’intégrer le laboratoire, Professeur
BELKAHLA.H, Professeur KRIMI.Z, Mme TOUA.D et aux ingénieurs du
laboratoire particulièrement Djamila et Samia.
Une thèse, tant nominative soit elle, est avant tout un travail de réflexion
collectif et c’est avec un grand plaisir que je tiens à remercier toutes les personnes
qui ont participé, sous ma direction, à ce travail : BOUMAHDI.Z, OTSMANE .Z,
LEHLALI.M, IZRI.H, MIRAD.S, SOUABER.M, ZARZOUR.I, CHARFA.R et
BELRAMOUL.N (Masters).
Je tiens à remercier particulièrement le personnel du secrétariat du CWBI, que
je nomme affectueusement la « tour de contrôle du CWBI », Marina CHANET,
Marguerite DEMI et Cécile EK et pour leur accueil chaleureux, leur disponibilité et
surtout leur bonne humeur qui n’a jamais fait défaut tout au long de mes séjours à
Gembloux.
Je tiens à remercier les doctorants avec lesquels j’ai passé ces journées au
CWBI à l’unité de Bio-industries de Gembloux: Annick LE JEUNE et Jean Noel pour
leur marque de sympathie et leur contribution dans la réalisation de la partie
d’identification moléculaire et la lyophilisation.
Mes remerciements aux personnels de la station expérimentale de la Faculté
des Sciences de la Nature et de la Vie Université Blida 1.
Je ne pourrai oublier d'adresser mes remerciements aux amis :
BENCHABANE .D, MOHAMED MAHMOUD .F, BOUCHERIT.A, BERRAF-
TEBBAL, MANSOURI.W. TEMMAR.M, DRIASSA.N.
Un grand merci aux collègues et amis - enseignants de la faculté des Sciences
de la nature et de la Vie de Blida plus spécialement du département de Biologie pour
leur soutien pendant les années d’études et pour tous les excellents souvenirs.
Comment peut-on oublier mon époux Hocine pour son soutien sans faille, sa
grande indulgence, sa compréhension et surtout sa contribution dans le partage du
stress de la recherche. Je suis heureuse de partager cette thèse avec lui.
Merci enfin à tous ceux que j’aurais oublié de citer ici et qui normalement le
mériteraient…
v
Ce travail je le dédie particulièrement à mes parents, à ma famille et ma belle-
famille.
A ma Mère source d’affection, de compréhension et de patience,
A la mémoire de mon père,
Mes frères HAMID et KARIM,
Mes sœurs OUARDIA, SAMIA, CECILE et leurs enfants
Ma belle-sœur MERIEM
Ma nièce DJAMILA
Enfin à mes Enfants (Chandelles) :
YOUCEF RAMI ET ANES.
vi
Résumé
Titre: Etude de quelques caractères phénotypiques et

génotypiques du métabolisme secondaire lié au biocontrôle et la
phytostimulation chez les Pseudomonas spp. fluorescents.
L’exploration des échantillons de sols rhizosphériques, en provenance de divers
environnements du sud Algérien (palmeraie, poirier, pommier et tomate), a permis de
sélectionner plus de 100 isolats de Pseudomonas spp. fluorescents. Les espèces
types de ce groupe: P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis et P. aureofaciens ont
été retrouvées avec la prédominance de la première espèce.
Les résultats de l’approche moléculaire (l'ARNr 16S) comparés avec les
résultats phénotypiques (clé dichotomique et Biolog GENIII) révèlent la complexité et
la forte hétérogénéité au niveau des différentes espèces du genre Pseudomonas. Le
criblage, via les tests du pouvoir antagoniste, a dégagé 17 souches montrant de
fortes activités antagonistes in vitro vis-à-vis de phytopathogènes bactériens et
fongiques avec des taux d’inhibition allant jusqu’à 67,33 %.
Six souches ont pu croitre à 45°C et produisent des métabolites impliqués dans
le biocontrôle et la phytostimulation (protéases, chitinases, amylases, siderophores,
HCN, AIA, phosphatase et ammoniaque).
La recherche de composés phénaziniques, par CCM et HPLC, révèlent que les
souches PI9 et F21 synthétisent l’acide-phénazine-carboxylique (PCA). La souche
BB9 est suspectée productrice d’un autre composé phénazinique ou d’un dérivé de
phénazines.
Le protocole de formulation, non optimisé, appliqué sur trois souches (BB10,
BB9 et F21) a causé des pertes en viabilité après leur lyophilisation directe (0.39 %
et 1.09 %). Les résultats de la cytométrie en flux ont permis une meilleure
détermination de l'état physiologique cellulaire (cellules viables, cellules mortes et
cellules viables mais non cultivables). L’addition de cryoprotecteurs (maltodextrine et
glycérol), n’a pas réduit les pertes dues à la lyophilisation, mais a pu influencer,
relativement, la stabilité des préparations microbiennes séchées lors du stockage (5
années) avec des taux de viabilité relativement variables (13.28 % et 25.21 %)
enregistrés, respectivement, avec les souches BB9 et F21.
L’application de lyophilisats, avec et sans protecteurs, en comparaison avec les
souches fraichement cultivées assure une bioprotection des plants de tomate contre
la fusariose vasculaire, en réduisant sensiblement les symptômes et sa sévérité où
les taux d’inhibition sont parfois au-delà de 40 %. L’application des mêmes
lyophilisats a induit des phytostimulations appréciables en hauteurs des plants, en
phytomasse des parties aériennes et souterraines, ainsi que sur les teneurs en
chlorophylle totale.
Mots clés: Pseudomonas spp fluorescents, identification, métabolites secondaires, lyophilisation,

viabilité, stockage, biocontrôle, Fusarium oxysporum f.sp. lycopercisi.
vii
Abstract
Title:
Study of some phenotypic and genotypic characters of secondary
metabolism related to biocontrol and phytostimulation in Pseudomonas
spp. fluorescent.
Exploration of rhizospheric soil samples from various environments in southern

Algeria (palm, pear, apple and tomato), selected more than 100 isolates of
Pseudomonas spp. fluorescent. The typical species of this group: P. fluorescens, P.
putida, P. chlororaphis and P. aureofaciens were found with the predominance of the
first species.
The results of the molecular approach (16S rRNA) compared with the
phenotypic results (dichotomous key and Biolog GENIII) reveal the complexity and
the strong heterogeneity in the species of the genus Pseudomonas. Screening,
through antagonism tests, revealed 17 strains showing strong antagonistic activity in
vitro against bacterial and fungal phytopathogens, with inhibition rates of up to 67.33
%.
Six strains were able to grow at 45 ° C and produce metabolites involved in
biocontrol and phytostimulation (proteases, chitinases, amylases, siderophores,
HCN, AIA, phosphatase and ammonia).
The search for phenazine compounds, by TLC and HPLC, reveals that the PI9
and F21 strains synthesize the phenazine carboxylic acid (PCA). The BB9 strain is
suspected to be a producer of another phenazine compound or a phenazine
derivative.
The non-optimized formulation protocol applied to three strains (BB10, BB9 and
F21) caused viability losses after direct lyophilization (0.39% and 1.09%). The results
of the flow cytometry allowed a better determination of the cellular physiological state
(viable cells, dead cells and viable cells but not cultivable). The addition of
cryoprotectants (maltodextrin and glycerol) did not reduce losses due to
lyophilization, but could relatively influence the stability of dried microbial
preparations during storage (5 years) with relatively variable viability rates (13.28%
and 25.21%) recorded, respectively, with strains BB9 and F21.
The application of lyophilisats, with and without protectors, in comparison with
the freshly cultivated strains ensures a bioprotection of tomato plants against
vascular fusariosis, significantly reducing the symptoms and its severity (40%). The
application of the same lyophilisats induced appreciable phytostimulations in the
heights of the plants, in phytomass of the aerial and underground parts, as well as in
the total chlorophyll contents.
Key words: Pseudomonas spp fluorescents, identification, secondary metabolites,

lyophilization, viability, storage, biocontrol, Fusarium oxysporum f.sp. lycopercisi.
viii
‫ﺨﺺ‬Āÿ
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، ‫ﺔ‬Āÿ‫ﻮ‬ÿ‫ﻮ‬Āÿ ‫ﺔ‬ÿ‫ﺎ‬Āÿ biocontrol þÿ‫ﺰ‬ĀĀÿ‫ ا‬، lyophilization
Fusarium oxysporum f.sp. lycopercis.
ix
LISTE DES FIGURES
FIGURE.I.1 : RELATIONS PHYLOGÉNÉTIQUES DES PROTÉOBACTÉRIES, CONTENANT LES
GENRES BACTÉRIENS ACTUELLEMENT OU ANCIENNEMENT (EN GRAS)
ASSOCIÉS AUX PSEUDOMONAS (KERSTERS ET AL., 1996). ................................... 5
FIGURE I.2 : PRINCIPAUX CHANGEMENTS DANS LA TAXONOMIE DES PSEUDOMONAS (2212
ESPÈCES ONT ÉTÉ RÉORGANISÉS DANS LA LISTE HOMOLOGUÉE DE 1980);
DONT 96 SONT DES PSEUDOMONAS (GRACIA-VALDE ET LALUCAT, 2016) .......... 7
FIGURE I. 4 : BOUCLE DE RÉTROACTION REPRÉSENTANT L’INTERACTION BÉNÉFIQUE
PLANTE-RHIZOBACTÉRIES (VACHERON, 2015 MODIFIÉ DE LEMANCEAU ET AL.,
2014). ............................................................................................................................. 11
FIGURE I.5 : REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DES MÉTABOLITES SECONDAIRES
PRODUITS PAR LES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS DANS LA RHIZOSPHÈRE
IMPLIQUÉS DANS LE BIOCONTRÔLE DES PHYTOPATHOGÈNES (MISHRA ET
ARORA ,2017)................................................................................................................ 12
FIGURE I.6 : 1-AMINOCYCLOPROPANE-1- CARBOXYLATE (ACC DÉSAMINASE) CHEZ LES
PGPR (PATEL ET MINOCHEHERHOMJI, 2018) .......................................................... 23
FIGURE II.1 : CLÉ DICHOTOMIQUE D’IDENTIFICATION DES PSEUDOMONAS SPP.
FLUORESCENTS (BOSSIS, 1995). .............................................................................. 35
FIGURE II.2 : COURBE CARACTÉRISTIQUE D’UN ADN INTÈGRE .................................................. 41
FIGURE II.3 : RÉPARTITION SPÉCIFIQUE ET INFRA SPÉCIFIQUE DES SOUCHES SELON LES
BIOTOPES. .................................................................................................................... 48
FIGURE II.4 : AFFILIATION DES SOUCHES BACTÉRIENNES SELON LES TESTS BIOLOG GENIII
........................................................................................................................................ 51
FIGURE II.5 : GEL REPRENANT LES 5 ADN AMPLIFIÉS ET LE MARQUEUR DE POIDS
MOLÉCULAIRE .............................................................................................................. 52
FIGURE II. 6 : ARBRE PHYLOGÉNÉTIQUE (ARNR 16S) DES ESPÈCES VALIDÉES AVEC DES
SIMILARITÉS 97%. ..................................................................................................... 55
FIGURE III.1 : PROTOCOLE DE PRODUCTION ET D'EXTRACTION DES PHÉNAZINES ............... 68
FIGURE III.2: BIOAUTOGRAPHIE DES EXTRAITS DES SURNAGEANTS DE CULTURES DES
SOUCHES PI9, BB9 ET F21 SUR AM APRÈS RÉVÉLATION ..................................... 78
FIGURE III.3 : BIOAUTOGRAPHIE DES EXTRAITS DES SURNAGEANTS DE CULTURE DES
SOUCHES PI9, BB9, F21 SUR CA APRÈS RÉVÉLATION .......................................... 79
FIGURE III.4 : PROFIL D’HPLC DE L’ÉTALON.................................................................................... 80
FIGURE III.5 : PROFIL HPLC APRÈS INJECTION DE L’EXTRAIT À L’ACÉTATE D’ÉTHYLE DE
L’ISOLAT F21 ................................................................................................................. 80
FIGURE III.6 : PROFIL D’HPLC APRÈS INJECTION DE L’EXTRAIT À L’ACÉTATE D’ÉTHYLE DE
L’ISOLAT BB9 ................................................................................................................ 80
L’ISOLAT PI9.................................................................................................................. 81
L’ISOLAT CHAO............................................................................................................. 81
FIGURE IV.1 : DENSITÉS BACTÉRIENNES AVANT LYOPHILISATION ET APRÈS FORMULATION
........................................................................................................................................ 96
FIGURE VI.2 : VIABILITÉ DU TÉMOIN (A04-BB9) EN CYTOMETRIE EN FLUX ............................... 97
FIGURE IV.4 : VIABILITÉ (%) DES SOUCHES DE PSEUDOMONAS APRÈS STOCKAGE. ......... 100
FIGURE V.1 : RÉHYDRATATION ET PURIFICATION DE PSEUDOMONAS SPP. FLUORESCENTS
LYOPHILISÉES. ........................................................................................................... 111
FIGURE V.3 : DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL (3 BLOC ALÉATOIRE COMPLETS) ........................ 116
FIGURE V.4 : ECHELLE D'ÉVALUATION DES SYMPTÔMES TYPIQUES DE LA FUSARIOSE
VASCULAIRE DE LA TOMATE ................................................................................... 117
FIGURE V.5 : EVOLUTION DE LA FUSARIOSE VASCULAIRE (INFECTION ET SÉVÉRITÉ (INDICE
MCKINNEY, EN SITUATION DE BIOCONTRÔLE AVEC LES SOUCHES BB9 (A),
BB10 (B) ET F21 (C). (AP) LYOPHILISAT AVEC PROTECTEUR, (SP) LYOPHILISAT
SANS PROTECTEUR, CR (CRÈME FRAICHE), (T+) TÉMOIN POSITIF SANS
BACTÉRISATION INOCULE PAR LE PATHOGÈNE. ................................................. 122
FIGURE V.6 : L’ÉCHELLE DE SYMPTOMATOLOGIE DE LA FUSARIOSE VASCULAIRE DE LA
TOMATE....................................................................................................................... 123
FIGURE V.7 : SYMPTÔME DE LA FUSARIOSE VASCULAIRE CHEZ LES PLANTS DE TOMATES
...................................................................................................................................... 124
FIGURE V.8 : BRUNISSEMENT DES RACINES DES PLANTS MALADES ..................................... 124
FIGURE V.9 : STADE ULTIME (54 JOURS) DE LA FUSARIOSE VASCULAIRE ............................. 125
FIGURE V.10 : BIOPROTECTION DES PLANTS DE TOMATE ........................................................ 126
FIGURE V.11 : OBSERVATION SUR MICROSCOPE PHOTONIQUE AU DES SYMPTÔMES
INTERNES TYPIQUES DE F.O.L D’UNE PLANTE INFECTÉ ET BACTÉRISÉ PAR
BB10 S.P ...................................................................................................................... 127
FIGURE V.12 : OBSERVATION MICROSCOPIQUE DES SYMPTÔMES INTERNES TYPIQUES DE
F.O.L D’UNE PLANTE INFECTÉ ET BACTÉRISÉS PAR F21 S.P. .................................. 127
FIGURE V.13 : COLONISATION RACINAIRE D’UNE PLANTE BACTÉRISÉE (BB10 AVEC
PROTECTEUR)............................................................................................................ 128
FIGURE V.14 : PROMOTION DE LA CROISSANCE DE LA PARTIE AÉRIENNE DES PLANS
BACTERISÉS PAR RAPPORT AU TÉMOIN POSITIF................................................ 129
FIGURE V.15 GAINS (%) EN PARAMÈTRES DE CROISSANCE ................................................. 129
FIGURE V.16 GAINS (%) EN TENEUR CHLOROPHYLLIENNE ..................................................... 130
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU I.1 : MÉTABOLITES SECONDAIRES DES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS ÉTUDIÉS

DANS LE CONTRÔLE BIOLOGIQUE DES PHYTOPATHOGÈNES (MISHRA ET
ARORA, 2017). ............................................................................................................ 13
TABLEAU II. 1 : NOMBRE ET ORIGINE DES SOUCHES BACTÉRIENNES RETENUES ................ 40
TABLEAU II.2 : RÉACTIFS UTILISÉS POUR L’AMPLIFICATION PCR .............................................. 42
TABLEAU II.3 RÉPARTITION DES SOUCHES ISOLÉES SELON LES BIOTOPES.......................... 45
TABLEAU II.4. : IDENTIFICATION SPÉCIFIQUE DES SOUCHES .................................................... 45
TABLEAU II.5 : SPECTRES DE RÉPONSES D’IDENTIFICATION SPÉCIFIQUE ET
INFRASPÉCIFIQUE .................................................................................................... 46
TABLEAU II-6 : RÉPARTITION DES SOUCHES SELON LA PLANTE HÔTE. .................................. 47
TABLEAU II.7 : ACTIVITÉS ANTAGONISTES IN VITRO ................................................................... 49
TABLEAU II.8 : TAUX D’INHIBITION DE LA CROISSANCE MYCÉLIENNE DES AGENTS
FONGIQUES. .............................................................................................................. 49
TABLEAU II.9 : IDENTIFICATION COMPARATIVE (BIOLOG GENIII ET L'ADNR 16S) .................... 54
TABLEAU III.1 : TESTS DE PRODUCTION DE MÉTABOLITES SECONDAIRES............................. 71
TABLEAU III.2 : PRODUCTION DE CYANIDE D’HYDROGÈNE ........................................................ 72
TABLEAU III.3: PRODUCTION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE D’ACIDE INDOLE ACÉTIQUE
(AIA) ............................................................................................................................. 73
TABLEAU III.4 : ACTIVITÉS ANTAGONISTES IN VITRO .................................................................. 75
TABLEAU III.5 : ACTIVITÉS ANTAGONISTES IN VITRO ................................................................... 76
TABLEAU III.6: ACTIVITÉS ANTAGONISTES EXPRIMÉES EN ZONES D’INHIBITION (MM). ........ 77
TABLEAU IV.1 : CROISSANCE DES SOUCHES DE PSEUDOMONAS AUX TEMPÉRATURES
TESTÉES. .................................................................................................................... 94
TABLEAU IV.2 : COMPOSITION EN ACIDES GRAS CELLULAIRES (AGC) .................................... 95
TABLEAU IV.3 : EFFETS DE LA LYOPHILISATION ET DE LA CRYOPROTECTION SUR LA
VIABILITÉ (%).............................................................................................................. 96
TABLEAU IV.4 : VIABILITÉ (%) DES SOUCHES DE PSEUDOMONAS APRÈS STOCKAGE À 4° C.
..................................................................................................................................... 99
TABLEAU V.1 : ORIGINE DES SOUCHES SÉLECTIONNÉES. ....................................................... 111
TABLEAU V.2 : TAUX D’INHIBITION (%) DE LA CROISSANCE MYCÉLIENNE ............................. 120
LISTE DES ABREVIATIONS
°C degré Celcius
ADN Acide Désoxiribo Nucléique
AIA Acide indole actéique
ARN Acide ribonucléique ribosomal
ATP Adénosine 5'-triphosphate
BET Bromure d’éthydium
BBCM Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Laboratory of Microbiology
CCM Chromatographie en couche mince
CFDA Carboxyfluoresceindiacétate
CPG Chromatographie en Phase Gazeuse
cv. cultivar
DO Densité optique
EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique
EMBL EuropeanMolecularBiologyLaboratory
g gramme
h Heure
G/C Guanine/Cytosine
HCN Cyanure d’hydrogène
HPLC High Pressure LiquidChromatography
HR HypersensitiveResponse (Réaction d'hypersensibilité)
ISR InducedSystemicResistance (Induction Systémique de Résistance)
Kb Kilo paire de bases
LMG Laboratory of Microbiology Gent
m Mètre
min Minute
ml Millilitre
MPM Marqueur de poids moléculaire
μl Microlitre
nm Nanomètre
nmole Nanomole
NJ Neighbour - Jorning
Pb paire de bases
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerasechainreaction
PFA Paraformaldéhyde
PGPR Plant GrowthPromotingRhizobacteria
Phl 2,4- diacetylphloroglucinol (DAPG)
Phz Phénazines
Plt Pyoluteorines
PR RelatedProteins
Prn Pyrrolnitrines
pv. Pathovar
pvd Pyoverdine
QS Quorum sensing
RH Réponse hypersensible (Réaction d'hypersensibilité)
rpm Rotation par minute
sid Sidérophores
TAE Tris Acétate -EDTA
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane
ufc Unité formant colonie
UPGMA Unweighted Pair Group Méthode withAverage
UV Ultra-Violet
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Introduction générale
Les niveaux actuellement atteints en productions agricoles, tant qualitatif que
quantitatif, sont la résultante d’une mécanisation élargie, accompagnée de l’usage
systématique des intrants chimiques (fertilisants et pesticides). Le secteur agricole
utilise plus de 90% du totale des pesticides commercialisés dans le monde. Les
dépenses mondiales en substances chimiques sont estimées à plus de 56 milliards
de dollars, avec l'utilisation de plus de 3,5 milliards de kg de principes actifs /an
(Pretty et Bharucha, 2015 ; Atwood et Paisley-Jones, 2017). De telles pratiques,
caractéristiques de l’agriculture intensive, ont engendré le développement de formes
de bioagresseurs de plus en plus résistantes, ajouté aux problématiques de pollution
et des risques de santé, remettant sérieusement en cause ces procédures
agrochimiques. Ainsi, la recherche d’alternatives durables et biologiques, limitant,
diminuant ou même bannir, l’usage systématique des produits chimiques, est
devenue un objectif à atteindre (Loboa et al., 2019).
Dans le contexte de la valorisation de la biomasse microbienne, de nombreux
travaux, depuis plus de trois décennies, ont souligné l’opportunité de l’exploitation de
certaines catégories de microorganismes telluriques, adaptées à la vie
rhizosphérique des plantes et peuvent procurer des effets phytobénéfiques. La
masse des travaux dédiée à ce sujet montre qu’il s’agit d’un réel attrait pour les
chercheurs, ainsi nous assistons à l’investigation de divers profils, de la microbiologie
du sol, des associations microbiennes, de leurs mécanismes d’action et autres voies
métaboliques modulant la vie rhizosphérique et leurs relations avec les plantes.
Actuellement des ressources microbiennes sont valorisées pour des usages
biologiques, en qualité de biofertilisants, de biostimulants et/ou de biopesticides,
permettant ainsi d’améliorer les rendements tout en limitant le recours excessif aux
intrants chimiques (engrais et pesticides) (Gupta et al., 2016).
Parmi les rhizobactéries, le groupe des Pseudomonas fluorescents est l’un des
pôles microbiens ayant démontré des potentialités phytobénéfiques certaines
(Lemanceau ,1992 ; Latour et al., 2009 ; Lemanceau et al., 2014; Vacheron, 2015;
Novo et al., 2017). Les Pseudomonas spp. fluorescents présentent un intérêt
scientifique majeur, ils se caractérisent par une diversité génétique et phénotypique
en relation avec leur impact positif sur le fonctionnement de la rhizosphère, en
exerçant des actions directes et/ou indirectes sur le développement de la plante; de
1
plus ils représentent un modèle d'étude pour la compréhension des interactions avec
les microorganismes d'une part (Pseudomonas – champignons et bactéries
pathogènes), et avec la plante (eucaryote – procaryote) d'autre part (Van Lonn et
Glick, 2004; Pozo et al., 2004). Ce groupe rhizobactérien se caractérise par des
avantages écologiques, leur permettant d’évoluer dans les rhizosphères de diverses
plantes, en établissant des relations interactives. En plus, ces rhizobactéries sont
caractérisées par un arsenal métabolique, s’exprimant par la synthèse de divers
métabolites secondaires impliqués dans les aspects trophiques, nutritionnels et de
compétition avec les autres microorganismes (Lemanceau, 1992 ; Weller, 2007 ; Van
Lonn, 2007 ; Loper et al, 2011 ; Figueroa‑Lopez et al., 2016) .
Ces rhizobactéries peuvent devenir un complément ou même une réelle
alternative pour les techniques de lutte et de fertilisation chimiques, particulièrement
pour les maladies telluriques qui sont souvent mal maîtrisées par les techniques
conventionnelles (luttes chimique et génétique). Ces maladies, affectant les racines
et/ou les systèmes conducteurs des plantes, sont souvent causées par des agents
fongiques se caractérisant par des formes de persistance et de conservation
durables et un pouvoir infectieux épidémique destructif des cultures (Benchabane,
2005).
Leur utilisation en qualité d’intrant biologique, certes dépend de leurs
mécanismes d’action, mais aussi de leur efficacité déterminée par une compétence
rhizosphérique dans les conditions pratiques (Hofte et Altier 2010 ; Cipriano et
Freitas, 2018). L'hétérogénéité des sols constitue un obstacle considérable pour les
inoculats, car les bactéries introduites doivent concurrencer un microbiote indigène
mieux adapté et survivre à la prédation par la microfaune du sol, en particulier
lorsqu'elles sont inoculées sous une forme non protégée. Ainsi, les inoculats
devraient fournir un microenvironnement plus approprié, associé à une protection
physico-chimique sur une longue période, qui empêcherait la diminution rapide des
bactéries introduites (Shahzad et al., 2017; Berninger et al., 2018; Liffourrena et
Lucchesi, 2018). Par conséquent, le but des formulations d'inoculants est de
permettre une survie plus élevée du PGPR à la fois pendant le stockage et sur le site
d'application, sous des formes adaptées et disponibles.
Généralement, les formulations utilisées sont des préparations lyophilisées pour
l’obtention de concentrés bactériens de qualité acceptable, comportant des cellules
viables et cultivables, avec une reprise maximale d’activités lors de leur utilisation
2
(Coulibaly et al., 2010 ; Corrêa, 2015 ; Seema et al., 2018). De tels procédés,
incluant les étapes de production, de conditionnement et de stockage provoquent
des situations de stress sur la masse microbienne, induisant des dysfonctionnements
physiologiques, mettant en cause leur qualité technologique.
Vu ce qui précède, ce travail prend toute son importance en mettant en
évidence l’exploitation pratique de quelques souches du groupe des Pseudomonas
spp. fluorescents. Dans notre projet de thèse, nous avons structuré notre travail, de
telle sorte à sélectionner des souches, isolées localement et d’en réaliser un travail
microbiologique aboutissant à une application pratique. Il est à souligner, que les
souches rhizobactériennes recherchées doivent procurer des effets phytobénéfiques,
que ce soit en phytostimulation et/ou en biocontrôle des parasites phytopathogènes.
A cet effet, nous avons adopté des méthodologies appropriées pour les
différentes parties de notre travail. Ainsi, après une introduction générale et la
présentation d’une synthèse bibliographiques sur les travaux relatifs à notre sujet
(chapitre I), le deuxième chapitre présente les circonstances et les techniques
utilisées dans la recherche, l’isolement et les critères de caractérisation et de
classification des souches bactériennes. Dans le troisième chapitre, nous avons
testé les potentialités des souches bactériennes en production de métabolites
incriminées, directement ou indirectement, dans les processus phytobénéfiques de
biocontrôle et de phytostimulation.
Étant donné que la finalité de notre travail est l’aboutissement vers des
préparations microbiennes à usage agronomique pratique, le quatrième chapitre
traite des expérimentations de conception de formulations lyophilisées, à base de
souches bactériennes sélectionnées, selon des profils présentant des potentialités
phytobénéfiques. Le dernier chapitre est réservé à tester l’efficacité des formulations
conçus, par des tests in vitro et in situ, dont les objectifs sont à la fois de s’assurer de
la viabilité de nos préparations microbiologiques, après les processus de formulation
et de stockage, aussi de l’efficacité de leur emploi à titre de bioinoculant dans le
biocontrôle.
Au terme de ce travail, nous tentons d’expliquer et d’interpréter les différentes
étapes à travers une discussion générale suivie d’une conclusion générale.
3
CHAPITRE I: DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
Chapitre I : Données Bibliographiques
CHAPITRE I: DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
I.1. Introduction au genre Pseudomonas

Le genre Pseudomonas est l'un des genres les plus diversifiés, de par sa
composition, regroupant de nombreuses espèces et de par leurs origines issues des
différents écosystèmes. La description taxonomique de ce genre ne casse de voir
des réarrangements et des changements de statuts (espèces, sous espèces et
nouvelles espèces), depuis ses premières descriptions (Migula, 1894 ; Palleroni,
1984). Avec l’application des résultats du séquençage de l'ADNr 16S, certaines des
espèces de ce genre ont été redistribuées dans d'autres genres des sous-classes
alpha, bêta ou gamma des protéobactéries (Kersters et al., 1996 ; Rajwar et Sahgal,
2014). Les membres du genre Pseudomonas (sensu stricto) appartiennent au
groupe I de la sous-classe des gamma-protéobactéries (Figure I.1).
Figure.I.1 : Relations phylogénétiques des protéobactéries, contenant les genres

bactériens actuellement ou anciennement (en gras) associés aux
Pseudomonas (Kersters et al., 1996).
5
I.2. Evolution de la taxonomie du genre Pseudomonas

Le genre Pseudomonas a été décrit à la fin du 19ème siècle (Migula, 1894), en
se basant sur les morphologies macro et microscopiques, pratique universellement
adoptée par les taxonomistes microbiens (Cohn, 1872). Depuis ces premières
descriptions, ce genre n’a cessé d’enregistre des réorganisations (Figure I.2)
(Garrido-Sanz et al., 2016).
A partir du début du 20ème siècle, les caractéristiques physiologiques étaient
proposées comme critères de base pour la taxonomie bactérienne (Orla-Jensen,
1909). Dans le manuel de Bergey publié en 1923, plusieurs caractéristiques
phénotypiques ont été ajoutées à la morphologie, à la coloration de Gram, au type de
flagellation et au métabolisme vis-à-vis de l'oxygène, afin de différencier les espèces
du genre Pseudomonas (Bergey et al., 1997). Avec l’avènement des techniques
basées sur l’ADN, des approches génétiques ont été utilisées en taxonomie
bactérienne (Marmur, 1961 ; Marmur et Dotty, 1961; Schildkraut et al., 1961) ; ainsi,
la composition en bases (G + C) et l'hybridation ADN-ADN ont été sollicitées dans la
classification des Pseudomonas (Colwell et Mandel, 1964; Colwell et al., 1965;
Johnson et Ordal, 1968 ; Doudoroff et Palleroni, 1974). Les bactéries de ce genre ont
été divisées en cinq sous-groupes d'ARNr sur la base des hybridations ARN-ADN
(Palleroni, 1984).
6
Figure I.2 : Principaux changements dans la taxonomie des Pseudomonas (2212

espèces ont été réorganisés dans la liste homologuée de 1980); dont 96 sont
des Pseudomonas (Gracia-Valde et Lalucat, 2016)
Les changements les plus profonds dans la taxonomie bactérienne se sont

produits dans les années 1980, lorsque Woese et ses collaborateurs ont proposé
l'analyse des séquences géniques de l'ARN ribosomal 16S pour la classification des
bactéries, plaçant le genre Pseudomonas dans les gamma protéobactéries (Woese
et al., 1984). Néanmoins, le plus pertinent de ces changements a commencé à partir
de l’année 2000, avec un premier travail compilant les séquences du gène ARNr 16S
de 128 espèces de Pseudomonas (Anzai et al., 2000), qui ont montré que de
nombreuses espèces ne faisaient pas partie du groupe Pseudomonas sensu stricto,
aboutissant à la définition de plus de 25 genres appartenant aux classes Alpha, Beta
et Gamma des Protéobactéries (Peix et al., 2009 ; García-Valdés et Lalucat, 2016).
Ces modifications ont été consignées dans l'édition 2005 du Manuel référentiel de
Bergey, en systématique bactérienne, qui est passée du format imprimé au format en
ligne en 2015, permettant des mises à jour continuelles, marquées par des
augmentations de publications en nombre des genres et des espèces (Peix et al.,
2018). Il y en avait 118 en 2009 (Mulet et al., 2010) ,10 espèces supplémentaires en
2013 et six en 2014 (Parte, 2014). 213 espèces de Pseudomonas sont citées dans la
liste des procaryotes, mais seulement 147 sont acceptées (Gomila et al., 2015).
7
Actuellement le genre Pseudomonas contient plus de 190 espèces

(http://www.bacterio.ne/pseudomonas.html). Selon Peix et al., (2018), en se basant
sur les analyses phylogénétiques et chimiotaxonomiques, Il est fortement probable
que ce genre sera réaménagé, dans un futur proche, en divers genres et espèces.
I.3. Les Pseudomonas spp. fluorescents

Au sein du groupe Pseudomonas sensu stricto, les Pseudomonas fluorescents
comprennent toutes les espèces ayant la capacité de produire de la pyoverdine
fluorescente, particulièrement : Pseudomonas aeruginosa, P. syringae, P. putida et
P. fluorescens (Palleroni, 2009). Les espèces types sont: P.aeruginosa, agent
pathogène humain, opportuniste fréquemment impliqué dans les infections
nosocomiales (Bentzmann et Plésiat, 2011) et P. syringae, un phytopathogène de
diverses espèces de plantes cultivées (Morris et al., 2007).
Les Pseudomonas fluorescents saprophytes sont des habitants typiques des
sols agricoles et interagissent avec les plantes de plusieurs façons (Kloepper et
Schroth, 1981). Dans ce groupe, les espèces saprophytes sont à cytochrome
oxydase positive, ayant une arginine dihydrolase et ne provoquent pas de réaction
d’hypersensibilité sur tabac (Stanier et al., 1966; Palleroni, 1984 et 1992). De
nombreuses espèces accumulent des polyhydroxyalcanoates (mcl-PHA), comme
réserve de carbone (Anjum et al., 2016), et montrent une polyvalence métabolique
avec un taux élevée en G + C (59- 68%) (Palleroni, 2009 ; Mishra et Arora ,2017).
Initialement, les Pseudomonas spp. fluorescents renfermaient trois espèces : P.
chlororaphis, P. fluorescens et P. putida, qui se caractérisent par une grande
hétérogénéité phénotypique et génotypique (Bossis et al., 2000). Les deux dernières
espèces ont été subdivisées, sur la base de tests phénotypiques, respectivement en
cinq (I à V), et deux (A et B) biovars (Stanier et al., 1966; Palleroni, 1984).
I.3.1 Les Pseudomonas spp. fluorescents Phytobénéfiques

Les Pseudomonas spp. fluorescents saprophytes sont des habitants typiques
des sols agricoles, en s’impliquant dans de nombreuses interactions avec les
plantes, notamment au niveau des rhizosphères (Schroth et al., 1992). Ces bactéries
sont considérées comme des composés biologiques du sol agricole, douées de
potentialités suppressives et inhibitrices de diverses maladies des plantes. De
nombreuses études ont mis en évidence les aptitudes de souches de Pseudomonas
8
spp.fluorescents dans l’amélioration de la croissance et la protection sanitaire des

plantes (Lemanceau, 1992; Viebahn et al.,2005 ; Mavrodi et al.,2012 ; Sharifi-Noori
et al.,2015; Hussein et Joo, 2017; Mishra et al.,2018).
Ce groupe bactérien est assigné aux rhizobactéries dites PGPR "Plant Growth
Promoting Rhizobacteria" (Kloepper et al., 1980). Ces rhizobactéries peuvent
contribuer dans la lutte biologique contre les agents phytopathogènes et dans la
biofertilisation des sols dans les pratiques de l’agriculture durable et intégrée,
prônant la limitation de l’utilisation des intrants chimiques. Les effets positifs des
PGPR, s’expliquent en partie par le contrôle des agents phytopathogènes (Kloepper
et al., 1980; Schnider-Keel et al., 2000; Herth, 2011; Maheshwari, 2011; Lemanceau
et al., 2012; Le Mire et al., 2016 Prabhukarthikeyan et al., 2018) et la stimulation de
la croissance des plantes (Digat et Gardan, 1987; Karakurt et Aslantas, 2010; Gupta
et al., 2013 ; Calvo et al., 2014; Le Mire et al., 2016; Tabassum et al., 2017; Novo et
al.,2018).
Les Pseudomonas spp. fluorescents présentent un intérêt scientifique majeur.
Ils se caractérisent par une diversité génétique et phénotypique en relation avec leur
impact positif sur le fonctionnement de la rhizosphère, en exerçant des actions
directes et/ou indirectes sur le développement des végétaux (Beauchamp,1993;
Jacque et al.,1993; Walsh et al., 2001; Haas et Defago, 2005; Weller, 2007; Ahmad
et al., 2008; Beneduzi et al., 2012; Benchabane et al., 2013; Upadhyay et al., 2016;
Figueroa‑Lopez et al., 2017; Novo et al., 2018). Ils représentent un modèle d'étude
pour la compréhension des interactions avec les microorganismes d'une part
(Pseudomonas – champignons et bactéries pathogènes), d'autre part avec la plante
(eucaryote – procaryote).
La compréhension des mécanismes d'action et des conditions permettant
l'optimisation des effets bénéfiques, de ces rhizobactéries, constitue une voie
indispensable pour leur exploitation dans les pratiques agronomiques comme
biopesticides et/ou biofertilisants, afin de diminuer la dépendance excessive en
intrants chimiques dont les effets négatifs sur la santé et l'environnement ne sont
plus à démontrer. Ces rhizobactéries peuvent devenir un complément ou même une
réelle alternative pour les techniques de lutte et de fertilisation chimiques
(Benchabane et al., 2013).
Les bactéries du groupe des Pseudomonas spp. fluorescents sont retrouvées
abondantes dans la rhizosphère de nombreuses plantes (Couillerot et al. 2009 ;
9
Almario et al., 2014 ; Haney et al.,2015) et possèdent une large gamme de fonctions
phytobénéfiques avec différents modes d’action sur le végétal (Ahmad et al., 2008 ;
Loper et al., 2012). Ces rhizobactéries peuvent agir sur :
- Le développement de la plante, par modification de l’architecture racinaire en
produisant des hormones ou en modulant la production hormonale végétale
(Garcia de Salamone et al., 2001; Picard et Bosco, 2005; Shaharoona et al.,
2006).
- La nutrition des plantes, par la biodisponiblé de certains minéraux essentiels,
comme le phosphore et le fer (Meyer et al., 2010).
- La santé des plantes, en produisant des métabolites secondaires
antimicrobiens, pouvant nuire au développement de phytopathogènes et/ou
activer les mécanismes de défenses de la plante (Bakker et al., 2007, Gross
et Loper 2009).
La production de métabolites secondaires chez ces rhizobactéries peut
également réguler l’expression de gènes phytobénéfiques chez d’autres PGPR parmi
le rhizomicrobiote (Combes-Meynet et al., 2011). Du fait de ce large éventail de
fonctions phytobénéfiques, ces rhizobactéries ont un rôle écologique primordial dans
la rhizosphère. C’est en particulier le cas dans les sols qualifiés de «sols résistants»
où leur implication dans la résistance naturelle de certains sols à quelques maladies
a été démontrée (Mazzola et al., 2002, Ramette et al., 2003; Lemanceau et al., 2014;
Vacheron, 2015). La libération des exsudats racinaires représente une dépense
métabolique pour la plante, qui va être investi dans la sélection de populations
microbiennes particulières. En retour, certaines populations sélectionnées ont un
impact positif sur la croissance et la santé de la plante, en lui exprimant des fonctions
bénéfiques (Figure I. 4) (Vacheron, 2015).
10
Figure I. 4 : Boucle de rétroaction représentant l’interaction bénéfique plante-

rhizobactéries (Vacheron, 2015 modifié de Lemanceau et al., 2014).
Les Pseudomonas fluorescents ont développé des mécanismes pour améliorer

la croissance et le développement des plantes dans diverses conditions
environnementales (Figure I.5). Selon Kloepper et Schroth (1981), la promotion de la
croissance des plantes à médiation par les rhizobactéries favorise la modification de
toute la communauté microbienne dans la niche rhizosphérique par la production de
diverses substances. Généralement, les rhizobactéries favorisant la croissance des
plantes directement, en leur assurant une biodisponibilité de nutriments (azote,
phosphore, potassium et minéraux essentiels), ou en modulant indirectement, les
effets de divers agents phytopathogènes par voie de biocontrôle (Charde et al.,
2010; Maheshwari, 2011; Gupta et al., 2015; David et al., 2018).
Les Pseudomonas fluorescents agissent via différents mécanismes pour
supprimer les agents pathogènes des plantes, entre autres la compétition pour les
nutriments et l'espace (Elad et Baker, 1985; Elad et Chet, 1987), l’antibiose en
produisant des antibiotiques (Pierson et Thomashow, 1992), de sidérophores
(Kloepper et al., 1980; Lemanceau et al., 1992 ; Ongena et al., 2005), d'enzymes
lytiques (Lim et al., 1991; Frindlender et al., 1993; Potgieter et Alexander, 1996;
Velazhahan et al., 1999), de l’HCN et autres métabolites (Defago et al., 1990;
(Borowitz et al., 1992).
11
Figure I.5 : Représentation schématique des métabolites secondaires produits par les
Pseudomonas fluorescents dans la rhizosphère impliqués dans le biocontrôle
des phytopathogènes (Mishra et Arora ,2017).
I.3.2. Métabolites secondaires phytobénéfiques

Il est reconnu que les PGPRs sont dotées d'une machinerie de biocontrôle de
pointe et sont donc utilisées pour le développement de bioinoculants, ciblant la
protection des cultures contre une large gamme de phytopathogènes (Ciancio et al.,
2016; Mishra et Arora, 2017; Sun et al., 2017; Jeyanthi et Kanimozhi, 2018). Ces
rhizobactéries ont développé la capacité de synthétiser divers métabolites
secondaires, qui leur offrent un avantage sélectif par rapport aux autres
microorganismes rhizosphériques (Tableau I.1).
12
Tableau I.1 : Métabolites secondaires des Pseudomonas fluorescents étudiés dans

le contrôle biologique des phytopathogènes (Mishra et Arora, 2017).
Métabolites Pseudomonas Phytopathogènes Effets Références
Pseudomonas sp. Diverses

HCN P76 and P124 Sclerotium rolfsii plantes Priyanka et al., (2017)
Pseudomonas sp. Clavibacter michiganensis
LBUM300 subsp. Tomate Lanteigne et al., (2012)
michiganensis
Pseudomonas CF1
and CF5 Macrophomina phaseolina in-vitro Reetha et al., (2014)
P. corrugata and
P. B. cinerea in-vitro Strano et al., (2017)
mediterranea
HCN et
autres Ralstonia solani,
métabolites P. donghuensis Fusarium. culmorum et
volatiles P482 Pythium in-vitro Ossowicki et al., (2017)
ultimum
F. graminearum et R.
PRN P. chlororaphis O6 solani Tomate Park et al., (2011)
P. cepacia Aphanomyces cochliodes Canne à sucre Homma (1994)
P. fluorescens Pythium ultimum Légumineuses León et al. ,(2009)
Colletotrichum truncatum
P. cepacia et F. sambucinum in-vitro Burkhead et al. (1994)
Gaeumannomyces Thomashow et Weller
PCA P. fluorescens graminis var. tritici. Blé (1988), Thomashow
et al., (1990)
F. oxysporum f.sp. ciceris
P. aeruginosa et F. udum Légumineuses Anjaiah et al., (2003)
Pseudomonas spp. C. circinans, C. dematium,

MCC 3145 F. oxysporum In-vitro Patil et al., (2017)
Pseudomonas sp. R. solani Blé Jaaffar et al., (2017)
2,4-DAPG P. aurantiaca F. oxysporum Blé Garagulya et al., (1974)
P. fluorescens
VUPf5 G. graminis var. tritici Blé Lagzian et al., (2013)
C. michiganensis subsp.
Pseudomonas spp. michiganensis Tomate Lanteigne et al., (2012)
Xanthomonas oryzae pv. Velusamy and
P. fluorescens oryzae (Xoo) Rizier Gnanamanickam (2003)
F. oxysporum f. sp.
P. aeruginosa cubense Bananier Ayyadurai et al. (2006)
Pseudomonas sp. C. michiganensis subsp.
LBUM300 michiganensis Tomate Lanteigne et al. (2012)
Aspergillus niger, K.
P. fluorescens flavus, S. rolfsii Groundnut Sherathia et al. (2016)
P. brassicacearum
J12 Ralstonia solanacearum in-vitro Zhou et al. (2012)
Nielsen et al., (2000,
CLPs P. fluorescens R. solani and P. ultimum Canne à sucre 2002)
P. fluorescens Phytophthora infestans Tomate Tran et al., (2007)
Pseudomonas SH-
C52 S. rolfsii Arachide Le, 2012
13
1.3.2.1. Phénazines (PHZ)

Les phénazines sont un groupe de composés hétérocycliques, à cycle azoté,
identifiés chez les phyla Actinobacteria, Proteobacteria et le phylum Euréarcheota
(Mavrodi et al., 2001). Plus de 6000 composés contenant la phénazine en tant que
fragment central ont été synthétisés, ainsi que plus de 100 dérivés structuraux
naturels ont été reconnues par leurs propriétés antimicrobiennes (Mavrodi et al.,
2006). En fait, plus de 180 produits à base de PHZ sont connus avec des activités
antibiotiques, antifongiques, insecticides, antitumorales, anticancéreuses, anti-
protozoaires et autres activités anti-pathogènes (Guttenberger et al., 2017).
Dans les PHZ, les substituants autour des cycles donnent naissance à des
composés de couleurs différentes : les PHZ isolés de Pseudomonas spp. montrent
une coloration bleue pour la pyocyanine (PYO), le jaune pour l'acide phénazine-1-
carboxylique (PCA) et le phénazine-1-carboxamide (PCN) et l'orange pour la 1-
hydroxyphénazine (1-HP) (Briard et al., 2015). Les phénazines PCA et PYO se sont
révélées très efficaces dans le traitement des maladies fongiques.
Bien que la plupart des PHZ soient efficaces dans la lutte biologique contre
plusieurs maladies fongiques et bactériennes (Chincholkar et Thomashow, 2014),
dans de nombreux cas, les mêmes dérivés de PHZ n'ont pas inhibé la croissance de
bactéries concurrentes concomitantes (Beifuss et Tietze, 2005). La PHZ joue
également un rôle important dans l'acquisition du fer, la signalisation cellulaire, la
régulation de l'expression génique, la formation de biofilms et la survie des bactéries.
Toutes ces fonctions aident les bactéries dans leur compétition et leur colonisation
de la rhizosphère, procurant ainsi un avantage à leurs producteurs et éloignent les
phytopathogènes (Pierson et Pierson, 2010).
Les chercheurs ont également indiqué le rôle de la PHZ dans le métabolisme
primaire. Price-Whelan et al., (2006) ont suggéré que PHZ peut réagir avec les
métabolites primaires et se transformer par des enzymes impliquées dans les voies
métaboliques centrales. Ces caractéristiques suggèrent leur rôle possible dans le
métabolisme des cellules primaires, en particulier dans la survie de la cellule dans
des conditions de stress.
14
1.3.2.2. Phloroglucinols
Le phloroglucinol (1,3,5-benzènetriol ou 1,3,5-trihydroxybenzène) et ses dérivés
sont des composés phénoliques à large spectre, possédant des propriétés
antivirales, antibactériennes, antifongiques, antihelminthiques et phytotoxiques
(Loper et al., 2012). Plus de 700 dérivés de phloroglucinol d'origine naturelle sont
signalés de différentes sources naturelles y compris les plantes, les micro-
organismes et les organismes marins (Singh et Bharate, 2006).
Chez les Pseudomonas fluorescents, la capacité de synthèse de phloroglucinol
et de ses dérivés est hautement conservée (Weller, 2007; Raaijmakers et Weller,
2001). Un des principaux types de dérivés de phloroglucinol produits par les
Pseudomonas fluorescents est le DAPG (Troppens et al., 2013). Plusieurs études
expérimentales affirment que le DAPG est un métabolite antimicrobien majeur
impliqué dans le contrôle biologique des phytopathogènes (Sonnleitner et Haas,
2011). Le locus biosynthétique du DAPG serait conservé chez les Pseudomonas
isolées de divers endroits géographiques (Keel et al., 1996).
Le phloroglucinol et ses dérivés appartiennent à la classe des polycétides et
leur biosynthèse se fait par condensation décarboxylative de monomères tels que
l'acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA), la propionyl-CoA, la malonyl-CoA et la
méthylmalonyl-CoA (PKSs) (Singh et Bharate, 2006). Il existe trois types distincts de
PKS reconnus (Achkar et al., 2005). La production de DAPG est déterminée par six
facteurs structurels (phlA, phlC, phlB, phlD et phlI). ) et trois gènes régulateurs (phlF,
phlG et phlH) (Kwak et al., 2012; Mandryk-Litvinkovich et al., 2017 ; Meyer et al.,
2016 ;Mishra et Arora, 2017).
1.3.2.3. Pyrolnitrine (PRN)

PRN est un arylpyrrole halogéné, initialement isolé à partir de Burkholderia
pyrrocina (Arima et al., 1964). La PRN est connue pour être produite par une gamme
étroite de bactéries à Gram négatif, y compris les Pseudomonas spp (Mujumdar et
al., 2014; Weller et al., 2016). La PRN produite par les Pseudomonas est connue
pour avoir une activité antagoniste contre les champignons, les levures et les
bactéries à Gram positif (Jani et al., 2015). Le mécanisme de l'activité de la PRN
implique l'inhibition du glycérol kinase, qui entraîne une fuite dans la membrane
cellulaire via l'accumulation de glycérol (Pillonel et Meyer, 1997), cependant son
mode d'action exact de la PRN n'est pas clair. Pour les Pseudomonas fluorescents,
15
la biosynthèse des PRN est réalisée en quatre étapes séquentielles et nécessite du

tryptophane (Kirner et al., 1998).
L’opéron biosynthétique de PRN est relativement petit (5,5 kb) et contient
quatre gènes, prnABCD qui convertissent le tryptophane en PRN (Hammer et al.,
1997).
Le gène prnD catalyse une étape très importante de l'oxydation de l'aminopyrrolnitrin
à PRN (Nakatsu et al., 1995). Le gène prnD possédant des Pseudomonas
fluorescents a été largement signalé dans les sols suppressifs et est particulièrement
connu pour l'inhibition de Rhizoctonia solani (Steinberg et al., 2006; Costa et al.,
2009).
Les dérivés chimiques de la PRN, connus sous le nom de phénylpyrroles, sont
produits au niveau commercial et utilisés avec succès pour le traitement des
semences et des feuilles afin de les protéger contre des phytopathogènes fongiques.
Le fludioxonil, un analogue du phénylpyrrole, est efficace et utilisé contre plusieurs
phytopathogènes fongiques (Kilani et Fillinger, 2014; Mishra et Arora, 2017).
1.3.2.4. Pyolutéorine (PLT)

Le PLT, un polycétide phénolique comprenant du pyrrole bichloré lié à un
groupement résorcinol, a été tout d'abord isolé de P. aeruginosa et ensuite d'autres
Pseudomonas fluorescents (Nowak-Thompson et al., 1997). La PLT a des activités
bactéricides, herbicides et fongicides (Takeda, 1958). Le groupe de gènes PLT
ABCDEFG est requis pour la biosynthèse des PLT (Nowak-Thompson et al., 1999).
La PLT fonctionne également comme un auto-inducteur et comme signal
intercellulaire entre des populations distinctes de cellules bactériennes cohabitant
dans la rhizosphère (Brodhagen et al., 2004).
Récemment, il a été étudié que le phloroglucinol avait une influence
dépendante de la concentration sur l'expression des gènes de biosynthèse du PLT et
la production de PLT chez P. protegens (Clifford et al., 2016), induisant différents
métabolites (DAPG et PLT) avec des mécanismes distincts et des cibles
phytopathogènes (Mishra et Arora , 2017).
1.3.2.5. Mupirocine
Plus connu comme l’acide pseudomonique, est un antibiotique polycétide
naturellement présent chez les Pseudomonas spp. fluorescents. La mupirocine
16
produite par P. fluorescens NCIMB 10586, est d’une activité élevée contre
Staphylococcus aureus et d’autres bactéries à Gram positif (El-sayed et al., 2001).
C’est un antibiotique largement utilisé dans les maladies tropicales (Carcanague,
1997).
1.3.2.6. Composés peptidiques (CLP)

Les CLP sont des oligopeptides courts avec une queue d'acides gras, liée
produite par diverses bactéries et champignons (Raaijmakers et al., 2006). Un
oligopeptide court est cyclisé par la formation d'un cycle lactone entre deux des
acides aminés. Cependant, la variabilité des CLP est due aux différences dans le
nombre d'acides gras, la modification des acides aminés et l'organisation du cycle
lactone (Raaijmakers et al., 2006, 2010).
Au cours des dernières années, les CLPs ont été reconnus comme
biosurfactants et représentent une activité antimicrobienne contre un large éventail
de micro-organismes pathogènes, y compris les virus enveloppés, les mycoplasmes
et les bactéries Gram-positives (Raaijmakers et al., 2006; Li et al, 2013; Raju et al.,
2016). Les CLP des Pseudomonas fluorescents joueraient également un rôle actif
dans la colonisation des graines (Nielsen et al., 2005), des racines (Tran et al.,
2007), la motilité en essaimage, la formation de biofilms et la virulence (Raaijmakers
et al., 2010).
Les CLP produits par les Pseudomonas fluorescents sont de divers types et
certains d'entre eux ne sont pas complètement caractérisés. Les CLP les plus
étudiés appartiennent aux groupes viscosine, amphisine, tolaasine et syringomycine
(Nybroe et Sørensen, 2014). Les CLP sont biosynthétisées par les peptides
synthétases non ribosomiques (NRPS). Ces derniers sont des multi-enzymes
géantes qui réalisent des couplages séquentiels d'acides aminés, pour générer des
peptides linéaires ou cycliques (Baltz, 2014).
1.3.2.7. Cyanure d'hydrogène (HCN)

La cyanogénèse bactérienne (production de cyanure) est signalée chez
certaines Pseudomonas fluorescents (Blumer et Haas, 2000; Zheng et al., 2013 ;
Ahemad et Kibret, 2014). Selon les facteurs environnementaux, ces bactéries
produisent une quantité variable d’HCN dans la rhizosphère (Schippers et al., 1990).
La glycine est le précurseur métabolique immédiat du cyanure et, en présence d’
17
HCN synthase, elle est décarboxylée en HCN et en CO2 (Nandi et al., 2017). L’HCN
synthase, un produit du groupe de gènes hcnABC synthase est une enzyme
associée à la membrane et sensible à l'oxygène qui participe à la cyanogenèse (Devi
et al., 2013).
Le HCN produit par les Pseudomonas fluorescents a montré une toxicité contre
les phytopathogènes en inhibant le cytochrome c-oxydase (Devi et Kothamasi,
2009). Néanmoins, les Pseudomonas fluorescents eux-mêmes sont résistants au
cyanure en raison de la présence de RhsA, un thiosulfate : cyanure
sulfurostransférase (rhodanèse) qui convertit le cyanure en thiocyanate moins
toxique chez plusieurs Pseudomonas spp. (Blumer et Haas, 2000).
.
1.3.2.8. Sidérophores
Le fer fait partie des minéraux en vrac présents à la surface de la terre, mais il
est indisponible dans le sol pour les plantes. Le fer est généralement présent dans la
nature sous forme de Fe+3, qui est hautement insoluble ; pour résoudre ce problème
les PGPRs sécrètent des sidérophores (Bhattacharya, 2010 ; Sreedevi et al., 2014
Kotasthane et al., 2017). Le mot sidérophore, issu du grec, signifie sidêros: fer et
phore: porteur. L’utilisation des sidérophores représente chez les bactéries l’un des
systèmes les plus efficaces pour l’acquisition du fer. Les sidérophores sont des
composés protéiques de liaison au fer de faible poids moléculaire compris entre 200
et 2000 daltons, dont le rôle est de solubiliser, de chélater et d’extraire le fer ferrique
de nombreux complexes minéraux ou organiques et de le rendre ainsi accessible
aux microorganismes (Neilands, 1995).
Lorsque le fer est limité, les sidérophores microbiens fournissent aux plantes
des ions de fer, améliorant ainsi leur croissance. Ces molécules agissent comme
agents solubilisant du fer, à partir de minéraux ou de composés organiques, dans
des conditions de limitation en fer. Une fois excrétés, les sidérophores chélatent le
fer ferrique et sont ramenés sous forme de complexes sidérophore-ferrique à
l’intérieur de la cellule bactérienne, où le fer ferrique est libéré du sidérophore et
réduit en fer ferreux (Fe+2) (Chu et al., 2010; Trapet et al., 2016; Kumar et Sharma,
2017).
Sur la base de leurs groupes fonctionnels coordonnants du fer, de leurs
caractéristiques structurelles et de leurs types de ligands, les sidérophores
bactériens ont été classés en quatre classes principales (carboxylates,
18
hydroxamates, catécholates de phénol et pyoverdines) (Crowley, 2006). Des

centaines de sidérophores ont été identifiés et signalés chez des microorganismes
cultivables, dont certains sont largement reconnus et utilisés par d’autres
microorganismes, tandis que d'autres sont spécifiques à certaines espèces (Sandy et
Butler, 2009 ; Beneduzi et al., 2012; Patel et Minocheherhomji, 2018).
Les Pseudomonas spp. fluorescents produisent des sidérophores fluorescents
jaune-vert appelés pyoverdines (ou pseudobactines) ayant une forte affinité pour le
Fe3+, avec une constante de stabilité du complexe pyoverdine ferrique vers 1032M
(Meyer et Abdallah, 1978 ; Albrecht-Gary et al., 1994). Cette dernière est constituée
d’une chaîne peptidique d’acides aminés liée à un chromophore fluorescent
responsable de la fluorescence jaune-vert caractéristique de ce pigment (Demange
et al., 1987). En outre, certains souches produisent un composé appelé ferribactine
qui pourrait être un produit de dégradation ou un précurseur de la pyoverdine (Taraz
et al., 1991). Un autre sidérophore dérivé de l’acide salicylique est le pseudomonine
produit par certaines souches de Pseudomonas spp. fluorescents (Anthony et al.,
1995; Mercado-Blanco et al., 2001; Trapet et al., 2016). Des souches de
Pseudomonas spp. fluorescents, à l'exemple de la souche Pseudomonas
fluorescens CHA0 aux propriétés antagonistes reconnues (Duffy et Defago, 2000),
produisent un sidérophore non fluorescent, la pyocheline présentant une faible
affinité pour le fer (Cox et al., 1981 ; Bholay et al., 2012 ).
1.3.2.9. Enzymes lytiques

L'amélioration de la croissance par l'activité enzymatique est un autre
mécanisme, utilisé par les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes. Ces
dernières peuvent produire certaines enzymes, telles que les chitinases, les
déshydrogénases, la ³-glucanase, les lipases et les protéases…etc., qui présentent
une activité hyperparasitaire, attaquant les agents pathogènes en excrétant les
hydrolases sur leurs parois cellulaires (Hayat et al., 2010 ;Joshi et al., 2012). Grâce à
l'activité de ces enzymes, les Pseudomonas fluorescents jouent un rôle très
important dans la promotion de la croissance des plantes, en particulier pour les
protéger des stress biotiques et abiotiques par la suppression des champignons
pathogènes tels que Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani et Pythium
ultimum (Upadyay et al., 2012 ;Nadeem et al., 2013).
19
1.3.2.10. Induction de la résistance systémique (ISR)

Une quatrième lignée de la recherche contemporaine, sur le biocontrôle des
Pseudomonas, peut être attribuée à des démonstrations indépendantes menées en
1991 par des groupes de recherche aux Pays-Bas, États-Unis et en Suède, que
certaines Pseudomonas colonisant les racines protégeaient les plantes de divers
agents pathogènes en induisant une résistance systémique (Weller, 2007). La
résistance systémique induite (RSI) est un état de résistance active, qui dépend des
barrières chimiques ou physiques de la plante hôte et qui est déclenchée par des
stimuli biotiques ou abiotiques spécifiques (Tuzun, 2001 ; Senthilraja et al., 2013).
Il n’est pas facile de distinguer l’ISR de la résistance acquise systémique (SAR),
car les deux utilisent des composés similaires pour supprimer les agents
pathogènes. Des progrès considérables ont été réalisés pour révéler les
mécanismes impliqués dans les interactions plante-PGPR-pathogène. Cependant, il
existe une absence d'élucidation globale de la signalisation ISR par les bactéries. Il a
été rapporté que certains composants structuraux de bactéries, tels que les flagelles,
les lipopolysaccharides (LPS) et la production de sidérophores et d'antibiotiques sont
les déterminants des ISR (García-Gutiérrez et al., 2012 ;Pieterse et al., 2014;
Naureen et al., 2015).
D’autres produits biochimiques produits par des PGPR ont été proposés pour
déclencher l’ISR; à l’exemple du dérivé de benzylamine N-alkylé produit par P.
putida, BTP1 (Kumar et al., 2015), des composés organiques volatils (COV) produits
par B. subtilis et B. amyloliquefaciens (Yuan et al., 2012; Pérez-García et al., 2011),
du diméthyldisulfure produit par B.cereus C1L (Meldau et al., 2013) et du DAPG
produit par P. fluorescens CHA0 (Hernández-León et al., 2015). De plus, la
résistance systémique induite implique la signalisation de jasmonate et de l'éthylène
chez la plante ; ces hormones stimulent l’activation des réponses de défense contre
divers agents pathogènes (García-Gutiérrez et al., 2013; Prabhukarthikeyan et al.,
2018).
1.3.2.11. Solubilisation des phosphates

Le phosphore est parmi les éléments clés dans la nutrition des plantes, à côté
de l'azote (N) ; il joue un rôle déterminant dans tous les processus métaboliques
majeurs des plantes, notamment dans la photosynthèse, le transfert d'énergie, la
transduction des signaux, la biosynthèse macromoléculaire et la respiration (Khan et
20
al., 2010). Il est abondamment disponible dans les sols sous forme organique et
inorganique, ainsi les plantes ne peuvent pas l’utiliser tel qu’il est, car 95 à 99% se
présentent sous des formes insolubles, immobilisée ou précipitée (Pandey et
Maheshwari, 2007). Les plantes n'absorbent le phosphate que sous deux formes
solubles : les ions monobasiques (HPO4) et diabasiques (H2PO4) (Bhattacharyya et
Jha, 2012 ; Gupta et al., 2015 ; Tabassum et al., 2017) .
Les Pseudomonas spp. fluorescents contribuent dans la biodisponibilité du
phosphore au profit des plantes, par des mécanismes de solubilisation des
phosphates dans les sols par la libération de :
- Composés complexants ou dissolvants les acides organiques, les

protons et ions hydroxyles.
- D’enzymes extracellulaires (minéralisation biochimique en phosphates)
- Phosphateses pendant la dégradation du substrat (minéralisation
biologique en phosphate) (Shaharoona et al., 2008; Sharma et
al.,2013).
Des effets bénéfiques notables après l'inoculation de bactéries solubilisatrices

de phosphates, utilisés seules ou en combinaison avec d'autres microorganismes
rhizosphériques, ont été également rapportés en interaction avec diverses espèces
végétales (Zaidi et al., 2009 ; Maheshwari,2011 ; Gupta et al.,2015 ;Vejan et
al. ,2016 )
1.3.2.12. Acide Indole-3-acetique (AIA)
Les rhizobactéries peuvent produire différents types de phytohormones,
notamment les auxines, les cytokinines, les gibbérellines, l'éthylène et l'acide
abcissique, qui facilitent différents processus de croissance chez les plantes, comme
l'élargissement et l'extension cellulaire radiculaire (Glick, 2014 ; Kaur et al., 2016;
Vejan et al., 2016; Tabassum et al., 2017).
L'acide indole-3-acétique (AIA) est une auxine synthétisée par de nombreuses
PGPR, qui influence la division, l'extension et la différenciation des cellules
végétales. Elle stimule la germination des tubercules, augmente le xylème et les
racines latérales et adventives, contrôle les réponses à la lumière, la fluorescence,
affecte la photosynthèse, la formation de pigments, la production de différents
métabolites et la résistance au stress. La synthèse de l'AIA par les PGPR se produit
généralement par au moins cinq voies différentes dépendantes du tryptophane,
21
après son exsudation par les racines (Meera et Balabaskar, 2012 ; Tabassum et al.,
2017; David et al., 2018 ;Novo et al., 2018).
1.3.2.13. Cytokinines
Les cytokinines appartiennent à une classe de phytohormones, à partir de
laquelle plus de 30 composés distinctifs ont été décrits. La production de cytokinines
par les PGPR est bien documentée, ayant été identifiée chez des microorganismes
de différents genres bactériens, tels que Azospirillum, Bacillus, Escherichia,
Klebsiella, Proteus, Xanthomonas et Pseudomonas (Maheshwari et al., 2015). De
nombreux processus de développement végétale sont grandement influencés par les
cytokinines, notamment la division cellulaire, la formation du système vasculaire
embryonnaire, la signalisation nutritionnelle, l'expansion des feuilles, le retard de
sénescence, la ramification et la production de chlorophylle (Bhattacharyya et Jha,
2012 ; Goswami et al., 2016; Tabassum et al., 2017; Novo et al., 2018) .
1.3.2.14. 1-Amino-cyclopropane-1-carboxylate (ACC) désaminase

Sous différents types de stress environnementaux, tels que le froid, les
courants d'air, les inondations, les infections par des agents pathogènes et la
présence de métaux lourds, les plantes synthétisent le 1-aminocyclopropane-1-
carboxylate (ACC), précurseur de l'éthylène (Chen et al., 2007, Grichko et Glick,
2001). Une certaine quantité de l'ACC est sécrétée dans la rhizosphère et est
adsorbée par les racines, qui sont ensuite convertie en éthylène. L’accumulation
d'éthylène nuit à la croissance des racines, ayant comme conséquence sur
l’acquisition de l'eau et des nutriments, ce qui provoque un stress supplémentaire.
L'éthylène est essentiel à la croissance végétale, avec des effets différentiels sur le
développement des plantes, selon sa concentration dans les tissus racinaires. Ainsi,
en concentrations élevées, il induit une défoliation qui entraîne une inhibition de la
croissance des tiges et des racines et une sénescence prématurée, réduisant les
performances des cultures et leurs rendements (Li et al., 2000).
Les PGPR ont la capacité de dégrader l'ACC dans la rhizosphère, en
intervenant positivement dans ce cycle préjudiciable par l’élaboration d’un système
racinaire sain nécessaire pour faire face aux stress biotique et abiotique (Wang et al.,
2006). L'ACC désaminase peut prévenir les effets nocifs des niveaux élevés en
éthylène (Glick et al.,1998 ) et agit sur l'ACC en le dégradant et en le convertissant
22
en α-kétobutyrate et en ammoniac (Glick et al.,1998; Mayak et al.,1999; Grichko et

Glick, 2001; Govindasamy et al., 2008; Vejan et al., 2016; Patel et Minocheherhomji,
2018).
Figure I.6 : 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC désaminase) chez les PGPR

(Patel et Minocheherhomji, 2018)
I.3.3. Quorum sensing (QS) et métabolisme secondaire

Sous sa forme la plus simple, le «quorum sensing» est considéré comme un
mécanisme de régulation globale de l’expression génique d’une bactérie, en réponse
à un seuil de densité d’une population bactérienne. Ce phénomène est possible
grâce à la production et à l’accumulation de molécules dans l’environnement
immédiat (Fuqua et Winans, 1994). Ces molécules, dites molécules signal, sont des
composés organiques de faible poids moléculaire qui présentent une diversité
fonctionnelle et chimique (Visick et Fuqua, 2005).
Suite à des stimuli environnementaux et physiologiques, les molécules signal
sont synthétisées et déclenchent alors des cascades de transduction de signaux, ce
qui permet aux bactéries de coordonner et de moduler l'expression de gènes cibles
afin de mettre en place une réponse adaptée à leur environnement (Atkinson and
23
Williams, 2009). Ces systèmes de communication permettent ainsi de moduler les

activités métaboliques des communautés microbiennes et leurs interactions (Yim et
al., 2006). Les premiers mécanismes de communication ou signalisation identifiés
ont été décrits comme étant des systèmes d’auto-induction. Ce terme provient de
l’observation que la bactérie est elle-même la source du signal qu’elle reçoit. Dans
ces systèmes, les molécules signal déclenchent une modification de l’expression des
gènes en réponse notamment aux fluctuations de la densité de la population
bactérienne (Fuqua et al., 1994; Visick et Fuqua, 2005).
Jadis considéré comme marginal et peu commun dans le monde bactérien, le
QS est maintenant reconnu comme un mécanisme de régulation majeur chez
plusieurs microorganismes. Les bactéries à Gram positif ont développé un système
de communication fonctionnant avec des oligopeptides comme signaux, tandis que
les bactéries à Gram négatif utilisent des molécules de faible poids pour la
signalisation (Elad, et Baker, 1985 ; Fuqua et Winans,1994 ; Benchabane,2005;
Romero et al.,2011). Une famille de ces molécules fait l’objet d’une attention
particulière de la part de la communauté scientifique, puisqu’elle est utilisée par un
grand nombre de bactéries à Gram négatif.
Les acyles-homosérine lactone (acyle-HSL), observées pour la première fois
dans le contexte de l’écologie microbienne, sont maintenant connues pour leur
importance dans les relations avec les plantes, les animaux et les humains (Noga,
1996). Le Q S issu des HSL joue un rôle dans plusieurs activités physiologiques,
notamment la symbiose, la virulence, la compétence, la conjugaison, la production
de métabolites secondaires, la motilité de type «swarming», la sporulation et la
formation de biofilms bactériens (Noga, 1996 ; Bosgelmez, 2003 ; Galet, 2014).
La communication par les HSL, chez les rhizobactéries, conditionne
l’expression des fonctions métaboliques et physiologiques impliquées dans leurs
interactions rhizosphériques (Wood et al., 1997; Rodelas et al., 1993; Delorme,
2002). De plus, l’activité des rhizobactéries peut être modulée par des molécules
signal émises par les plantes et la flore indigène, qui peuvent être analogues, sur les
plans structuraux et fonctionnels, avec les HSL. Les mécanismes d’action invoqués
pour ces molécules peuvent être un blocage du signal au niveau de la cible par
mimétisme et/ou carrément une destruction des HSL (Michiko et al. 2003 ; Sullivan,
2004 ; Romero et al., 2011).
24
Les propriétés antagonistes et phytostimulatrices des Pseudomonas spp.

fluorescents, via la synthèse de métabolites secondaires, la compétence
rhizosphérique et l’induction systémique de la résistance chez la plante sont sous le
contrôle génétique du quorum sensing. Dans ce sens, Derek et al., (1997) et Blumer
et Haas (2000), ont rapporté le rôle du quorum-sensing dans la synthèse des
phénazines et des cyanures d'hydrogène.
I.4. Bioformulations microbiennes phytobénéfiques

Les biopesticides microbiens comprennent des substances qui agissent contre
un large éventail d'organismes nuisibles invertébrés, ainsi que contre les mauvaises
herbes, les maladies des plantes et certains vertébrés. En 2017, on comptait plus de
356 principes actifs aux effets biopesticides, comprenant des insecticides, des
acaricides, des nématicides, des fongicides, des bactéricides, des herbicides, des
biostimulants et des promoteurs de la protection des plantes (Montesinos et
Bonaterra, 2017). Parmi ceux-ci, il y a 125 principes actifs à base d'espèces/de
souches de microorganismes ou de leurs métabolites pesticides, dont 57 étiquetés
pour une utilisation contre des invertébrés (Arthurs et Dara, 2018).
Les biopesticides suscitent un intérêt croissant dans le monde entier en raison
de leur biodégradabilité, de leur pertinence dans les programmes de lutte intégrée, et
suite à la demande croissante en ces éléments biologiques (Elliott et al., 1996; Gupta
et Dikshit, 2010 ; Kumar et Singh,2015). Les avantages spécifiques des biopesticides
par rapport aux pesticides chimiques classiques sont surtout (Thakore, 2006 ;
Ghodak et al., 2017):
- Les biopesticides sont généralement moins toxiques que les pesticides
chimiques conventionnels.
- Les biopesticides n'affectent généralement que l'organisme nuisible ciblé
et les organismes étroitement apparentés, à la différence des pesticides
classiques à large spectre pouvant affecter des organismes non ciblés, y
compris l'homme.
- Les biopesticides sont souvent efficaces en très petites quantités et se
décomposent rapidement, ce qui réduit les expositions et évite
principalement les problèmes de pollution causés par les pesticides
classiques.
25
- Lorsqu'ils sont utilisés dans le cadre de programmes de lutte intégrée, les

biopesticides peuvent réduire considérablement l'utilisation de pesticides
classiques, tout en maintenant des rendements élevés.
I.4.1 Marché des biopesticides

Ces dernières années, les biopesticides sont largement utilisés à travers le
monde pour lutter contre les insectes nuisibles et les maladies. Ils présentent un des
secteurs, en pleine croissance sur le marché international, qui devrait accroître sa
demande prochainement.
Le marché mondial des biopesticides était estimé à 1,3 milliard US$ en 2011 et
devrait atteindre 3,2 milliards US$ en 2017. L'Amérique du Nord a dominé le marché
mondial des biopesticides, couvrant plus de 40% de la demande mondiale en
biopesticides en 2011. Cette région représentait la plus grande part du marché des
biopesticides microbiens en 2015, avec une valeur de 539 millions de dollars, et
devrait atteindre 1,67 milliard de dollars d'ici 2022 (Markets and Markets, 2016). Le
marché européen est proche des États-Unis, avec 200 millions de dollars et devrait
être le marché à la croissance la plus rapide, en raison de l’adoption d’une
réglementation restrictive en pesticides chimiques et de la demande croissante en
producteurs biologiques. Le marché asiatique offre un grand potentiel de croissance
pour les biopesticides, la Chine et l'Inde prônent plus pour l’adoption de biopesticides
dans les pratiques agricoles. La production mondiale de biopesticides a été estimée
à plus de 3000 tonnes par an. À l'échelle mondiale, l'utilisation de biopesticides
augmente d'environ 10% chaque année. Plus de 200 produits sont vendus sur le
marché américain, alors que seuls 60 produits comparables sont vendus sur le
marché européen. La plupart des pays ont révisé leurs politiques afin de limiter
l'utilisation de pesticides chimiques de synthèse et de promouvoir l'utilisation de
biopesticides (Kumar, 2012 ; Ghodak et al., 2017).
L’absence de profilage des biopesticides est l’un des problèmes majeurs pour
les promouvoir comme alternative aux pesticides chimiques. Une meilleure
compréhension du mode d'action des biopesticides, de leurs effets et des problèmes
de réglementation peut aider à mieux promouvoir leur profil auprès des agriculteurs
et ainsi leur permettre de comprendre leur contribution à la durabilité (Dubey et al.,
2008 ; Kumar et Singh, 2015; Ghodak et al., 2017).
26
I.4.2. Limites des biopesticides

Dans de nombreux cas de conception de biopesticides microbiens, les résultats
obtenus dans des conditions de laboratoire ou contrôlées ne sont pas facilement
transférables sur terrain, en particulier lorsqu'il s'agit de bactéries à Gram négatif,
non sporulantes. L’absence de formes sporales les rendent plus sensibles aux
facteurs délétères survenant pendant le traitement et l'application au champ
(O’Callaghan, 2016). Par conséquent, ils ont besoin de formulations protectrices
appropriées pour améliorer leur efficacité sur le site cible et faciliter leur utilisation
pratique chez les agriculteurs. Plusieurs auteurs ont établi des revues complètes sur
le développement de formulations (Herrmann et Lesueur, 2013 ; Bashan et al.,
2014), en signalant le manque de formulations adéquates et la faible qualité
concomitante des inoculats comme l’un des principaux obstacles à l’utilisation
réussie et généralisée des bioformulations microbiennes (Stephens et Rask, 2000;
O’Callaghan, 2016).
La livraison d'un nombre élevé de cellules viables à la plante est une condition
préalable pour atteindre un taux de colonisation satisfaisant, ce qui améliore l'effet
recherché sur le terrain. La viabilité des inoculats peut en souffrir à différents stades
avant et pendant l'application. Premièrement, un produit doit afficher une durée de
conservation suffisamment longue, décrivant sa stabilité tout au long du processus
de production, des conditions d'emballage, de stockage et de transport (Arora et al.,
2016). Lors de l'application ultérieure sur le terrain, l'inoculant est confronté à
d'autres facteurs préjudiciables à sa viabilité. Ceux-ci incluent les rayons UV (Zohar-
Perez et al., 2003), en particulier lorsqu'ils sont appliqués sur des parties de plantes
hors sol, les propriétés fluctuantes du sol telles que la texture, la température et le
pH (Arora et al., 2016), ainsi que des cycles de séchage et de mouillage répétés en
fonction des conditions climatiques et la fréquence des précipitations. Pour les
inoculats appliqués directement sur les semences, la toxicité inhérente de
l'enveloppe de la graine peut être nocive (Deaker et al., 2012).
De plus, les interactions biotiques avec la microflore et la microfaune indigènes
représentent un défi majeur pour toutes les souches appliquées. Fréquemment, le
nombre de cellules d’une souche introduite diminue après l’application sur un sol
naturel, car il est neutralisé par les microbes indigènes ou diminué par les
prédateurs, tels que les protozoaires (Bashan, 1998 ; Arora et al., 2016). De toute
évidence, les facteurs de stress en pré-application survenant au cours du processus
27
de production exacerbent ce problème. Plus le nombre de cellules viables livrées sur

le terrain est faible, moins il est probable qu'un établissement réussisse sur le site
cible. Un processus de formulation adapté est donc d'une importance vitale
(Berninger, 2017).
1.4.3. Conception de bioformulations microbiennes

Le succès de toute formulation dépend de l'aptitude des matières de support et
de la durée de conservation du « bioagent» dans la formulation. Après tout, un
matériau de support devrait fournir des conditions favorables pour des bactéries qui
maintiendront une survie à long terme et amélioreront l'activité de contrôle biologique
des antagonistes (Patil et al., 2013). La plupart des biopesticides bactériens sont
produits par une fermentation liquide, bien que la production in vivo et la fermentation
du substrat solide aient été utilisées pour des produits de niches particulières. Une
fois la fermentation terminée, les bactéries sont concentrées et formulées en
produits, qui doivent avoir une stabilité durant leur stockage et être susceptibles
d'une application à grande échelle. Le contrôle de la qualité est nécessaire tout au
long du processus de production, pour assurer un produit final cohérent (Jackson,
2017). Des biopesticides bactériens ont été produits dans des formulations sèches,
telles que poudres mouillables et granulés, ainsi que dans des concentrés liquides
pour répondre à des besoins spécifiques du marché (Jackson, 2017). Il existe
plusieurs techniques de séchage de microorganismes appliquées à l’échelle
industrielle, à savoir l’atomisation (Bucio et al., 2005; Coulibaly et al., 2011), la
fluidisation (Li et al., 2004) et la lyophilisation (Rey, 1965 ; Perry, 1998 ; Palmfeldt et
al., 2003 ; Zhao and Zhang, 2005 ; Nanasombat and Sriwong, 2007; Coulibaly et al.,
2009).
I.4.3.1. Lyophilisation
La lyophilisation a été réalisée pour la première fois en 1890, est considéré
comme l'une des plus anciennes méthodes de conservation des aliments et des
herbes (Oetjen et Haseley, 2004). Cette méthode de formulation a évolué en
accordant des avenages à plusieurs domaine, telles que : la conservation des
produits pharmaceutiques (Garcia, 2011), la conservation de produits biologiques
(Garcia, 2011 ; Stephan et al., 2016) et la conservation des aliments thermosensibles
(Tse-Chao Hua et al., 2010).
28
La lyophilisation est la technique de séchage la plus répandue et la plus

courante pour la conservation des micro-organismes (Morgan et al., 2006 ; Liu et al.,
2009; Garcia, 2011; Mputu Kanyinda et al., 2012). Elle est appropriée pour la
production de cultures bactériennes concentrées avec l'avantage que le matériel
séché peut être stabilisé et stocké à température ambiante pour de longues
périodes, qui devrait aussi être facilement transportable (Palmfeldt et al., 2003;
Coulibaly et al., 2009; Stephan et al., 2016 ), tout en conservant l’aspect et les
propriétés du produit traité (Perry, 1998). Cette technique est décrite comme la plus
commode pour le séchage des Pseudomonas (Vidhyasekaran et al., 1997; Palmfeldt
et al., 2003; Tse-Chao Hua et al., 2010).
La lyophilisation comprend essentiellement deux étapes de traitement : la pré-
congélation et la sublimation de l'eau en exposant l'échantillon à des conditions de
vide poussé. La sublimation décrit la transition de phase de l'échantillon de l'état
solide à l'état de vapeur et dépend de sa température et du vide environnant. En
dessous d'une certaine valeur, qui dépend de la composition de l'échantillon, une
transition de phases a lieu immédiatement de l'état solide (glace) à l'état vaporeux
sans passer par une phase liquide. L'omission de la fusion rend le processus plutôt
doux et aide à maintenir les caractéristiques du produit. Le résultat final du
processus de sublimation est influencé par la température de pré-congélation, la
pression dans la chambre de séchage, la température d'entrée, la quantité
d'échantillon, le point final du séchage et les propriétés de l'instrument. Cela implique
qu'il existe d'innombrables combinaisons de paramètres de processus à évaluer lors
de l'optimisation d'un protocole de lyophilisation pour un échantillon donné (Morgan
et al., 2006).
Les inconvénients de la lyophilisation sont les coûts élevés (Santivarangkna et
al., 2007) et le volume limité de cette opération par lots (Morgan et al., 2006).
Néanmoins, la lyophilisation est l'une des méthodes les plus fréquemment utilisées
dans le développement de formulations de bactéries à l'échelle du laboratoire. Il a
été évalué pour la conservation de différentes souches de Pseudomonas fluorescens
(Jean-Noël et al., 2012; Cabrefiga et al., 2014; Bisutti et al., 2015), Pseudomonas
spp. (Stephan et al., 2016) et des souches de Pantoea agglomerans (Conesa-Muñoz
et al., 2015).
En outre, plusieurs auteurs (Carvalho et al., 2004 ; Montel Mendoza et al.,
2014) ont indiqué que les micro-organismes appartenant à différentes espèces et
29
souches peuvent présenter une sensibilité différente à la lyophilisation (Stephan et

al., 2016). Malgré tout, la congélation et le séchage sont connus pour leurs effets
néfastes sur les différents produits biologiques (Hurst, 1977). D’où l'un des
inconvénients les plus importants de la lyophilisation est la perte de viabilité (Schwab
et al., 2007 ; Garcia, 2011 ; Shafiei et al., 2013) pendant le traitement ainsi que
durant le stockage ultérieur (Potts, 1994 ; Castro et al.,1995; Miyamoto-Shinohara et
al., 2000). En règle générale, la viabilité, par exemple, de Pseudomonas spp, soumis
à la lyophilisation, a été réduite d'un à deux ordres de grandeur quand aucune
mesure de protection n'a été prise (Stephan et al., 2016).
I.4.3.2. Cryoprotection
L’addition d’agents cyroprotecteurs (CPAs) est d'une importance incontestable
pour la survie des cellules bactériennes lors du processus de lyophilisation (Morgan
et al., 2006 ; Coulibaly et al., 2010), car ils peuvent agir sur les fonctions biologiques
pour préserver l'intégrité de la bicouche lipidique par le phénomène de remplacement
d'eau (Coulibaly et al., 2010). Ces CPAs ont deux fonctions principales pour
préserver la viabilité des cellules lyophilisées : le premier est de fournir un résidu sec
avec une structure physique définie agissant comme un matériau de support et
comme un récepteur en réhydratation, et le second est de protéger les cellules
vivantes biochimiquement contre les dommages durant la congélation et le séchage
à l'air (Berny et Hennebert, 1991). Les milieux de lyophilisation couramment utilisés
contiennent des solutés protecteurs.
Ces derniers peuvent être des disaccharides non réducteurs, des alcools, des
sucres , des polyols (le sorbitol et le glycérol), des polysaccharides, des acides
aminés (le glutamate monosodique) (Fonseca et al., 2000; Fonseca et al., 2001) ,
des protéines et des mélanges complexes ( le lait écrémé) (Font de Valdez et al.,
1983 ; Tsvetkov et Brankova, 1983 ; Costa et al., 2000), des minéraux, des sels
d'acides organiques, des milieux complexes de vitamines (antioxydants)
(Champagne et al., 1991, Huba'lek 2003) et des macromolécules (maltodextrine)
(Béal et al., 2008). Cependant, la protection offerte par un additif donné au cours de
ces processus varie selon les espèces de microorganismes (Font de Valdez et al.,
1983).
30
Les cryoprotecteurs sont groupés en deux classes selon qu’ils sont à l’intérieur
(intracellulaire) ou à l’extérieur (extracellulaire) de la cellule:
- Cryoprotecteurs intracellulaires : ce sont des substances de faible poids
moléculaire (< 100 Da) qui pénètrent à l’intérieur de la cellule. Ils sont
utilisés à une concentration de l’ordre de mol/l et agissent
principalement lors d’une congélation lente. Le plus important
représentant de cette catégorie est le glycérol (Halliwell et Chirico,
1993 ; Bakhach et al., 2007; Kawahara, 2008).
- Cryoprotecteurs extra cellulaires : ce sont des substances de haut
poids moléculaire (>10000 Da) qui se concentrent à l’extérieur de la
cellule. Ils sont utilisés à une concentration plus faible, de l’ordre de
mmol/l, et sont indiqués lors des congélations rapides. Parmi les
molécules les plus utilisées de cette catégorie se trouvent le lactose, le
saccharose, le tréhalose, la maltodextrine, le dextrane et l’amidon
(Palmfeldt et al., 2003 ; Nanasombat et Sriwong, 2007 ; Coulibaly et al.,
2011).
31
Chapitre II. Isolement et identification de
Pseudomonas spp. fluorescents.
Chapitre II : Isolement et identification de Pseudomonas spp. fluorescents
Chapitre II. Isolement et identification de Pseudomonas spp.

fluorescents.
II.1. Introduction
Le genre Pseudomonas (Migula, 1894), appartenant aux δ protéobactéries, à la
famille Pseudomonadaceae, est l'un des plus complexes genres bactériens, il
possède le plus grand nombre d'espèces (231 espèces publiées) de tous les genres
de bactéries Gram-négatives (Peix, 2018). Ce genre, hautement hétérogène, a fait
l'objet de plusieurs reclassements sur la base d'études phénotypiques,
chimiotaxonomiques et génétiques (Palleroni, 1993 ; Anzai et al, 2000 ; Palleroni,
2015 ; Peix, 2018). Le genre Pseudomonas représente un groupe de bactéries
cosmopolites, important pour l'environnement, dotées d’une grande polyvalence
métabolique et possédant un large spectre de systèmes enzymatiques (Vasconcellos
et al., 2017). Avec des besoins nutritionnels simples, ces bactéries se retrouvent
quasiment dans tous les peuplements naturels : les sols, les eaux usées ou
naturelles, le milieu marin et l’air (Andreani et al., 2015). Ces bactéries se retrouvent
aussi dans des échantillons cliniques humains, de produits d'origine animale et de
parties vivantes de plantes et d'animaux (Pascual et al., 2015) ; dont certaines
espèces sont bien connues pour leur rôle bénéfique avec les plantes, d'autres en
bioremédiation, tandis que d'autres sont pathogènes des plantes ou des animaux
(Mulet et al., 2009; Sun et al.,2017) .
Les Pseudomonas spp. fluorescents forment un groupe diversifié de bactéries,
qui peuvent se distinguer visuellement des autres Pseudomonas par leur aptitude à
produire un pigment jaune vert (pyoverdines) soluble dans l’eau et diffusible dans
des milieux de culture pauvres en fer (Palleroni et al., 1973; Palleroni, 1984). Les
saprophytes de ce groupe renferment diverses espèces non pathogènes, à
cytochrome oxydase arginine dihydrolase positives et ne provoquent pas de réaction
d’hypersensibilité sur le tabac. Ce groupe était représenté initialement P.
chlororaphis, P. fluorescens, P. putida et P. aureofaciens (Johnson et Palleroni,
1989). Les espèces P. fluorescens et P. putida sont subdivisées, respectivement, en
cinq biovars (I, II, III, IV et V) et en deux biovars (A et B). L'importance de ces deux
dernières espèces est relatée dans divers environnements et sont l’objet de
nombreuses études écologiques (Digat et Gardan, 1989 ; Andreani et al., 2015) .
33
Les travaux, portant sur les populations rhizosphériques de ce groupe

rhizobactérien, ont mis en évidence l’influence de la plante et du sol sur la sélection
de populations de Pseudomonas spp. fluorescents (Latour, 1996 ; Clays–Josserand
et al., 1999). Il est admis, chez bactéries rhizosphériques, l’existence d’une très
grande diversité spécifique et écologique, ainsi les méthodes phénotypiques utilisées
pour leur taxonomie restent insuffisantes. L’étude réalisée sur des échantillons issus
de différentes régions d’Algérie, a montré que la distribution des espèces de
Pseudomonas spp. fluorescents et de leurs biotypes, est fonction de leur origine, et
des plantes hôtes, en exerçant une influence sélective, notamment au niveau des
sols cultivés et sans cultures (sols nus) (Benchabane, 2005).
Dans ce chapitre, l’effet rhizosphère a été analysé, sur les plans phénotypique
et taxonomique, avec une collection de souches de Pseudomonas spp. fluorescents
isolées à partir de quatre biotopes différents. La définition du biotope est basée sur
les caractéristiques pédoclimatiques de la région et la plante hôte (la culture).
II.2. Matériel et Méthodes
II-2.1. Echantillons de sol

Les isolements bactériens ont été réalisés à partir de prélèvements de sols
rhizosphériques, provenant de différentes palmeraies de régions phoenicicoles et
d’arbres fruitiers du sud algérien (Ghardaïa, Ouargla et Bechar). Ces régions ont été
choisies sur la base de leur vocation agricole et des conditions climatiques
(température élevée pouvant atteindre 49 et 50°C). Au niveau des plantes, choisies
aléatoirement, la partie supérieure du système racinaire a été déterré (profondeur de
50 à 80 cm) et le sol adhéré aux racines est récupéré, à raison de 200 à 250 g par
échantillon. Les échantillons de sols, prélevés en respectant les exigences de
l’asepsie microbiologique avec des outils désinfectés et stériles, sont déposés dans
des sachets en papier et conservés au froid (5 °C).
. II-2.2. Isolement des souches bactériennes

Apres élimination des éléments racinaires grossiers, le sol fortement adhéré
aux racines a été récupéré par rinçage dans des fioles, contenant 100 ml d’une
solution tampon (MgSO4 ,7H2O, 100 mM, pH 7), laissées 10 minutes en agitation
continue avant de préparer des dilutions, de 10 en 10, pour chaque échantillon
34
servant aux opérations d’ensemencement sur le milieu King B (KB) (King et al.,
1954), additionné de chloramphénicol et d’ampicilline (0.01 ppm) (Benchabane,
2005). L’incubation a été réalisée à 25 °C pendant 24 à 48h. Les colonies
bactériennes individualisées, fluorescentes sous lumière ultraviolette (350 nm), ont
été sélectionnées, repiquées sur le même milieu KB additionné de glycérol (25 %) et
conservées à –20 °C. De chaque biotope, nous avons pris aléatoirement trois
prélèvements, soit un total de 18 échantillons (3 x6).
II-2.3. Identification taxonomique

La vérification préliminaire des caractères génériques a été effectuée selon les
tests classiques décrits par Lelliot et Stead (1987) et Schaad (1988) : coloration de
Gram, morphologie cellulaire, oxydase, catalase et la voie d'utilisation du glucose.
Les caractérisations spécifiques et infraspécifiques ont été réalisées selon la clé
dichotomique d’identification des Pseudomonas spp. fluorescents saprophytes,
proposée par Bossis (1995) (Figure II.1).
P : Pseudomonas; fluor: fluorescens; chlor: chlororaphis; aure: aureofaciens; put: putida, bv: biovar
Trp : tryptophane, Deni : dénitrification, tar : tartrate ; ara : arabinose.
+ : réaction positive, - : réaction négative
Figure II.1 : Clé dichotomique d’identification des Pseudomonas spp. fluorescents
(Bossis, 1995).
35
Hormis les tests où il est mentionné les conditions de culture et d’incubation, les
autres tests ont été effectués avec des cultures bactériennes âgées de 18 à 24 h sur
milieu KB, incubées à 25 °C. Les concentrations des suspensions bactériennes ont
été déterminées par photométrie (DO), en se référant à des courbes étalons (Annexe
III). Les suspensions bactériennes ont été préparées dans l’eau distillée stérile ou
dans la solution tampon (MgSO4.7H2O 100 mM, pH 7) selon les techniques de Lelliot
et Stead (1987).
Production du pigment fluorescent : La production du pigment fluorescent

diffusible a été recherchée sur milieu KB ensemencé avec des cultures pures. Après
incubation de 24 à 96 h à 26° C, la fluorescence est révélée sous UV (350 - 400 nm).
Test de Gram : Les différentes étapes de la coloration de Gram sont
réalisées selon la description de Gardan et Luisetti (1981). Une autre méthode,
décrite par Suslow et al., (1982), a été utilisée et qui consiste à déposer sur une lame
deux à trois gouttes d’une solution de KOH (3 %) et on dépose une crème
bactérienne de 24h. La réponse positive corrélative au Gram négatif se traduit par
l’obtention d’un filet visqueux.
Arginine dihydrolase (ADH) : Le système enzymatique dihydrolase de
l’arginine permet à certains Pseudomonas de se développer sous des conditions
anaérobiques, selon deux réactions enzymatiques : dégradation de l’arginine en
citriculline (arginine desmidase) et sa transformation en ornithine (citruculline
ureidase). L’hydrolyse de l’arginine est testée sur le milieu Mueller Arginine (ADH
5%). Les tubes inoculés ont été recouverts par une légère couche de vaseline et
incubés à 26°C pendant 5 jours. La réaction positive se traduit par l’apparition d’une
coloration violette suite à l’alcalinisation du milieu dû à la présence de NH3
(Hildebrand, 1988).
Oxydase : Une crème bactérienne de 24h est étalée sur le disque d’oxydase
imbibé d’eau distillée stérile. La cytochrome oxydase se manifestant par l’apparition
d’une coloration violette après 10 secondes. La réponse est positive tardive lorsqu’
elle apparait en retard (10 à 60 secondes) ; après ce temps la réponse est négative
(Hildebrand et al., 1988).
Test d’hypersensibilité (HR) : Pour la réaction d’hypersensibilité sur tabac
(Klement, 1963), une suspension bactérienne (10⁸‐10¹⁰ cfu /ml) a été infiltrée dans le
limbe foliaire de jeunes plantules de Nicotiana tabaccum var xanti. L’infiltration a été
36
effectuée par injection à l’aide d’une seringue stérile, en piquant latéralement une
surface du limbe au niveau des nervures principales, qui se traduit par l’apparition
d’une plage humide. Sur une autre zone de la même feuille une autre infiltration est
réalisée avec de l’eau distillée stérile (témoin). Apres 48 à 72 h s’il y a apparition de
tâches nécrotiques et formation de collapses au niveau de la zone infiltrée, la
réponse est positive.
Gélatinolyse : L’hydrolyse de la gélatine sous l’action d’une enzyme
extracellulaire conduit à la libération des acides aminés. La crème bactérienne âgée
de 24h a été ensemencée par piqure centrale dans des tubes à essai contenant le
milieu gélatine. Après incubation à 25°C pendant 7 à 10 jours, les tubes
ensemencés, ainsi que les témoins non ensemencés, sont déposés au réfrigérateur
(4 °C pendant 10 minutes) pour favoriser la prise du gel. La gélatinolyse se traduit
par la liquéfaction du milieu (Gardan et Luisetti, 1981).
Utilisation de tréhalose : L’oxydation des sucres conduit en aérobie à la
formation d’acide pyruvique qui entraine l’acidification de milieu. Le test d’utilisation
de tréhalose est réalisé sur le milieu minéral (ARJ), additionné après autoclavage de
tréhalose (5%) stérilisé à froid par filtration. Des cultures bactériennes âgées de 24h
ont été ensemencées par piqure centrale et incubés à 27 °C pendant 3 à 5 jours. La
réaction positive se traduit par un virage de la couleur du milieu du vert au jaune
Levane sucrase : Ce test, réalisé selon la technique décrite par Hildebrand
et al., (1988), consiste en l’ensemencement d’une jeune culture sur le milieu levane.
Après incubation (27 °C, 3 jours), la présence de la levane sucrase est indiquée par
l’apparition d’une culture abondante, muqueuse et brillante.
Dénitrification : Pour certaines bactéries, la réduction des nitrates aboutit à
la formation de nitrite ou bien d’azote ammoniacal. Pour réaliser le test de la
réduction des nitrates, une crème bactérienne âgée de 24 h a été ensemencée sur le
milieu eau peptonée nitratée. Après incubation à 27 °C pendant 5 jours, deux réactifs
spécifiques A et B révélateurs de nitrates sont additionnés. Si le milieu vire au rose,
la souche possède la nitrate réductase, si par contre il reste incolore même après
l’ajout d’une pincée de poudre de zinc, il s’agit d’une dénitrification des nitrates
Utilisation de L-tryptophane : Le milieu peptoné exempte d’indole (riche en
tryptophane) a été utilisé pour réaliser ce test. Les tubes à essais contenant le milieu
37
peptoné ont été ensemencés par des cultures bactériennes de 24h puis incubé à
27°C pendant 24h. La transformation du tryptophane en indole se traduit, après
addition du réactif de Kovacs, par l’apparition d’un anneau rouge (Bortolotti et al.,
2016).
Utilisation de l’arabinose : Le test d’utilisation d’arabinose est réalisé sur le
milieu minéral de base (ARJ), additionnée après autoclavage d’arabinose (5 %)
stérilisé à froid par filtration. Des cultures bactériennes de 24h sont ensemencées
par piqure centrale et laissés en incubation à 27 °C pendant 3 à 5 jours. La réaction
positive se traduit par un virage de la couleur du milieu du vert au jaune (Meijnen et
al., 2008).
Utilisation de L tartrate-Na: Ce test est utilisé pour différencier entre les
biovars II et IV de Pseudomonas fluorescens. Le test est réalisé dans des tubes à
essais contenant le milieu ARJ, additionné de L tartrate-Na (10 %) stérilisé à froid
par filtration. Les tubes sont ensemencés par piqure centrale avec une crème
bactérienne âgée de 24 h et incubés pendant 3 à 5 jours à 27 °C. L’utilisation de ce
substrat se traduit par l’alcalinisation du milieu qui vire de vert au bleu (Digat et
gardan, 1987).
Activité pectolytique: Des tubercules de pomme de terre, lavés et essuyés,
sont désinfectés par trempage (10 mn) dans une solution d’éthanol (70 %). Après
rinçage à l’eau distillée stérile, les tubercules sont découpés en tranches (1-2 cm
d’épaisseur) et déposés dans des boites de Pétri dans de l’eau physiologique stérile.
Trois gouttes d’une suspension bactérienne préparées après 24 h de culture, sont
déposées sur les tranches. Après 7 à 14 jours, la réaction est considérée positive
avec l’apparition de pourriture qui s’accompagne d’une forte odeur (Cooksey et al.,
1990).
II.2.4. Sélection et caractérisation des souches

Les caractérisations phénotypiques et génotypiques ont été réalisées avec une
collection de souches sélectionnées sur la base de leur activité antagoniste in vitro, à
titre de test préliminaire, vis à vis de deux champignons phytopathogènes: Fusarium
oxysporum f.sp lycopercisi et Fusarium oxysporum f.sp albedenis.
II.2.4.1. Sélection des souches antagonistes
L’activité antagoniste in vitro a été évaluée à travers l’inhibition de la croissance
mycélienne des deux isolats fongiques de sur le milieu KB (King et al., 1954). La
38
pureté des isolats fongiques a été vérifiée après repiquage sur le milieu gélosé PDA
(Annexe I).
Les tests d’antagonisme ont été réalisés sur les milieux de culture KB, PDA et
le mileu mixte (KB-PDA : ½, ½) (Annexe I) selon la méthode de Becker et Cook
(1988). Des disques (φ 5 mm) de papier Whatman, tapissés d’une crème bactérienne
d’une culture de 24 heures, ont été déposés à la périphérie de la boite de Pétri
contenant le milieu de culture. Après 24 heures d’incubation à 25 °C, une pastille (φ 5
mm) "milieu solide" de l’isolat fongique a été déposée au centre de la boite. Cet essai
a été réalisé en deux étapes : (i) Une première étape préliminaire où l’isolat fongique
a été confronté aux quatre souches de Pseudomonas en même temps. Les
observations ont porté sur l’existence ou l’absence d’une inhibition de la croissance
mycélienne, comparativement à la croissance des témoins dans les trois milieux de
culture utilisés. (ii) Dans la deuxième étape, chaque souche bactérienne, ayant
montré une activité antagoniste notable, a été confrontée seule avec l’isolat fongique,
dans une disposition en deux spots bactériens aux extrémités opposées de la boite
et l’isolat fongique au centre. L’activité antagoniste a été faite notée après 8 jours
d’incubation à 25°C, en mesurant la croissance mycélienne (diamètre moyen de la
colonie fongique).
II.2.4.2. Caractérisation des profils trophiques
Les opérations de caractérisation sont réalisées au niveau du laboratoire
spécialisé en microbiologie (BCCM/LMG, GENT Belgique ; Belgian Coordinated
Collections of Microorganisms, Laboratory of Microbiology). La caractérisation
phénotypique, via l’étude des profils trophiques, a été réalisée avec 15 souches
bactériennes issues des différents biotopes (Tableau II.1).
L'identification des bactéries isolées a été effectuée avec le test GENIII-
MicroPlate™ du système «BIOLOG». Ce système permet de vérifier simultanément
diverses réactions métaboliques : 94 réactions phénotypiques ; 71 sources de
carbone et 23 tests de sensibilité aux inhibiteurs chimiques. En plus, il détermine
d’autres propriétés physiologiques importantes : le pH, la tolérance au sel et à l’acide
lactique, le pouvoir réducteur et la sensibilité chimique.
Les souches ont été cultivées pendant 24 h à 33 °C sur le milieu spécial (agar
Biolog Universal Growth) additionné de sang (BUG + B). La suspension bactérienne
doit avoir une transmittance de 90 à 98 %. 100 µl microlitres de suspension
bactérienne ont été utilisés pour inoculer les microplaques. La densité optique (595
39
nm) est mesurée après 48 h d'incubation à 25 °C, à l’aide du lecteur automatique de

microplaques (Bio-Rad modèle 550).
Tableau II. 1 : Nombre et Origine des souches bactériennes retenues
Souches Biotopes Origine
BB6, BB10, BB2, BB9 Palmier dattier Bechar (Beni Abbas)
BT3, BT7, BS4 Palmier dattier Bechar (Taghit)
F8, F20, F21, F23 Palmier dattier Ouargla
F19, F27, F48 Tomate Ghardaïa
PI9, PI11 Poirier Ghardaïa
GP4 Pommier Ghardaïa
L’identification des bactéries, par le système Biolog, est réalisée avec le lecteur
de plaque jumelé à une base de données informatisée des profils de bactéries de
référence. L’utilisation des substrats ou la résistance aux inhibiteurs chimiques se
traduisent par l’apparition dans les puits d’une couleur pourpre, produite par la
réduction de l’indicateur, le tétrazolium, en un composé coloré le formazan. En
l’absence de l’utilisation du substrat ou si la bactérie est sensible au produit, les puits
demeurent incolores. Les résultats ont été interprétés selon les instructions du
fabricant (Biolog Inc., Californie, États-Unis).
Une analyse, par groupe de résultats, a été réalisée à l'aide du coefficient de
Bray¬Curis et de l'UPGMA avec le logiciel BioNumerics (Applied Maths, Belgique).
L’identification est donc réalisée en jumelant le profil de la bactérie à identifier à celui
de l’espèce bactérienne présentant le plus de similarité. L’identification s’appuie
principalement sur deux valeurs:
• La similarité : un indice reflétant le degré d’appariement entre le profil
métabolique de la bactérie à identifier et celui de la bactérie proposée
par le système Biolog. Plus la valeur se rapproche de 1, meilleure est
considérée l’identification.
40
• La distance : indique le nombre de puits dont les résultats sont

différents entre la bactérie inconnue et celle proposée par le système
Biolog. Plus cette différence se rapproche de zéro, meilleure est
considérée l’identification.
II.2.4.3.Séquençage de l'ADNr 16S et étude phylogénétique

En plus de l’identification basée sur le système BIOLOG, un séquençage partiel
de l'ADNr 16S a été réalisé. La pureté des cultures bactériennes a été vérifiée sur
milieu TSA à 28 °C (BBL 11768), avant d’entamer les différentes étapes suivantes.
Extraction de l’ADN : L'ADN a été préparé selon le protocole de Niemann et al.,

(1997). L’extraction de l’ADN se fait sur un échantillon de 1,5 ml prélevé dans les
fioles de culture (2 répétitions/souche). L’échantillon est centrifugé et le culot est lavé
à l’eau peptonée. Les cellules sont lysées (lyzosyme, 20 mg/ml) et de protéinase K
(20 mg/ml). Le culot est repris et les étapes suivantes sont celles définies par le kit
d’extraction (Kit Wizard® Genomic DNA Purification, Promega). L’ADN extrait est
lavé à l’éthanol 70%, éliminé par séchage sous hotte et ADN est remis en
suspension dans de l’eau milliQ autoclavée. Cet ADN peut être stocké à 4°C (ou à -
20°C pour une plus longue période).
Vérification de l’intégrité de l’ADN : L’intégrité de l’ADN extrait est vérifiée
à l’aide d’un spectrophotomètre, après balayage entre 200 et 400 nm. Le résultat est
une courbe qui est caractéristique dans le cas d’un ADN intègre. Si la courbe
obtenue pour l’échantillon diffère de cette courbe type, l’ADN n’est pas de bonne
qualité (Figure II.2).
Figure II.2 : Courbe caractéristique d’un ADN intègre
41
Les rapports des DO obtenues, pour les longueurs d’onde 260 nm et 280 nm,
permettent de calculer les facteurs d’intégrité : si ce facteur est supérieur à 1,7
l’intégrité des ADN est bonne et les étapes suivantes peuvent être entamées. La
concentration de l’ADN extrait (ng/µl) peut être obtenus à partir de la DO (DO260nm *
50 * dilution).
Amplification du gène 16S
L’ADN ribosomique 16S est amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction), en
utilisant deux amorces :
Nom (a) Séquence synonymique (5 '-> 3') Position (b)

16F27 pA AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 8-27
16R1522 pH AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 1541-1522
(a) F : amorce directe / R : amorce inverse
(b) Position d'hybridation faisant référence à la numérotation des séquences du gène
de l'ARNr 16S de E. coli.
1μl d’ADN génomique obtenu est amplifié dans 25 μl de mixture réactionnelle,

contenant tous les réactifs nécessaires pour l’amplification PCR (Tableau II.2).
Tableau II.2 : Réactifs utilisés pour l’amplification PCR
Concentration de la Concentration V (µl) utilisé pour

Réactifs
solution mère de travail une réaction
Buffer KCl – MgCl2 10X 1X 2,5
MgCl2 25 mM 2 mM 2
dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,5
16SP0 10 µM 0,5 µM 1,25
16SP6 10 µM 0,5 µM 1,25
Taq polymérase 5 U/µl 0,625 U/25 µl 1
H20 PCR - - 15,5
V total (µl) - - 25
Le programme d’amplification est lancé sur le thermocycleur: 5 minutes à
95°C, 25 cycles comprenant : 30 secondes à 95°C, 30 secondes à 55°C, 2 minutes à
72°C, suivis de 10 minutes à 72°C. Une fois le programme terminé les échantillons
sont conservés à 4°C.
Vérification de la spécificité de l’amplification
Les produits PCR ont fait l’objet d’une électrophorèse sur gel d’agarose (1%),
additionné de bromure d’éthidium (BET). 100 mg d’agarose en poudre sont ajoutés à
42
100 ml de tampon TAE 1X (Tris Acétate-EDTA ; Euromedex). Cette solution est

homogénéisée par ébullition (micro-onde, 3min) avant d’être coulé dans une plaque
d'électrophorèse horizontale. Un marqueur de poids moléculaire est aussi chargé sur
le gel pour vérifier que la bande recherchée (1500 bp) est bien retrouvée dans les
échantillons amplifiés. La migration s’effectue dans le tampon TAE 1X à 100 V
pendant environ 30 minutes. Le gel est visualisé par la suite par un transluminateur
(gel Doc XR) piloté avec un ordinateur.
Purification du produit PCR : L’ADNr 16S amplifié par PCR a été purifié en
utilisant le kit de nettoyage PCR NucleoFast® 96 (Macherey-Nagel, Düren,
Allemagne). Les produits purifiés sont stockés à 4°C, en attendant le dosage.
Dosage des produits PCR purifiés : Le dosage des produits PCR purifiés
est réalisé sur gel d’agarose (1%). Les paramètres utilisés pour la migration sont
identiques à ceux décrits précédemment. Les produits purifiés sont chargés sur le
gel, ainsi que le marqueur de poids moléculaire. La détermination des concentrations
se fait en comparant l’intensité de la bande à 1500 pb de chaque échantillon à celle
de la bande correspondante pour le marqueur de poids moléculaire. Si l’intensité est
2 fois plus importante pour l’échantillon, la concentration de celui-ci sera deux fois
plus importante que pour le marqueur de poids moléculaire (MPM).
Séquençage du gène 16S : Les réactions de séquençage ont été réalisées

en utilisant le kit de séquençage Cycle BigDye® et purifiées avec le kit de purification
BigDye® XTerminatorT. Le séquençage a été effectué en utilisant l’analyseur
génétique ABI Prism® 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Les amorces directes et inverses suivantes ont été utilisées pour obtenir un
chevauchement partiel des séquences, assurant des données assemblées très
fiables :
- Pour 1D14041-à lD14045: gamma, * gamma, BKL1
- Pour 1D14047, 1D14050, 1D14052 et 1D14054: gamma, * gamma, BKL1, 3
Nom (a) Séquence synonymique (5 '-> 3') Position (b)
16F358 * Gamma CTC CTA CGG GAG GCA GCA GT 339-358
16R339 Gamma ACT GCT GCC TCC CGT AGG AG 358-339
16R519 BKL1 GTA TTA GCC CGG CTG CTG GCA 536-516
16R1093 3 GTT GCG CTC GTT GCG GGA CT 1112-1093
(a) F : amorce directe / R : amorce inverse
(b) Position d'hybridation de référence à la numérotation des séquences du gène de l'ARNr
16S de E. coli.
43
Traitement des séquences : L'assemblage des séquences a été réalisé en

utilisant le logiciel Bio Numerics (Applied Maths, Belgique). Une matrice de similarité
a été créée en utilisant le même logiciel pour le calcul d'homologie avec une pénalité
d’écart nulle (0 %) et après élimination des bases inconnues. L'analyse
phylogénétique a été réalisée après inclusion de la séquence consensus dans un
alignement de petites séquences de sous-unités ribosomiques collectées à partir de
la banque de séquences nucléotidiques internationale EMBL (European Molecular
Biology Laboratory, www.embl.org).
Un arbre phylogénique a été construit en utilisant la méthode phénétique NJ

(neighbour-joining) pour établir des regroupements entre espèces par une matrice
des distances. Ces dernières sont calculées en rapportant le nombre de sites
variables par comparaison des séquences. La validation de cette méthode est établie
par le test de robustesse (bootstrap) qui traite le résultat de 1000 analyses en
Neighbour-Joining (Felsenstein, 1985).
II .3. Résultats
II.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas spp. fluorescents
Les méthodes de caractérisation ont permis une identification préliminaire des
isolats issus des biotopes étudiés (Tableau II. 1). La sélection initiale a permis de
constituer une collection de 242 souches bactériennes fluorescentes. Les tests de
l’oxydase et de l’arginine-dihydrolase, considérés comme des tests déterminatifs
dans l’identification des Pseudomonas spp. fluorescents (Bossis, 1995), ont été
pratiqués sur les 242 souches. L’étude des cytochromes respiratoires a permis de
distinguer P. aeruginosa des autres espèces saprophytes ayant une cytochrome C
oxydase (Stanier et al., 1966) et de la plupart des espèces phytopathogènes
dépourvues de cette enzyme (Lelliot et al., 1966; Sands et al., 1967; Palleroni,1984).
Le test de l’hypersensibilité (HR) a permis de discriminer davantage les saprophytes
des phytopathogènes, lesquels provoquent une réaction d’hypersensibilité (Klement,
1963).
Les résultats ont permis de retenir 100 souches [oxydase (+), arginine (+) et
tabac (-)], apparentées à des Pseudomonas spp. fluorescents saprophytes, soit un
taux de 41,32% du total des souches isolées, La répartition des souches selon les
quatre biotopes, montre une dominance des souches issues des palmeraies (70 %).
44
A partir du biotope des poiriers, 15 souches ont été isolées, suivi de près par les 11
isolats du biotope de tomate et 4 isolats du biotope pommier (Tableau II.3).
Tableau II.3 Répartition des souches isolées selon les biotopes

Biotopes Souches Isolées Souches fluorescentes
identifiées
Palmier dattier (Phenix dactylifera) 155 (64,04 %)* 70 (70 %)
22 (09,09 %) 4 (4 %)
Pommier (Malus pumila)
45 (18,59 %) 15 (15 %)
Poirier (Pyrus communis) 20 (08,26 %) 11 (11 %)
Tomate (Solanum lycopersicum)
Total 242 100 (41.32)%
* Pourcentage par rapport au nombre total de souches sélectionnées (n = 242).
II-3.2. Identification spécifique

Les caractères physiologiques et biochimiques des isolats bactériens, selon les
réactions obtenues dans les tests discriminatifs proposés par Bossis (1995), ont
permis de regrouper la grande partie des souches en quatre espèces principales :
Pseudomonas fluorescens, P. chlororaphis, P. aureofaciens et P. putida. Les
souches qui ne correspondent pas aux profils des espèces citées sont regroupées
au sein du groupe intermédiaire entre P. putida et P. fluorescens (Tableau II-4). Les
résultats montrent une nette dominance de l’espèce P. fluorescens (52 souches),
suivie par P. putida, (24 souches) et 20 souches appartenant au groupe
intermédiaire. En ce qui concerne les deux espèces de P. chlororaphis et P.
aureofaciens, chacune est représentée par deux souches.
Tableau II.4. : Identification spécifique des souches

P. aureofaciens
P. fluorescens-
P. chlororaphis
P. fluorescens
P. putida
putida*
Nombre et (taux) 52 (52 %) 24(24%) 20 (20 %) 2 (2 %) 2 (2 %)
P : Pseudomonas ; *Groupe intermédiaire entre P. putida et P. fluorescens
45
II-3.3. Identification infraspécifique

Les caractérisations spécifiques et infraspécifiques ont permis d’observer dix
spectres de réponses, correspondant aux taxons et subdivisions des Pseudomonas
spp. fluorescents (Tableau II.5).
Chez P. fluorescens (52 souches), le biovar III, reconnu par ses réactions
gélatine (+), tréhalose (+/-), levane (-) et dénitrification (-), est de loin le plus
dominant avec 45 souches (86,53%). Les 7 souches restantes se répartissent dans
les autres biovars: biovar V (4 = 7,69 %), biovar IV (2 = 3,84 %) et biovar II (1=
1,92%).
Sur les 24 souches affiliées à P. putida, selon le test d’utilisation du L-
tryptophane, 23 souches appartiennent au biovar (A) et une seule souche du biovar
(B) (Tableau II.5).
Tableau II.5 : Spectres de réponses d’identification spécifique et infraspécifique
Spectres des réponses

Spectres 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nombre de souches 20 23 4 1 23 22 2 1 2 2
Tests
Fluorescence + + + + + + + + + +
Oxydase + + + + + + + + + +
Gram - - - - - - - - - -
+ + + + + + + + + +
Arginine
- - - - - - - - - -
Tabac - - + - + + + + + +
Gélatine + - + - - + + + - +
Tréhalose nt nt - nt - - + + + +
Levane sucrase nt nt - nt + + + + - +
Dénitrification nt nt nt nt nt nt - + nt +
Arabinose nt nt nt nt nt nt nt - nt +
L+ Tartrate Tryptophane nt nt nt nt nt nt nt nt nt nt
P f. bv. III
P f. bv. III
P f. bv. II
P. f bv IV
P f. bv. V
P . chlor.
P p. bv. B
Intermédiaire
P .aureo
P p. bv. A
nt : non testé Pf : Pseudomonas fluorescens ;

Pf : Pseudomonas putida ; bv : biovar
46
II.3.4. Distribution des souches selon les biotopes

La répartition des souches (biovars) selon la plante hôte montre que, quel que
soit cette dernière, le biovar III est présent, et toujours prédominant, à l’exception du
pommier où la prédominance revient à l’espèce Pseudomonas putida bivar A.
Selon les résultats mentionnés dans le tableau II.6, le plus grand nombre de
souches isolées provient du sol cultivé en palmier dattier (70 souches) quel que soit
le biovar. Tous les taxons des Pseudomonas spp. fluorescents ont été retrouvés que
dans les isolements issus des biotopes de Palmeraie.
Concernant les deux espèces de Pseudomonas chlororaphis et Pseudomonas
aureofaciens, on note une absence commune au niveau des cultures du pommier et
de tomate, alors que cette absence est enregistrée seulement pour l’espèce
Pseudomonas Chlororaphis chez le poirier. En revanche, ces deux espèces existent
chez le palmier dattier mais qui reste faible.
Tableau II-6 : Répartition des souches selon la plante hôte.
Plantes hôtes
Palmier dattier Pommier Poirier Tomate
Espèces
P.fluorescens
Biovar II 1 0 0 0
Biovar III 27 1 8 9
Biovar V 3 0 0 1
Biovar IV 2 0 0 0
P.putida
Biovar A 17 2 4 0
Biovar B 2 0 0 0
Autres espèces
P.fluorescens/putida 15 1 2 1
P.chlororaphis 2 0 0 0
P.aureofaciens 1 0 1 0
Total 70 4 15 11
En résumé, P. fluorescens est toujours l’espèce la plus fréquemment isolée

(52%), suivi du P. putida (23%). Le biovar III prédomine dans l’ensemble et
spécifiquement au niveau de quatre biotopes 45% (Figure II.3).
47
Figure II.3 : Répartition spécifique et infra spécifique des souches selon les biotopes.
II.3.5. Essai d’antagonisme in vitro

L’activité antagoniste in vitro, vis à vis des deux agents phytopathogènes
(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol) et Fusarium oxysporum f.sp. albedenis
(Foa), a permis d’observer 9 spectres de réponses selon leur l’intensité. La
croissance mycélienne enregistrée chez les témoins a été nettement supérieure à
celle des interactions Pseudomonas-isolat cryptogamique. Cette activité est plus
importante vis-à-vis de Foa comparativement à Fol. D’après les spectres de
réponses, 22 souches ont inhibé la croissance mycélienne des deux agents
pathogènes (Tableau II.7).
L’activité antagoniste des différentes souches de Pseudomonas est variable
vis-à-vis des agents phytopathogènes. Toutes les souches sont antagonistes au
moins à l’encontre d’un agent fongique. Le taux d’inhibition le plus important a été
enregistré avec PI9 (59.33%) vis à vis de foln et E39 et F27 (67.33%) via à vis de la
même souche (E39) (Tableau II.8).
48
Tableau II.7 : Activités antagonistes in vitro

Fusarium Fusarium
oxysporum oxysporum
f.sp. f.sp.
Souches lycopersici albedinis
BS4,F8,F19,F20,F21,F22,F23,F27,F42;F43,F44, +++ +++
F45,F48,GP4,BT3,BT7,PI9,PI11,BB2,BB6,BB9,BB10
F24,F25,F41,PI12,F46 +++ ++
BS3,F15,F16,F18,F28,F29,F30,F32,F33,F40,BS7, ++ +++
GP3,BT2,BT4,BT5,BT13,PI5,PI6,PI7,PI8,BB5,BB7,BB11
F17,BS6,GP1,BT9,PI1,PI2,PI3,PI10 + +++
BS1,BS2,F1,F2,F5,F9,F10,F11,PI13 - +++
BS5,F14,F26,F47;GP2,BT12,PI4,PI15,BB1,BB3,BB4,BB8,BB12 ++ ++
BB13,BB14,BB15,BB16,BB17,BB18,BB19,BB20,BB21,BB22
BT1,BT8 + ++
F6,F7,F12,BT10,BT11,PI14 - ++
F4,F13 - +
+++ Très forte activité ++ moyenne activité + faible activité - : absence d’activité
Tableau II.8 : Taux d’inhibition de la croissance mycélienne des agents fongiques.
Taux d’inhibition (%)

Souches Foa Fol Foln Pyt E39 Ggt
BB6 28,97 (± 0,38)* 43,75 (±1,25) * 39,33 (±2,31) * 24,50 (±2,18) * 29,83 (±0,29) * 42,67 (±1,15) *
F21 31,76 (±2,04) * 42,92 (±0,72) * 22,67 (±1,15) * 25,67 (±0,58) * 17,33 (±1,15) * 12,67 (±1,15) *
F23 42,92(±0,72) * 39,58 (±0,72) * 42,67 (±1,15) * 20,67 (±1,15) * 19,33 (±1,15) * 41,50 (±0,50) *
BB10 25,87 (±2,04) * 47,50 (±1,25) * 14,67 (±1,15) * 14,00 (±2,00) * 46,00 (±2,00) * 24,00 (±2,00) *
BT7 35,93 (±0,55) * 36,67 (±0,72) * 39,67 (±1,53) * 00.00 (±0.00) * 34,00 (±2,00) * 44,00 (±2,00) *
BB9 40,00 (±2,17) * 27,84 (±0,68) * 44,33 (±0,58) * 32,00 (±2,00) * 38,67 (±1,15) * 47,33 (±2,31) *
PI11 36,07 (±2,45) * 40,83 (±1,44) * 37,67 (±0,58) * 12,00 (±2,00) * 24,67 (±1,15) * 41,33 (±2,31) *
PI9 28,23 (±1,18) * 42,92(± 0,72) * 59,00 (±1,00) * 34,67 (±1,15) * 59,33 (±1,15) * 48,67 (±1,15) *
F48 40,44 (±1,40) * 38,75 (±1,25) * 51,33 (±1,15) * 4,33 (±0,58) * 34,67 (±1,15) * 35,67 (±0,58) *
F27 34,26 (±0,89) * 29,58 (±1,44) * 31,67 (±0,58) * 7,33 (±0,58) * 67,33 (±1,15) * 30,67 (±1,15) *
F20 34,58 (±0,72) * 39,17 (±0,72) * 39,67 (±0,58) * 31,33 (±1,15) * 42,67 (±1,15) * 49,33 (±1,15) *
F19 36,07 (±1,36) * 35,83 (±1,44) * 22,00 (±2,00) * 0,00 (±0,00) * 40,67 (±1,15) * 00,00 (±0,00) *
F8 30,83 (±0,72) * 40,83 (±0,72) * 29,33 (±1,15) * 27,33 (±1,15) * 59,67 (±0,58) * 24, 67 (±1,15) *
GP4 26,25 (±2,17) * 25,83 (±0,72) * 26,67 (±2,31) * 17,33 (±1,15) * 21,33 (±1,15) * 40,33 (± 0,58) *
BT3 32,75 (±1,80) * 42,92(± 0,72) * 15,67 (±0,58) * 24,67 (±1,15) * 53,33 (±2,31) * 27,33 (±1,15) *
BB2 32,08 (±0,72) * 42,92(± 0,72) * 0,00 (± 0,00) * 21,67 (±0,58) * 0,00 (±0,00) * 42,00 (±2,00) *
BS4 31,25 (±1,25) * 37,92 (±0,72) * 20,67 (±1,15) * 24,67 (±1,15) * 31,33 (±1,15) * 31,33 (±1,15) *
Foa : Fusarium oxysporumf.sp albedenis ; Fol: Fusarium oxysporum f.sp. lycopercisi ; Foln : Fusarium
oxysporum f.sp. lini; Pyt : Pytium ultimum ; GGt : Gaymanomyces graminis var tritici ; E39: Eutypa
lata. . * : Ecart type de trois répétitions
49
II.3.4. Caractérisation des profils trophiques (BIOLOG)

Les résultats du test de microtitration (BIOLOG GENIII) (Annexe II) réalisé avec
quinze souches antagonistes (Figure II.4), montrent que:
- Les souches ID14054(BT7), ID14055(F21),

ID14053(BT3), ID14043(F20), ID14044(F23), ID14046(F48) et
ID14050(BS4) sont affiliés à Pseudomonas fluorescens biotype C. avec
respectivement des similarités significatives de 0.694, 0.757,0.694,
0.764,0.763, 0.721 et 0.841.
- Les souches ID14048 (BB10) et ID14045 (F27) sont identifiées comme

étant Pseudomonas fluorescens, mais sans biotypage (similarité faible
de 0.252 et 0.400).
- Les souches ID14041(F8), D14047(BB6), ID14042(F19) et ID14052

(PI11) ont été identifiées comme étant Pseudomonas mendocina avec
respectivement des similarités significatives de 0.700, 0.619 et 0.514.
- La souche ID14051(PI9) a été identifiée comme étant Pseudomona sp
(0.475). La souche ID14049 (GP4) a été affiliée à Pseudomonas putida
biotype B (0.444).
50
Figure II.4 : Affiliation des souches bactériennes selon les tests BIOLOG GENIII
51
II.3.5.Séquençage de l'ADNr 16S et étude phylogénétique

L’amplification de l’ADNr des isolats de Pseudomonas a révélé l’apparition des
bandes similaires pour l’ensemble des isolats avec une taille approximative de 1500
paires de bases (Figure II.5).
F21 BB9 BB2 PI9 GP4
Marqueur de poids moléculaire

1500 pb
Figure II.5 : Gel reprenant les 5 ADN amplifiés et le marqueur de poids moléculaire
Les séquences ADNr 16S isolats ont été directement déterminés à partir des
produits PCR dans les deux sens (reverse et forward), par Genome-Express. Les
alignements ont été effectués, le programme BLAST de la banque de données NCBI
(National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (
Annexe II).
Une similarité significative (> 98,7%) est observée avec plusieurs espèces
validées des sous-groupes de P. gessardi et P. fluorescens (Figure II.6), indiquant :
- Les souches 1D14054 (BT7), ID14043 (F20), ID14044, (F23) et
ID14050 (BS4) appartiennent à l'une de ces espèces (P. gessardi et P.
fluorescens).
- La souche ID14045(F27) a été identifiée comme P. fluorescens.
- Les souches ID14047(BB6), ID140152(PI11), ID14041(F8) et ID14042
(F19) ont été identifiées comme étant P. putida.
L’analyse phylogénétique des Pseudomonas étudiés permet de positionner
chaque isolat et sa corrélation génétique avec les autres souches les plus proches,
existant dans la banque NCBI. Cette analyse a permis de rapprocher les isolats
étudiés aux deux groupes de Pseudomonas (P putida et P. fluorescens l P gessardi
subgroup). Les résultats obtenus par approche moléculaire en comparant avec les
52
résultats phénotypiques obtenus (clé dichotomique et Biolog GENIII) révèlent la

complexité et la variabilité au niveau des différentes espèces (Tableau II 8).
L’identification génétique des six souches qui ne figurent pas sur l’arbre
phylogénétique (BB9, PI9, GP4, F21, BB2 et BB10) (Tableau II. 8), montre que :
- GP4 a été affiliée à Pseudomoas sp (96%).
- PI9 et BB2 ont été identifiées comme étant Pseudomonas
putida/Pseudomonas monteilli (99%).
- BB9 a été affiliée à l’espèce Pseudomonas putida (96%).
- F21 a été affilié à Pseudomonas sp, P. fluorescens ou P.verronii (94%)
- BB10, bien que les résultats de la PCR sont de mauvaise qualité, les résultats
du BIOLOG (faible similarité de 0.400) et l’identification classique l’ont
identifié comme étant P. fluorescens.
53
Tableau II.9 : Identification comparative (Biolog GENIII et l'ADNr 16S)

N° Biolog GEN III l'ADNr 16S
identifié Similarité identifié Similarité
BT7 P. fluorescens biotype C 0.694 P.gessardi / fluorescens sgpe > 98.7
F21 P. fluorescens biotype C 0.757 P.sp/P.fluorescens / P.verronii /
BT3 P. fluorescens biotype C 0.694 ND /

F20 P. fluorescens biotype C 0.764 P.gessardi / fluorescens sgpe > 98.7
F23 P. fluorescens biotype C 0.763 P.gessardi/ fluorescens sgpe > 98.7
F48 P. fluorescens biotype C 0.721 ND /
BS4 P. fluorescens biotype C 0.841 P.gessardi/fluorescens sgpe > 98.7
F27 P. fluorescens sous / groupe 0.252 P. fluorescens sgpe > 98.7
F8 P. mendocina 0.700 P.putida > 98.7
BB6 P. mendocina 0.619 P.putida sgpe > 98.7
BB10 P. fluorescens 0.400 / /
GP4 P.putida biotype B 0.444 Pseudomonas sp 81
PI9 Pseudomonas.sp 0.475 P.putida/P.monteilli 99
F19 P.mondocina 0.677 P.putida > 98.7
BB2 ND / P.putida/P.monteilli 99
BB9 ND / P.putida/P.monteilli 96
PI11 P.mondocina 0.514 P.putida > 98.7
ND : Non donné
54
Figure II. 6 : Arbre phylogénétique (ARNr 16S) des espèces validées avec des
similarités g 97%.
55
II.4.DISCUSSION
Les résultats de l’identification phénotypique et génotypique (Tableau II.9), ont
révélé une forte hétérogénéité du genre Pseudomonas. Globalement, les
caractérisations phénotypiques utilisées n’ont pas permis de réaliser une
identification totale et précise. Il a été noté des différences entre les trois méthodes
d’identification utilisées. La détermination des profils trophiques des souches a mis
en évidence une grande diversité dans leur métabolisme carboné ; néanmoins il n’y
pas eu de concordance entre les résultats de l’identification et les profils trophiques,
ce qui révèle les limites des tests phénotypiques d’identification des Pseudomonas.
Ces résultats confirment la faiblesse de ces approches phénotypiques pour une
caractérisation stable.
Bien que la classification multivars montre une forte hétérogénéité
phénotypique, elle demeure cependant comme le système le plus utilisé dans la
classification de ce groupe bactérien (Lemaceau et al., 1995; Latour, 1996; Latour et
al., 1996). Initialement les Pseudomonas spp. fluorescents renfermeraient trois
espèces (P. fluorescens, P. putida et P. chlororaphis) et P. aureofaciens rattachée
par la suite à P. chlororaphis (Johnson et Palleroni, 1989). Les espèces P.
fluorescens et P. putida ont été subdivisées sur la base des tests phénotypiques,
respectivement, en 5 et en 2 biovars (Stanier et al., 1996; Palleroni, 1984). Elles se
caractérisent par une grande hétérogénéité phénotypique (Bossis et al., 2000).
Palleroni et al., (1993) ,ont montré par des études d’hybridation ADN-ARNr que
le genre Pseudomonas renfermait des espèces très diversifiées dont les similarités
sont parfois faibles, sur la base de ce critère moléculaire, le genre Pseudomonas a
été subdivisé par Palleroni (1984) en 5 groupes d’homologie (I, II, III, IV,V)
(Benchabane, 2005). Dans une étude phénotypique réalisée par Stanier et al.,
(1996) sur une collection de souches saprophytes issues d’origines diverses, il a été
mis en évidence une forte hétérogénéité chez les espèces P. fluorescens et P.
putida. Les souches du biovar V sont très hétérogènes et montrent dans leurs
caractéristiques une grande variabilité, rendant difficile leur différenciation des autres
biovars (Palleroni,1984 ; Bossis et al., 2000). Les études taxonomiques réalisées par
divers auteurs (Stanier et al., 1966 ; Bossis,1995 ; 2000 ; Palleroni, 2015) indiquent
que la définition actuelle des espèces en biovars n’est pas assez précise, laissant
des confusions sur les plans spécifique et infraspécifique.
56
Les études réalisées depuis plus d’un siècle sur ce genre bactérien ont mis en
évidence une complexité dans ses caractéristiques taxonomiques. La majorité des
études taxonomiques sur les Pseudomonas spp. fluorescents a révélé la complexité
de la variabilité au niveau des différentes espèces appartenant à ce groupe
(Palleroni et Stanier, 1964 ; Digat et Gardan,1987; Bossis et al., 2000 ;
Palleroni,2015 ). En effet, il est souvent difficile de réaliser une identification précise
et de faire la distinction entre les différentes espèces (Benchabane, 2005; Garrido-
Sanz et al., 2016).
Outre leur signification taxonomique, les tests biochimiques utilisés pour
l’identification des isolats de Pseudomonas spp. fluorescents, peuvent être
considérés comme indicateurs de l’aspect des profils métaboliques de ces bactéries,
qui semble être un avantage pour leur adaptation au sol et dans la rhizosphère
(Benchabane, 2005). Pseudomonas est l'un des genres les plus complexes et les
plus variés, comme en témoignent les nombreuses espèces décrites (plus de 100)
(Palleroni, 2015). Depuis sa description initiale (Palleroni et Stanier, 1964), la
taxonomie a subi de nombreux changements et remaniements. Plusieurs études ont
évalué de manière informelle la présence de groupes et de sous-groupes au sein
des genres (Gomila et al.,2015 ; Mulet et al.,2010), dont le groupe Pseudomonas
fluorescens, où plus de 50 espèces nommées ont été décrites et divisées en sous-
groupes qui diffèrent de l'analyse de séquence multiloci du (MLSA) et l’analyse
phylogénomique (Gomila et al.,2015, Redondo-Nieto et al., 2013).
La quasi-totalité des études taxonomiques réalisées sur les Pseudomonas spp.
fluorescents, particulièrement P. fluorescens et P. putida, a signalé la difficulté et la
complexité dans l'élaboration de critères taxonomiques précis. Ces études ont révélé
la complexité et la variabilité au niveau des différentes espèces appartenant à ce
groupe (Palleroni et al., 1972; Delorme, 2002; Benchabane, 2005 ; Peix,
2009 ;2018). L’hétérogénéité que l’on rencontre chez certaines espèces et leurs
biovars laisse la classification des souches de Pseudomonas spp. fluorescents
sujette à beaucoup de divergences (Bossis et al., 2000 ; Palleroni 2015 ; Garrido-
Sanz et al.,2016).
L'énorme hétérogénéité phénotypique et génétique démontrée par les souches
appartenant au groupe P. fluorescens (Loper et al., 2012 ) a conduit à une évaluation
difficile de sa phylogénie qui n'englobe pas complètement la taxonomie, et la
proposition selon laquelle un complexe d'espèces façonne la phylogénie du groupe
57
P. fluorescens (Seaton et Silby, 2014). Une autre difficulté de ce groupe est la

description fréquente de nouvelles espèces, telles que P. protegens (Ramette,2011),
et de sous-espèces, telles que P. brassicacearum subsp. néoaurantiaca (Ivanova et
al., 2009), et l’inclusion de souches dans le groupe P. fluorescens( P. sp.UW4)
(Duan et al.,2013).
Les phylogénie basées sur la petite séquence de sous-unités ribosomales
(séquence du gène de l'ADNr 16S) ont été l'une des méthodes les plus courantes
pour les analyses phylogénétiques des bactéries (Peix et al., 2009). Cependant,
cette méthode est problématique en raison de son manque de résolution lors de la
comparaison d'organismes étroitement apparentés, ainsi que d'événements de
recombinaison et de transfert de gène latéral (Ramette et al., 2011). L’analyse de
séquence multilocus (MLSA) résout souvent les problèmes des phylogénies déduites
de l’ADNr 16S (Gevers et al., 2005) et s’est révélée plus fiable que l’ADNrS 16S du
genre Pseudomonas (Kämpfer et Glaeser, 2012), dans laquelle la séquence de trois
gènes de ménage concaténés (gyrB , rpoD, rpoB), ainsi que l’ADNr 16S ont bien
démontré qu’ils permettaient de déduire une phylogénie relativement meilleure
(Mulet et al.,2010).
L’analyse des profils d’acides gras (FAMES) a également été proposée comme
méthode d’identification (Mansfeld-Giese et al., 2002; Chao et al., 2010; Janisiewicz
et Buyer, 2010), en particulier pour l’identification de souches phytopathogènes
(Gitaitis et al., 2012; Gumtow et al., 2013; Bozkurt et al., 2016; Webb et al., 2016).
Les profils SDS-PAGE, polyamine et sidérophores ne sont actuellement pas
inclus dans les marqueurs taxonomiques nécessaires pour les nouvelles descriptions
(Auling et al., 1991; Vancanneyt et al., 1996; Meyer et al., 1996 , 2002). Le
sidérotypage a été utilisé pour caractériser de nouvelles espèces, telles que P.
costantinii (Munsch et al., 2002), P. salomonii (Gardan et al., 2002), ou les non-
pathogènes P. palleroniana (Gardan et al., 2002) et P. protegens (Ramette et al.,
2011). Des techniques protéomiques sont sollicitées pour une meilleure clarification
de la taxonomie de ces bactéries, qui peuvent être.prometteuses.
Il faut souligner que toutes les nouvelles espèces sont phylogénétiquement très
diverses. Une telle diversité n'est pas surprenante compte tenu des habitats très
hétérogènes où ces espèces ont été trouvées, ce qui reflète que Pseudomonas est
un genre omniprésent. Étant donné que la plupart des environnements n’ont toujours
pas été étudiés du point de vue microbiologique, il faut s’attendre à ce que le nombre
58
de nouvelles espèces de Pseudomonas augmente considérablement dans les

années à venir (Peix et al., 2018 ).
Les Pseudomonas spp. fluorescents possèdent plusieurs caractéristiques
intrinsèques qui les rendent particulièrement intéressantes pour une utilisation
comme agents de lutte biologique. Ainsi leur capacité à coloniser les racines et à y
maintenir une forte densité de population est remarquable (Haas et Keel,
2003 ;Garrido-Sanz et al.,2016). Cette grande rhizocompétence vient de leur taux de
croissance plus élevé que celui de la plupart des autres bactéries; et de leur capacité
à utiliser une gamme de substrats très large, souvent issus des exsudats racinaires,
comme source d’azote ou de carbone. De plus, elles sont très faciles à isoler et à
cultiver au laboratoire et se prêtent aisément aux manipulations génétiques (Moore
et al., 2006 ; Wu et al.,2011).
D’après les résultats obtenus, ou il a été constaté que les deux espèces de
Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas putida sont très répandus dans les sols
cultivés de diverses plantes hôte, concordent avec ceux de Holloway (1992) ;
Schroth et al(1992) qui notent que les deux espèces se rencontrent dans divers
biotopes à des densités élevées.
L'analyse de la diversité taxonomique des populations de Pseudomonas spp.
fluorescents en fonction de leur origine (biotope) montre, en grande partie, que leur
distribution est aléatoire. D'une manière générale, les tests biochimiques utilisés,
outre leur signification taxonomique, ils peuvent être des indicateurs sommaires de
l'aspect métabolique de ces rhizobactéries, qui semblent essentiels pour leur
adaptation au sol et à la rhizosphère.
Les travaux de Digat (1993) et Benizri et al (2001), basés sur la diversité des
populations rhizosphériques suggèrent qu’il pourrait exister des mécanismes de
« spécificité » ou « sélectivité » de l’effet rhizosphérique aboutissant à la stimulation
préférentielle de certains phénotypes bactériens en fonction de la plante hôte.
Les Pseudomonas sont abondants dans le sol, particulièrement au voisinage du
système racinaire des plantes dans différentes régions, et leur colonisation efficace
des parties souterraines des plantes, signe de leur potentiel d’adaptation
(Lugtomberg et al., 2001; Benchabane,2005). Elles se caractérisent aussi par un
meilleur développement dans la rhizosphère par rapport au sol nu (Latour et
Lemanceau, 1997, Benchabane, 2005).
59
Au sein des populations rhizospheriques, les Pseudomonas spp. fluorescents

sont prédominants et peuvent constituer plus de 60% de la microflore bactérienne
(Foster et Rovira, 1978 ; Digat et Gardan, 1987). Ces résultats confirment, selon ces
auteurs, qu’il y a un «effet rhizosphérique sélectif» interactif entre les souches
bactériennes et les plantes hôtes. La vitesse de division cellulaire de ces bactéries
dépend de la richesse du milieu en composés organiques et de leur métabolisme.
Les exsudats racinaires de certaines plantes peuvent influencer la composition et
l’activité de la microflore racinaire (Rovira et Davey, 1971).
La distribution des isolats bactériens en fonction de leur origine a mis en
évidence que la plante a une influence sélective sur les populations des
Pseudomonas spp.fluorescents. Ces dernières diffèrent d’un sol cultivé à l’autre, et
d’une rhizosphère à l’autre, selon l’espèce végétale. L’association des
Pseudomonas avec les végétaux et notamment avec les plantes cultivées constitue
un aspect intéressant du point de vue écologique (Keel et al.,1996). La versatilité
nutritionnelle des Pseudomonas (Misko et Germida, 2002 ; Pacheco et al., 2003),
ainsi que le caractère ubiquiste et le pouvoir d’adaptation à des conditions
écologiques variées a été mentionnée dans de nombreux travaux (Latour et
Lemanceau, 1997; Bossis et al., 2000). D’autres espèces, sont associées aux
racines de plantes, c’est le cas de P. brassicacearum (ail) et P. thivervalensis (riz)
(Achouak et al., 2000). P. rhizosphaerae, P. lutea et P. argentinensis de la
rhizosphere de gazons (Peix et al., 2003, 2004, 2005), ou encore des phyllosphères
des plantes comme P. lurida (Behrendt et al., 2007).
La clarification de la taxonomie requiert des recherches complémentaires qui
associent des méthodes récentes phénotypiques et génotypiques plus poussées. Il a
été suggéré d’élaborer une identification basée sur une taxonomie polyphasique pour
différencier les espèces, permettant à la fois de réaliser une caractérisation
phénotypique et une caractérisation génotypique L’environnement et les facteurs
trophiques jouent un rôle majeur dans leur évolution, certains de ces facteurs sont
probablement impliqués dans le processus de spéciation de ces bactéries ubiquistes.
60
Chapitre III: Métabolites secondaires
Chapitre III : Métabolites secondaires

III.1. Introduction
Dans le sol, les Pseudomonas représentent une grande fraction de la
communauté microbienne tellurique, on les retrouve partout, particulièrement au
voisinage des systèmes racinaires des plantes. Leur capacité à coloniser les racines
et d’y maintenir une forte densité de populations est remarquable (Haas et Keel,
2003 ; Benchabane et al., 2013). Cette rhizocompétence est favorisée par leur
croissance élevée, relativement concurrentielle en temps de générations par rapport
à la plupart des autres rhizobactéries, en plus de leur capacité à métaboliser divers
et plusieurs composés formant les exsudats racinaires (Chin-A-Woeng et al., 2003 ;
Blom et al., 2011). Une telle adaptation à l’environnement rhizosphérique a rendu
certaines espèces de Pseudomonas interactives avec les plantes, en y assurant des
effets phytobénifiques, directement pour la plante en améliorant sa balance
nutritionnelle, ou indirectement en inhibant ou en éliminant les activités délétères et
phytopathogènes des agents biotiques indésirables (Fenton et al., 1992; Chin-A-
Woeng et al., 2001; Hinsinger, 2010 ; Malek, 2015). Ce genre d’activités, profitable
pour les plantes, est assuré grâce à l’arsenal de métabolites secondaires synthétisé
par ces rhizobactéries adaptées aux niches rhizosphériques.
Depuis plusieurs années de nombreux travaux ont démontré, chez le groupe
des Pseudomonas spp. fluorescents, l’implication d’une partie de ces métabolites
dans le biocontrôle des agents phytopathogènes et dans la phytostimulation de la
croissance des plantes (Defago et Haas, 1990; Lemanceau, 1992; Ton et al., 1999;
Van Loon et Glick, 2004; Gao et al., 2012; Mavrodi et al., 2012; Sharifi-Noori et al.,
2015; Hussein et Joo, 2017; Mishra et al.,2018). La complexité de cette interaction
rhizobactérienne avec les plantes, qui est surtout non symbiotique, ajoutée à la
grande diversité des métabolites impliqués ont ouvert les voies sur une recherche
pluridisciplinaire touchant, entre autres, les aspects microbiologique, biochimique,
génétique et écologique (Kim et al., 2004; Mavrodi et al., 2006 ; Charde et al., 2010;
García-Gutiérrez et al., 2012 ; Chincholkar et Thomashow, 2014 ; Naureen et al.,
2015; Mishra et Arora, 2017).
Dans ce chapitre, nous nous intéresserons à mettre en évidence la synthèse de
quelques métabolites secondaires, chez des souches de ce groupe de
62
rhizobactéries, connus par leur implication dans les effets phytobénéfiques

recherchés en biocontrôle et/ou en phytostimulation.
III.2. Matériel et Méthodes

III.2.1. Matériel biologique
A l’issue du travail réalisé initialement (cf. chapitre I), accompli sur l’isolement et
la caractérisation des souches rhizobactériennes isolées des différents biotopes, dix-
sept (17) souches de Pseudomonas fluorescents, sélectionnées sur la base de leurs
profils trophiques et moléculaire, ont été analysées quant à leur aptitude à produire
certains métabolites secondaires. A titre de souches de référence et de
comparaison, deux souches types de Pseudomonas fluorescens, ont été utilisées
dans nos travaux d’antagonisme et de caractérisation métabolique :
- Une souche de référence B545 et la phénazine-1-carboxylate [PCA], utilisée
comme standard, nous ont été offerte aimablement par le Pr Philippe
Thonnard, (Gembloux, Belgique).
- La souche CHA0, très connue par ses activités phytobénéfiques et la diversité
de ses métabolites secondaires (Pr. Kristopher Keel, Laboratoire de Biologie
microbienne, Université de Lausanne, Suisse).
III.2.2. Production de siderophores

La détection des sidérophores a été réalisé dans le milieu CAS (Chrome Azurol
S) en boite de Pétri, selon les techniques d’Alexander et Zuberer (1991). Des
cultures bactériennes de 24h sur milieu King B (King et al., 1954) ont été déposées
en spots sur la surface du milieu CAS et incubées 72h à 28 °C. L’apparition d’un halo
orangeâte sur le fond bleuté du milieu indique une synthèse de sidérophores
(Schwyn et Neilands, 1987; Sharma et Johri ,2003).
III.2.3. Production de l’acide indole acétique (AIA)
La production d’IAA a été déterminée selon la méthode standard de Bric et al.,
(1991). Une colonie isolée est étalée sur gélose Luria-Bertani enrechi du
tryptophane. La gélose a été recouverte de papier Whatman n° 1, puis incubée à
28°C/48h. Le papier est récupéré et traité avec le réactif de Salkowski (2% de FeCl3
à 0.5M dans 35% d’acide perchlorique). Après 10 à 30 min, la production d’IAA et/ou
de ses analogues se manifeste par la formation d’un halo rose à rouge autour des
colonies. Pour les souches productrices d’autres types d’indoles, la coloration est
jaune à jaune brune (Naik et Sakthivel, 2006).
63
La quantification de production de l’AIA a été réalisé sur le milieu de

Winogradsky (Holt et al., 1994) additionné de tryptophane (5g /l). Le milieu est
ensemencé par 100 µl de suspensions bactériennes et incubé 96 h à 30 °C. Selon la
méthode de Loper et scroth (1986), les cultures ont été centrifugées (5000 rpm,
20min) et un millilitre (1ml) du surnageant a été additionné de 2ml du réactif de
Salkowski (50ml d’acide perchlorique 35% et 1 ml de FeCl3 à 0,5M) et de quelque
gouttes d’acide orthophosphorique. Les densités optiques ont été mesurées à
530nm après 30 mn d’incubation. Les concentrations de l’AIA sont déterminées à
l’aide d’une courbe d’étalonnage obtenue dans un intervalle de 0 à 10-3 M d’AIA
(Fluka) (Annexe III).
III.2.4. Phosphatases
La solubilisation des phosphates a été évaluée qualitativement, en déposant
des aliquotes de 100μl (107 UFC/ml) de cultures bactériennes fraîches (24 h) sur le
milieu de Pikovskaya (Mehta et Nautiyal, 2001). Cette méthode est basée sur la
décoloration du Bleu-Bromo-Phenol (BPB) suite l’abaissement du pH du milieu par
production de phosphatases. Après incubation (96h à 28°C), la décoloration du
milieu autours des colonies est un indicateur d’une solubilisation des phosphates.
III.2.5. Pectinases
La production de pectinases a été déterminée selon la méthode décrite par
Cattelan et al., (1999) sur le milieu gélosé M9 (Miller, 1974), supplémentée de 4,8g/l
de pectine et de 1.2g d’extrait de levures. Après incubation (48h à 28°C) et
application de quelques gouttes d’HCl (73 g/l), l’apparition d’un halo claire autour des
colonies indique une réaction positive.
III.2.6. Lipases
La recherche de lipases a été effectuée par la mise en culture des isolats sur le
milieu TSA (Tryptone Soya Agar) additionné de 1% d’acide oléique. Une réaction
positive est marquée par l’apparition d’un halo clair autour des colonies après 5 à 7
jours d’incubation à 28°C (Degroot et al., 1991).
III.2.7. Protéases
L’activité protéolytique a été déterminée selon la méthode de Smibert et Krieg
(1994), par la mise en culture pendant deux jours d’incubation à 28°C des isolats sur
gélose au lait écrémé .Le développement d’un halo clair autour des colonies indique
une réaction positive (Naik et Sakthivel, 2006).
64
III.2.8. Chitinases
L’activité chitinolytique a été testée selon la méthode décrite par Reniwick et al.,
(1991) sur gélose à la chitine. La formation d’halos clairs autour des colonies après 5
jours d’incubation à 30°C indique une chitinase positive (Naik et Sakthivel, 2006).
III.2.9. Cellulases
La production de cellulases a été déterminée selon la méthode de Cattelan et
al., (1999) sur la gélose M9 (Miller, 1974) supplémentée de 10 g de cellulose et
de1.2 g d’extrait de levures. Les isolats ont été étalés puis incubés (8 jours à 28°C) ;
le développement d’un halo clair autour des colonies indique une réaction positive
(Verma et al., 2007).
III.2.10. Amylases
Des cultures fraîches (24 h) sont déposées sur gélose nutritive additionnée
d’amidon par ensemencement par trait au centre de la boite de Pétri. Après
incubation à 30°C pendant 48h, une solution de lugol préalablement préparée sera
dispersée sur toute la surface du milieu. La présence de l’amidon dans le milieu
donnera une couleur bleue noirâtre, signifiant l’absence d’activité amylasique. La
présence d’une activité amylolytique est indiquée par la formation d’une zone claire
(halo) autour de la crème bactérienne (Vinoth Raj et al., 2009).
III.2.11. Production de NH3
Le test qualitatif, de production d’ammoniaque, a été réalisé selon la méthode
de Capuccino et Sherman (1992). Il consiste à inoculer 100 μl de la suspension
bactérienne dans 10 ml d’eau peptonée (EP) (Cheminova). Après incubation (30 °C,
96h), 500 μl du réactif de Nessler (Prolabo) ont été ajoutés, le développement d’une
couleur jaune ou orange indique la production de NH3 par les souches testées.
III.2.12. Production de cyanure d’hydrogène (HCN)
La production de cyanure d’hydrogène (HCN) a été recherchée par la technique
de Bakker et Schippers (1987). Le milieu TSA (Tryptone Soya Agar) supplémenté
avec 4,4 g/l de glycine a été ensemencé à partir d’une culture de Pseudomonas spp
fluorescents âgée de 24h.Un papier Whatman n°1 (Ø= 8cm) imprégné d’une solution
de couleur jaune (5% d’acide picrique et 2% de carbonate de sodium) a été déposé
aseptiquement sur la face interne du couvercle de la boite de Pétri et scellée ensuite
par le para film. Après incubation à 28 °C pendant 4 jours, la production d’HCN se
traduit par le virage du papier du jaune à l’orange. Le cyanide d’hydrogène réagit en
65
effet sur l'acide picrique pour donner une matière colorante (l’acide isopurpurique)
qui exprime le virage de la couleur.
III.2.13. Production de Phénazines (PHZ)
III.2.13.1. Sélection de souches antagonistes in vitro
Avant d’entamer la procédure de rechercher des souches, éventuellement
productrices de phénazines, nous avons ciblé les souches présentant une large
activité antagoniste (antimicrobienne) in vitro vis-à-vis d’une collection d’agents
phytopathogènes (laboratoire de Phytopathologie, Département des Biotechnologies,
Université de Blida1).
Les 17 souches ont été testées pour leurs activités antibactériennes vis-à-vis de
quatre isolats bactériens : Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganens,
Agrobacterium tumefaciens et Erwinia carotovora. Les activités antifongiques ont été
testées en confrontation avec neuf isolats : Rhodotorula mucilaginosa, Geotriticum
sp, Gaeumannomyces graminis var tritici, Pythium ultimum, Eutypia lata, Botrytis
cinerea, Fusarium oxysporum f sp lini, Coleosporium sp et Fomitiporia sp. Les essais
ont été répétés trois fois pour chaque interaction.
Les tests antifongiques ont été réalisés selon la méthode décrite par Vincent et
al., (1991). Les souches de Pseudomonas, âgées de 24 h, sont étalées en lignes,
distantes des 1,5 cm des deux bords de la boite de Pétri contenant le milieu KB
(Annexe I). Un disque fongique (φ = 6 mm), prélevé d’une culture âgée de 7 jours, est
déposé au centre de la boite et laissée en incubation à 28 °C. Les résultats sont
notés lorsque la croissance mycélienne, dans les boites témoins (champignons
seuls, sans la présence des isolats de Pseudomonas), atteint les points d’inoculation
des souches bactériennes, permettant de mesurer les zones d’inhibition (Hariprasad
et al., 2009).
Pour les interactions avec les bactéries phytopathogènes, des disques de
papier wathman (n°3) imprégnés de la crème de souches de Pseudomonas, âgée de
24 h, ont été déposés à la surface du milieu de culture, préalablement ensemencé
par les souches phytopathogènes. Après incubation à 25 °C, lorsque les témoins
(bactéries phytopathogènes sans la présence des isolats de Pseudomonas) sont à
leur maximum de croissance ; s’il y développement d’antagonisme, la notation des
zones d’inhibition est mesurée.
66
III.2.13.2. Synthèse de phénazines in vitro

Seules les souches de Pseudomonas, parmi les 17 testés précédemment (cf.
III.2.13.1), ayant montrées des activités antimicrobiennes, ont subi le test de
production in vitro de phénazines ou de leurs analogues. Ce test a été réalisé selon
la méthode de Thomashow et Weller (1988), dans le milieu NBY (Nutrient Broth
Yeast extract) additionné de glucose (2%), ensemencé avec une culture de 24h et
incubé pendant 48h à 25°C. Après examen des cultures sous UV (356 nm), le
développement de colonies bactériennes pigmentées, avec des halos sombres
noirâtres, est révélateur d’une activité phénazinique.
III.2.13.3. Activité antibiotique
Le pouvoir antagoniste des souches, révélées positives en production de
phénazines, a été étudié in vitro de manière plus détaillée par la technique des stries
croisées (Waksman, 1945 ; Williston et al., 1947). Celle-ci est une technique simple
et pratique, largement utilisée pour le criblage de souches microbiennes présentant
des activités antibiotiques. Les tests ont été réalisés sur quatre milieux de culture :
- Le milieu King B ou « KB » (King et al., 1954).

- Le milieu gélose nutritive ou « GN » (Gardan et Luisetti, 1981).
- Le milieu Potato Dextrose Agar ou « PDA » (Jonhston et Booth, 1982).
- Le milieu ISP2 « Internatonal Streptomyces Project » (Shrirling et Gottieb,
1966).
Sur chaque milieu, en trois répétitions, les souches de Pseudomonas ont été
ensemencées en un seul trait à la surface des milieux solides et en bordure de la
boite de Pétri et incubées à 28 °C. Après 24 h, les microorganismes à tester
(Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus et Fusarium oxysporum
f.sp albedenis) ont été ensemencés en traits perpendiculaires, au trait de la culture
précédemment réalisé, et incubés à la même température pendant 2 à 5 jours. A titre
de témoins, les souches tests ont été cultivées, selon la même procédure, sans la
présence de souches de Pseudomonas pour évaluer leur croissance optimale. Ainsi,
nous mesurons les zones d’inhibition pour les souches antagonistes, suspectées de
synthèse de phénazines.
67
III.2.13.4. Extraction des composés (phénaziniques)

Les souches ayant montrées une activité antimicrobienne sont sélectionnées,
pour en extraire, éventuellement, les composés à effet antibiotique selon le protocole
suivant (Figure III.1).
Préparation de culture de production
Centrifugation
Culot cellulaire Surnageant de culture
Extraction avec 3 solvants organiques

Écartée de polarité différente (acétate d’éthyle ,
dichlorométhane et l’hexane)
Phase organique Phase aqueuse
Concentration au rotavapeur (40 C°)

Écartée
Antibiographie
Choix du meilleur solvant d'extraction
Figure III.1 : Protocole de production et d'extraction des phénazines
Pour la préparation des cultures bactériennes, chaque souche a été cultivée

dans 100 ml de milieu King B à l’état liquide ensemencés avec 3 ml d’une préculture
de 24 h. Après incubation de 48 h à 25 °C, sous agitation continue (150 rpm), les
suspensions bactériennes sont centrifugées (5000 tour, 15 min à la température
ambiante) pour séparer les culots des surnageants.
Des tests préliminaires ont été effectués pour optimiser l’extraction des
composés antibiotiques à partir du surnageant de culture. A cet effet, trois solvants
68
de différentes polarités ont été testés : acétate d’éthyle, dichlorométhane et l’hexane.

L’extraction a été effectuée dans une ampoule à décanter avec un mélange (1/2
solvant(s), 1/2 surnageant) de culture, puis agité doucement quelques secondes
avec dégazage de temps à autre. Après agitation et décantation, les phases
organiques ont été récupérées séparément, filtrées sur sulfate de sodium anhydre
afin d’éliminer toute trace d’eau, puis évaporées sous vide à 40 °C à l’aide d’un
évaporateur rotatif (Buchi heating bath B-490). Les extraits secs obtenus ont été
récupérés dans 1 ml de méthanol avant d’être soumis à une antibiographie, afin de
déterminer le meilleur solvant d’extraction.
III.2.13.5. Tests Antibiographie

Les extraits obtenus, à partir de surnageants des cultures des souches
productrices de phénazines, plus la souche de référence (CHA0), ont été testés
contre les microorganismes tests : Bacillus subtilis, Escherichia coli, Fusarium
oxysporum et Staphylococcus aureus.
Des disques (φ = 6 mm) de papier wathman ont été imprégnés avec 30 µl
d’extrait organique, puis séchés à l’aide d’un séchoir à froid. Les disques ont été
ensuite stérilisés sous UV (254 nm) durant 30 min avant d’être déposés
aseptiquement à la surface du milieu Muller Hinton, préalablement ensemencé par
les microorganismes tests. Les boites sont d’abord déposées à 4°C pendant 2 h,
pour une meilleure diffusion des éventuels composés antibiotiques et ensuite
incubées 24 h à 28 °C.
La lecture des résultats consiste à déterminer le diamètre des zones
d’inhibition autour des disques. Le solvant permettant d’obtenir le diamètre
d’inhibition le plus élevé est considéré comme le meilleur solvant d’extraction.
III.2.13.6. Analyse des composés (phénaziniques)

Il est déjà reconnu que chez les Pseudomonas synthétisent une mixture de
composés phénaziniques (Tomashow et al., 1990), donc Il semble impératif
d’essayer de fractionner l’extrait brut avant l’étape d’identification. La purification des
substances actives des souches de Pseudomonas a été réalisée par
chromatographie en couches minces (CCM), alors que l’identification s’effectue par
chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC).
69
A. Chromatographie en couche mince : Selon les descriptions de Betina (1973), la

séparation des composés à activité antibiotique, à partir des extraits de surnageant
de chaque souche de Pseudomonas testée, a été réalisée par chromatographie en
couche mince sur gel de silice (silcagel : 20×20 cm, 0,25 mm d’épaisseur). Les
extraits des souches productrices de phénazines et le témoin (standard) étant
l’acide phénazine-1-carboxylique (PCA),ont été déposés sous forme de spots (150
µl) à l’aide d’un capillaire à des points repères au bord inférieur de la plaque, suivi de
séchage à l’aide d’un séchoir. Deux associations de solvants ont été appliquées : le
solvant AM (acétate d’éthyle-méthanol : 100/15) et le solvant CA (chloroforme-
acétone : 9/1). Les plaques ont été placées dans des cuves en position verticale. La
révélation chimique a été réalisée avec le formaldéhyde-H2SO4 (révélateur de
composés aromatiques polycycliques). Après pulvérisation des plaques avec le
révélateur, les résultats ont été lus à chaud (5 min à 100°C) et le rapport frontal (Rf)
a été calculé. Le Rf est le rapport de la distance entre le dépôt et la tache active sur
la distance séparant le dépôt du front du solvant.
B. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) : Les spots, obtenus
précédemment, ont été grattés et élués dans du méthanol sous agitation (100 rpm, 2
h à la température ambiante). Après filtration du mélange (silice + méthanol), le filtrat
limpide a été évaporé à sec et conservé au congélateur pour analyse ultérieure par
HPLC. Les extraits semi-purifiés ont été analysés par HPLC. Les essais ont été
réalisés en phase inverse ; la phase stationnaire de la colonne C18 est une silice
greffée avec des groupements organiques apolaires et la phase mobile est polaire. Il
a été utilisé le mélange d’eau distillée et de méthanol (80-20%), avec un gradient
continu. Le débit du solvant est fixé à 1 ml/min et la longueur d’onde de détection est
de 220 nm. Avant l’injection des échantillons, la phase stationnaire (colonne) est
conditionnée et équilibrée (conditions initiales) pendant 10 min. Lorsque la colonne
est stabilisée, 20µl de l’extrait ultra filtré (filtre de 0,45 µl) est injecté à l’aide d’une
seringue de 1 ml. Les résultats obtenus sont donné sous forme de chromatogramme.
70
III.3 Résultats
III.3.1. Métabolites secondaires
A partir des tests de production de métabolites secondaires, nous avons
constaté que les 17 souches bactériennes de Pseudomonas fluorescentes
synthétisent des siderophores, produisent l’ammoniaque et les chitinases et qu’elles
ne produisent pas d'enzymes hydrolytiques (pectinases, cellulases et lipases)
(Tableau III.1).
Tableau III.1 : Tests de production de métabolites secondaires

Sid HCN Phen AIA Amm Phos Prot Chit Cellu Pect Lip Amy
17 16 3 6 17 16 10 17 0 0 0 13
Sid : Siderophore; HCN : Acide cyanidrique; Phen : Phenazne ; AIA : Acide indole acétique ; Ammo :
Ammoniac ; Phos : Phosphatase Prot : Protease; Chit : Chitinase ; Cellu : Cellulase ; Pect : Pectinase; Lip:
lipase ; Amy : Amylase .
Seule une souche est cyanogénèse négative, et 16 souches sont phosphatases

positives. Une dizaine de souches sont aptes à synthétiser des enzymes
protéolytiques et 13 souches sont amylase positive. La production de l’acide indole-
3-acétique (AIA) a été révélée chez six souches seulement, alors que l’activité
phénazinique n’est positive qu’avec trois souches parmi les 17 testées (Tableau
III.1).
III.3.1.1. Synthèse de sidérophores

Les 17 souches, déjà sélectionnées sur la base de la synthèse d’un pigment
fluorescent diffusible sur le milieu KB, ont montré un halo orangeâtre net sur le milieu
O-CAS indiquant la production de sidérophores.
III.3.1.2. Cyanogènese
Pendant les premières 24 heures, un léger virage du papier filtre imprégné
d’acide picrique a été observé chez la plupart des souches, pour devenir plus
apparent après 36 h et net entre 48 h et 72 h, traduisant une intensification de la
production d’HCN. La production était faible chez avec six souches et forte avec dix
souches. Ces dernières semblent les plus performantes en production de l’HCN, en
virant la couleur du papier vers l’orangée foncée
(Tableau III.2).
71
Tableau III.2 : Production de cyanide d’hydrogène
Les souches de Pseudomonas testées Production

d’HCN
BB6,BB10,BT3,BT7,BS4,F8,F19,F23,PI9,PI11 ++
BB9, F20, F21, F27, F48, GP4 +
BB2 -
B445, B447, CHAO* ++
* : Souches de référence, ++ : Fortement productrice ; + : Faiblement productrice ;

- : Aucune production
III.3.1.3. Production de l’acide indole acétique (AIA)

La production qualitative de l’acide indole acétique et/ou ses analogues a été
observée chez la plu part des isolats testés. Toutefois six (6) de ces derniers (BB2,
BB10, F8, F21, F48, GP4) ont développés une coloration rose à rouge après 10 à 30
min d’addition du réactif révélateur. Pour les souches productrices d’autres types
d’indoles, la coloration est jaune à jaune brune dont l’intensité varie d’un isolat à un
autre. La quantité de l’AIA est déterminée, d’après la courbe d’étalonnage
(Annexe III) ; le taux le plus important a été enregistré chez la souche F48 (18,3 µg
/ml) (Tableau III.3).
72
Tableau III.3: Production qualitative et quantitative d’Acide Indole Acétique (AIA)
Souches Production Production
Qualitative Quantitative ¼g/ml
F8 ++ 3,8
F19 (+)* Nd
F20 (+)* Nd
F21 + 1,8
F23 (+)* Nd
F27 (+) Nd
F48 +++ 18,3
BB2 +++ 7,6
BB6 (+)* Nd
BB9 (+)* Nd
BB10 +++ 5,9
Bs4 (+)* Nd
Gp4 + 1,7
PI9 (+) Nd
PI11 (+)* Nd
BT3 (+) Nd
BT7 - Nd
(- ) : absence de coloration rose, ( + ) : légèrement rose, (++ ) : rose,
(+++) : rose virant vers le rouge, Nd : non détectable (+)* : Analogue d’AIA
III.3.1.4.Production d’enzymes
Les tests enzymatiques qualitatifs ont permis de démontrer la production ou
non-des enzymes extracellulaires (phosphatases, pectinases, lipases) et les
enzymes dégradants les parois cellulaires.
Phosphatases: Le test de solubilisation du phosphate indique que 94 ,11% des
souches testées synthétisent la phosphatase qui solubilise le phosphore inorganique
sous forme bicalcique. La décoloration du milieu de culture et/ou le développement
d’un halo clair autour des spots, n’est devenu net qu’après 96h
d’incubation. L’intensité de la couleur du milieu de culture et le diamètre des halos
sont variable selon les souches, dénotant une variabilité dans le pouvoir de
solubilisation du phosphore selon les isolats testés.
Pectinases: La production de pectinases a été révélée par l’inondation par
quelques gouttes de HCL des cultures bactériennes ensemencées sur le milieu M9
additionné de 4,8 g/l de pectine et incubées pendant 2 jours. Les résultats montrent
qu’aucune réaction positive n’est observée marquée par l’absence de formation
d’halos autour des spots.
73
Lipases: Une réaction négative pour l’ensemble des souches testées est
marquée lors de la mise en évidence de la production de lipases, dans le milieu TSA
additionné de 1% d’acide oléique, après 7 jours d’incubation à 28 °C.
Enzymes dégradant les parois cellulaires (CWDE) : Relativement aux
enzymes citées précédemment, l’activité protéolytique était plus importante et
positive avec 12 souches bactériennes en dégradant les protéines par production de
protéases. Le meilleur résultat était noté chez la souche BS4 (3 cm). L’activité
chitinolytique est retrouvée positive chez la totalité des souches étudiées, qui sont
cellulase négative.
III.3.1.5.Production d’ammoniaque
La production de l’ammoniaque est révélée chez toutes les bactéries. Le
résultat positif se traduit par le virage de la couleur du milieu vers le jaune ou orange.
La souche BB6 montre une production d’ammoniaque très importante (orange ++).
III.3.1.6. Production de composés phénaziniques

III.3.1.6.1. Sélection des souches antagonistes in vitro
. Les résultats des tests de détection de l’activité antagoniste in vitro, réalisé par
les 17 souches de Pseudomonas fluorescents vis-à-vis de neuf isolats fongiques et 4
isolats bactériens, ont montré des activités antagonistes avec des taux variables. La
totalité souches (100 %) ont montré des activités antagonistes au moins à l’encontre
d’un agent phytopathogène fongique et bactérien. toute les souches ont provoqué
l’inhibition de la croissance de plus de 50% des isolats fongiques et bactériens, parmi
eux neuf souches ont montré l’inhibition de la croissance de la totalité des isolats
phytopathogènes testées. Les 8 autres souches actives ont montré des activités
seulement antifongiques.
Le degré d’antagonisme varie selon que les interactions soient avec les
bactéries ou les champignons. D’après nos résultats, les souches de Pseudomonas
ont noté des taux d’inhibition plus élevé vis-à-vis des isolats fongiques par rapport
aux bactéries phytopathogènes. L’effet inhibiteur le plus élevé est noté par la souche
BB9 vis-à-vis de toutes les espèces cryptogamiques et la souche F21 vis-à-vis de
des bactéries phytopathogènes comparativement avec la souche de référence
CHAO (Tableau III.4).
74
Tableau III.4 : Activités antagonistes in vitro
Isolats fongiques phytopathogènes
E32 B112 Coll GEO F4 GGT F8 Pyt Rhod
Souches
BT3 4 4 4 4 2 3 4 3 3
BB10 4 4 4 2 2 3 4 2 2
F48 4 4 4 4 4 4 4 1 2
PI9 4 4 4 3 4 4 4 4 2
BB9 4 4 4 4 4 4 4 4 4
F21 4 3 4 3 4 2 4 2 4
BB6 3 4 4 4 4 4 1 3 4
BS4 3 3 4 3 2 4 3 3 3
F20 2 4 4 3 3 2 2 3 2
CHAO* 3 3 4 3 2 3 4 4 2
GGT : Gaymanomyces graminis var tritici ,Coll : Colleosporium sp, Rhod: Rhodotorula mucilaginosa
GEO: Geotriticum sp, Pyt: Pythium ultimum, F4: Fusarium oxysporum f sp lini , F8 :Fomitiporia sp,
E32 :Eutypia lata, B112 : Botrytis cinerea . * : souche de référence (Pseudomonas fluorescens
CHA0).
0 (X = 0, Absence d’inhibition), 1 X f 2 mm , 2 2 mm < X f 10 mm, 3 10 mm < X f 15 mm, 4
X > 15 mm (X = zone d'inhibition) ; Gras : souches phénazines (+) in vitro.
III.3.1.6.2. Synthèse des phénazines in vitro

Les essais de la production des phénazines in vitro ont montré que parmi 17
souches antagonistes, trois souches (BB9, PI9, F21) ont révélé des zones sombres
autour des colonies indiquant la synthétise des composés phénaziniques. Nous
rappelons que ces derniers ont manifesté un pouvoir antagoniste important vis-à-vis
des souches pathogènes fongiques et bactériennes avec un taux allant de 62%
enregistré par la souche F21 vis-à-vis de l’isolat Colleosporium sp ,66% par BB9 vis-
à-vis l’isolat Geotriticum sp et 70% par la souche PI9 vis-à-vis de l’isolat Botrytis
cinerea (Annexe III). D’après les résultats obtenus les souches PI9, BB9, F21 sont
les souches suspectées productrice des composés phénaziniques, en plus de deux
souches de référence CHAO et B454.
75
Tableau III.5 : Activités antagonistes in vitro

Isolats bactériens phytopathogènes
Rhalstonia Erwinia Agrobacterium Clavibacter
souches solanacerum carotovora tumefaciens michiganens
BT3 2 3 3 2
BB10 2 3 2 2
F48 2 3 3 2
F21 3 3 3 2
PI9 3 3 2 3
BB9 3 3 2 2
F20 2 3 2 3
BB6 2 3 3 3
BS4 3 2 3 3
CHAO* 2 2 3 2
(X = zone d'inhibition) : (X = 0, Absence d’inhibition), 1 : X ≤ 2 mm , 2 : 2 mm < X ≤ 10 mm,
3 : 10 mm < X ≤ 15 mm, 4 : X > 15 mm.
Gras : souches phénazines (+) in vitro * : souche de référence (Pseudomonas fluorescens CHA0).
III.3.1.6.3. Activités antibiotiques

D’après les résultats des différentes souches de Pseudomonas sur chaque
milieu de culture, l’activité antimicrobienne des souches PI9, BB9, F21 se
manifestent sur la majorité des germes testés. Cependant, leur intensité varie selon
les microorganismes cibles et selon les milieux de culture (Tableau III.6).
Sur le milieu GN, de fortes inhibitions par les souches PI9, F21 vis-à-vis de
Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus ont été notées, avec des zones d’inhibition
moyennes, respectivement, de 16 mm et de 8 mm contre Escherichia coli et
Fusarium oxysporum f.sp. albedenis.
Sur le milieu King B, le diamètre de la zone d’inhibition le plus élevé (27 mm)
est enregistré avec la souche CHAO vis-à-vis de Fusarium oxysporum f.sp.
albedenis. La souche PI9 vient en deuxième position (26 mm), alors que le plus
faible diamètre (2 mm) a été noté avec les souches BB9 et CHAO vis-à-vis de
Staphylococcus aureus. Dans ce milieu, les activités inhibitrices sont meilleures à
l’encontre de FOA, BS et EC et un degré moindre contre SA.
Concernant le milieu ISP2, l’activité antimicrobienne apparait faible vis-à-vis des
différents pathogènes testés, avec des zones d’inhibition de l’ordre de 1 à 12 mm.
Cette dernière a été enregistrée par CHAO vis-à-vis de Fusarium oxysporum f.sp.
albedenis.
76
Tableau III.6: Activités antagonistes exprimées en zones d’inhibition (mm).

Gélose nutritive Milieu King B International Potato Dextrose
GN Streptomyces Agar
KB Project ISP2
PDA
FOA
FOA
FOA
FOA
Souches
BS
BS
BS
EC
SA
EC
SA
EC
SA
BS
EC
SA
PI9 24 16 5 8 26 15 6 6 5 10 5 4 7* 5 4 8*
F21 20 15 13 4 16 14 14 5 1 5 15* 4 0 4 3 5*
BB9 16 10 9 1 18 12 8 2 3 4 5 8* 0 5 4 0
B454 18 15 5 3 24 10 9 4 2 10 4 1 3 5 8 0
CHAO 22 13 5 5 27 14 5 2 12 9 4 1 1 6 6 1
*: Le microorganisme subit seulement un ralentissement de la croissance, BS: Bacillus subtilis,

EC: Escherichia coli, FOA: Fusarium oxysporum f.sp. albedenis, SA: Staphylococcus aureus.
En comparant les résultats de diamètre des zones d’inhibition par rapport aux
milieux utilisés (GN, KB, ISP2 et PDA), nous remarquons que les diamètres sont plus
élevés sur le milieu KB.
III.3.1.6.4. Extraction des composés à effet antibiotique

L’extraction des composés à effet antibiotique a été effectuée à partir des
souches PI9, BB9, F21 dans le milieu de culture King B qui a donné de meilleurs
résultats de point de vue activité biologique. Les extraits obtenus ont été testés par
antibiographie, afin de déterminer le meilleur solvant d’extraction.
III.3.1.6.4.1. Antibiographie
La méthode de diffusion des disques nous a permis de mettre en évidence le
meilleur solvant d’extraction. Cette étude est basée sur la mesure de diamètre des
halos d’inhibition de l’extrait obtenu (Annexe III). L’extrait à l’acétate d’éthyle s’est
montré efficace contre Bacillus subtilis et Foa pour les souches PI9, BB9, F21 et la
CHAO. La zone d’inhibition enregistrée s’étend de 14 mm à 19 mm contre Bacillus
subtilis et de 18 mm à 28 mm contre Foa. Pour le dichlorométhane les zones
d’inhibitions s’étendent de 11 mm à 17 mm contre Bacillus et de 8 mm à 10 mm
contre E. coli et de 12 à 18 mm contre Foa.
77
Pour l’hexane les zones d’inhibition s’étendent de 6 à 8 mm. La zone

d’inhibition enregistrée contre Staphylococcus aureus s’étend de 6 mm à 9 mm pour
toutes les souches de Pseudomonas et dans tous les solvants utilisés.
Le métabolite extrait au moyen de l’acétate d’éthyle a empêché la croissance
de la plupart des agents pathogènes testés. Le deuxième solvant était le
dichlorométhane suivi par l’hexane. Selon nos résultats, le meilleur solvant
d’extraction est l’acétate d’éthyle. Les disques témoins, imbibés par les solvants
utilisés lors de l’extraction et séchés dans les mêmes conditions, n’ont révélé aucune
activité antimicrobienne.
III.3.1.6.4.2. Chromatographie en couche mince (CCM)

La chromatographie en couche mince a été établie dont le but de la purification.
Les extraits obtenus par le meilleur solvant d’extraction provenant du surnageant de
la culture de milieu King B ont été déposés au bord inférieur de la plaque, après
migration du solvant (Figure.III.2).
Dans la phase mobile acétate d’éthyle-méthanol (AM), six taches ont été
détectées : (A) pour le témoin standard ; (B) pour la souche PI9 ; deux taches (C et
D) pour la souche BB9 et encore deux taches (E et F) pour la souche F21. (Figure
III.2).
A B C E
D F
Témoin Extrait de PI9
standard
Extrait BB9 Extrait F21
Figure III.2: Bioautographie des extraits des surnageants de cultures des souches PI9,
BB9 et F21 sur AM après révélation
78
Pour la phase mobile chloroforme-acétone (CA), le nombre des taches

détectées sont : une tache (A1) chez le témoin ; une tache (B2) chez PI9 ; une tache
(C1) chez BB9 et une autre tâche chez (E1) chez F21 (Figure III.3).
La phase mobile AM a permis d’obtenir une bonne séparation des différents
composés contenus dans les extraits de la souche PI9, BB9 et F21, par rapport à la
phase mobile CA où la séparation n’a pu être obtenue.
C1 E1
A1 B1
Témoin
PI9 BB9 F21
Standard
Figure III.3 : Bioautographie des extraits des surnageants de culture des souches PI9,
BB9, F21 sur CA après révélation
Les résultats ont permis de retenir le premier mélange AM comme phase
mobile idéale pour la séparation de différentes fractions des extraits des trois
souches. Après la révélation chimique, des composés aromatiques polycycliques, les
extraits de surnageant de chaque culture, sur milieu King B, ont révélé des taches
actives colorées sur AM.
- La tâche du témoin correspond au composé A (Rf = 0,90).
- Les composés B (PI9) et E (F21) ont montré une ressemblance avec la
molécule standard l’acide phénazine-1-carboxylique (Rf = 0,90).
- Le composé C a un Rapport frontal (Rf : 0,87)) différent de celui du témoin,
suggérant qu’il s’agit d’un autre type de composés phénaziniques.
III.3.1.6.4.3. Résultats de l’analyse par HPLC

Les composés C.B.E et le composé de la souche de référence CHAO ont été
purifiés par chromatographie sur couche mince (CCM). L’identification des
79
phénazines a été réalisée en comparaison avec l’élution du standard (PCA) dans les
mêmes conditions expérimentales. Les différents chromatogrammes (HPLC) sont
illustrés sur les figures suivantes :
Su
Figure III.4 : Profil d’HPLC de l’étalon
Figure III.5 : Profil HPLC après injection de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l’isolat F21
SS
u
u
R
R
FF
AA
CC
E
Temps de rétention (T R)
Figure III.6 : Profil d’HPLC après injection de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l’isolat BB9
80
S
u
Figure III.7 : Profil d’HPLC après injection de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l’isolat PI9.
S
u
Figure III.8 : Profil d’HPLC après injection de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l’isolat
CHAO
La similarité entre le temps de rétention des extraits des souches PI9 (Figure
III.7) et F21 (Figure III.5) avec le composé purifié de la PCA et la superposition de
leur profil chromatographique avec celui de la souche de référence CHAO, révèlent
la présence de l’acide-1-carboxilique (PCA) chez ces isolats, en plus de la souche de
référence (Figure III.8). Cependant le chromatogramme de l’isolat BB9 est différent
de celui du témoin (standard). Le temps de rétention de l’acide-1-carboxylique est
81
localisé à 3,85 min, alors que celui du composé visible sur le chromatogramme est
élué à 9,7 min (Figure III. 6).
III.3.Discussion
Nos résultats indiquent que toutes les souches, déjà sélectionnées sur la base
de la synthèse d’un pigment fluorescent diffusible sur le milieu KB, synthétisent des
sidérophores. Les Pseudomonas spp. fluorescents synthétisent de nombreux
sidérophores, chélateurs du fer ionique, qui exhibent des effets fongistatique et
bactériostatique, tels que les pyoverdines, les pseudobactines, les pyochelines et
l’acide salicylique (Bagg et Neilands, 1987). Les sidérophores ne sont produits qu’en
conditions de carence en fer (Meyer et al., 1995; Meyer, 2000; Chu et al., 2010).
Chez des souches de P. fluorescens et de P. syringae, la fluorescence,
représentative des sidérophores, est réduite en présence de sels ferreux. A
l’exception des lactobacilles, la quasi-totalité des microorganismes exige la présence
d’ions de fer assimilables pour leur croissance (Gross, 1990). Le fer joue un rôle
crucial dans la plupart des enzymes d’oxydoréduction intervenant, dans la chaîne de
transport d’électrons du métabolisme intermédiaire. Malgré son abondance dans la
nature, sa biodisponibilité reste extrêmement faible, les seuils de concentration
ferriques à pH 7.0 ne dépassent pas 10-18 M. Pour cette raison, la majorité des
organismes doivent réagir à ce problème, pour la capture et l’assimilation de fer de
leur environnement (Dreschsel et Winkelmann 1997). Les bactéries ont alors
élaborées des systèmes de capture complexes, via la sécrétion de sidérophores et la
capture des complexes ferri-sidérophores.
Les sidérophores sont parmi les composés des rhizobactéries qui ont un effet
de stimulation de la croissance des plantes (PGPR) (O’sullivan et O’gara, 1992;
Pieterse et Van Loon, 1999 ; Trapet et al., 2016). Il a été démontré que les PGPRs
améliorent la croissance végétale en produisant des sidérophores, extracellulaires
très efficaces, qui permettent de lutter contre plusieurs maladies des plantes en
privant l'agent pathogène de la nutrition en fer, entraînant ainsi une augmentation du
rendement des cultures. En plus du fer, les sidérophores peuvent également former
des complexes stables avec d’autres métaux préoccupants pour l’environnement,
tels que l’Al, Cd, Cu, Ga, In, Pb et Zn (Saharan et Nehra, 2011). Ces mêmes auteurs
ont montré que la présence de métaux lourds induit la production de sidérophores
82
par ces rhizobactéries (Kumar et Sharma ,2017; Patil et al., 2017). Pseudomonas
putida et Pseudomonas fluorescens ont une capacité remarquable d’utiliser un large
spectre de pyoverdines secrétés par d’autres micro-organismes, tandis que leurs
pyoverdines ne peuvent pas être utilisés par ces derniers (Adam et al., 2017;
Beneduzi et al., 2012 ; David et al., 2018).
Six souches seulement synthétisent l’AIA avec des quantités assez variables,
allant de 1,7 µg/ml à 18,3 µg/ml. Cette fluctuation est probablement due à la
variabilité génétique entre les souches. L’absence de production chez certaines
souches serait liée donc à la perte de l’information génétique et du mécanisme
physiologique de la biosynthèse de l’AIA (Mishra et al., 2010; Rabhi, 2012). La
synthèse d’AIA par Pseudomonas est bénéfique pour la croissance et le
développement végétal (Sandhya et al., 2009). Environ 80 % des bactéries
rhizosphériques sont capables de produire de l’AIA (Dastager et al., 2010). L’AIA
joue un rôle très important dans la division cellulaire, l’élongation des racines, la
prolifération des poils absorbants et dans les mécanismes de tolérance de la plante
aux stress (Sandhya et al., 2010).
La biosynthèse de l’AIA est largement répandue chez les Pseudomonas spp.
fluorescents, d'une manière prédominante à partir du tryptophane par la voie de
l'acide indole-3-pyruvique (Oberhansli et al., 1991; Forlani et al., 1995; Persello-
Cartieaux et al., 2003). Le L-tryptophane est considéré comme le précurseur, du fait
que son adjonction est nécessaire à la production de cette hormone. Les exsudats
racinaires sont une source naturelle de L-tryptophane pour la microflore de la
rhizosphère (Dastager et al., 2010; David et al., 2018). La production de ce composé
est variable selon les souches et les différentes espèces, ainsi que les conditions de
culture des plantes, leur phase de croissance et de la disponibilité de substrats
nutritifs (Miraza et al., 2001).
L’intervalle de concentrations dans lequel l’AIA exogène à la plante peut avoir
des effets bénéfiques, sur la croissance et le développement racinaire, est
relativement étroit. Des concentrations élevées, de l’ordre de micromoles, ont
provoqué des effets négatifs ; Il a été démontré avec la souche de Pseudomonas
CHA0 que l’élévation de la concentration en AIA exogène n’implique pas une
meilleure efficacité dans l’antagonisme. En terme d’activité de biocontrôle, l’AIA
semble être de moindre importance par rapport aux autres métabolites secondaires,
83
tels que le 2,4 diacetylphloroglucinol, la pyolutéorine, le cyanide d’hydrogène et les

phénazines (Voisard et al., 1989; Benchabane, 2005).
L’amélioration de l’alimentation minérale chez les plantes en phosphore a été la
première hypothèse proposée pour expliquer l’effet bénéfique enregistré à la suite de
leur bactérisation (Lemanceau., 1992). Même dans des sols qui en sont riches, le
phosphore se trouve sous une forme insoluble : oxydes de fer et d’aluminium dans
les sols acides, et oxydes de calcium dans les sols basiques, et seulement une faible
proportion (0.1 %) est assimilable par les plantes (Stevenson et Cole, 1999). En plus
les ¾ du phosphore apporté par les fertilisants appliqués au sol se précipitent en des
formes insolubles, augmentant ainsi le besoin des cultures en cet élément
(Goldstein, 1986 ; Khan et al., 2010; Gupta et al.,2015). Les Pseudomonas spp.
fluorescents, augmenteraient la concentration en phosphore soluble, soit par
minéralisation des phosphates organiques, grâce à des phosphatases, soit par
solubilisation des phosphates inorganiques, sous l’effet d’acides (Krasilnikov, 1961).
Le test de la solubilisation du phosphore, in vitro, a révélé que nos souches de
Pseudomonas, l’exception de BB6, ont la capacité de solubiliser le phosphore. La
solubilisation notée, indiquée par la formation d’un halo de solubilisation ou par
changement de la couleur du milieu de culture, n’est pas due à une production
d’acides organiques, mais plutôt à une production d’enzymes (phosphatases). Les
résultats obtenus au cours de cette expérimentation concordent avec ceux ayant mis
en évidence la capacité des bactéries rhizosphériques à solubiliser les phosphates
(Rodriguez et Fraga, 1999 ; Verma et al., 2001).
Le parasitisme et/ou la lyse des champignons par les bactéries de la
rhizosphère sont facilités par la production d’enzymes hydrolytiques, qui dégradent
les parois des cellules fongiques (CWDE : cell wall dedgrading enzymes). La
production in vitro de chitinases a été retrouvée chez les dix-sept souches testées.
Les chitinases, sont des enzymes hydrolytiques d’importance primordiale, car la
chitine est le constituant majeure de la paroi cellulaire des champignons
phytopathogènes (Kishore et al., 2005). Plusieurs études ont relaté une corrélation
entre la production d’enzymes chitinolytiques par des bactéries de genre
Pseudomonas sp et leur pouvoir inhibiteur de la croissance de divers champignons
telluriques, tel que Fusarium oxysporum (Lim et al., 1991; Palumbo et al., 2005).
L’absence de l’inhibition chez certaines souches peut être expliquée par la
production de quantités insuffisante pour l’activité inhibitrice.
84
En plus des chitinases, les Pseudomonas produiraient d’autres types

d’enzymes lytiques, en l’occurrence des protéases. Nos résultats montrent que 63,15
% des souches sont positivement protéolytiques. D’après Stanier et al., (1966), la
production de protéases extracellulaires , est une caractéristique chez P. aeruginosa
et P. fluorescens, mais absente chez P.putida et qui sont impliquées dans la
dégradation des composés structuraux des parois cellulaires fongiques.
La production de cellulases est négative chez toutes les souches testées. Ces
résultats peuvent être expliqués par le fait que la dégradation de la cellulose est
complexe ; elle nécessite l'action synergique de trois catégories d'enzymes. En effet,
seuls quelques organismes ont la capacité de produire de grandes quantités
d'enzymes de dégradation de la cellulose insoluble, en sucres solubles in vitro. Les
trois groupes enzymatiques du complexe de cellulase sont respectivement : endo-³
(1-4) glucanases, exo-³ (1-4) glucanases et ³-glucosidases (Mandels, 1981). Il
semble qu'une petite proportion des dérivés de la cellulose, pas entièrement
réticulés, qui sont présents sous forme soluble. Le même auteur confirme que la
totalité de la chaîne de cellulose substituée est complètement réticulé et que jusqu'à
10 % peuvent être sous une forme soluble. Ceci suggère que l’importante fraction
insoluble est la cause de cette activité limitée.
Les résultats de notre étude, sur la production de substances volatile (HCN),
ont montré que parmi les 17 souches, 16 souches (94.11%) ont montré une
cyanogénèse positive. Une différence existe entre les souches en termes d’intensité
de production de l’HCN. Celle-ci revient à la variabilité d’expression des gènes
responsables chez les Pseudomonas producteurs. La production d’HCN de nos
souches se présentent en deux groupes : faibles producteurs (6 souches) et forts
producteurs (10 souches), en plus des souches de référence). L’absence de
production chez BB2 serait due à la perte ou l’absence des gènes responsable de la
biosynthèse (Ramette et al ., 2003). La production de l’HCN par les Pseudomonas
est impliquée dans la suppression de différents agents pathogènes, en agissant
directement sur les cellules en bloquant les cytochromes oxydases dans la chaîne
respiratoire (Blumer et Haas, 2000).
Bien que la plupart des études menées dans le passé aient suggéré un rôle
certain du HCN dans le contrôle biologique des phytopathogènes, d’autres études
divergent de cet avis. Il a été rappporté que l’HCN est plus impliqué dans la chélation
des métaux, augmentant ainsi la disponibilité du phosphate pour la plante, plutôt que
85
le contrôle biologique des phytopathogènes (Rijavec et Lapanje, 2017 ; Mishra et

Arora, 2017).
Dans la présente étude sur l’effet antagoniste des souches de Pseudomonas
fluorescents vis-à-vis de différents isolats fongiques et bactériens, les résultats
reflètent clairement que les 17 souches testées ont la capacité inhérente à induire
des effets antagonistes sur la croissance mycélienne et par conséquent sur la
prolifération de ces champignons et de même sur la croissance des bactéries
phytopathogènes. Les taux d’inhibition, toutefois, varient selon les souches de
Pseudomonas testées et selon le champignon ou la bactérie phytopathogène cible.
Chez les souches antagonistes, il a été procédé à la détection de la synthèse
de phénazines ou de leurs analogues. Trois souches (PI9, BB9, F20) ont révélé des
zones sombres autour des colonies traduisant la production de composés
apparemment phénaziniques à effet antibiotique. D’après nos résultats, ces derniers
montrent un fort effet antagoniste, notamment en observant les deux souches de
référence B454 et CHAO.
Les trois souches suspectées productrice de phénazines ont fait l’objet d’une
étude antimicrobienne sur trois milieux de cultures. Les activités antagonistes sont
d’un spectre d’action proche de celui des cinq souches (PI9, BB9, F20, B454, CHAO)
de Pseudomonas. Il s’agit d’un spectre large touchant aussi bien les champignons
que les bactéries, Gram positif ou Gram négatif. Ceci pourrait suggérer la présence
chez une même souche de nombreux métabolites variables, selon le milieu de
culture utilisé. La production de métabolites secondaires impliqués dans
l’antagonisme microbien est sous l’effet du milieu de culture (Meyer et
Abdallah ,1978). L’activité antagoniste in vitro dépend non seulement des espèces et
souches testées, mais aussi de la composition du milieu de culture (Digat, 1992). Le
pouvoir antimicrobienne des souches PI9, BB9, F21 est meilleur sur le milieu King B.
Ces résultats sont proches de ceux obtenus par Benchabane (2005) et Reddy Battu
et Reddy (2009). En effet, le milieu King B était le meilleur pour la production des
métabolites efficaces. Les inhibitions constatées peuvent être sont le résultat d’un
antagonisme exercé par les molécules à activité antimicrobienne, produites par les
souches PI9, BB9, F21 diffusibles dans le milieu de culture. Ce phénomène est
communément appelé : antibiose (Baker et Cook, 1974).
Les métabolites secondaires isolés chez ces microorganismes, qui provoquent
une activité antimicrobienne (antibactérienne, antifongique ou antiprotozoaire), et/ou
86
antivirale, peuvent être considérés à titre d’antibiotiques (Berdy, 2005). La synthèse

des antibiotiques est étroitement liée au métabolisme cellulaire, qui est à son tour
liée à la disponibilité en éléments nutritifs (minéraux, sources de carbone…) et autres
stimuli environnementaux (pH, température (Thomashow, 1996; Bender et al., 1999).
Thomashow et Weller (1990), révèlent dans leur première démonstration
expérimentale, utilisant une approche génétique, l’implication d’un antibiotique
produit par une souche de Pseudomonas dans la suppression d’agents
phytopathogènes. Ils ont utilisé une souche de P. fluorescens productrice d’acide
phénazine carboxylique, isolée de la rhizosphère du blé et qui est fortement
antagoniste envers Gaeumannomyces graminis var tritici. Ce type de démonstration
a été réalisé également avec d’autres composés, comme le DAPG, la pyrrolnitrine, la
pyoluteorine et le HCN (Haas et Keel, 2003).
Les composés à effet antibiotiques phénaziniques secrétés dans les différents
milieux de culture par les souches PI9, BB9, F21 ont fait l’objet d’extraction par trois
solvants de polarité différentes : acétate d’éthyle, le dichlorométhane et l’hexane.
L’efficacité de ces solvants a été déjà rapportée dans l’extraction de phénazines
(Gurusiddiah et al., 1986). Parmi ces solvants l’acétate d’éthyle a permis l’obtention
de meilleurs résultats. En utilisant le témoin PCA (standard), la comparaison des
résultats des deux techniques chromatographiques (CCM et HPLC) avec les
composés issus des souches PI9 et F21, additionnée à la vérification de leur activité
antimicrobienne, a permis de mettre en évidence et d’identifier la PCA comme
composé actif. La souche BB9 possède une activité antimicrobienne marquée et
produit des composés de nature phénazinique, mais sa composition diffère de celle
du PCA produit par les autres souches.
La souche PI9 apparait la plus performante, parmi les autres souches
sélectionnées et productrice des phénazines. Cela se traduit par une activité
antimicrobienne beaucoup plus marquée accompagnée d’une production plus
importante en PCA.
Les antibiotiques de type PCA et autres phénazines sont les déterminants
majeurs dans le contrôle biologique des phytopathogènes telluriques chez les
Pseudomonas spp. fluorescents (Thomashow et Weller, 1996). La production de
phénazines est impliquée aussi bien dans la survie de la bactérie que dans
l’inhibition du pathogène. Ces antibiotiques sont produits vers la fin de la phase
exponentielle et pendant la phase stationnaire (Turner et Messenger, 1986).
87
Nos résultats montrent que les souches productrices des composés

phénaziniques, à effet antibiotique, ont provoqué des taux d’inhibition très élevé en
interaction avec G. graminis var .Tritici ,allant jusqu'à 50 %. Thomashow et ses
collaborateur (1990), ont trouvé que les antibiotiques produits sur les racines saines,
et plus spécifiquement la PCA, pourrait servir comme une importante première ligne
de défense contre l’infection primaire par G. graminis var .Tritici.
Les phénazines chez Pseudomonas joueraient un rôle important dans la lutte
biologique contre les maladies infectieuse des plantes (Thomashow et Weller, 1988 ;
Tomashow et al., 1990). Il est intéressant de noter dans notre cas que les composés
majoritaires extraits à partir des souches PI9, BB9, F21 qui semblent appartenir au
groupe des phénazines. Ces derniers jouent aussi un rôle dans la compétition
rhizosphérique, incluant la survie et la compétence des bactéries productrices
(Mazzola et al., 1992).
Chen et al., (2012) ont indiqué que PHZ joue un rôle dans le métabolisme et le
transfert d'énergie, fonctionnant comme une navette électronique. De nouvelles
connaissances ont récemment été rapportées pour la production de PHZ substituée
(Guttenberger et al., 2017). Bien que quelques produits anti-phytopathogènes à base
de PHZ sont maintenant disponibles sur le marché (Zhou et al., 2015), mais pour le
succès commercial et l'utilisation généralisée de ce métabolite très efficace, il est
nécessaire de sélectionner des souches performantes et efficaces (Mishra et
Arora ,2017; Jeyanthi et Kanimozhi, 2018).
Bien qu’il est admis aujourd’hui que les rhizobactéries, particulièrement les
PGPRs peuvent engendrer des gains appréciables, il demeure toujours que leurs
application sur terrain rencontre des difficultés. Parmi ces obstacles, le processus de
formulation et les méthodes d’applications restent les garants de leur adoption et de
l’élargissement de leur emploi.
88
Chapitre IV: Formulation de rhizobactéries
par lyophilisation
Chapitre IV : Formulation de rhizobactéries par lyophilisation

IV.1. Introduction
Après des décennies de recherche en développement de produits biologiques,
intégrés dans la gestion des productions agricoles, il en demeure qu’actuellement les
préparations à base d’entités microbiennes occupent une place de choix. Ainsi il est
devenu possible de recourir à l'application de micro-organismes en tant que
biofertilisants pour améliorer la croissance des plantes, et en tant que biopesticides
pour gérer les maladies et les ravageurs des plantes. L’intérêt de ces préparations
microbiennes est d’autant plus important dans les stratégies de contrôle des
parasites biotiques insidieux, notamment les agents phytopathogènes (Spadaro et
Gullino, 2005 ; Liu et al., 2014; Bisutti et al., 2015).
Les résultats, de nombreux laboratoires de recherches, ont mis en évidence
expérimentalement l’existence de divers microorganismes doués de potentialités
phytobénéfiques, néanmoins le passage à leur application sur terrain rencontre
beaucoup d’obstacles technologiques, dont la formulation adéquate semble le
principal. Par rapport aux spécialités chimiques, la situation actuelle est loin d’être
concurrentielle.
Le processus de formulation est une étape primordiale dans le développement
des agents de lutte biologique, quand les microorganismes sont transformés de
produits testés en laboratoire à des produits appliqués sur le terrain (Liu et al., 2014).
Une application microbienne réussie dépend de la mise au point d’une
formulation appropriée et économiquement réalisable. Les formulations doivent
fournir un produit final ayant une efficacité optimisée (Bora et al., 2004), une
méthode d’application conviviale et une longue stabilité au stockage (Costa et al.,
2002; Selvaraj et al., 2014).
Généralement, les formulations se présentent sous forme liquide, en poudre ou
granulaire et contiennent des additifs pour améliorer leurs propriétés physiques et
faciliter leur application. La lyophilisation est souvent sollicitée dans les procédés de
conception des inoculats microbiens.
L’objectif de ce chapitre est double : (i) Tenter de concevoir des formulations à
base de souches bactériennes sélectionnées en étudiant l’impact de la lyophilisation.
(ii) Evaluer la viabilité des formulations obtenues après stockage de longue durée.
90
IV.2. Matériel et méthodes

IV.2.1.Test de résistance à la température
Le test de résistance aux températures a été réalisé avec les dix-sept souches
de Pseudomonas sélectionnées, précédemment, en fonction de leur identité (cf.
chapitre II), de leur pouvoir antagoniste et de production de métabolites secondaires
(cf. chapitre III). Ce test permettra le criblage de souches pouvant croitre
relativement, aux températures élevées, leur permettant de tolérer ou de résister aux
conditions de séchage, durant les procédés de formulation, en vue d’une
conservation optimale, compatible avec la préservation d’une viabilité maximale.
Le test a été réalisé en milieu KB liquide en fioles de 50 ml sous agitation
continue (50 rpm, 48 h), incubées séparément, aux températures : 35 °C, 40 °C, 45
°C, 50 °C, 55°C et 60 °C. La croissance bactérienne a été évaluée, sur milieu KB en
boite de Pétri, à 30°C entre 24 h et 48 h (Coulibaly et al. 2010).
IV.2.2. Analyse des acides gras par Chromatographie gaz - liquide
Les souches présentant des aptitudes à croitre aux températures élevées ont
subi des analyses des acides gras, afin de déterminer leur composition qui peut
expliquer, éventuellement, cette tolérance thermique. Selon la méthode appliqué par
Coulibaly et al., (2010), les acides gras cellulaires sont extraits dans un mélange
éthanol-éther (3/1; v/v) à partir d’1 g du culot. La biomasse cellulaire est reprise dans
10 ml d’une solution de lysozyme à 0,8 mg/ml et laissée en incubation pendant 20
minutes à 37°C.
Après incubation, le mélange est centrifugé à 4000 rpm pendant 20 minutes à
4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans 10 ml de
mélange éthanol-éther (3/1) puis mis sous agitation continue dans un agitateur rotatif
pendant 3 heures. Après filtration (filtre plissé), le filtrat est évaporé et repris dans 0,2
ml d'hexane et 0,5 ml de réactif au méthanol-BF3 (méthanol, méthanol-BF3, hexane ;
55:25:20). Les tubes, hermétiquement fermés sont placés dans un bain Marie à 70°C
pendant 90 minutes. Après la transestérification, on ajoute successivement et après
une légère agitation, 0,5 ml d'une solution saturée en NaCl, 0,2 ml de H2SO4 (10%)
et 1 ml d'hexane. Les tubes sont agités vigoureusement et laissés au repos pendant
5 minutes. La couche supérieure est prélevée pour injection en chromatographie
gazeuse (CPG).
L'analyse CPG des acides gras cellulaires, extraits à partir des culots des
différentes souches, a été réalisé sur une colonne de type ECWAX avec un
91
détecteur FID à 250 °C. Un standard d'esters méthyliques a été injecté afin de
déterminer les temps de rétention correspondants aux différents esters méthyliques
existants. Les acides gras des différents échantillons sont identifiés par comparaison
avec les temps de rétention des produits témoins (Coulibaly et al., 2009; Mputu
Kanyinda et al., 2012).
IV.2.3. Procédé de formulation
IV.2.3.1. Cultures bactériennes en fermenteur
Des précultures (5 l), de 24 h obtenues en milieu KB liquide après d’incubation
à 30 °C, ont été inoculées dans des bioréacteurs (100 l) (Biolafitte, Artechno, Liège -
Belgique), contenant 60 l du milieu 863. L'aération est effectuée par barbotage d'air
à un débit de gaz initial de 1 vvm. La saturation de l'air est contrôlée par régulation
automatique de la vitesse d'agitation (100 à 150 trs/mn) et en fonction de la vitesse
de consommation d'oxygène. En maintenant le pH à 7, la croissance cellulaire
(culture de 16 h) a été évaluée par la densité optique (DO) à 540 nm
(spectrophotomètre V-1200). Les cellules ont été récoltées puis concentrées 20 fois
par centrifugation (Sorval RC 12 BP) à 4700 rpm pendant 20 mn à 4 °C (Yao et al.
2008).
IV.2.3.2. Lyophilisation et Conservation
Les culots, obtenus après centrifugation, ont été divisés en deux parties
égales : Une partie est mélangée avec le composé protecteur (1% de glycérol et 5%
de maltodextrine) (Mputu Kanyinda et Thonart, 2013) et l’autre est appliquée
directement. Les échantillons ont été congelés pendant 24 h et lyophilisés pendant
72 heures dans un lyophilisateur (Louw Koeltechniek Bvba) selon le programme
standard (temps de séchage primaire de 6 h ; la température de condenseur de - 45
°C). Pour l'échantillon final, la température était de 25 °C, en élevant la température
progressivement de - 45°C à 25 °C à 0,9 mbar. Les lyophilisats obtenus sont scellés
sous vide dans des sachets en aluminium (250 g) et stockés à 4 °C.
IV.2.4. Viabilité des bactéries
La viabilité des souches bactériennes a été déterminée avant et après
lyophilisation et après stockage, par dénombrement sur milieu KB (King et al., 1954)
et par cytometrie en flux.
IV.2.4.1. Dénombrement
Un gramme de chaque lyophilisat a été réhydraté dans 9 ml d’eau peptonée.
Après une série de dilutions, 100 µl ont été étalées sur des géloses KB (King et al.,
92
1954), en trois répétitions. Le nombre de colonies a été déterminé après 24 h

d’incubation à 28 °C (Coulibaly et al. 2009). Le taux de survie a été exprimé en
unités formant colonies (UFC) par gramme après lyophilisation (Nf) et avant
lyophilisation (N0) :
Viabilité (%) = (Nf / N0) x 100.
Chaque valeur exprime la moyenne de trois répétitions.
IV.2.4.2. Cytometrie en flux

Le Carboxy fluorescein diacétate (CFDA) a été utilisé pour évaluer la viabilité
des bactéries, tandis que l'iodure de propidium (PI) permet de quantifier les cellules
endommagées et/ou mortes. Avant la coloration, les cellules bactériennes ont été
diluées dans de l'eau peptonée (DO 0,2 à 590 nm) et centrifugées (2 mn à 12.000
rpm). Les culots ont été remis en suspension, dans 1 ml d’une solution saline
tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre 106 cellules/ml. 1 ml de la dilution a
été supplémenté avec 10 µl de PI, après incubation de 15 min à 37 °C, 10 µl de
CFDA ont été rajoutés et incubés (30 mn à 37 °C) pour l’évaluation de l'intégrité de la
membrane cellulaire (Rault et al., 2007).
Après centrifugation (Fischer Bioblock Scientifik; 3 mn à 12.000 rpm) et
élimination du surnageant, le culot a été lavé avec 1 ml du tampon PBS et remis en
suspension dans 1 ml de PFA (Paraformaldéhyde) pour fixer les cellules. Après une
autre centrifugation (12.000 rpm, 3 mn), le culot est remis en suspension dans 1 ml
de tampon PBS et stocké à 4°C, avant analyse par cytometrie en flux (Rault et al.,
2007).
IV.3. Résultats
IV.3.1. Résistance à la température
Le tableau ci-dessous montre les résultats préliminaires de sélection de 17
souches de Pseudomonas ayant pu se développer aux températures comprises
entre 35 °C et 45 °C. En plus de leurs activités antagonistes in vitro et la capacité à
produire des métabolites, impliqués dans le biocontrôle et la phytostimulation, les
souches retenues (BB2, BB9, BB10, F21, PI9 et GP4) se développent même à 45° C
(Tableau IV.1).
93
Tableau IV.1 : Croissance des souches de Pseudomonas aux températures testées.
Souches Croissance à 35, 40, 45 °C Souches Croissance à 35, 40, 45 °C

BB6 + + + - F20 + + + -
F21 + + + + F19 + + + -
F23 + + + - F8 + + + -
BB10 + + + + GP4 + + + +
BT7 + + + - BT5 + + + -
BB9 + + + + BT3 + + + -
PI11 + + + - BB7 + + + -
PI9 + + + + BB2 + + + +
F48 + + + - BS4 + + + -
F43 + + + - F25 + + + -
F27 + + + -
+ : Croissance - : Pas de croissance, en gars souches retenues
IV.3.2. Analyse des acides gras cellulaires (AGC)

L’étude de la composition membranaire en acides gras a été effectuée sur les
souches bactériennes retenues (BB2, BB9, BB10, F21, PI9 et GP4) ayant pu se
développer à 45 °C. Six principaux acides gras ont été identifiés, à savoir les acides
palmitique (C16 :0), palmitoléique (C16 :1), stéarique (C18 :0), oléique (C18 :1),
linoléique (C18 :2) et l'acide linolénique (C18 :3). Les résultats montrent de faibles
taux en acides gras insaturés (C18 :2 et C18 :3) voir nulle chez F21 pour l’acide
linoléique (C18 :2) et chez BB2, F21, et PI9 pour l’acide linoléniques (C18 :3) en
comparant avec les taux d’acides gras saturés (C16 :0 et C18 :0) présents dans les
membranes cellulaires de la plupart des souches sélectionnés (Tableau IV.2).
Les taux les plus importants en acide gras saturés ont été obtenus avec l’acide
palmitiques (C16 :0). Les taux varient de 43,32 % à 59,01 % enregistrés,
respectivement, chez les souches F21 et BB9.
94
Tableau IV.2 : Composition en acides gras cellulaires (AGC)
Acides gras cellulaires (Pourcentages des pics)
C16 :0 C16 :1 C18 :0 C18 :1 C18 :2 C18 :3

Souches
BB2 49,32±0,64 a 21,39 ±0,85 13,80±0,02 14,.54±0,57 0,96±0,01 0,00 ±0,00
BB10 54,00±2,90 23,14±1,98 1,96±1,20 17,30±2,05 0,.70±0,21 2,91±1,91
F21 43,32±0,77 34,71±2,19 5,18±1,68 16,79±2,33 0,00±0,00 0,00±0,00
PI9 48,18±0;45 25,34±0,14 11,78±0,13 14,23±0,11 0,47±0,13 0,00±0,00
GP4 50,63±2,97 23,31±1,13 4,10±1,63 18,64±3,49 0,65±0,78 2,66±1,34
BB9 59,01±3,61 14,61±3,25 8,19±1,98 06,95±3,32 05,45±0,57 05,79±0,64
Acides gras : palmitique (C16 : 0), pamitoléique (C16 :1), stéarique (C18: 0), oléique (C18: 1),
linoléique (C18: 2) et linolénique (C18: 3). a : Ecart type issu de trois répétions.
IV.3.3. Viabilité des lyophilisats bactériens

IV.3.3.1. Dénombrement bactérien
Les résultats de formulation, de trois souches de Pseudomonas, montrent que
la viabilité évaluée par dénombrement sur gélose KB a beaucoup diminué après
lyophilisation. Les taux de viabilité variaient entre 1.10% à 6.51% enregistrés,
respectivement, chez les lyophilisats des souches BB9 et BB10 additionnés d’agents
protecteurs (glycerol+maltodextrine). Ces mêmes souches présentent des taux de
viabilité plus faibles, variant entre 00,39% à 01,09%, en l’absence d’une
cryoprotection. Donc, l’’utilisation de composés protecteurs, additionnés avant la
lyophilisation, a permis de maintenir une viabilité notable, en comparaison avec les
même souches lyophilisées sans agents protecteurs (Tableau IV.3, Figure IV.1).
95
Tableau IV.3 : Effets de la lyophilisation et de la cryoprotection sur la viabilité (%).
Souches Avant lyophilisation Après lyophilisation (cfu/g)

(cfu/g) AP (avec protecteur) SP (sans agent protecteur)
1,43.1010 (± 1,97.1010)
3,63. 1011 (± 6,03.1010) a 4,00.109 (± 2,00.109) a
BB9 (00.39)
(01.10) b
5,83. 1011 (± 7,64.1010) 3,80.1010 (± 8,54.109) 6,40.109 (± 7,94.108)

BB10
(06.51) (01.09)
6,33.109 (± 2,52.109) 3,53.109 (± 7,57.108)

11 10
F21 4,80. 10 (± 7,55.10 ) (01.31) (00.73)
a : écart type issu de trois répétions b : Viabilité (%) des cellules lyophilisées et stockées 4°C.
Les barres avec la même lettre ne différent pas significativement, selon le test de Newman-Keuls (α= 5%)
Figure IV.1 : Densités bactériennes avant lyophilisation et après formulation.
IV.3.3.2. Cytometrie en flux

L’échantillon témoin (A04bb9), a été placé à l’étuve (105 °C, 30 mn) pour tuer
les bactéries, afin d’avoir une idée sur les dommages que l’on peut voir avec la
cytometrie en flux. Le constat est que plus de 91% des cellules sont mortes pendant
l’exposition à la chaleur. Après la coloration à l’Iodure de Propidium (PI) et au
96
diacétate de carboxyfluorescéine (cFDA) ; nous avons relevé que 3,1% des cellules
sont endommagés (se trouvant dans un état intermédiaire entre vie et mort). 5,3%
des cellules bactériennes n’ont pas pu être marquées et moins de 0,2% des cellules
ont résistées. Le temps d’incubation du colorant ayant donné le bon résultat est de
15 minutes. Ainsi, ce temps a été reconduit pour la suite de nos analyses. Ce résultat
nous permet de traiter nos différents échantillons, en état de crème bactérienne ou
en poudre lyophilisée, afin de noter la résistance que présenteraient ses souches.
Figure VI.2 : Viabilité du Témoin (A04-BB9) en cytometrie en flux
La viabilité des trois souches bactériennes lyophilisées a été comparée aux

résultats de la cytométrie en flux qui permet, après une double coloration par PI et
cFDA, la détermination de l'état physiologique cellulaire (cellules viables, cellules
mortes et cellules viables mais non cultivables). Il apparait que la souche F21 est la
plus sensible à la lyophilisation. Cette sensibilité s’est traduite par une importante
diminution de la concentration des cellules viables (de 34 % à 0,8%). Les résultats
montrent également que la lyophilisation entraîne une quantité importante en nombre
de cellules intermédiaires, que l’on peut récupérer sur un milieu adéquat, pour les
souches BB9 et F21 (24,6% et 34,6%) (Figure IV.3).
97
BB9
F21
BB10
Q3-UR: Cellules endommagées ; Q3-UL: Cellules mortes ;Q3-LR: Cellules vivantes ;Q3-LL: Non marquée
Figure IV.3 : viabilité (%) avant et après lyophilisation par cytometrie en flux.
98
IV.3.3.3.Viabilité des lyophilisats après stockage

Dans les essais de stockage des lyophilisats, avec et sans cryoprotection, les
souches se sont montrées très sensibles au séchage et qu’il n’y a pas d’effets
notables des agents protecteurs lors de la lyophilisation. Cependant, les
cryoprotecteurs peuvent influencer, relativement, la stabilité des préparations
microbiennes séchées lors du stockage. En effet, les taux de viabilité enregistrés
sont relativement variables (13,28% et 25,21 %), respectivement, avec les souches
BB9 et F21, lyophilisées et stockées pendant cinq années à 4°C (Tableau IV.4).
La viabilité des souches de Pseudomonas a légèrement diminué après
stockage. Le taux de survie varie entre 2,84% à 20,05% enregistrés, respectivement,
avec les souches BB10 et BB9 lyophilisées avec protecteur. Ce taux est entre 4.27%
à 22.09%, respectivement, pour les souches BB9 et F21 lyophilisées sans
protecteur. L’addition de composés protecteurs, avant la lyophilisation, a permis de
maintenir une meilleure viabilité à la fin de la procédure. Il a été constaté, à travers
nos résultats, que la viabilité des produits bactériens lyophilisés restait relativement
stable après stockage que ce soit après 3 ou 5 années (Tableau IV.4, Figure IV.4).
Tableau IV.4 : Viabilité (%) des souches de Pseudomonas après stockage à 4° C.
Avant stockage Après 3 ans de stockage Après 5 ans de stockage

Souches AP SP AP SP AP SP
4,00.109 a 1,43.1010 9,00.108 a 7,37.108 8.2. 108 6.4.108
BB9 (± 2,00.109) b (± 1,97.1010) (± 2,00.108) b (± 4,73.107) (±1.24.108) (± 1.16.108)
(22.50) c (05.15) (20.5) b (4.47)
3,80.1010 6,40.109 9,30.109 8,50.108 1,08.109 7.9.108
BB10 (± 8,54.109) (± 7,94.108) (± 5,29.108) (± 1,22.109) (±2,57.108) (± 1.16.108)
(24.47) (13.28) (2.84) b (12.3)
3,53.109 7,77.108 8,90.108 7,66.108 7.8.108
6,33.109
F21 (± 7,57.108) (± 2,08.108) (± 1,00.107) (± 2,73.108) (± 1.75.108)
(± 2,52.109)
(12.27) (25.21) (12) b (22.09)
AP : avec protecteur ; SP : sans protecteur ; a : Viabilité par dénombrement (cfu/g) ; b : écart type
issu de trois répétions ; c : Viabilité (%) des cellules lyophilisées et stockées 4°C ;
99
Les barres avec la même lettre ne différent pas significativement, selon le test de Newman-Keuls (α= 5%)
Figure IV.4 : Viabilité (%) des souches de Pseudomonas après stockage.
IV.3. Discussion
Le test de thermotolérance a montré que parmi les souches étudiées, six sont
relativement résistantes et peuvent croitre même à 45 °C. Le choix de ce critère,
parmi d’autres, repose sur l’hypothèse qu’une souche ayant survécu dans un
environnement drastique (chaud et sec) peut posséder ou développer des
mécanismes d’adaptation à ce genre de stress. Or, en biotechnologie microbienne,
lors des étapes de formulation et/ou au cours de leur stockage, les préparations à
base de microorganismes enregistrent systématiquement des pertes en viabilité.
C’est dans cette optique, que nous avons sélectionné des souches résistantes, qui
peuvent tolérer des traitements ou des chocs thermiques.
Une sélection rigoureuse est le premier des facteurs pour l’amélioration de la
conservation des Pseudomonas spp fluorescents, pour garantir une viabilité
commercialement satisfaisante. Pour le stockage à long terme, il est opportun de
sélectionner des souches qui ont survécu à des conditions drastiques (température
élevée). Le criblage de microorganismes thermotolérants est souvent avancé comme
un préalable, pour d’éventuelles utilisations comme des biopesticides ou des
biofertilisants (Niamsup et al., 2003 ; Prasad et al., 2003).
100
Pour expliquer le phénomène de résistance thermique, que présentent ces

souches en leur permettant de croître et de se reproduire à 45 °C, une analyse des
acides gras cellulaire (AGC) a été réalisée. Six principaux acides gras ont été
identifiés, à savoir les acides palmitique (C16:0), palmitoléique (C16:1), stéarique
(C18:0), oléique (C18:1), linoléique (C18:2) et l'acide linolénique (C18:3). Les acides
gras insaturés sont faiblement présents. Aux regards de ces résultats, la
thermoresistance des souches sélectionnées est probablement attribuée, au moins
en partie, à ces acides gras cellulaires. Les travaux de Sow et al., (2004), montrent
que la thermotolérance bactérienne peut être la résultante de plusieurs facteurs, dont
la synthèse d’un fort pourcentage d’acide oléique (C18:1) et dans une moindre
mesure d’acide linolénique (C18:3). Russell et al., (2002) et Yoo et al. (2005) sont
unanimes sur ce sujet, en concluant que la diminution de la synthèse des acides
gras monoinsaturés est étroitement liée à l’augmentation de la température
d’incubation. Ceci constitue, en fait, une réponse à une modification de la fluidité
membranaire.
Les acides gras saturés est un moyen pour réguler la fluidité des membranes
biologiques en fonction de la température. Les lipides membranaires sont le siège
d’intenses modifications en vue de maintenir une fluidité et ainsi d’en assurer la
perméabilité des membranes cellulaires. Cette activité est indispensable pour le bon
fonctionnement des cellules en cas de stress (Russell et al., 1989). D’autres travaux
effectués par Russell et al., (1995) ont montré que l’augmentation de la synthèse des
acides gras insaturés (C18:1 principalement) et de C16:0 régule la fluidité
membranaire, qui était fortement liée à l’élévation de la température d’incubation des
bactéries. Donc il est évident de conclure, que la résistance cellulaire et l’adaptation
des bactéries aux conditions drastiques sont en fonction de la modification des
phospholipides membranaires.
En se basant sur ces critères (thermorésistance et composition en AGC), nos
résultats ont permis de trier trois souches bactériennes (BB9, BB10 et F21), pour des
essais de formulation, sous forme de poudres séchées, par voie de lyophilisation. A
cette finalité, la viabilité des cellules bactériennes est un préalable «sine qua none»
pour envisager une procédure de formulation efficace et réussie lors de son
application. Le processus de lyophilisation a engendré une nette diminution dans les
taux de viabilité des trois souches, dans l’intervalle de 1,10% à 6,51%. Certes, de
tels taux apparaissent relativement faibles ; néanmoins la quasi-totalité des travaux,
101
dans ce domaine, souligne cette faiblesse et ce niveau de viabilité reste suffisant

pour des procédures de formulation. Stephan et al., (2016) ont obtenu des niveaux
variant entre 2% à 10%, avec cinq souches de Pseudomonas après lyophilisation
sans optimisation.
Les résultats présentés ici apportent un support expérimental à l'hypothèse
que la lyophilisation et le stockage endommagent les membranes des bactéries
testées. Ainsi la perte de viabilité reste l’un des inconvénients majeurs lors de la
lyophilisation des préparations bactériennes (Shafiei et al. 2013). La tolérance des
microorganismes à la lyophilisation dépend du milieu utilisé, de l'état physiologique
des cellules, du temps de congélation, des paramètres de lyophilisation, des
conditions de réhydratation et de la concentration cellulaire initiale (Palmfeldt, 2003 ;
Shafiei et al., 2013; Sahu et al., 2018).
Par rapport aux bactéries Gram positif, celles de Gram négatif démontrent
généralement un taux de survie plus faible après lyophilisation (Mputu Kanyinda,
2014). Le taux de survie dépend du genre bactérien, ainsi il a été montré que le taux
de survie, après congélation, est plus élevé avec les bactéries à Gram positif
(Brevibacterium et Corynebacterium) que pour les bactéries à Gram négatif
(Pseudomonas), respectivement, de 80 % et de 50 %. De même, les spores, chez
les bactéries sporales, sont plus résistantes à la lyophilisation que les cellules
végétatives (Morgan et Vesey, 2009).
La survie bactérienne pendant la lyophilisation n'est pas seulement influencée
par les caractéristiques intrinsèques de l'espèce bactérienne, mais également par
d’autres facteurs extrinsèques : le milieu de suspension utilisé, le moment de la
récolte, les conditions de croissance, les concentrations en cellules dans le milieu de
fermentation, les conditions de lyophilisation et de réhydratation (Heckly, 1985 ;
Bisutti et al., 2015).
La lyophilisation est largement utilisée pour la conservation de diverses
substances biologiques, même en engendrant des effets indésirables suite au
processus de déshydratation. Etant donné que les molécules d'eau contribuent à la
stabilisation des protéines, de l'ADN et des lipides en conférant l'ordre structurel aux
cellules ; ainsi l'élimination de l'eau (en particulier l'eau liée) affecte directement la
viabilité (Santivarangkna et al., 2008). Tous les sites cellulaires, tels que la paroi
cellulaire, le chromosome, les ribosomes, les membranes et les enzymes (Shafiei et
al., 2013) sont soumis à des traitements physiques, notamment la congélation et le
102
séchage (Hurst, 1977; Shafiei et al., 2013). De tels traitements, exposent les cellules
bactériennes aux contraintes de concentration élevée de solutés, y compris des pH
extrêmes, à des basses températures, à la formation de cristaux de glace et à
l'élimination d'eau des cellules bactériennes (Zhao and Zhang, 2005).
Les bactéries Gram – (Pseudomonas chlororaphis et P. fluorescens…etc.) sont
très sensibles à toutes formes de séchage surtout en l’absence de composés
protecteurs (Palmfeldt et al., 2003; Nanasombat et Sriwong, 2007). Ces bactéries ont
tendance à une rupture plus grande pendant les processus de dessiccation et de
réhydratation (Pembrey et al., 1999). Cette sensibilité est due à la composition de
leur paroi cellulaire, présentant une couche mince en peptidoglycanes (environ 5 à
10 nm), par rapport à celle des Gram + (20 à 80 nm). L’absence de l’acide techoïque
chez la bactérie Gram - réduit sa résistance au séchage par rapport à son
homologue Gram + (Alberts et al., 1994; Beveridge, 1999 ; Lodish et al., 2000). La
plupart des bactéries Gram-négatives ont des lipopolysaccharides sur leurs surfaces
(Gupta, 2002). Les membranes cellulaires sont souvent endommagées pendant le
processus de congélation, ou pendant la dessiccation et la réhydratation (Wolfe et
Bryant, 1999).
Des changements de perméabilité ont conduit à suggérer que la lyophilisation,
crée de petits pores dans la membrane cytoplasmique engendrant la fuite de
matériel cytoplasmique (Wesche et al., 2009). Bien que la diminution de la teneur en
eau pendant la lyophilisation entraîne certaines lésions cellulaires (Shafiei et al.,
2013), cependant le reste de l'eau dans les cellules séchées favorise également les
réactions défavorables (Lievense et van‘t Riet , 1994). Les compositions lipidiques
des cellules lyophilisées changent habituellement en raison des réactions d'oxydation
et une diminution du rapport entre la teneur en acides gras insaturés et saturés des
cellules est observée (Castro et al., 1996; Coulibaly et al., 2009). Les lipides
membranaires jouent un rôle important dans la perméabilité des membranes
cytoplasmiques ; il est apparu probable que les dommages subis par les membranes
lors de la lyophilisation et du stockage étaient dus à des modifications du profil
lipidique (Teixeira et al., 1996). La formation de radicaux pendant les premiers jours
de stockage peut être une preuve de l'instabilité des réactions d'oxydation des
bactéries lyophilisées (Carlsen et al., 2009). A l'état sec, les biomolécules deviennent
plus sensibles à l'attaque de l'oxygène (Garait et al., 2005), souvent due aux espèces
103
oxygénées réactives (ROS), qui peuvent endommager les protéines, modifier les
bases et les sucres des acide désoxyribonucléique (ADN) (Blair, 2008).
Dans nos travaux, nous avons constaté que l'ajout de protecteurs (glycérol et
maltodextrine), avant la lyophilisation, ne modifie pas significativement la viabilité
bactérienne pendant la lyophilisation, mais ils influencent positivement la stabilité
pendant le stockage. Les additifs ont un rôle important dans la conservation et le
maintien de la viabilité cellulaire. Il est rapporté que la présence d'antioxydants
augmente le taux de survie des bactéries séchées pendant le stockage (Carvalho et
al., 2003; Coulibaly et al., 2009).
Pour remplir ces fonctions, l’additif utilisé comme protecteur devrait fournir une
bonne cryoprotection des cellules pendant la lyophilisation, il doit être facile à sécher
et fournir les atouts d’une matrice permettant la stabilité et la facilité de réhydratation
(Costa et al., 2000). Stephan et al., (2016) ont démontré que la congélation sans
agents cryoprotecteurs (CPA) affectait de façon spectaculaire la survie souches de
P. putida et P. fluerecsens. Lorsque la souche P. fluerecsens Pf153 a été mise en
suspension dans du saccharose, du lactose, de l'acide ligninosulfonique, du glucose
ou du lait écrémé, la viabilité a augmentait à deux décimales par rapport aux cellules
sans protection. Palmfeldt et al., (2003) ont montré qu'une combinaison de plusieurs
CPA augmente la viabilité des cellules après leur lyophilisation. Les CPAs ont deux
fonctions principales : protègent les cellules vivantes, biochimiquement, contre les
dommages lors de la congélation et fournissent un résidu sec avec une structure
physique définie, agissant comme matériau de support et comme récepteur lors de la
réhydratation (Berny et Hennebert 1991). Le choix d’un composé protecteur
approprié est très important pour assurer une viabilité élevée des bactéries pendant
la lyophilisation et au cours du stockage (Lievense et al., 1993 ; Leslie et al., 1995;
Kawahara, 2008). L’addition de composés protecteurs, lors des opérations de
séchage de suspensions de souches de Pseudomonas, améliore nettement les
niveaux de leur viabilité (Palmfeldt et al., 2003; Stephan et al,. 2007
La lyophilisation entraîne des effets secondaires indésirables, tels que des
modifications de l'état physique des lipides membranaires (Shafiei et al., 2013).
Selon la théorie de Crowe et al.,(1987), l'élimination de l'eau liée à l'hydrogène de la
bicouche de phospholipides entraîne une augmentation de l'empaquetage dans le
groupe de tête des lipides membranaires (Shafiei et al., 2013) et l’altération des
protéines, entraînant la perte de viabilité cellulaire pendant le processus ainsi que
104
pendant le stockage ultérieur (Garait et al., 2005; Nanasombat et Sriwong, 2007).

L'oxydation lipidique des cellules membranaires a été jugée responsable de la mort
cellulaire pendant la lyophilisation et pendant le stockage (Teixeira et al., 1996;
Mputu Kanyinda et al., 2012).
Plusieurs approches décrites optimisent la formulation d'un agent de lutte
biologique, comme l'application de matériaux porteurs appropriés (Vidhyasekaran et
al., 1997; Krishramuthy et Grarananickam 1998; Ali et al., 2001) et des additifs de
formulation. Ces derniers devraient améliorer l'efficacité de l'antagoniste en matière
de lutte biologique, mais ne devraient pas favoriser la croissance de l'agent
pathogène ni causer de dommages à la plante hôte (Wiyono et al. 2008 ; Sallam et
al., 2013).
Bien que divers types de formulations de Pseudomonas aient été développés
par plusieurs auteurs (Dandurand et al., 1994 ; Moenne-Loccoz et al., 1999 ;
Commare et al., 2002; Rajappan et al., 2002; Senthil et al., 2003 ; Bora et al., 2004 ;
Mathivanan et al., 2006), le stockage et le développement de produits commerciaux
restent toujours limités, à cause de certaines contraintes (Stephan et al., 2016). (i)
L’effet protecteur est parfois insuffisant par rapport aux produits chimiques (Shishkoff
et McGrath, 2002) ou nést pas constant, dépendant notamment des conditions du
milieu (température, sol, humidité, plante hôte, pH, etc…) (Mendoza Garcia et al.,
2003). (ii) Le coût et le délai sont très élevés pour lénregistrement technique, de
même que le coût de production reste très élevé pour la plupart des agents de
biocontrôle, relativement aux formulations chimiques (Fravel et al. 1999). (iii) Le
conditionnement et la formulation sont très difficiles pour des, espèces non
sporulantes et même parfois pour les espèces sporulantes (Hjeljord et al. 2000;
Collins et Jacobsen 2003).
Dans un aspect comparatif, les pesticides chimiques peuvent offrir rapidement
une activité beaucoup plus efficace, tandis que les biopesticides peuvent avoir
besoin de temps après leur application pour commencer à agir. Il est important de se
rappeler que la plupart des biopesticides sont composés d’organismes vivants qui
ont un spectre relativement restreint de ravageurs cibles (Akram, 2008).
La viabilité des inoculats peut en souffrir à différents stades avant et pendant
l'application. Tout d'abord, un produit acceptable doit afficher une durée de
conservation suffisamment longue, décrivant la stabilité tout au long du processus de
105
production, du conditionnement, du stockage et des conditions de transport (Arora et

al., 2011).
Lors de l'application ultérieure sur le terrain, l'inoculat microbien est confronté à
des facteurs supplémentaires préjudiciables à sa viabilité. Ceux-ci incluent les rayons
UV (Zohar-Perez et al., 2003), en particulier lorsqu'ils sont appliqués sur des parties
de plantes hors sol, les propriétés fluctuantes du sol telles que la texture, la
température et le pH (Arora et al., 2011), ainsi que des cycles de séchage et de
mouillage répétés selon les conditions climatiques et la fréquence des précipitations.
Pour les inoculats appliqués directement sur les semences, la toxicité inhérente de
l'enveloppe de la graine peut être nocive (Deaker et al., 2012).
De plus, les interactions biotiques avec la microflore et la microfaune indigènes
représentent un défi majeur pour toutes les souches appliquées. Fréquemment, le
nombre de cellules d’une souche introduite diminue après l’application sur un sol non
stérile, car il est neutralisé par les microbes indigènes ou diminué par les prédateurs,
tels que les protozoaires (Bashan, 1998; Arora et al., 2011). De toute évidence, les
facteurs de stress pré-application survenant au cours du processus de production
exacerbent ce problème : plus le nombre de cellules viables livrées sur le terrain est
faible, moins la réussite de l’établissement sur le site cible est probable. Un
processus de formulation adéquat est donc d'une importance vitale (Berninger et al.,
2017).
106
Chapitre V : Biocontrôle de la fusariose
vasculaire de la tomate
Chapitre V : Biocontrôle de la fusariose vasculaire de la tomate
Chapitre V : Biocontrôle de la fusariose vasculaire de la

tomate
V.1. Introduction
Les pratiques agricoles adoptées, depuis les dernières décennies du siècle
passé, ne cessent de faire l’usage systématique des intrants chimiques que ce soit
pour améliorer les fertilités des sols, augmenter et varier les rendements, aussi pour
protéger les cultures et les produits agricoles jusqu’à leur utilisation directe, leur
stockage et même durant leur transformation agroalimentaire. Ainsi, avec les
tendances alarmistes sur les conséquences de ces produits chimiques sur la santé
des consommateurs, sur la pollution environnementale, particulièrement la pollution
des sols et de l’eau, les orientations actuelles et celles d’un proche futur, à court
terme, sont unanimes pour le développement d’autres alternatives qui prônent la
diminution à grande échelle, voir même l’interdiction de l’usage des produits
chimiques, dans certaines situations. De nombreuses études et expérimentations,
même des applications en conditions réelles, ont mis en évidence l’importance et
l’opportunité de l’utilisation d’alternatives biologiques à base de microorganismes,
que ce soit à titre de biofertilisants ou de biopesticides (Lemanceau et al., 2012; Le
Mire et al., 2016 ; Prabhukarthikeyan et al., 2018; Karakurt et Aslantas, 2010; Calvo
et al., 2014;Tabassum et al., 2017; Novo et al.,2018). Depuis quelques décennies,
certains types de rhizobactéries « PGPR, plant growth promoting rhizobaceria » sont
présentés comme des agents potentiellement phytobénéfiques, assurant à la fois la
phytostimulation de la croissance végétale (Kloepper et al., 1980 ; Silva et al., 2006 ;
Benchabane et al., 2013 ; Sivasakthi et al., 2014 ; Novo et al., 2018 ), la
bioprotection des plantes vis-à-vis de nombreuses pathologies végétales (Ongena et
al., 2005; Figueroa‑Lopez et al., 2017 ) et l’induction et le renforcement des
capacités défensives et de résistance chez les plantes (Ramette et al., 2003;
Lemanceau et al., 2014).
Parmi ces PGPRs, le groupe des Pseudomonas spp. fluorescents est considéré
comme un pôle de recherche et de développement de formulations microbiennes,
dont l’intérêt ne cesse d’augmenter, qui est démontré avec l’engouement et la
grande masse des travaux de recherche et de publications qui lui sont dédiés. Les
PGPRs sont des microorganismes bien adaptés à la vie tellurique, particulièrement
dans les espaces rhizosphériques où ils sont capables de délivrer diverses
108
métabolites secondaires, profitables aux plantes directement, en améliorant leur

balance nutritionnelle, et/ou indirectement en éliminant ou en inhibant les microflores
parasites phytopathogènes (Walsh et al., 2001; Haas et Defago, 2005; Weller, 2007;
Ahmad et al., Benchabane et al., 2013; Upadhyay et al., 2016; Figueroa‑Lopez et al.,
2017; Novo et al., 2018).
Les souches de Pseudomonas, cependant, n'ont pas été largement
commercialisées, en raison de la non disponibilité de formulations viables longtemps
et facilement stockables. Il est utile de rappeler que parmi les produits biologiques
commercialisés dans le monde, pour lutter contre les maladies et favoriser la
croissance des plantes, seuls 6% étaient conçus avec des Pseudomonas, contre
15% pour Bacillus et encore plus pour Trichoderma (Bettiol et al., 2012 ; Corrêa et
al., 2015). Une telle faiblesse sur le marché est attribuée, en grande partie, au
manque de formulations adaptées aux pratiques agricoles, mais aussi au manque de
garanties de reproductibilité des résultats de la recherche expérimentale sur terrain.
Dans ce contexte, notre laboratoire a œuvré dans des thématiques de
recherche depuis plusieurs années, à travers de nombreuses expérimentations,
aboutissant à sélectionner quelques souches rhizobactériennes efficaces dans la
phytostimulation et le biocontrôle de diverses maladies des plantes, notamment les
fusarioses vasculaires. Dans notre présent travail, après avoir appliqué des
méthodologies expérimentales, retraçant l’isolement, la sélection et le criblage de
souches potentiellement phytobénéfiques (cf. chapitres II), nous avons retenu celles
synthétisant les métabolites secondaires d’intérêt (cf. chapitres III).
Il est a souligné que ces souches sont expérimentées presque annuellement,
depuis au moins dix années dans divers essais, en procédant avec des inoculats
préparés extemporanément, ou enrobés avec des matériaux à usage de court terme
(quelques jours) (Benchabane et al., 2012, Berdja, 2012 ; Boukarma, 2012 ;Toua et
al., 2013 ; Mekhaldi,2016 ; Yala, 2016).
La tomate se présente parmi les cultures modèles, les plus expérimentées par
rapport à ses réponses quantifiables en biostimulation (Steinkellner et al., 2007;
Nefzi et al., 2018) et dans sa bioprotection vis-à-vis de la fusariose vasculaire
(Lemanceau, 1992 ; McGovern,2015 ; Sun et al., 2017, Sathiyabama et
Charles,2015 ; Sharma et al.,2018).
Notre objectif, avec l’aboutissement de la conception de formulations
lyophilisées de trois souches (cf. chapitre IV), est de concrétiser leur application. A
109
ce titre, nous voulons, à travers ce chapitre, vérifier la viabilité des formulations

rhizobactériennes conçues et mettre en épreuve leur efficacité in vitro et in situ.
V.2. Matériel et méthodes

V.2.1. Agent phytopathogène
L’Agent pathogène Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (FOL, MUCL 43876)
fourni par la Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain, Belgique a été utilisé
pour les essais de biocontrôle de la fusariose vasculaire de la tomate. La suspension
fongique a été préparée en cultivant FOL sur PDA (Potato Dextrose Agar) et incubée
à 25 °C pendant 7 jours. Le mycélium a été raclé et remis en suspension dans un
milieu nutritif liquide et cultivé à 25 °C. La suspension finale a été étalonnée avec du
MgS04 10 mM stérile à une concentration de 106 conidies/ml. La pureté a été vérifiée
avec des cultures monosporales sur PDA. Les suspensions cnidiennes ont été
préparées avec des disques de culture fongiques (âgées de huit jours, incubées à 28
°C) et inondées avec 2 ml d’eau distillée stérile. La culture est ainsi raclée et mise en
suspension dans 48 ml d’eau distillée stérile. Les suspensions de macroconidies
obtenues ont été filtrées à travers six couches de gazes stériles, pour séparer le
mycélium des conidies, et ajustées par un hématimètre à 106 microconidies / ml
(Benchabane, 2005).]
V.2.2. Inoculats bactériennes
Trois souches (BB9, BB10 et F21) (Tableau V.1), de Pseudomonas
fluorescens, précédemment sélectionnées et lyophilisées (cf. chapitres III et IV) avec
des cryoprotecteurs (Maltodextrine plus glycerol) ou lyophilisées sans additifs
protecteurs ont été utilisées dans nos essai de biocontrôle vasculaire de la fusariose.
Les lyophilisats obtenus ont été scellés sous vide (Figure IV.1.A), dans des sachets
en aluminium (250 g) et stockés pendant cinq années à 4 °C.
110
Tableau V.1 : Origine des souches sélectionnées.

Souches Origine de l’isolement Observation
F21 Rhizosphère du palmier Sid +, HCN+, IAA +, phos +, phz+,Lip-

dattier ,Amy+,Chit+,Cel-, Pec-,Prot+ ,Amm+
BB9 Rhizosphère du palmier Sid +, HCN+, IAA -, phos +, phz + Lip-

dattier ,Amy+,Chit+,Cel-, Pec-,Prot+ ,Amm+
BB10 Rhizosphère du palmier Sid +, HCN+, IAA +, phos +, phz - Lip-

dattier ,Amy+,Chit+,Cel-, Pec-,Prot- ,Amm+
Sid :Siderophore; HCN: Acide cyanidrique ; AIA : Acide Indole Acétique ; Phos : Phosphatase Prot : Protease ;
Phz: Phenazine Chit :Chitinase ; Cel :Cellulase ; Pec :Pectinase ;Lip :lipase ;Amy :Amylase ; Ammo :Ammoniac
(+) :reaction positif ;(-) :réaction négative.
1g de chaque lyophilisat (Figure IV.B) de Pseudomonas a été réhydraté dans

un tube à essai contient 9ml d’eau distillée stérile puis ensemencées sur le milieu
King B (Annexe I). Les souches bactériennes non lyophilisées ont été repiquées sur
boites de Pétri contenant le même milieu (Figure V.1 C).
A B C
A et B : souches de Pseudomonas lyophilisées sous forme de poudre conservés
dans des sacs opaque sous vide, C : souches bactériennes non lyophilisées purifiées.
Figure V.1 : Réhydratation et purification de Pseudomonas spp. fluorescents

lyophilisées.
V.2.3. Matériel végétal

La variété « var. marmande) de la tomate (Lycopersicum esculentum L.) a été
utilisé dans nos essais in situ. Les semences sont fournies par l’Institut Technique
des Cultures Maraichères et Industrielles, ITCMI - Staouali, Alger).
La désinfection des graines de tomate a été réalisée dans une solution
d'hypochlorite de sodium à 2%, par immersion pendant 3 minutes, suivie de trois
rinçages à l'eau distillée stérile durant 2 minutes pour chaque rinçage. En conditions
d'asepsie, ces graines ont été mises dans des boîtes Pétri en verre stériles,
tapissées de papier filtre stérile imbibé d’eau. Les boites recouvertes avec du papier
111
aluminium sont étuvées (23°C) pendant 4 à 7 jours, jusqu’à au début de la

prégermination des graines, qui sont directement transférées à ce stade dans des
alvéoles contenant de la tourbe stérile pour l’obtention de plantules de tomate.
V.2.4. Sol
Le sol est prélevé au niveau la station expérimentale du département de
biotechnologie (Faculté SNV, Université de Blida 1) à partir de parcelles de terrain,
non cultivée depuis au moins deux décennies. Les caractéristiques
physicochimiques du sol ont été étudiées au niveau du laboratoire de pédologie
(Boukerma, 2012) (pH = 6,7, K 0.63 %, Na 2,63 %, capacité d’échange cationique
12,5 meq /100 g de sol, phosphore assimilable 189,33 ppm, teneur en matière
organique 1,89%). Le sol a été séché à l’air libre et débarrassé de ses éléments
grossiers avant qu’il soit tamisé (2 mm). Des opérations de désinfection ont été
réalisées par autoclavage (trois autoclavages de 30 minutes à 120°C et à 24 heures
d’intervalle) pour inhiber la microflore indigène naturelle. Le sol désinfecté a été
ajouté à la tourbe stérilisée (2: 1). Le substrat résultant a été utilisé pour remplir les
alvéoles et les pots en plastique (200 g de substrat / pot).
V.2.5. Antagonisme in vitro

Le test d’antagonisme in vitro a été effectué avec les trois souches
bactériennes de Pseudomonas.spp fluorescents lyophilisées ou non lyophilisées
(cultures fraiches) vis-à-vis de Fusarium oxysporum f sp lycopersici agent de la
fusariose vasculaire de la tomate par la méthode de la confrontation directe en boite
de Pétrie. Le pouvoir antagoniste a été testé sur trois milieux différents : le milieu
PDA (favorable au développement des champignons), milieu KB (favorable au
Pseudomonas) et le milieu mixte composé de parts égale des deux milieux.
Les interactions rhizobactéries -champignon sont réalisées selon les techniques
décrites par Reddy & Patrick (Keel et al., 1992). L’essai consiste à mettre au centre
d’une boite de Petri un disque gélosé de l’agent pathogène (Fol) (5mm de diamètre)
d’une culture de 7 jours sur milieu PDA (Annexe I ) et quatre disques de papier filtre
(5mm de diamètre) stériles imbibés de crème bactérienne d’une culture de 24h sur
milieu KB dans la périphérie à une distance de 2,8 cm du centre de la boite de Petri.
Apres 7 jours d’incubation à 25°C, les mensurations des diamètres de la croissance
de Fol ont été effectuées afin d’évaluer les effets d’inhibition. La réduction du
112
diamètre des colonies mycéliennes des champignons pathogènes en présence des

souches de Pseudomonas spp fluorescents comparé au témoin non inoculé, indique
la présence d’une activité antagoniste ou non.
Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la relation suivante (Wang et al., 2002)
% d’inhibition = (R témoin – R test) / R témoin x 100
R témoin : Distance radiale maximale de la croissance du champignon. R test : Distance radiale sur
une ligne en direction de l’antagoniste.
V.2.6. Antagonisme in situ

L’étude a inclue les trois souches bactériennes lyophilisées (BB9, BB10, F21),
vis à vis de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici G2, agent de la fusariose
vasculaire de tomate
V.2.6.1 Test de pathogénicité

Avant la réalisation de test d’antagonisme in situ, un test de virulence du
champignon G2 a été vérifié par inoculation de plantules de tomate. Deux semaines
après le semis, cinq ou dix jeunes plantes de tomate (stade apparition de la première
feuille vraie) sont déterrées ; leurs racines sont lavées à l'eau du robinet, puis mises
à tremper pendant 15 min dans une suspension de microconidies titrant 106
spores/ml. Les microconidies proviennent d'une culture de la souche à inoculer âgée
de 4 jours obtenue par étalement uniforme à la surface du milieu en boîte de Pétri
d'une suspension dense de microconidies. Les témoins sont trempés dans l'eau
pendant le même temps. Plantules inoculées ou témoins sont ensuite repiqués dans
des godets de 5 cm de diamètre, contenant du 'terreau. Selon les essais, cinq ou dix
plantes de chaque variété sont utilisées pour chaque souche à inoculer (Boisson et
Geig, 1994).
V.2.6.2.Désinfection des semences

La désinfection des graines de tomate a été réalisée dans une solution
d’hypochlorite de sodium à 2%. Elles y ont immergé pendant 10 minutes à
température ambiante, suivi de trois rinçages à l'eau distillée stérile durant 20
minutes pour chaque rinçage) (Messiaen et al.,1991 ; Boukerma et al., 2017). Dans
113
des conditions d'asepsie, ces graines ont été mises dans des boîtes de Pétri en verre
stériles, tapissées de papier filtre stérile imbibé d’eau. Les boites ont été recouvertes
avec du papier aluminium pour les abriter de la lumière et incubées à une
température de 23°C dans l’étuve pendant 4 jours (fig.13 C) (Boukerma et al., 2017).
Après 7 jours les graines prégermées ont été transférées dans des alvéoles à raison
de deux graines par alvéole avec un arrosage quotidien.
V.2.6.3. Conditions d’expérimentation

. Les essais ont été réalisés au niveau de la station expérimentale du
département de biotechnologie de l’université de Blida 1, sous serre en
polycarbonate, aérée par des fenêtres latérales et chauffée par des radiateurs sous
un cycle jour / nuit de 16/8 h, 28 ° C / 18 ° C. C ± 2 ° C et 60 à 65% d'humidité
relative.
V.2.6.4. Préparation d’inoculum

Pour la préparation des suspensions bactériennes des trois souches
antagonistes, nous avons utilisé des cultures bactériennes âgées de 24 h cultivé sur
le milieu KB et incubé à 23°C. A l’aide d’une pipette Pasteur stérile, la crème
bactérienne a été raclée puis transférée dans un flacon contentent de l’eau distillé
stérile. Les suspensions bactériennes ont été ajustées à une concentration de 107
UFC/ml (de longueur d’onde » = 620 nm) (Benchabane, 2005). Pour la préparation
de l’inoculum fongique, le champignon a été repiqué sur milieu PDA et incubé à 25°C
pendant 7 jours. Une suspension conidiènne a été préparée après repiquage des 6
disques mycéliens ensemencée sur milieu PDB. Les cultures ont été incubées sous
agitation 170 tour/min et filtrées par les compresses stériles pour assurer un filtrat
des conidies seulement. La concentration des suspensions conidiennes a été
ajustée, à l’aide d’un hématimètre à 107 conidies /ml (Benchabane, 2005).
V.2.6.5. Bactérisation et inoculation fongique des plantes

Bactérisation
Au stade 2 à 3 feuilles, chaque alvéole, contenant un plant de tomate, a reçu 5
mL d’une suspension bactérienne de 107 à 108 cfu mI-l aux alentours des racines
déterrées (Benchabane et al.,2000) .
114
Inoculation Stade végétatif d’inoculation
Figure V.2. : Inoculations bactériennes.
Après 24 h de l’inoculation bactérienne, les plantules ont été transplantées dans

des pots en plastiques de 9.5 cm de hauteur et de 4.5 cm de diamètre (200 g de
substrat / pot) (Figure V.3). L’arrosage des plantules a été effectué chaque jour avec
de l’eau stérile.
Inoculation fongique
Après 48 h de l’inoculation par les solutions bactériennes, les plantules ont été
inoculées par le champignon Fol. Les plantes des témoins négatives ont été
inoculées par l’eau distillée stérile. Les plantes des témoins positives ont été
inoculées uniquement avec la suspension conidiènne de Fol. L’inoculation fongique a
été effectuée par injection des racines par la suspension conidiènne à raison de 2 ml
par pot (Benchabane, 2005).
V.2.6.6. Dispositif expérimental

Nous avons adopté un dispositif expérimental en trois blocs aléatoires complets
sous serre en verre. Chaque bloc est composé de onze traitements. Chaque
traitement est représenté par dix plants par bloc, soit 30 plants par traitement. Le
nombre total des plantes était de 330 pour chaque variété de tomate (Saint pierre et
Marmande). Le dispositif expérimental établi est présenté par la figure ci-dessous.
Les traitements utilisés sont les suivants :
- T1, T4 et T7 : plants inoculées respectivement avec les souches BB9, BB10, F21
lyophilisées avec cryoprotecteur en interaction avec F.O.L.
lyophilisées sans cryoprotecteur en interaction avec F.O.L.
115
non lyophilisées (à l’état fraiche) en interaction avec F.O.L.
- T10 : Témoin positif (+), plants inoculés uniquement avec la suspension conidienne
de F.O.L.
- T11 : Témoin négatif (-), plants inoculées iniquement par l’eau distillée stérile.
BBLOC A
BBLOC B BLOC C
Répartition des traitements au niveau de chaque bloc

A : Bloc 1 : T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T- T+.
B : Bloc 2 : T3 T6 T4 T2 T1 T+ T7 T8 T9 T- T5.
C : Bloc 3 : T2 T- T9 T3 T6 T+ T4 T8 T5 T7 T1.
Figure V.3 : Dispositif expérimental (3 bloc aléatoire complets)
V.2.6.7.Suivi du développement de la maladie

Un suivi quotidien des symptômes a commencé 24 h après l'application de la
suspension fongique pendant une période de 60 jours. La notation des symptômes
typiques de la fusariose vasculaire a été réalisée individuellement sur chaque plant
pour évaluer les paramètres de la maladie selon des formules définies (Boukerma et
al., 2017).
L’estimation de la progression de la maladie, a été réalisé à l’aide d’une échelle
adaptée (Figure V.4), pour le flétrissement de Fusarium des plantes herbacées telles
que définies par Benchabane et al., (2000) et Boukerma, (2012).
116
0 : Pas de symptômes 1 : Jaunissement unilatéral 2 : Jaunissement généralisé
3 : Flétrissement unilatéral 4: Flétrissement généralisé 5: Mortalité
Figure V.4 : Echelle d'évaluation des symptômes typiques de la fusariose vasculaire de

la tomate
1- Taux d’infection
Ce taux exprime le pourcentage des plants malades, relatif au nombre total des
plants (N) examinés et le nombre des plants malades (n) (Manikandan et al., 2010).
Taux d’infection (%) (∑ n / N) × 100
n : Nombre des plants malades

N : Nombre total des plants observés
2- Indice de McKinney (Sévérité)

La sévérité de la fusariose vasculaire a été évaluée par le calcul de l’indice de
Mckinney (Mckinney et al., 1923).
Indice de McKinney (%) [∑ (f.v) / N.X] × 100
f : Echelle de l’infection.
v : nombre des plants par chaque classe.
N : nombre totale des plants observés.
X : valeur la plus élevée de l’échelle d’évaluation (5).
117
3-Taux d’inhibition (bioprotection)

Le niveau de protection des plants, vis-à-vis de la maladie, est exprimé en
termes de taux d’inhibition de l’indice d’infection (I) et de la sévérité (S) par rapport
aux témoins malades (T+).
V.2.6.7. Observation des coupes longitudinale

Pour confirmer la présence de l’agent pathogène au niveau des tissus
vasculaire, des coupes réalisées au niveau des racines, collets, tiges inferieurs, et des tiges
supérieurs des plants infectés par Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici permettent d’observé
les symptômes internes aux niveau des vaisseaux sous microscope photonique au
grossissement (G : × 40) aussi que sous une loupe binoculaire.
V.2.6.8 Colonisation rhizosphérique

Dans le but d’évaluer le pouvoir colonisateur des souches bactériennes de
Pseudomonas, une vérification de l’installation des bactéries au niveau des
rhizosphères des plantes étudiées a été réalisée. A cet effet un fragment de racine
est prélevé au niveau de chaque traitement et de chaque bloc, suivi de plusieurs
rinçages à l’eau distillé stérile et séché séparément sur papier filtre stérile. Chaque
fragment a été déposé aseptiquement sur le milieu King B dans des boites de Pétri.
Les observations ont été effectuées 24h à 48h après incubation à 25°C (Boukerma,
2012).
V.2.9. Paramètres de croissance

V.2.9.1. Hauteur de la tige
La hauteur des tiges a été mesurée à l’aide d’un mètres a ruban à partir de
collet jusqu’à l’apex de la tige principales. A partir des mesures de la hauteur des
tiges, effectuées chaque 10 jours pendant 1 mois, nous avons calculé la moyenne de
chaque traitement, à travers les répétitions des blocs.
V.2.9.2 Poids frais et poids secs des parties aériennes
Tout plant choisi pour subir les mensurations, est coupé au niveau de collet et
pesé immédiatement pour éviter les pertes dues à la déshydratation. Une fois le
poids frais est noté, le plant est coupé en fragments est déposé dans l’étuve à 100
°C pendent 24 h pour déterminer son poids sec (Boukerma, 2012).
118
V.2.9.3. Poids frais et poids secs des parties souterraines

Après dépotage, les racines sont écartées soigneusement, lavées et secouées
pour éliminer le substrat qui adhère et pesées pour déterminer le poids frais. Le
poids sec a été détermine de la même façon que les parties aériennes (Boukerma,
2012).
V.2.9.4. Chlorophylle totale

Pour la quantification de la chlorophylle, les échantillons de feuilles recueillies
deux semaines après l'inoculation des agents pathogènes (5 feuilles, 3 répétitions
pour chaque traitement). L'analyse a été effectuée selon la méthodologie décrite par
Arnon (1949) : on mélange 0,5 g de poudre de feuilles avec 5 ml d'acétone (80%),
après centrifugation à 4 000 tr / min pendant 5 min, les extraits ont été filtrés et
l'absorbance a été mesurée à 649 et 665 nm de longueur d'onde (Kanawapee et al.,
2012).
Chlorophylle a (mg/g*MF) = [12.21× A (665) - 2.79 × (A (649)] × V/ (1000×W).
Chlorophylle b (mg/g*MF) = [12.21× A (649) - 5.1 × (A (665)] × V/ (1000×W).
Chlorophylle totale (mg/g*MF) = Chl a + Chl b.
A : absorbance.
V : volume de la solution extraite.
W : masse de la matière fraiche.
V.2.10. Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de logiciel SYS STAT (version 13).
Tous les paramètres analysés ont fait l’objet d’une analyse de variance (ANOVA) et
sont comparés par le test de Newman-Keuls au seuil de probabilité (α =0,05)
(Dagneli, 1975).
V.3 Résultats
V.3.1. Antagonisme in vitro
Globalement, les niveaux d’inhibition sont différenciés par rapport à l’état de la
culture bactérienne (lyophilisée ou fraiche). En effet les lyophilisats semblent plus
performants dans les trois milieux de cultures. La comparaison des valeurs
moyennes des taux d’inhibition (Test Newman-Keuls, α = 5 %), après la mise en
119
évidence de variances significatives, fait apparaitre huit groupes homogènes,

dénotant ainsi une variabilité conséquentes, selon les interactions et les milieux de
culture. Les taux d’inhibition les plus élevés ont été notés sur le milieu KB, par
rapport aux deux autres milieux. (Tableau V.2).
Tableau V.2 : Taux d’inhibition (%) de la croissance mycélienne

Milieux de culture
PDA KB Mixte (PDA-KB)
Souches
lyophilisé Non lyophilisé lyophilisé Non lyophilisé lyophilisé Non lyophilisé
bactériennes
32,00 e 32,04 e 54,16 a 32,46 e 25,83 f 34,20 e
F21
(± 1,29)* (± 0,26) (± 1,89) (± 0,65) (± 1,90) (± 0,36)
43,50 c 20,08 g 48,34 b 39,04 d 22,08 g 22,36 g
BB10
(± 0,90) (± 0,32) (± 1,88) (± 0,40) (± 0,72) (± 0,36)
26,58 f 10,25 i 44,58 c 41,90 c 23,33 g 17,10 h
BB9
(±0,80) (± 0,55) (± 1,44) (± 0,81) (± 0,72) (± 0,51)
* : Ecart type issue de trois répétitions. Les valeurs ayant des lettres différentes ont des différences significatives
(Test Newman-Keuls, α = 5 %).
V.3.2. Test de pathogénicité

Les tests d’inoculation préliminaire ont permis de constater, après une semaine
de leur inoculation, que les plants de tomate ont développé des symptômes
relativement typiques aux symptômes externes de la fusariose vasculaire. Il s’agit du
jaunissement généralisé et l’apparition de flétrissement. Une fois les plants sont
déterrés, les racines apparaissent noircies et nécrosées et atrophiés. Donc, l’isolat
fongique garde son pouvoir pathogène et sa virulence.
V.3.3. Biocontrôle de la fusariose vasculaire de la tomate
V.3.3.1. Evaluation de la maladie
Le suivi de développement de la maladie a révélé, que les premiers
symptômes, annonciateurs de situations de stress chez les plantules de tomate, sont
apparus après 15 jours des opérations d’inoculation et de bactérisation. Le
jaunissement a affecté, de manière intense les feuilles basales et celles du centre,
de plus de la moitié des plants. Après une semaine (J22), l’évolution des symptômes
est relativement rapide et même brutale, où le jaunissement s’est généralisé,
provoquant des situations de flétrissement partiel et parfois total, notamment chez le
témoin (Figure V.5).
120
Les plants bactérisés avec les souches BB9 (fraiche) et F21 (fraiche) ont
montré des jaunissements affectant de grandes proportions des feuillages (Figure
V.5 A et C). De même en présence de la souche F21 (lyophilisée sans protecteur),
les taux d’infection sont relativement élevés, mais avec des indices échelles
symptomatologiques qui ne dépassent pas le troisième niveau.
Le suivi du développement de la maladie de la fusariose vasculaire a été
mentionné chaque jour, en se basant sur le descriptif symptomatologique typique de
la maladie (figure V.6).
Le jaunissement unilatéral est observé au niveau des folioles, des feuilles
du plant entier et enfin un jaunissement généralisé, les parties jaunies finissent
par flétrir. Chez les plants bactérisés, le jaunissement et le flétrissement ne
parviennent qu’aux premiers étages foliaires selon les traitements (figure V 7 A),
contrairement aux témoins positifs où ces symptômes sont plus développés (figure
V.7 B.).
Nous avons observé une décoloration longitudinale de la tige et un
brunissement correspondant à une dégradation de vaisseaux vasculaires, qui sont
plus accentués chez les témoins positifs par rapport aux plants bactérisés. De
même, chez les plants malades, un brunissement à un noircissement des racines
sont constatés chez certains plants accompagnés d’une dégradation de quelques
chevelus racinaires (figure.V.8).
121
a
a
c b
a
a
c
b
a
a
b
a b
Figure V.5 : Evolution de la fusariose vasculaire (Infection et sévérité (Indice McKinney, en

situation de biocontrôle avec les souches BB9 (A), BB10 (B) et F21 (C). (AP)
Lyophilisat avec protecteur, (SP) Lyophilisat sans protecteur, Cr (Crème fraiche), (T+) Témoin
positif sans bactérisation inocule par le pathogène.
122
Pas de symptômes Jaunissement unilatéral
Jaunissement Flétrissement Flétrissement

généralisé unilatéral généralisé
Mortalité
Figure V.6 : l’échelle de symptomatologie de la fusariose vasculaire de la tomate
123
A
B
A : Jaunissement des premiers étages foliaires chez les plants bacterisés par la souche BB10 sans
protecteur
B : jaunissement généralisé chez le témoin malade
Figure V.7 : Symptôme de la fusariose vasculaire chez les plants de tomates
Brunissement des racines
Figure V.8 : brunissement des racines des plants malades
V.3.3.2. Stade ultime (54 jours) de la fusariose vasculaire

La souche F21 affiche une efficacité limitée, notamment en état de crème
fraichement préparée et en lyophilisat sans protecteur. La bactérisation n’a pas
éliminé totalement le développement de l’infection, mais ce qui est remarquable c’est
124
la sévérité qui a diminué, dénotant une régression dans la virulence où les taux
d’inhibition sont parfois au-delà de 40 % (Figure V 9. ). La comparaison entre les
souches ne fait ressortir une souche typique, même si les observations mentionnent
des niveaux d’inhibition légèrement supérieurs et significatifs (groupe homogène e),
quel que soit son état lyophilisé ou culture fraiche. La symptomatologie s’est
stabilisée au stade primaire de jaunissement généralisé, considéré comme une
légère infection chez tous les plants bactérisés, par rapport au témoin où tous les
plants sont morts (Figure V.10).
T + :Témoin malade, AP : lyophilisé Avec Protecteur SP : Lyophilisé Sans Protecteur Cr ou Fr : Culture fraiche
Figure V.9 : Stade ultime (54 jours) de la fusariose vasculaire
125
Mortalité des Régression dans la

plants témoins virulence des plans
bactérisés par la
souche BB9 crème
Figure V.10 : Bioprotection des plants de tomate
V.3.4. Observation microscopique

Des coupes réalisées au niveau des racines, collets, tiges inferieurs, et des tiges
supérieurs des plants infectés par F.o.L permettent de dégager les vaisseaux sur le
microscope photonique et de constater qu’ils ont une teinte brune très marquée sur
les tissus corticaux nécrosés. Cette coloration brune sombre des vaisseaux confirme
les symptômes typiques externes et confirme l’installation de la maladie de la
fusariose vasculaire sur les plants infectés (voir figure.V.11 et figure.V.12).
Nous remarquons que la coloration brune sur les tissus corticaux est manifesté
au centre de la racine et collet, et dans les coté de la tige inferieur et de la tige
supérieur ce qui confirmes les symptômes externes typiques de la maladie
caractérisé par le jaunissement unilatérale et le flétrissement unilatérale. (Voir
figure.V.11 et figure V.12.).
126
Rac Racine Collet
Figure V.11 : observation sur microscope photonique au des symptômes internes

typiques de F.O.L d’une plante infecté et bactérisé par BB10 S.P
Coloration brune du
centre du collet
Coloration brune
du côté de la tige
Figure V.12 : observation microscopique des symptômes internes typiques de F.O.L

d’une Plante infecté et bactérisés par F21 S.P.
127
V.3.5 Colonisation rhizosphérique

L’essai de la vérification de la survie des Pseudomonas spp. fluorescents au
niveau des rhizosphères des plantes des différents traitements ont montré après 24
h à 48 h d’incubation, la présence des colonisations notables de ces bactéries sur les
fragments racinaires et révélé une culture bactérienne fluorescente verte tout autour
des fragments racinaires chez toutes les racines des plants bactérisés. Leur
présence sur toute la surface de la boite de Pétri confirme la présence des PGPR
appliqués (Figure V.13).
Figure V.13 : Colonisation racinaire d’une plante bactérisée (BB10 avec protecteur).
V.3.6 Phytostimulation
Globalement les gains sont considérables, témoignant d’une activation de la
croissance, en réponse aux effets positifs de la bioprotection. Les réactions sont
variables selon le paramètre considéré, mais d’apparence plus importante en partie
aérienne (Figure 14). Le calcul des gains, par comparaison des plants bactérisés
et sans bactérisation, a révélé des taux assez conséquents notamment en biomasse
des parties aériennes et en hauteur des tiges. Avec les plants bactérisés par la
souche BB9 lyophilisée (avec protecteur) les taux sont les plus élevés,
respectivement 85 % et 68 % (Figure V.15. ).
128
Gains en hauteur
des tiges des
plants bactérisés
par apport au
témoin malade
Figure V.14 : Promotion de la croissance de la partie aérienne des plans bacterisés par
rapport au témoin positif.
Figure V.15 Gains (%) en paramètres de croissance
129
Le calcul des gains en chlorophylle totale montre une bonne stimulation de

l’activité photosynthétique, se traduisant par des gains pour tous les plants
bactérisés, avec une large supériorité chez ceux qui sont bactérisés avec la souche
BB9 (68 à 210 %). Chez les autres traitements les gains calculés varient entre 45 à
78 % (Figure V.16)
Figure V.16 Gains (%) en teneur chlorophyllienne
V.4. Discussion
L'utilisation de micro-organismes bénéfiques comme biopesticides pour réduire
les maladies de diverses cultures d'importance agronomique est considérée comme
l'une des méthodes les plus prometteuses dans les pratiques de gestion des
cultures. Dans la présente étude, nous avons évalué l'efficacité, in vitro et in planta,
de souches de P. fluorescents lyophilisées afin de déterminer l’impact de la
lyophilisation sur l’efficacité de ces souches en tant qu'agents de biocontrôle contre
F. oxysporum f.sp lycopersici.
Les trois milieux de culture utilisés ont permis l’expression de l’antagonisme par
les trois souches de Pseudomonas, et ce malgré les différences dans leur
composition chimique et son influence sur la synthèse des métabolites dont le rôle
dans le biocontrôle est reconnu, à l’exemple du milieu KB qui favorise la synthèse de
sidérophores, contrairement au milieu PDA. L'inhibition de la croissance mycélienne
même faible observée sur le milieu PDA suggère que l'inhibition observée n'était pas
due à l'action des sidérophores mais que d'autres mécanismes (antibiose
principalement) avaient été développés par la bactérie, contrairement à la croissance
130
mycélienne sur milieu KB, ce qui peut être corrélé avec la présence des
sidérophores.
Il a été démontré précédemment que l'action antagoniste de ces mêmes
souches ne semblait pas être spécifique à l'agent pathogène, mais dépendait plutôt
de le milieu de culture (Toua et al.,2013) . Dans certains cas, une efficacité à large
spectre a été observée, agissant simultanément sur plusieurs isolats fongiques de
genres différents (Fusarium, Rhizoctonia, Vertcillium et Pythium) (Benchabane,
2005). La variabilité de l'activité antagoniste des souches de Pseudomonas dans les
milieux testés suggère une diversité des mécanismes impliqués dans le contrôle
biologique. Outre le déterminisme plurifactoriel de l'antagonisme, nos résultats
soulignent la possibilité d'une efficacité large et non spécifique contre l’isolat de F.
oxysporum f.sp lycopersici. La différence de stimulation ou d'inhibition mycélienne
dans les milieux de culture résulte de mécanismes physiologiques dans les
conditions de culture.
D’une façon globale, la souche de Pseudomonas la plus active était F21
lyophilisée (54.16%), son performance peut être corrélée à son pouvoir métabolique,
notamment secondaire. Les trois souches de P. fluorescents (lyophilisées et non
lyophilisées) utilisées dans nos expériences ont montré des effets antagonistes
variés contre Fol. Ces souches de rhizobactéries sont caractérisées par des
potentialités différentes en termes de production de métabolites impliqués dans le
biocontrôle, telles que la synthèse de pyoverdine et la variation (+ ou -) d'autres
caractéristiques, notamment la synthèse de phénazines et la production de HCN
(tableau V.1).
Le fer est un élément indispensable à la germination conidienne. La production
en quantité importante de métabolites chélateurs de Fe+3, permet aux Pseudomonas
spp. fluorescents de s’approprier le fer nécessaire à leur croissance et de le rendre
inassimilable pour les autres microorganismes (Lemanceau et al., 1986; Jacques et
al., 1993). Des effets inhibiteurs par des pseudobactines purifiées des souches
WC358 et WC417 de Pseudomonas putida ont été obtenus in vitro sur la germination
conidienne de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Duijff et al., 1993) et de
F.oxysporum f.sp.lini (Reddy, 1992). Cependant Weller et al., (1988), ont rapporté
que la compétition pour le fer n'est pas le seul mode d'action des Pseudomonas spp.
fluorescents antagonistes. Fravel (1988), a montré l'absence de corrélation entre
l'activité antagoniste des Pseudomonas spp. fluorescents et la concentration en
131
pigment fluorescent, même si ces bactéries sont plus aptes que les Fusarium à
mobiliser le fer. Ces rhizobactéries possèdent d'autres mécanismes inhibiteurs, qui
peuvent être liés à la synthèse d’antibiotiques et à d'autres types de métabolites
secondaires à effet d'antibiose (Lemanceau, 1988; Lemanceau, 1992). Selon
Figueroa‑Lopez et al., (2016), l'analyse de l'activité antagoniste in vitro a révélé que
la souches de Pseudomonas fluorescens produit des glucanases, des protéases ou
chitinases, ainsi que sidérophores et auxines et suggèrent que ces mécanismes de
contrôle sont possibles contre Fusarium verticillioides de maïs.
D’autres métabolites produits par ces Pseudomonas spp fluorescents peuvent
également interférer avec la croissance des phytopathogènes ; il s’agit d’enzymes
mycolytiques, de l’acide cyanhydrique ou de l’ammoniaque (Jacques et al.,1993).
D’après les travaux de Howell et Stipanovic (1980), de nombreuses molécules
antibiotiques sont impliqués, notamment la pyolutéorine et la pyrrolnitrine. Ces
antibiotiques ont inhibé in vitro la croissance de Pythium ultimum et de Rhizoctonia
solani. Il a été démontré également que certaines souches de Pseudomonas
fluorescens ont la capacité de produire le 2,4 diacétylphloroglucinol (Phl) qui se
caractérise par des effets d'antibiose (Keel et al., 1990, 1991).
Les essais d’antagonisme conduits in situ vis à vis des fusarioses de la tomate
ont mis en évidence une action globalement similaire des souches de Pseudomonas
lyophilisées et non lyophilisées. Cette action s’est traduite par une réduction du taux
d’infection (nombre de plants malades) et de la sévérité des symptômes. Les
souches BB9 et BB10 ont exercé un contrôle sur la maladie, contrairement à F21
(crème fraichement préparée et en lyophilisat sans protecteur). Toutes les souches
actives présentent un profil de synthèse de métabolites secondaires qui les
prédisposent à un pouvoir de bioprotection.
L’application des Pseudomonas spp. fluorescents assure une bioprotection
significative des plants de tomate vis-à-vis de la fusariose vasculaire. Cette
bioprotection s’est montrée variable selon les souches appliquées. Malgré l’apparition
et l'évolution de l’infection chez tous les traitements étudiés, les situations de
bactérisation ont influencé positivement le développement des plants de tomate en
réduisant la maladie avec des degrés appréciables. Les plants bactérisés montrent
une tolérance à la fusariose vasculaire, se manifestant par un ralentissement de la
cinétique de la maladie par rapport aux témoins positifs, caractérisés par une
progression assez rapide et vigoureuse.
132
La comparaison entre le taux d’infection et la sévérité de la maladie (Indice de

Mckinney) permet de constater que malgré la progression de la maladie, la sévérité
reste moins développée sur les plants bactérisées par rapport aux témoins positifs.
Dans cette étude, globalement, les souches de rhizobactéries les plus actives
étaient BB9 et BB10 quel que soit leur état lyophilisé ou culture fraiche et leurs
activités antagonistes peuvent être corrélées à leurs caractères métaboliques,
notamment leurs métabolites secondaires (phénazines de la souche BB9) (Tableau
V.1). L'inefficacité de la souche F21 contre F. oxysporum f.sp lycopersici est
probablement liée à son origine rhizosphérique. On distingue généralement deux
types de suppression de maladie: (i) la suppression de maladie spécifique (Weller et
al., 2002) est provoquée par un ou plusieurs micro-organismes spécifiques
(génotypes), tels que les Pseudomonas produisant du phloroglucinol supprimant
Gaeumannomyces graminis (Raaijmakers et Weller, 1998) et (ii) la suppression
générale de la maladie est provoquée par plusieurs microorganismes agissant contre
de multiples agents pathogènes et est rétablie rapidement après une perturbation
majeure (Hoitink et Boehm, 1999). La présence d'antagonistes agissant
spécifiquement peut se produire n'importe où, mais elle semble être dominante dans
le sol rhizosphérique et, par conséquent, elle n'est pas entièrement compatible avec
la suppression des agents pathogènes (Termorshuizen et Jeger, 2008).
La réduction de la sévérité de la maladie causée par Fol au cours de notre
essai sous serre, peut-être expliquer par plusieurs mécanismes de bioprotection en
produisant des sidérophores, acide cyanhydrique, Phenazines (Phz), et certaines
enzymes de dégradations de parois cellulaire tels que la protéase et chitinase (
Tableau V.1). Il apparait clairement que ces mécanismes responsables des effets de
certaines souches de Pseudomonas spp. fluorescents reposent sur leurs activités
antagonistes par la production des métabolites secondaires à l’encontre des agents
phytopathogènes (Digat, 1994).
Les Pseudomonas excrètent des molécules qui inhibent la croissance des
phytopathogènes notamment les antibiotiques (Jacques et al., 1993). Ces
métabolites sont capables d’interférer avec la germination, la croissance mycélienne,
la physiologie cellulaire et/ou la sporulation des agents phytopathogènes (Lepoivre,
2003). Plusieurs antibiotiques sont synthétisés par les Pseudomonas, tels que l'acide
phénazine-1-carboxyclique, 2,4diacetyl phoroglucinol (DAPG), oomycine,
pyoluteorine, pyrrolnitrine, kanosamine, zwittermycine-A,pantocine (Fernando et al.,
133
2005; Suty,2010), la viscosamide et les butyrolactones .Ces molécules sont

impliquées dans le biocontrôle (Raaijmakers et al. 1995; Haas et Keel 2003; Haas et
Defago 2005).
Les Pseudomonas fluorescents produisent d’autres métabolites, de nature
volatile qui peuvent interférer avec la croissance des phytopathogènes. Il s’agit de
l’acide cyanhydrique (HCN) (Jacques et al., 1993) et les butyro-lactones (Suty
,2010). D’après les travaux de Neito et al., (2013), Hernández et al., (2016), Meyer et
al., (2016), plusieurs souches de Pseudomonas fluorescens produisent divers
composés diffusibles et volatils impliqués dans la protection des plantes contre
plusieurs agents phytopathogènes. Ces métabolites secondaires avec des
propriétés antifongiques et antibactériennes tels que le cyanure d'hydrogène et le
2,4diacetyl phoroglucinol (DAPG) assurent le contrôle biologique des agents
phytopthogènes comme le fusarium oxysporum spp. lycopersici agent causale de la
fusariose vasculaire de la tomate et Fusarium oxysporum f. Sp. Niveum (Fon) agent
causale de la fusariose de pastèque.
D’après l’hypothèse de Sedra et Maslouhy (1994), selon laquelle ces
antagonistes sécrètent des substances antibiotique, ces dernières agissent sur le
parasite par une lyse du mycélium ; ceci est à l’origine du phénomène
d’aplatissement des colonies observé face aux antagonistes.
La réduction de la maladie peut être également, le résultat d’une colonisation
importante des racines ou des sites de l’infection par ces rhizobactéries bénéfiques,
ce qui réduit l’espace nécessaire à la croissance du pathogène (Jacques et al., 1993
; Suty, 2010). Ces caractéristiques expliquent leur aptitude à s’installer en nombre et
durablement sur et à proximité des racines (Latour et Lemanceau, 1997). La
colonisation des tissus de la plante joue un rôle primordial dans le biocontrôle (Chin-A-
Woeng et al., 2000).
Les résultats de la vérification de la viabilité et de la dynamique microbienne ont
confirmé la survie des Pseudomonas spp. fluorescents utilisés dans nos essais et
leur capacité de coloniser la rhizosphère et se multiplier sur les racines des plants de
tomate. Les Pseudomonas fluorescents sont connus par leur forte colonisation des
racines, leur utilisation de plusieurs substrats comme source de carbone et la
diversité de leur métabolisme (Latour et Lemanceau, 1997 ; Whipps, 1997 ; Misko et
Germida, 2002 ; Lugtenberg et Kamilova, 2009).
134
La croissance et l'activité du système racinaire induisent des modifications non

significatives des propriétés physico-chimiques et biologiques du sol entourant la
racine (effet rhizosphérique) dues à la rhizodéposition. La capacité à prendre en
charge certains agents de lutte biologique varie selon les espèces de plantes, les
cultivars et les génotypes (Lucy et al., 2004). La sécrétion de rhizodéposition est un
moyen important pour les plantes de réagir à leur environnement. Les exsudats
racinaires facilitent la communication entre les plantes et d'autres organismes
(agents pathogènes et antagonistes) et stimulent les réactions de défense contre les
agents pathogènes du sol et / ou favorisent l'association à des agents bénéfiques.
L’espèce végétale, le cultivar et le stade phénologique jouent également un rôle
primordial dans la modulation de la quantité et de la qualité des exsudats de racines,
similaire aux réactions physiologiques aux facteurs de stress lors du développement
de micro-organismes dans la rhizosphère et à leur adhésion aux composés de la
racine (Nelson , 1991; Lugtenberg et al., 1999)
Les résultats de la bactérisation de la plante avec les souches de P.
fluorescens ont montré divers degrés de bioprotection qui ont été invoqués chez la
tomate, ainsi que dans d'autres plantes (Kloepper et al., 1980; Maurhofer et al.,
1995; Raaijmakers et Weller, 1998). Les PGPR antagonisent les champignons
phytopathogènes, principalement par la production de métabolites antimicrobiens,
mais aussi par la compétition pour les niches de fer ou de rhizosphère (Keel et al.,
1992) et la stimulation des défenses de l'hôte (résistance systémique induite) (Van
Loon et al., 1998). D'autres mécanismes sont directement impliqués dans la
promotion de la croissance des plantes et modulent l'activité de biocontrôle de la
bactérie (Lemanceau et Alabouvette, 1993; De Werra et al., 2009).
Les résultats du réisolement de l’agent pathogène de la fusariose vasculaire à
partir des fragments racinaires et des tiges de plants infectés par F.O.L révèle un
développement mycélien intense après 48 h d’incubation comparativement avec les
plants bacterises et infectés par Fol. La germination des conidies de FOL est
déclenchée par les exsudats de la tomate (Kamilova et al., 2008). Selon Olivain et
Alabouvette, (1999), les souches pathogènes de FOL colonisent rapidement la
surface des racines de leur plante hôte (tomate) en formant un réseau dense
d'hyphes.
Les signaux affectant la germination des spores de F. oxysporum, l'agent
pathogène de la tomate, ne semblent pas être spécifiques à l'hôte, un schéma
135
similaire de germination microconidiale ayant été observé en présence d'exsudats de

racines de la plante tomate hôte et de plusieurs plantes non hôtes (poivrons,
haricots, orge, tabac et concombre). Cependant, certains signes indiquent que les
composés présents dans les exsudats de racines de tomate ont un effet spécifique et
il a été rapporté que le taux de germination de plusieurs souches de F. oxysporum
est affecté différemment par les exsudats de racines de tomate (Steinkellner et al.,
2008). Aucune différence dans le développement mycélien de F. oxysporum n'a été
observée à proximité des racines de tomate et de blé, de sorte que les plantes non
hôtes peuvent fonctionner comme des porteurs asymptomatiques de la fusariose
(Steinberg et al., 1999). La variation observée peut être attribuée à la variation
biologique des souches fongiques et / ou des structures cellulaires.
Cependant, d'autres études sont nécessaires pour caractériser les composés
de signalisation dans les exsudats de racines de plantes susceptibles d'être
impliqués dans les interactions des plantes hôtes avec F. oxysporum. Les processus
de développement des spores étant essentiels à la reproduction et à la survie des
champignons. La germination des spores d’un champignon phytopathogène peut
être considérée comme une étape cruciale du développement de la pathogenèse : la
germination doit avoir lieu à la fois au bon moment et au bon endroit pour que
l’infection soit efficace ( Seong et al., 2008).
Le processus d'infection de F. oxysporum comprend les étapes suivantes :
germination des spores en réponse à des exsudats de racines, production d'hyphes
de pénétration qui s'attachent à la surface de la racine et la pénètrent directement, et
croissance envahissante dans les tissus de la plante hôte (Rodríguez-Gálvez et
Mendgen , 1995). La stimulation des agents phytopathogènes par les exsudats de
racines fait partie intégrante du concept de potentiel d'inoculum (Lockwood, 1986) et
de nombreuses études ont été menées sur la biologie de F. oxysporum et le
processus de colonisation (Steinkellner et al., 2008). Les exsudats de racines sont
supposés jouer un rôle clé dans la détermination du résultat positif ou négatif d'une
interaction dans la rhizosphère par divers métabolites appelés stimuli généraux de la
germination des spores (Nelson, 1991 ; Bais et al., 2006).
À différents stades de croissance, les racines des tomates dégagent des
quantités variables de sucres et d'acides organiques et, en fonction de l'âge de la
plante, l'effet des exsudats de racines de tomates sur la germination des spores de
136
l'agent pathogène de la tomate F. oxysporum varie également (Lugtenberg et al.,

1999; Steinkellner et al., 2008).
Il a été rapporté que l'application préalable d'un agent biologique inducteur
(Pseudomonas spp. fluorescents) déclenche ou active les mécanismes de défense
latents des plantes, en réponse à l'infection avec les pathogènes (Ramamoorthy,
2002). L’application de ces rhizobactéries sous conditions de serre déclenche l’ISR,
qui protège significativement le radis vis-à-vis de la fusariose vasculaire et augmente
le rendement de 40 % (Leeman et al., 1995).
De même, le 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) produit par P. fluorescens
CHA0 et Q2-87, possède une action inhibitrice directe sur les pathogènes, en même
temps, il est essentiel pour induire des réactions de défense chez Arabidopsis et
chez la tomate (Audenaert et al., 2002; Siddiqui et Shaukat 2002; Weller et al.,
2004). Selon Saikia et al., (2003), P. fluorescens induit la résistance systémique chez
le pois chiche et réduit la sévérité de la fusariose vasculaire avec des taux allant de
26 % à 50 %.
En plus de l’effet protecteur des souches lyophilises et non lyophilisés en
interaction avec le pathogène, l’essai in planta de la promotion de la croissance par
l’utilisation des de Pseudomonas a montré une amélioration de la croissance
végétale. L’amélioration est significative sur les paramètres de croissance étudiés
ainsi que sur les teneurs en chlorophylle totale comparés au témoin non inoculé.
Cette amélioration a permis une augmentation une biostimulation remarquable en
hauteurs des plants, et phytomasse des parties aériennes et souterraines chez les
des plants bacterisés par les isolats de Pseudomonas. Le calcul des gains a révélé
des taux assez conséquents notamment en biomasse des parties aériennes et en
hauteur des tiges. Avec les plants bactérisés par la souche BB9 lyophilisée (avec
protecteur) les taux sont les plus élevés, respectivement de 85 % et 68 %.
D’après les travaux de Kamal et al., (2008), l'application de Pseudomonas
fluorescents entraîne une augmentation de la longueur du système racinaire et de la
partie aérienne, du poids sec ainsi que le rendement en tomates. Il a été rapporté
que ces bactéries jouent également un rôle dans la promotion de la croissance par la
production d'hormones végétales, telles que les auxines les gibberellines et d'autres
substances favorisant la croissance (Figueroa‑Lopez et al., 2016). La synthèse d’AIA
par les Pseudomonas est très bénéfique pour la croissance et le développement
végétal, elle est largement répandue chez ces rhizobactéries et environ 80% des
137
bactéries rhizosphériques sont capables de produire cette phytohorme (Khan 2014).

L'acide indol-3-acétique (IAA) est une phytohormone qui influence de nombreuses
fonctions cellulaires chez les végétaux et par conséquent, est considérée comme un
régulateur important de la croissance et du développement des plantes. Cette
phytohormone est impliquée dans l’initiation de la division des cellules au niveau des
racines et de leur élargissement. Cet effet engendre une surface racinaire plus
grande, avec une meilleure accessibilité pour plus de nutriments pour la plante et par
conséquent stimule efficacement sa croissance.
L’amélioration de l’alimentation minérale de la plante en phosphore a été parmi
les premières hypothèses proposées pour expliquer l’effet bénéfique engendré par la
bactérisation des plantes (Weller 2007). Les Pseudomonas spp. fluorescents,
augmenteraient la concentration en phosphore soluble soit par minéralisation des
phosphates organiques, grâce à des phosphatases, soit par solubilisation des
phosphates inorganiques sous l’effet d’acides (Berthelin et al. 1991). La relation
entre la solubilisation du phosphate et le pH indique que les conditions acides
observées par la diminution du pH, joueront un rôle dans la solubilisation de
phosphate (Taguet, 2015).
Les résultats de l’essai in planta obtenus par la présente étude sur l’effet,
révèlent une augmentation significative sur les teneurs en chlorophylle totale
comparés au témoin non inoculé. Les meilleurs résultats ont été obtenus par la
souche BB9 (68 à 210 %) comparativement aux autres traitements (F21 et BB10) ou
les gains calculés varient entre 45 à 78 %. Nos résultats concordent avec ceux d’une
étude réalisée par Boukerma et al., (2017) ; ou la teneur en chlorophylle des
plantes bactérisées par rapport aux témoins, a montré une augmentation des
pigments de chlorophylle chez les plants de tomate traités avec les souches de
Pseudomonas fluorescens PF15 and Pseudomonas putida PP27 ou leur
combinaison. Cependant, les témoins présentent une faible valeur d'indice de
chlorophylle.
Selon Sharma et al., (2003) et Farhan et al., (2010), les souches de
Pseudomonas spp. fluorescentes peuvent augmenter les teneurs totale en
chlorophylle dans les plantes cela révèle l'effet positif des PGPR appliquées sur la
physiologie végétale. La capacité des Pseudomonas spp. fluorescents d’augmenter
le niveau en chlorophylle totale chez les plantes peut être liée à leur
approvisionnement en certains éléments nutritifs tels que l’azote et le phosphore
138
(Hameed et Farhan, 2007). D’après les travaux de Browne et al. ,( 2009) et Miller
et al., (2010), les Pseudomonas spp. fluorescents possèdent une grande capacité de
solubiliser le phosphate, en produisant des acides organiques et des phosphatases
acides (Rodríguez et Fraga, 1999). Il a été signalé que la RuBisCO produite par les
plantes bactérisées avec P. fluorescens KH-1 (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase
- oxygénase) joue un rôle primordial dans la photosynthèse et l'accumulation de la
chlorophylle (Agrios, 2005 ; Kandasamy et al., 2009).
L’utilisation des rhizobactéries comme le genre de Pseudomonas spp.
fluorescents favorisent la croissance des plantes en agriculture, peut permettre de
stimuler la croissance des plantes et d’inhiber l’action des pathogènes. L’emploi des
PGPR modifiés génétiquement ou non peut permettre de diminuer l’utilisation des
pesticides (Beauchamp, 1993). Plusieurs études corroborent nos résultats, Asha et
al., (2011), ont confirmé que les Pseudomonas spp. fluorescens ont été efficaces
pour favoriser la croissance des plantes dans des conditions de terrain
(Ramamoorthy et al., 2002) et interviennent sur l’augmentation de la germination des
graines , de la vigueur des semis, croissance des racines, croissance des pousses,
la biomasse totale des plantes, poids de graines, et le rendement des fruits, etc (Van
Loon et al., 1998 ; Ramamoorthy et al., 2001 ; Nezarat et al., 2009). Ces activités de
promotion de la croissance des plantes de P.fluorescens a été signalé dans des
cultures telles que le riz, le blé, Sorgho, tomate, Concombre et tournesol (Prasad et
al., 2002 ; Niranjan et al., 2004 ; Jeun et al., 2004).
A travers nos résultats, nous considérerons que la lyophilisation est une
technique préconisée dans le cas des Pseudomonas spp. fluorescents vue que c’est
une technique appropriée pour la production de cultures bactériennes concentrées,
une méthode établie pour préserver les micro-organismes en gardent toutes leurs
viabilités et efficacités avec l'avantage que le matériel séché peut être stabiliser,
stocké à température ambiante pour de longues périodes, facilement transporté et
manipulée. Par contre, pour que le la lyophilisation soit prioritaire et recommandé
aux souches de Pseudomonas spp. fluorescents par rapport aux autres traitements
physiques préexistants, il est conseiller d’apporter une cryoprotection avant le
processus de lyophilisation.
139
Discussion générale
Il est reconnu que les espèces du genre Pseudomonas, de par leur ubiquité,
sont fréquemment isolées de différentes niches écologiques. Certaines peuvent agir
comme des pathogènes des animaux des plantes ou des champignons, alors que
d’autres sont des bactéries bénéfiques vivant librement dans le sol (Achouak et al.,
2000). Les études de microbiologie du sol sont assez vastes, concernant la présence
et l’implication des Pseudomonas dans les cycles géochimiques, dans les processus
de pédogenèse, dans leurs interactions à différents niveaux avec les autres
communautés microbiennes telluriques et avec les plantes. Avec ces dernières les
relations sont très diversifiées et se présentent sous les formes parasitaires,
saprophytes et aussi mutualistes.
Les prélèvements de sols à partir des quatre biotopes étudiés ont permis de
constater l'existence de densités appréciable en populations de Pseudomonas spp.
fluorescents. Ceci témoigne de l'adaptation de ces rhizobactéries à ces biotopes dont
les caractéristiques pédoclimatiques et végétales sont pourtant relativement
différentes. Les fréquences de ces bactéries sont variables en fonction du biotope
considéré. La colonisation des sols de palmeraies s’est montrée considérable, où la
fréquence d'isolement de souches de Pseudomonas spp. fluorescents a atteint 70%,
même si les conditions de sol et de climat sont relativement extrêmes pour l'activité
microbienne mésophiles. Donc, d’une part la plante peut exercer des effets directs
sur la modification des caractéristiques physico-chimiques et biologiques du sol,
modulant ainsi sa réceptivité et sa colonisation par les microorganismes. D’autre
part, nous constatons que les prélèvements des sols des autres cultures (pommier,
poirier et tomate) sont aussi assez riches en espèces de Pseudomonas. Donc, outre
les caractéristiques purement pédologique et climatique, la plante, par le biais de ses
exsudats racinaires, notamment quand il s’agit de plantes pérennes dont l’effet
rhizosphère se construit à long terme, peut exercer un effet sélectif interactif avec les
communautés microbiennes telluriques.
L'effet rhizosphère engendre des modifications biotiques et abiotiques dans le
sol sous l'influence de la plante. La population bactérienne de la rhizosphère est 100
à 1000 fois plus élevée que celle du sol environnant. La rhizosphère est fortement
influencée par des entités microbiennes possédant une polyvalence métabolique
adaptée à l’utilisation efficace des exsudats racinaires (Latour et al., 1997; Latour et
141
al., 2003). Les racines des plantes synthétisent, accumulent et sécrètent un large
éventail de composés et de substrats, dont les caractéristiques chimiques modifient
régulent la structure de la communauté microbienne évoluant aux alentours des
racines (rhizoplan et rhizosphère) (Lemanceau, 1992; Dakora et Phillips, 2002).
En utilisant une approche polyphasique pour une identification aussi précise
que possible, des souches sélectionnées des quatre biotopes, nous avons adopté
les méthodes de l’identification phénotypique décrites par Digat et Gardan (1987)
inspirées de Stanier et al., (1966), la clé dichotomique proposée par Bossis (1995), le
recours au système BIOLOG GENIII et les méthodes génotypiques avec l'analyse
des séquences du gène de l'ARNr 16S. L'identification taxonomique a permis de
retrouver les principales espèces du groupe des Pseudomonas spp. fluorescents
avec une nette dominance de P. fluorescens. Même si les fréquences d'isolement
des autres espèces (P. putida, P.aureofaciens et P. chlororaphis) sont moindres, leur
présence témoigne de l'ubiquité et des capacités d'adaptation de ces rhizobactéries
aux différentes conditions écologiques et agronomiques caractérisant nos biotopes.
Il est à souligner que les caractérisations phénotypiques utilisées n’ont pas
permis de réaliser une identification totale et précise. De plus la comparaison des
résultats obtenus par ces méthodes fait ressortir des divergences entre elles. La
détermination des profils trophiques des souches a mis en évidence une grande
diversité dans leur métabolisme carboné ; néanmoins il n’y pas eu de concordance
entre les résultats de l’identification et les profils trophiques, ce qui révèle les limites
des tests phénotypiques d’identification des Pseudomonas. Ces résultats confirment
la faiblesse de ces approches phénotypiques pour une caractérisation stable à
l’échelle spécifique.
Nous revenons sur la faiblesse de la caractérisation taxonomique de ce groupe
bactérien, qui n’est pas nouvelle ; elle a ouvert le champ à de nombreuses
investigations et propositions, d’où de nombreux travaux récents proposent de
nouvelles affiliations d’espèces. La majorité des études taxonomiques sur les
Pseudomonas spp. fluorescents a révélé la complexité de la variabilité au niveau des
différentes espèces appartenant à ce groupe (Palleroni et Doudorof , 1972; Palleroni
et al., 1984; Peix et al., 2009 ). Sur le plan taxonomique, le travail réalisé sur ce
groupe des Pseudomonas spp. fluorescents, dans des biotopes algériens montre
cette complexité où il était difficile d’en réaliser une distinction précise entre les
différentes espèces (Benchabane, 2005).
142
L'énorme hétérogénéité phénotypique et génétique démontrée chez les

souches de P. fluorescens (Loper et al., 2012 ), a conduit à une évaluation imprécise
de sa phylogénie, selon laquelle un complexe d'espèces façonne la phylogénie de
cette espèce (Seaton et Silby, 2014). Une autre difficulté de ce groupe est la
description fréquente de nouvelles espèces, telles que P. protegens (Ramette,
2011), et de sous-espèces, telles que P. brassicacearum subsp. néoaurantiaca
(Ivanova et al., 2009), et l’inclusion de souches dans le groupe P. fluorescens (P.
sp.UW4) (Duan et al.,2013). En somme même avec les outils moléculaires,
l’imprécision taxonomique reste posée, notamment avec certaines espèces et leurs
sous espèces. Nous assistons ces dernières années à des révisions taxonomiques,
à de nouvelles espèces et au reclassement d’autres. Bien que le gène de l'ARNr 16S
soit l'outil de base du système de classification bactérien actuel, il est connu que des
espèces étroitement apparentées de bactéries ne peuvent pas être différenciées sur
la base de ce gène. Ainsi, d’autres travaux utilisent d’autres séquences génétiques,
codant pour des gènes d’entretien (ménages) à titre de marqueurs moléculaires
(Sánchez et al., 2014), ou à travers l'analyse de séquence multilocus (MLSA) (Mulet
et al., 2010), pour mieux appréhender la complexité de ce groupe bactérien.
L’efficacité des isolats de Pseudomonas fluorescents, à titre de microorganisme
phytobénéfiques, notamment dans le biocontrôle des agents phytopathogènes et/ou
la stimulation de la croissance et de la nutrition des plantes, dépendra évidemment
sur la convergence d’une multitude de propriétés physiologiques, métaboliques et
écologiques. De notre première partie de ce travail (chapitre II), il en est ressorti 17
isolats présentant des caractéristiques de candidature potentiellement recherchées.
En effet, de nombreux isolats sont capables de synthétiser une multitude de
métabolites secondaires reconnus comme importants dans le biocontrôle
(Pyoverdines, Phénazines et HCN), ou encore en phytostimulation (AIA et
Phosphatases).
L’essentiel était concentré sur les métabolites fortement prouvés dans leurs
actions (chapitre III), notamment les sidérophores pour dépasser la limitation en fer
et le fournir sous forme bodisponible et assimilable aux plantes (Vejan et al., 2016).
Quelques isolats ont montré leur capacité de production in vitro de l’AIA et des
phosphatases, dont leurs rôles ne sont pas à démontré en biostimulation et en
nutrition phosphatée. L’AIA est un régulateur clé de nombreux aspects de la
croissance et du développement des plantes, notamment la division et l'élongation
143
cellulaires, la différenciation, les tropismes, la dominance apicale, la sénescence,

l'abscission et la floraison (Ahemad et Kibret, 2014). Les PGPRs solubilisent et
minéralisent directement le phosphore inorganique ou facilitent la mobilité du
phosphore organique par le renouvellement microbien et/ou augmentent le système
racinaire (Richardson et Simpson, 2011). Le phosphore est impliqué dans les
processus métaboliques des plantes, tels que la photosynthèse, le transfert
d'énergie, la transduction du signal, la biosynthèse macromoléculaire et la respiration
(Khan, et al., 2010)
En termes de biocontrôle, la synthèse de l’HCN et de métabolites
phénaziniques, retrouvées chez trois de nos souches (BB9, PI9, F21), constitue un
atout dans les activités antagonistes et compétitrices dans la rhizosphère. D’ailleurs
ces souches ont manifesté un pouvoir antagoniste important vis-à-vis des
pathogènes fongiques et bactériens testés, se traduisant par une activité
antimicrobienne inhibitrice à leur égard. Outre ces métabolites, les chitinases, les
glucanases, les protéases et les lipases peuvent protéger les plantes de ces stress
biotiques (Gupta et al., 2015). Ces enzymes lytiques digèrent et déforment les
composants de la paroi cellulaire des champignons pathogènes.
Une grande partie des métabolites secondaires synthétisés par les
Pseudomonas spp. fluorescents présentent un large spectre d’action vis à vis
d’agents phytopathogènes telluriques fongiques et bactériens. Ils sont caractérisés
par des structures particulières nécessaires à leur action par complexation avec des
composés organiques rhizosphériques. La production de ces métabolites est
considérée comme l’un des moyens favorisant leur compétence écologique.
Les travaux de chapitre IV ont été orientés sur la conception de formulations, à
base de souches bactériennes sélectionnées, en étudiant l’impact de la lyophilisation
et d’estimer leur viabilité après stockage de longue durée. La lyophilisation est
souvent sollicitée dans les procédés de conception des inoculats microbiens et selon
les critères considérés, six souches (BB2, BB9, BB10, F21, PI9 et GP4) ont été
retenues. L’analyse de la viabilité nous a semblé liée aux profils des souches
bactériennes en acide gras membranaires. Six principaux acides gras ont été
identifiés (palmitique, palmitoléique, stéarique, oléique, linoléique et linolénique), qui
peuvent en avoir un lien avec la thermorésistance des souches sélectionnées. Les
acides gras saturés régulent la fluidité et la perméabilité membranaire chez les
bactéries, notamment en situation de stress (Russell et al., 1989).
144
Pour toute application de préparations bactériennes lyophilisées, l’obtention

d’une concentration élevée en cellules viables et cultivables est requise. La
détermination de cette viabilité cellulaire est systématique. Dans nos formulations, in
fine, les analyses de cytométrie en flux montrent que la perte de viabilité est plus
prononcée au cours du séchage qu’au cours du stockage. Le recours aux agents
protecteurs (maltodextrine et glycérol), pendant le processus de lyophilisation n’a pas
d’effets remarquables sur la viabilité bactérienne, cependant il influence positivement
la stabilité des lyophilisats obtenues pendant les cinq années de stockage.
Dans la dernière partie de ce travail (Chapitre IV), la vérification de l’efficacité,
en plus de la viabilité des lyophilisats bactériens conçus, apparaissent acceptables
par rapports aux prérequis d’application. Les potentialités antagonistes restent
significatives in vitro et in situ. La variation de l’activité antagoniste in vitro dépend
non seulement des souches antagonistes, mais aussi du milieu de culture utilisé. Les
essais d’antagonisme conduits in situ, vis à vis de la fusariose vasculaire de la
tomate, confirment ceux obtenus in vitro concernant l’état des souches utilisées.
Globalement, les actions restent similaires, en état de lyophilisats ou en cultures
fraichement préparées, dans la réduction des taux d’infection et de la sévérité des
symptômes.
Dans le criblage de souches rhizobactériennes potentielles, Il est nécessaire de
comptabiliser à la fois, les aptitudes d’adaptation et d’évolution dans les
environnements rhizosphériques ; comme il en ressort également que leurs activités
antagonistes puissent être corrélées à leurs métabolites secondaires qui seront
impliqués de facto dans les effets phytobénéfiques désirables.
145
Conclusion générale
Dans cette étude, des caractérisations ont été effectuées, in vitro et in situ, sur
des souches de Pseudomonas isolées à partir de divers environnements (biotopes)
du sud d’Algérie, dans l’objectif est d’aboutir à sélectionner celles qui sont douées
d’effets phytobénéfiques, en phytostimulation et en biocontrôle des agents
phytopathogènes. Notre travail a permis d’identifier des caractères (morphologiques,
biochimiques, génomiques et métaboliques) reconnus aux Pseudomonas spp.
fluorescents. 100 souches de Pseudomonas spp. fluorescents sont isolées des
quatre biotopes (palmeraie, poirier, pommier et tomate), montrant ainsi l’ubiquité et
l’adaptation de ce groupe bactérien, en particulier dans les sols cultivés (effet
rhizosphère).
Les quatre espèces types de ce groupe P. fluorescens, P. putida, P.
chlororaphis et P. aureofaciens ont été retrouvées avec la prédominance de la
première espèce, particulièrement de son biovar III (ou biotype). Il est à souligner
que les caractérisations phénotypiques utilisées n’ont pas permis de réaliser une
identification précise. Cependant, il n’y a pas de concordance entre ces résultats et
ceux des profils trophiques. Nous réitérons les limites des tests phénotypiques pour
une identification totale et précise des Pseudomonas. Les résultats obtenus par
approche moléculaire en les comparants avec les résultats phénotypiques (clé
dichotomique et Biolog GENIII) révèlent la complexité et la variabilité au niveau des
différentes espèces. Cependant l’identification phénotypique et génotypique a révélé
une forte hétérogénéité du genre Pseudomonas.
Le criblage, via les tests du pouvoir antagoniste, a dégagé 17 souches montrant
de fortes activités inhibitrices in vitro vis-à-vis de phytopathogènes fongiques et
bactériens. En explorant certains aspects du métabolisme secondaire, impliqués
dans les activités phytobénéfiques, ces souches sont avérées productrices de :
siderophores (Sid), de cyanure d’hydrogène (HCN), de l’acide indole-3-acétique
(AIA, jusqu’à 18,3 µg/ml), de phosphatase, de chitinase, et d’enzymes protéolytiques.
Des composés phénaziniques, à effet antibiotique, ont été extraits et d’après les
résultats d’antibiographie contre des germes-cibles, les extraits à l’acétate d’éthyle
ont donné de meilleurs résultats par rapport aux dichlorométhane et l’hexane. Les
analyses de ces composés, par chromatographie en couche mince (CCM) et
chromatographie liquide à haute performance (HPLC), indiquent que les deux
147
souches PI9 et F21 sont productrices de l’acide phénazine-carboxylique (PCA). La

souche BB9 est suspectée productrice d’un autre composé phénazinique ou d’un
dérivé phénazinique.
Les résultats des essais de formulation de trois souches de Pseudomonas, en
adoptant un protocole de lyophilisation non optimisé, montrent que leur viabilité est
fortement affectée par les procédures de la lyophilisation. Le recours aux techniques
de la cytométrie en flux a permis une meilleure détermination de l'état physiologique
cellulaire (cellules viables, cellules mortes et cellules viables mais non cultivables).
Les résultats, montrent que la souche F21 est la plus sensible à la lyophilisation.
Cette sensibilité s’est traduite par une importante diminution de la concentration des
cellules viables (de 34% à 0,8%). Une quantité importante en cellules intermédiaires
(pas totalement viables) a été observée pour les souches BB9 (24,6%) et F21
(34,6%), que l’on peut récupérer en utilisant un milieu adéquat. Dans les essais de
stockage des lyophilisats, les cryoprotecteurs ont pu influencer, relativement, la
stabilité des préparations microbiennes séchées lors du stockage avec des taux de
viabilité relativement variables (13,28% et 25,21%) enregistrés respectivement, avec
les souches BB9 et F21.
Les résultats de l’application pratique des souches lyophilisées contre la
fusariose vasculaire de la tomate montrent que la bactérisation n’a pas éliminé
totalement le développement de l’infection, mais la sévérité a diminué de façon très
significative, dénotant une régression dans la virulence où les taux d’inhibition sont
parfois au-delà de 40 %. A travers nos résultats, il ressort que les actions restent
similaires, en état de lyophilisats ou en cultures fraichement préparées. La
symptomatologie s’est stabilisée au stade primaire de jaunissement généralisé,
considéré comme une légère infection chez tous les plants bactérisés, par rapport au
témoin où tous les plants sont morts. Comme il a été démontré que ces souches ont
induit des phytostimulations appréciables en hauteurs des plants, en phytomasse
des parties aériennes et souterraines ainsi que sur les teneurs en chlorophylle totale.
Enfin, nous pouvons dire alors que la lyophilisation, même si la viabilité des
souches est lourdement atteinte, mais les lyophilisats conçus gardent relativement
leur efficacité en biocontrôle et en phytostiumulation.
148
Que ce soit au niveau fondamental ou appliqué, de la compréhension du

phénomène d’interaction plantes-microorganismes, de nombreuses perspectives
découlent de cette recherche.
La poursuite de l’identification moléculaire des souches déjà identifiées par
séquençage des gènes de ménage et l’analyse par MLSA ou (Multi Locus Sequence
Analysis).
Des études plus approfondies sur les mécanismes biochimiques, moléculaires
et physiologiques qu’exercent les bactéries sélectionnées, sont nécessaires pour
améliorer nos connaissances dans ce domaine qui reste toujours sous-évalué.
D’un point de vue appliqué, un complément d’information, notamment
protéomique est nécessaire pour concevoir une utilisation efficace et rationnée de
ces bactéries, en tant que biopesticides et/ou biofertilisants. De ce fait, plusieurs
expériences complémentaires doivent être réalisées, en l’occurrence, élargir le
spectre des plantes hôtes et des pathogènes.
La procédure de lyophilisation adoptée nécessite son optimisation au vue des
taux de viabilités obtenus. Ainsi, l’expérimentation et l’élaboration d’autres protocoles
plus adaptés sont préconisées, en testant d’autres adjuvants ou agents
cryoprotecteurs (CPA) pour rehausser les taux de viabilité, garantissant la
conservation et l'efficacité des préparations lyophilisées.
Tester les souches bactériennes dans des phénomènes inductibles autres que
ceux liés aux maladies biotiques, comme la résistance à des stress abiotiques
(hydrique, thermique, salins) et leurs interactions avec les techniques culturales
prônées en agriculture intégrée et durable.
149
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180
ANNEXES
Annexe I
MILIEUX DE CULTURE
Milieu B de King (KB) Milieu PDA (Potato Dextrose Agar)
(King et al., 1954) (Jonsthon et Booth, 1983)
Peptone (Difco) 20 g Pomme de terre 200 g
Glycerole (Prolabo) 15 ml Dextrose 20 g
K2 Hpo4 (Sigma) 1,5 g Ager 15 g
MgSO4 (Sigma) 1,5 g Eau distillée 1000 ml
Agar (Sigma) 15 g pH 7 autoclavage 20 minutes à 120° C
Eau distillée 1000 ml
pH = 7,2 autoclavage 20 minutes à 120° C
Milieu gélatine(Lelliot et Stead, 1987) Milieu Levane (Hildebrand et al.,1988)
Extrait de levure 3g Extrait de levure 2g
Peptone 5g Bactopeptone 5g
Gélatine 120 g NaCl 5g
Eau distillée 1000 ml Saccharose 50 g
pH = 7 autoclavage 20 minutes à 120° C Agar 15 g
pH 7,2 autoclavage 20 minutes à 120 °C
Milieu LB (Gardan et Luisetti, 1981) NBY à 2% de glucose
Bactotryptone 10g Bouillon nutritif (Difco) 8
Extrai de levure 5g Extrait de levure (Difco) 2
NaCl 5g K2HP04 2
Agar 15 g KH2PO4 0.5
Eau distillée 1000 ml Glucose 2
pH = 7 autoclavage 20 minutes à 120° C MgSO4-7H20 0.25
Milieu de Pikovskaia (Pikovskaya, 1948) Milieu pour les enzymes protéolytiques
(solubilisation des phosphates) pH7 CAA 5
Sucrose 10 Extrait de levure 2,5
Ca3 (PO4)2 5 glucose 1
MgCl2.6 H2O 5 Agar 15
MgSO4. 7 H2O 0,25 Solution de lait écrémé 1000 ml
(7%)
KCl 0,2
(NH4)2SO4 0,1
BPB 0,25
Milieu pour production d’AIA Milieu pour production d’HCN
LB à 5 mm de tryptophane et 0,06% de SDS TSA ou TSB à 4,4 g de glycine
Milieu pour réduction des nitrates Milieu ISP2 (INTERNATIONAL

STREPTOMYCES PROJECT)
(SHRIRLING et GOTTIEB, 1966)
Bouillon nutritif à 0,2 % de KNO3 Extrait de levure 4g
Extrait de malt 10 g
glucose 4g
Agar 15 g
Annexe II
II.1 Alignement del’ADNr 16 S des isolas de Pseudomonas

1- IDENTIFICATION1014041(F8)
>F8
ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGC
GGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAAT
ACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGA
TTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA
CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAA
GCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAG
GGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGT
TAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTA
GAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG
ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTT
>F19
GGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGRACGCTAAT
GGCAGTAAGYTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
TAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTA
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTG
>F20
ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGC
GGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAAT
GGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGAMAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTAGT
TAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTA
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGG
>F23
Annexe II
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGG
5- IDENTIFICATION1014045 (F27)
>F27
GGCAGTTACCTAATACGTAATTGTTTTGACGTTACCGAMAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
ACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAA
6- IDENTIFICATION1014047(BB6)
>BB6
GGCAGTAAGYTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGT
TAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTA
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATC
7- IDENTIFICATION(BS4)
>BS4
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGT
8- IDENTIFICATION1014052(PI11)
>PI11
Annexe II
GGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGT
TAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTA
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTG
9- IDENTIFICATION1014054(BT7)
>BT7
GGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
TCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGG
10- IDENTIFICATION(F21)
>F21
CAAGAATATTTCTAATGGGGTGAAACCCCCCTTTCACCTGGATTTGTGAACCGGCCGGTGCGGGGGAGACAAAAA
GACCCGGGGGGAAAAGCAATTCCTTTCGCGTGGCCGTTTTAAGTACTGGGGGAACTAATAGGAAGGCAAACCCG
GTTCCCCAACGGTGTGTACGCGAGGGTGGGAGGAAGGACCTGGGGAAAGGGATTAAGAGGGGGGCATTTTGATT
GGGGATTACTAGGATTCCCGACTTCACGCAGTGGAGTGGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGGGA
TTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGACGTAAGGGCCAT
GATGACGTTCCGTCATCCCCACCTTCCTAACGGTTTGTCACCCCGGGCAGTCTCCCTTAGAGTGCCCCACCATAAC
CGTGGTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAAACATCTCACGACACGAGCTGACG
ACAGCCATGCAGCACCTGGTCTCAATGTTCCCGAAAGGCACCAATCTATCTCTAGAAAGTTTATTGGATGTCAAG
GCCGGAAAGGTTCTTCGCGTGGTTTCGAATAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTG
AGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAAGCTC
CCAACGGCTAGTTGGCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCACCACGCTTTCGCAC
TTCAGTGCAGTTCAGTCGAGGGTGGTGACAATCACCACCGGGGGGCTGCCCTTCCCATAGGGGATGTCAACCTAC
CGCTAAAAACTTACGCCCACCTCACCGATAAACTAAGTGGATCAATTTTTTAAACCACCCGGTCTTGGACGCGCC
GGGGGTGAGCCCATGGCCAAATTTATTAAACCACCCTT
11- IDENTIFICATION (BB9)
>BB9
CTAACCACATTGGCCAATTTCCGAAGCCGAATTAACCCGGGGAGCCTTTGGCTCCCTTGGAATCCAGGCNGGCGG
GGGCCGGGTGGAGTAAAAACCCCCCCGCGAAATTTTCCCCCGGGTAAATTGGGGGGGAAAAACCCTTTTTGAAA
AGGAACGCCCAACCCCCCCAATACGTCCTTTGGGGAAGAAAGCAGAGGGACCTTTCTGGGCCCTTGCCGCTTTCG
GATGACCCTAGGGTCGTATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCGTAACTGTTCTGAG
AGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA
ATGGACGAAAGCCTGATCCAGCCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCCCTTTAAGTTGGG
AGGAAGGGCAGTAAGTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAG
TTGGATGTGAAAGCCTCGGGCTCAACCTAGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGNANAGAGGA
KGGTGGAATTTCCYTGTGTAGNCGGTGNAAATGCGTARATATAGGAAGGAACACCANGTGGCGAAGGCGACCAC
CTGGACTGATACTGACATNTNGAGGTGMGAAAGCSTGGGGWAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTATTCCTTC
GCCGTAAACGATGTACAACTAGCCGTTNGGAATCTTTGCAGANTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGAC
CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG
GTTTAATTCAAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATGCRGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCC
Annexe II
TTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAAC
GAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAG
GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGGTACA
GAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCTGATCGCAGTCTGCAACTCGAC
TGCGTGAAGTCGGAATCGCTGGTAATCGCAAATCAGAATGTCGCGGTGAATACCTTCCCGGGTCTTGTACACACC
GCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTNACCYTTCGGGGGGACGGTTACCACGGGT
GTGATTCATGACTGGGGGTGAAAGTCGTAACAAGGGTACCCCTTTAAAAA
12- IDENTIFICATION (GP4)
>GP4
GGGTTTGCCCTCCCGTAACGGGACTTTAACCCAACATCTCACGGACACGAGCTGCACGAACAGCCATGCAGGCAT
TTGTGTCAGAGTTCCTGAAGGCACCAATCCATCTCTGGGAAAGTTCTTTTCATGTCAAGGCCCCCCACGCTCCTCC
CCTTGGGTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCG
GGCCGTACTCCCCCAGGGGGTCCAACTTTAATGCGTTAGGTTCCGCCCCTAAAATTTCCAAGGAATTCCAAACGG
GCAAGTTGGACATCGTTTTACGGGCGTGGGGAATAACCAAGGGTTTTTTATTCCTGTTTCTTCCCCAGGTTTTGGC
CCCTCAGTGGGTCGTTTTATGTCAGGGTTCGCCCTTCGGCACCGGGTGGGTTCCTTCCTTTTATTACCAATTTTCCC
TCCACAGGGGAATTTCCCCCCCCCCTTTCCCGATCTCAACCGCCCGTTTTTGGTGCCCTTTCCCCGTTTGAGACCCG
GGCCTTTCACCCTACCAACTTACACGAAAAACCTTTGCCGCGCTTTTCACCCCCTTATTTTCCAGTAAAACCTTTCC
CACCCTCTATTTCCCCGGGGTTTGGGAAACCAAATTGCCCCGGGGGTTTTTTGTCCCGGGAACGTCTCAAAAGGC
AGGATTTTACTTTCAGCCCCCCCCTTCCAGGTGAGAAGGGTTTACAAATCCCGGAGACCCTTTCTTTTTACCCCAA
CACGCGGGTGTGGACCGTCTTAGGAACCTTCTGGCCTTGGGGCCAAGAATTCCCCCCGGTGCGGGCCCAGAGACG
GAACCCTGGTGCCCCCCCAAGGAAGACTGGGTCAAACCTTTCCCAAACAAATTACGGAATCGTCCCCCTGGGGGA
AACCATTTACCCCACCAAA
13- IDENTIFICATION (PI9)
>PI9
GGATGACGGGAGCTTTTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATTCCTAGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGAC
AACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATC
AGATGAGCCTAGTTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGGGACGATCCGTAACTGGTCTGAGA
GGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAA
TGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG
GAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAG
CCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTT
GGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTG
GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGA
TACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG
TCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGC
CGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAAC
GCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACAC
AGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCC
TTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG
TCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCG
AGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAATCCGGAATC
GCTAGTTAATCGCGAATCAAAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG
GAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGA
AGTCGTAACAGGGTAGCCGTAGAAA
>BB2
CACCCCAGTCATGAATCACACCGGGGTAACCGTTCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTC
CCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTTCACCGCGACATTTTGATTCGCGATTACTAGC
GATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAGCTCCACCTC
GCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGAC
GTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGA
CAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGGTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTG
TCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTG
CTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTA
CTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATCGT
TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCA
Annexe II
GGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTC
TACCGTACTCTAGCTCGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACGAAC
CACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGA
GTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAGCTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAG
TGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCC
ACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGATTACTG
GATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTAGCCTTCACCAGACTAGCTAATTCCGACCTAGGGTCAGTCTGATAGCGCAAG
GACAGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCCCACTAC
CAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCAGCCGTCCGCCGCTGAATCAAGGAGCAAGCTCCCGTCATCCGCTCGACTTG
CAT
II.2 BIOLOG (GENIII)
Annexe II
Annexe II
Annexe II
Annexe II
Annexe II
6- IDENTIFICATION1014047 (BB6)
Annexe II
7- IDENTIFICATION(BS4)
Annexe II
8- IDENTIFICATION1014052(PI11)
Annexe II
9- IDENTIFICATION1014054(BT7)
Annexe II
10- IDENTIFICATION(F21)
Annexe II

Annexe II
12- IDENTIFICATION (GP4)

Annexe II
13- IDENTIFICATION (PI9)

Annexe II

Annexe II
15- IDENTIFICATION (F21)

Annexe II
II.3Résultat des analyses statistiques de la caractérisation des profils

trophiques (BIOLOG)
ID 14041 (F8)
ID 14042 (F19)
ID 14043 (F20)
Annexe II
ID 14044 (F23)
ID 14045 (F27)
ID 14046 (F48)
Annexe II
ID 14047 (BB6)
ID 14048 (BB10)
ID 14049 (GP4)
Annexe II
ID 14050 (BS4)
ID 14051 (PI9)
ID 14052 (PI11)
Annexe II
ID 14053 (BT3)
ID 14054 (BT7)
ID 14055 (F21)
Annexe III
III. 1 Rapport d'analyse par H.P.L.C

Produit analysé : (33)090713
Date d'analyse : 09/07/13 10:43:48
Méthode : C: \CLASS-VP\METHODS\E1.met
Fichier DATA : C:\WINDOWS\Bureau\ABDELI\(33) 090713inj002.dat
Conditions d'analyse : Colonne C18
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
Volume d’injection 20 µl
6 Detector A (254nm )
(33)090713
(33) 090713inj002.dat
Retention Tim e
Nam e
367505 22038867
Height
4 Area
26320 299786
7837 432999
2996 305099
4279383 124015678
3260 73828
940 685149
1340712 33378875
135738
3508 111395
Volts
3441 5178
2
374
6,917
10,733
11,600
13,692
20,767
7,933
3,342
3,758
4,225
8,450
9,325
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
Pk # Name Retention Time Area Area Percent Height
1 3,342 135738 0,07 3441
2 3,758 5178 0,00 374
3 4,225 111395 0,06 3508
4 6,917 22038867 12,14 367505
5 7,933 299786 0,17 26320
6 8,450 33378875 18,39 1340712
7 9,325 124015678 68,33 4279383
8 10,733 73828 0,04 3260
9 11,600 432999 0,24 7837
10 13,692 305099 0,17 2996
11 20,767 685149 0,38 940
Totals
181482592 100,00 6036276
Annexe III
Produit analysé : (33nv) 090713

Date d'analyse : 09/07/13 11:43:33
Méthode : C:\CLASS-VP\METHODS\E1.met
Fichier DATA : C:\WINDOWS\Bureau\ABDELI\(33nv) 090713inj003.dat
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
Detector A (254nm )
(33nv)090713
94726 2577765
(33nv) 090713inj003.dat
Retention Tim e
Nam e
0,6
Height
13475 1488940
Area
6165 90358
1822 449452
31249 1712105
651 18847
555266 17959556
0,4
Volts
7,408 7,908
69 2809
6,883
10,667
0,2
15,817
2,850
1,067
8,808
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
1 1,067 2809 0,01 69
2 2,850 1712105 7,05 31249
3 6,883 1488940 6,13 13475
4 7,408 90358 0,37 6165
5 7,908 2577765 10,61 94726
6 8,808 17959556 73,91 555266
7 10,667 18847 0,08 651
8 15,817 449452 1,85 1822
Totals
24299832 100,00 703423
Annexe III

Date d'analyse : 09/07/13 13:58:52
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
Detector A (254nm )
(39nv)090713
1,00 (39nv) 090713inj001.dat
Retention Tim e
17046 1475604
Nam e
Height
20476 2077319
0,75 Area
22558 924251
29430 1523005
1452 58873
219 128399
19574662
791 26067
Volts
0,50
8156496,750
5,933
12,875
10,558
16,100
0,25
9,450
3,025
7,258
0,00
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
1 3,025 1523005 5,91 29430
2 5,933 924251 3,58 22558
3 6,750 1475604 5,72 17046
4 7,258 19574662 75,91 815649
5 9,450 26067 0,10 791
6 10,558 58873 0,23 1452
7 12,875 2077319 8,06 20476
8 16,100 128399 0,50 219
Totals
25788180 100,00 907621
Annexe III
Produit analysé : (43)090713

Date d'analyse : 09/07/13 15:01:29
Méthode : C: \CLASS-VP\METHODS\E1.met
Fichier DATA : C:\WINDOWS\Bureau\ABDELI\(43) 090713inj001.dat
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
6 Detector A (254nm )
(43)090713
(43) 090713inj001.dat
Retention Tim e
Nam e
Height
4 Area
28403 1866229
363755
4172938 116247831
4993 288936
4240 811515
1115279 28565214
1493 34565
2645 87468
785 43852
Volts
310 7000
32718
2
10,525
11,392
16,542
7,558
7,133
3,258
3,875
2,608
8,200
8,917
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
1 2,608 7000 0,00 310
2 3,258 87468 0,06 2645
3 3,875 43852 0,03 785
4 7,133 1866229 1,26 32718
5 7,558 363755 0,25 28403
6 8,200 28565214 19,26 1115279
7 8,917 116247831 78,38 4172938
8 10,525 34565 0,02 1493
9 11,392 288936 0,19 4993
10 16,542 811515 0,55 4240
Totals
148316365 100,00 5363804
Annexe III

Date d'analyse : 09/07/13 12:47:08
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
Detector A (254nm )
(43nv)090713
(43nv) 090713inj001.dat
Retention Tim e
Nam e
67234 1123177
1,0 Height
50599 4638192
Area
5322 379225
1130221 28282376
Volts
0,5
2,933
5,417
16,700
0,0
3,867
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
1 2,933 1123177 3,26 67234
2 3,867 28282376 82,16 1130221
3 5,417 4638192 13,47 50599
4 16,700 379225 1,10 5322
Totals
34422970 100,00 1253376
Annexe III
Produit analysé : ESSAI 39 090713

Date d'analyse : 09/07/13 17:27:13
Fichier DATA : C:\WINDOWS\Bureau\ABDELI\ESSAI 39 090713inj00001.dat
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
2,0 Detector A (254nm )

ESSA I 39 090713
ESSA I 39 090713inj00001.dat
40711 2388438
Retention Tim e
Nam e
1,5
Height
44099 2447716
3391 1042619
Area
15387 276103
7502 675109
1520987 39387920
174 11194
1,0
255 5322
148 4816
Volts
9,175
0,5
12,150
17,683
7,242
8,192
3,417
4,217
2,450
0,0
9,700
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
1 2,450 4816 0,01 148
2 3,417 5322 0,01 255
3 4,217 11194 0,02 174
4 7,242 2447716 5,29 44099
5 8,192 276103 0,60 15387
6 9,175 2388438 5,17 40711
7 9,700 39387920 85,18 1520987
8 12,150 675109 1,46 7502
9 17,683 1042619 2,25 3391
Totals
46239237 100,00 1632654
Annexe III
Produit analysé : TEMOIN 090713

Date d'analyse : 09/07/13 16:24:12
Fichier DATA : C:\WINDOWS\Bureau\ABDELI\TEMOIN 090713inj001.dat
Débit 1,5 ml/mn
Température 25° C
Detector A (254nm )
TEM O IN 090713
4 TEM O IN 090713inj001.dat
Retention Tim e
Nam e
Height
3
Area
31623 3329877
14107 341513
3833436 160716138
2
Volts
55 1205
68 1567
1
3,117
1,692
57,375
59,425
0
3,850
0 10 20 30 40 50 60 70
M inutes
Detector A
(220nm)
1 1,692 3329877 2,03 31623
2 3,117 341513 0,21 14107
3 3,850 160716138 97,76 3833436
4 57,375 1205 0,00 55
5 59,425 1567 0,00 68
Totals
164390300 100,00 3879289
Annexe III
III. 2 Courbe d’étalonnage

A partir d’une solution de l’AIA (10-3 M), les dilutions 2- 3- 4- 5- 10- 15- 20- 50-100
sont effectuées . 1ml de chaque dilution préparée est mélangé à 2 ml de réactif de Salkowski. Après
30 min, la concentration de l’AIA est mesurée par spectrophotométrie à 530nm.
BENOUSSAID et al. Revue Agrobiologia (2018) 8(1): 753-764
Revue Agrobiologia
www.agrobiologia.net
ISSN (Print): 2170-1652
e-ISSN (Online): 2507-7627
IDENTIFICATION DE SOUCHES DE PSEUDOMONAS FLUORESCENTS ET

APPLICATION DE LEURS LYOPHILISATS POUR LE BIOCONTROLE DE LA
FUSARIOSE VASCULAIRE DE LA TOMATE
BENOUSSAID Nacéra*1, BENCHABANE Messaoud1 et THONART Philippe2
1. Laboratoire de Protection et valorisation des ressources biologiques (LPVRB) – Faculté SNV – Université de Blida 1, Algérie.
2. Walloon Center for Industrial Biology (CWBI), Bio-Industry Unit, Agro-Bio Tech, University of Liege, Passage des Déportés, 2-5030
Gembloux; Belgium.
Reçu le 16/02/2018, Révisé le 19/04/2018, Accepté le 29/05/2018
Résumé
Description du sujet : Indentification métabolique et moléculaire de souches de Pseudomonas fluorescents et
application des formes lyophilisées dans le contrôle biologique de Fusarium oxysporum f. sp. lycopercisi.
Objectifs. Confirmation de l’identification des souches rhizobactériennes sélectionnées, la production
d’inoculum lyophilisé et tester leur efficacité dans le biocontrôle de la fusariose vasculaire de la tomate
Méthodes : 15 souches ayant montré leur efficacité en tant qu'agents de lutte biologique ont fait l’objet d’une
identification classique (morphologie, tests physiologiques, biochimiques et Biolog), d’une analyse de
l’ARNr 16S et d’un séquençage. Des préparations bactériennes lyophilisées ont été testées in vitro et in situ
vis-à-vis de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici.
Résultats : L’identification phénotypique et génotypique a montré que l’espèce dominante est P. fluorescens
(50%), en plus de la présence de P. putida. Des activités antagonistes importantes, allant de 22.08 % à 54.16 %,
ont été enregistrées sur les trois milieux de culture testés (KB, PDA et le mixte KB - PDA). La fusariose
vasculaire s’est sensiblement réduite (63%), suite à l’application des lyophilisats bactériens, par rapport aux
témoins positifs malades.
Conclusion : Les inoculums lyophilisés présentent une stabilité biologique ayant permis de conserver les
potentialités antagonistes des souches sélectionnées.
Mots clés : Pseudomonas fluorescents; Identification; Lyophilisats; Biocontrôle; Fusarium oxysporum f. sp.
lycopercisi.
IDENTIFICATION OF FLUORESCENT PSEUDOMONAS STRAINS AND

APPLICATION OF THEIR FREEZE-DRIED IN BIOCONTROL OF TOMATO
FUSARIUM VASCULAR WILT
Abstract
Description of the subject: Metabolic and molecular identification of fluorescent Pseudomonas strains and
application of lyophilised forms in the biological control of Fusarium oxysporum f. sp. lycopercisi
Objective: Confirmation of the identification of the selected rhizobacterial strains, the production of freeze-dried
inoculum and test their effectiveness in the biocontrol of tomato fusarium vascular wilt.
Methods:15 strains that have demonstrated efficacy as biological control agents have been classically identified
(morphology, physiological, biochemical and Biolog tests), 16S rRNA analysis and sequencing. Lyophilized
bacterial preparations were tested in vitro and in situ against Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici.
Results: Phenotypic and genotypic identification showed that the dominant species is P. fluorescens (50%), in
addition to the presence of P. putida. Significant antagonistic activities, ranging from 22.08 % to 54.16 %, were
recorded on the three culture media tested (KB, PDA and the mixed KB - PDA). Vascular fusarium wilt was
significantly reduced (63%), following the application of bacterial lyophilisates, compared to the sick positive
controls.
Conclusion:The freeze-dried inocula have a biological stability, which has made it possible to preserve the
antagonistic potentialities of the selected strains.
Keywords: Pseudomonas fluorescents; Identification; freeze-dried inocula; biocontrol; Fusarium. oxysporum
f.sp. lycopercisi.
* Auteur correspondant : Benoussaid Nacera, E-mail : nacerabenoussaid@yahoo.fr
753
INTRODUCTION Pseudomonas spp. fluoresents [10, 11].

Même si leur utilisation en pratiques agricoles
La fusariose vasculaire de la tomate est reste limitée, des formulations à base de
l’une des maladies les plus dévastatrices sur souches de ces rhizobactéries ont été mises sur
cette culture à travers le monde. L’agent le marché international des biopesticides en
causal, Fusarium oxysporum f. sp lycopersici, dépit des difficultés agronomiques et
est un champignon tellurique doté d’une commerciales. De plus le stockage et la
spécificité stricte d’hôtes, capable d’envahir conservation de ces inoculums sont souvent
l’ensemble du système vasculaire provoquant délicats [12]. La lyophilisation des
ainsi son obstruction et par la suite Pseudomonas spp. fluorescents sous forme de
l’affaiblissement de la plante qui finit par poudre rend plus économique sa conservation,
mourir [1]. Bien que certaines pratiques son transport et sa commercialisation [13].
culturales soient recommandées, il n’existe Cette méthode, qui nécessite une congélation,
aucun traitement chimique efficace pour les exige des changements assez agressifs en
plantes infectées et aucune méthode ne température lors de la conception des
permettent de lutter efficacement contre cette formulations microbiennes. Dans certains cas,
maladie. La gestion de cette maladies par des elle occasionne des altérations cellulaires
fongicides cause de graves problèmes (peroxydation des acides gras) et génétiques
environnementaux et ils sont également (modification des protéines). L’utilisation de
toxiques pour les organismes non ciblés [2, 3]. cryoprotecteurs au cours de la lyophilisation et
L’élimination de ces agents pathogènes n’est d’antioxydants pendant le stockage augmente
pas aisée, car leur pouvoir saprophyte et leur sensiblement le taux de viabilité de ces cellules
aptitude à coloniser les plantes non hôtes leur [14].
permettent de survivre même dans les Le contexte de ce présent travail est de
conditions défavorables, ainsi ils sont capables confirmer l’identification de souches de
de persister dans le sol infesté pendant Pseudomonas fluorescents par des méthodes
plusieurs années en absence de la plante [4]. classiques (morphologie, tests biochimiques) et
L’utilisation de certains microorganismes non moléculaires. Les souches ainsi sélectionnées
pathogènes, en tant que biopesticides et/ou doivent subir des procédés de lyophilisation
biofertilisants, est une technologie émergente pour obtenir des préparations bactériennes
et écologiquement compatible, considérée applicables directement. Les expérimentations
comme alternative prometteuse aux pesticides de ces formulations, en qualité de biopesticide,
et engrais de synthèse [5]. En effet, des études seront vérifiées dans le biocontrôle de l’agent
ont été menées sur les rhizobactéries (PGPR), de de la fusariose vasculaire de la tomate. Dans
connus par leur forte colonisation des ce sens, notre travail a été orienté pour mettre
rhizosphères des plantes [6], exhibent des en évidence l’efficacité et la stabilité des
potentialités avérées en termes de préparations après formulation et stockage.
phytostimulation et de bioprotection des
plantes, par le biais d’un large éventail de MATÉRIEL ET MÉTHODES
mécanismes d’action [7, 8]. Globalement,
l’effet protecteur conféré par ces agents 1. Bactéries antagonistes
microbiens est basé sur la compétition pour les
nutriments essentiels, sur l’activité antagoniste Sur la base de leurs caractéristiques
vis-à-vis de la croissance des pathogènes via la métaboliques et de leur potentiel de lutte
production d’antibiotiques ou d’enzymes et/ou biologique, 15 souches de Pseudomonas
sur leur capacité à stimuler des systèmes de fluorescents isolées à partir de sols
défense chez l’hôte végétal. rhizosphériques de différentes palmeraies et
Une grande part des recherches réalisée sur les d’arbres fruitiers du sud algérien ont été
rhizobactéries souligne l’importance et le utilisées dans ce travail. La sélection est en
potentiel du groupe des Pseudomonas spp. fonction de leur origine et de leur capacité à
fluorescents [9]. En effet, au cours des deux produire des métabolites impliqués dans le
dernières décennies, des études ont signalé des biocontrôle, à savoir les pyoverdines (pvd),
augmentations significatives dans la croissance l'acide cyanhydrique (HCN) et les phénazines
et le rendement des cultures en réponse à (phz) (Tableau 1).
l'inoculation avec quelques souches de
754
Tableau 1 : Origine est caractéristiques des souches de Pseudomonas fluorescents
Code
Souches BCCM*/ Plantes hôtes Origine Caractéristiques
LMG
Pvd HCN Phz
BB6 ID14047 Palmier dattier Bechar (Beni Abbas) + + +

BB10 ID14048 Palmier dattier Bechar (Beni Abbas) + + -
BT3 ID14053 Palmier dattier Bechar (Taghit) + + -
BT7 ID14054 Palmier dattier Bechar (Taghit) + + -
BS4 ID14050 Palmier dattier Bechar (Taghit) + + -
F8 ID14041 Palmier dattier Ouargla + + -
F21 ID14055 Palmier dattier Ouargla + + +
F19 ID14042 Tomate Ghardaïa + + -
PI9 ID14051 Poirier Ghardaïa + + +
PI11 ID14052 Poirier Ghardaïa + + -
GP4 ID14049 Pommier Ghardaïa + + -
Pvd : Pyoverdines, HCN : Acide cyanhydrique, Phz : phénazines
*BCCM/ ILMG: Bacteria Collection Laboratorium Voor Microbiologie Universiteit Gent K. Lledeganckstraat 35 B-
9000 Gent - Belgium Bccm.
2. Agent pathogène un séquençage partiel de l'ADNr 16S a été

réalisé pour les souches F8 (ID14041), F19
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (ID14042), F20 (ID14043), F23 (ID14044),
(FOL, MUCL 43876) fourni par la F27 (ID14045), BB6 (ID14047), BS4
Mycothèque de l'Université Catholique de (ID14050), PI11 (ID14052) et BT7 (14054).
Louvain, Belgique a été utilisé pour les essais La pureté des cultures bactériennes a été
d’antagonismes. La suspension fongique a été vérifiée sur milieu TSA à 28 °C (BBL
préparée en cultivant FOL sur PDA (Potato 11768).
Dextrose Agar) [15] et incubée à 25 °C
pendant 7 jours. Le mycélium a été raclé et 3.1. BIOLOG, empreinte phénotypique
remis en suspension dans un milieu nutritif
Une plaque de microtitration
liquide et cultivé à 25 °C. La suspension finale
(BIOLOG GENIII) a été utilisée pour
a été étalonnée avec du MgS04 10 mM stérile à
déterminer les caractéristiques de chaque
une concentration de 106 conidies / ml [16]. La
bactérie à oxyder 71 sources de carbone et à
pureté a été vérifiée avec des cultures
tester sa sensibilité vis-à-vis de 23 substances
monosporales sur PDA. Les suspensions
chimiques. Les résultats ont été interprétés
conidiennes ont été préparées avec des disques
selon les instructions du fabricant (Biolog Inc.,
de culture fongiques (âgées de huit jours,
Californie USA). Après inoculation, les
incubées à 28 °C) et inondées avec 2 ml d’eau
cultures ont été cultivées pendant 24 heures à
distillée stérile. La culture est ainsi raclée et
33 °C sur de l'agar Biolog Universal Growth
mise en suspension dans 48 ml d’eau distillée
additionné de sang (BUG + B). Une analyse de
stérile. Les suspensions de microconidies
clusters sur les résultats a été réalisée en
obtenues ont été filtrées à travers six couches
utilisant le coefficient de Bray-Curis et
de gazes stériles, pour séparer le mycélium des
UPGMA en utilisant le logiciel BioNumerics
conidies, et ajustées par un hématimètre à 106
(Applied Maths, Belgique).
microconidies / ml [17].
3.2. Séquençage de l'ADNr 16S et étude
3. Caractérisation et identification des phylogénétique
bactéries
L'ADN a été préparé selon le protocole
En plus de l’identification basée sur de Niemann et al. [18]. Le gène de l'ARNr 16S
le système BIOLOG (BCCM/LMG GENT a été amplifié par PCR (Polymerase Chain
Belgique), Reaction) en utilisant les amorces suivantes :
755
Nom (a) Séquence synonymique (5 '-> 3') L'analyse phylogénétique a été réalisée
Position (b) après inclusion de la séquence consensus
dans un alignement de petites séquences
16F27 pA AGA GTT TGA TCC TGG de sous-unités ribosomiques collectées à
CTC AG 8-27 partir de la bibliothèque de séquences
16R1522 pH AAG GAG GTG ATC CAG nucléotidiques internationale EMBL
CCG CA 1541-1522 (European Molecular Biology Laboratory,
www.embl.org). Un arbre phylogénique a
(a) F : amorce directe / R: amorce inverse été construit en utilisant la méthode
(b) Position d'hybridation faisant référence à la phénétique NJ (neighbour-joining).
numérotation des séquences du gène de l'ARNr 16S
de E. coli. 4. Formulation
L’ADNr 16S amplifié par PCR a été Quarte souches, productrices de quelques
purifié en utilisant le kit de nettoyage PCR métabolites secondaires impliqués dans leurs
NucleoFast® 96 (Macherey-Nagel, Düren, activités antagonistes, ont fait l’objet d’une
Allemagne). Les réactions de séquençage ont formulation au niveau du Centre Wallon de
été réalisées en utilisant le kit de séquençage Biologie Industrielle, Unité de Bio-Industrie,
Cycle BigDye® et purifiées avec le kit de Gembloux Agro-Bio Tech, Université de
purification BigDye® XTerminatorT (Applied Liège, Belgique. La procédure de formulation
Biosystems, Foster City, CA, USA). Le a été réalisée sous la direction du Professeur
séquençage a été effectué en utilisant Philippe Thonart, pour l’obtention de
l’analyseur génétique ABI Prism® 3130XL préparations bactériennes lyophilisées à des
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). fins de conservation et de stockage. Les
lyophilisats obtenus ont été scellés sous vide
Les amorces directes et inverses suivantes ont dans des sachets en aluminium (250 g) et
été utilisées pour obtenir un chevauchement stockés pendant trois années à 4 °C.
partiel des séquences, assurant des données
assemblées très fiables :
5. Activités antagonistes in vitro
- Pour 1D14041 à lD14045: gamma, * gamma,
BKL1
Le test d’antagonisme in vitro a été
- Pour 1D14047, 1D14050, 1D14052 et
effectué avec les 4 souches bactériennes de
1D14054: gamma, * gamma, BKL1, 3
Pseudomonas fluorescent lyophilisées vis à vis
de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. Le
Nom (a) Séquence synonymique (5 '-> 3')
pouvoir antagoniste a été testé sur trois milieux
Position (b)
différents : PDA (favorable au développement
16F358 * Gamma CTC CTA CGG GAG GCA
des champignons), KB (favorable aux
GCA GT 339-358
Pseudomonas) et le milieu mixte PDA-KB (1:
16R339 Gamma ACT GCT GCC TCC CGT
1 v / v). Trois répétitions ont été effectuées
AGG AG 358-339
pour chaque interaction. La méthode utilisée
16R519 BKL1 GTA TTA GCC CGG CTG
est celle décrite par Vincent et al. [19]. Les
CTG GCA 536-516
souches bactériennes, âgées de 24 h, sont
16R1093 3 GTT GCG CTC GTT GCG GGA
étalées en ligne sur une distance de 1,5 cm à
CT 1112-1093
partir des deux bords d’une boite de Pétri le
(a) F : amorce directe / R: amorce inverse milieu gélosé.Vingt-quatre heures plus tard et à
(b) Position d'hybridation faisant référence à la l’opposé, un disque fongique de 6 mm (âgé de
numérotation des séquences du gène de l'ARNr 16S 5 jours) est déposé au centre de la boite.
de E. coli. L’ensemble est incubé à de 28 °C pendant sept
à dix jours. Trois répétitions ont été effectuées
L'assemblage des séquences a été pour chaque interaction.
réalisé en utilisant le logiciel BioNumerics
(Applied Maths, Belgique). Une matrice La réduction du diamètre des colonies
de similarité a été créée en utilisant le mycéliennes du champignon pathogène, en
même logiciel par calcul d'homologie présence des souches de Pseudomonas
avec une pénalité de gap de 0% et après comparé au témoin non inoculé, indique la
élimination des bases inconnues. présence d’une activité antagoniste.
756
Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la (4) flétrissement généralisé, (5) mortalité.
relation suivante [20] : % d’inhibition=(R témoin L’évolution de la maladie a été estimée par
–R test)/R témoin × 100. R témoin : distance radicale l’incidence de la maladie (taux d'infection) et
maximale de la croissance du champignon, R l'indice de McKinney (gravité) [22, 23].
test : distance radicale sur une ligne en direction
de l’antagoniste. 6.1. Taux d’infection
6. Essai d’Antagonisme in situ Le taux d’infection exprime le pourcentage

des plants malades (n), par rapport au nombre total
L’étude in situ, de l’impact de la des plants (N) examinés [23]. Taux d’infection (%)
lyophilisation et du stockage sur la stabilité des ꞊ (∑ n / N) × 100
propriétés antagonistes, a été expérimentée
avec trois souches (BB6, BB10 et F21) vis-à- 6.2. Indice de McKinney (Sévérité)
vis de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici
(Fol). Les semences de tomate (Solanum La sévérité de la fusariose vasculaire a
lycopersicum cv. Saint Pierre) ont été été évaluée par le calcul de l’indice de
désinfectées avec l’hypochlorite de sodium à Mckinney [22]. Indice de McKinney (%) ꞊ [∑
2° pendant 10 mn, suivie de trois rinçages à (f.v) / N.X] × 100, f : classe de l’infection, v :
l’eau distillée stérile et séchées sur papier filtre nombre des plants par chaque classe, N :
stérile. Les graines prégermées ont été nombre totale des plants observes, X : valeur la
transférées dans des pots en plastiques sur un plus élevée de l’échelle d’évaluation (5).
substrat stérilisé (2/3 de tourbe et 1/3 de sol).
L’arrosage a été effectué chaque jour avec de 7. Analyse statistique
l’eau stérile. Au stade 2 à 3 feuilles, les
plantules ont été inoculées par des suspensions L’analyse statistique a été réalisée à
bactériennes (108 UFC/ml). L’inoculation des l’aide de logiciel SYS STAT version 13
plantules avec la suspension fongique (106 (2009). Tous les paramètres analysés ont
conidies/ml) a été effectuée 48 h après la fait l’objet d’une analyse de variance
bactérisation à raison de 2 ml par pot. Les (ANOVA). Dans les cas où la différence est
témoins négatifs et positifs ont été traités, significative, les moyennes obtenues sont
respectivement, par l’eau distillée stérile et comparés et classées avec le test de
uniquement par la suspension conidienne de Newman-Keuls au risque d’erreur α =0,05
Fol [21]. [24].
Le dispositif expérimental adopté est en trois
blocs aléatoires complets sous serre en verre
(25 – 28 °C). Chaque bloc est composé de RÉSULTATS
onze traitements : plants inoculées
respectivement avec les souches lyophilisées 1. Caractérisation et identification
BB6, BB10, F21 avec et sans cryoprotecteur
en interaction avec Fol; des plants inoculés 1.1. BIOLOG, empreinte phénotypique
avec les mêmes souches non lyophilisées
(fraichement cultivées 24h) en interaction avec Les résultats du test de
Fol; des plants inoculés uniquement avec la microtitration (BIOLOG GENII) montrent
suspension conidienne de Fol et des plants que les souches ID14054, ID14055,
inoculés par l’eau distillée stérile. Chaque ID14053, ID14043, ID14044, ID14046 et
traitement est représenté par dix plants par ID14050 sont affiliés à Pseudomonas
bloc, soit 30 plants par traitement. fluorescens biotype C. La souche ID14048
Un suivi quotidien des symptômes a débuté 24 est identifiée comme étant Pseudomonas
h après l'application de la suspension fongique, fluorescens, mais sans biotypage. Les
pendant une période de 60 jours. Le suivi de la souches ID14041, D14047 et ID14042 ont
progression de la maladie s’est basé sur été identifiées comme étant Pseudomonas
l'échelle symptomatologique adaptée à la mendocina. La souche ID14051 a été
fusariose des plantes herbacées [21]: (0) aucun identifiée comme Pseudomona sp. La
symptôme, (1) jaunissement unilatéral, (2) souche ID14045 n’a pas été affiliée au
jaunissement généralisé, (3) décoloration genre Pseudomonas (Fig. 1).
unilatérale et/ou longitudinale,
757
1.2. Séquençage de l'ADNr 16S et étude

phylogénétique
Une similarité significative (> 98,7%)

est observée avec plusieurs espèces validées
des sous-groupes de P. gessardi et P.
fluorescens, indiquant que les souches
1D14054 (BT7), ID14043 (F20), ID14044,
(F23) et ID14050 (BS4) appartiennent à l'une
de ces espèces. La souche ID14045(F27) a été
identifiée comme P. fluorescens. Les souches
ID14047(BB6), ID140152(PI11), ID14041(F8)
et ID14042 (F19) ont été identifiées comme
étant P. putida (Fig. 2).
2. Activités antagonistes in vitro
Les quatre souches lyophilisées de

Pseudomonas présentent des activités
antagonistes appréciables in vitro vis-à-vis de
F. oxysporum f.sp. lycopersici sur les trois
milieux de culture, induisant des zones
d'inhibition limitant la croissance de l’agent
pathogène, avec des rapports allant de 22.08 %
à 54.16 %. Comparativement au témoin non
traité, la croissance mycélienne a diminué de
26,58 à 43,50 % sur PDA, de 43,08 à 54,16 %
sur KB et de 22,08 à 43,96 % sur le milieu KB
+ PDA (Tableau 2).
Tableau 2 : Taux d’inhibition (%) de la

croissance mycélienne sur les trois milieux
Souches Taux d’inhibition %
bactériennes PDA KB Mixte PDA-KB
F21 32,00 (± 1,29)* 54,16 (± 1,89)* 25,83 (± 1,90)*
BB10 43,50 (± 0,90)* 48,34 (± 1,88)* 22,08 (± 0,72)*
BB6 26,58 (± 0,80)* 44,58 (± 1,44)* 23,33 (± 0,72)*
PI9 38,33 (± 1,90)* 43,08 (± 0,63)* 43,96 (± 0,94)*
* : Ecart type issue de trois répétitions
3. Essai d’antagonisme in planta
3.1. Taux d’infection
Les notations individuelles des

symptômes, effectuées sur chaque plant,
ont permis d’exprimer en pourcentage
Figure 1 : Affiliation des souches bactériennes l’évolution du taux d’infection et l’indice
en Clusters selon les tests BIOLOG GENIII de Mckinney (sévérité) durant 64 jours de
suivi.
758
L’évolution des taux d’infection montré une progression rapide pour

chez les plants bactérisés, en présence du atteindre leurs maximums respectifs au
pathogène Fusarium oxysporum f.sp. 32ème jour suivant les opérations des
lycopersici, débutent à partir du 25ème , inoculations (85,71 % et 95,24 %). Une
accusant ainsi un retard de trois jours par stabilité relative, selon les traitements, a
rapport aux témoins malades. Après cette été notée à partir du 32ème jour jusqu’au
période, l’ensemble des traitements a dernier jour du suivie (Fig. 3).
Figure 2: Arbre phylogénétique (ARNr 16S) des espèces validées avec des similarités ≥ 97%
759
Figure 3 : Evolution des taux d'infection (%)

AP : lyophilisé Avec agent Protecteur, SP : Lyophilisé Sans agent Protecteur, Cr : non lyophilisé
3.2. Sévérité Nous signalons, à travers nos résultats, une

variabilité de l'activité antagoniste des souches
La figure 4, présente l’évolution de la de Pseudomonas lyophilisés avec et sans
sévérité (indices de Mckinney) pendant la protecteurs par rapport aux souches non
période d’étude. Les résultats montrent que la lyophilisées. Les taux d’infection enregistrés à
sévérité de la fusariose reste faible chez les la fin de notre expérimentation (95,24%) notés
plants bactérisés par rapport au témoin positif, chez les plants bactérisés et les indices de
dès l’apparition de la maladie (25ème jour). Une Mckinney demeurent par contre faibles, avec
évolution très faible de la sévérité de un maximum de 38%.
l’infection chez les plants bactérisés par La comparaison entre le taux infection et la
rapport au témoin positif a été observée entre sévérité de la maladie (Indice de Mckinney),
les 25ème et 39ème jours après inoculation. Entre permet de constater que malgré la progression
les 39ème et 46ème jours, une évolution plus ou de la maladie, ces souches antagonistes jouent
moins rapide a été observée chez tous les un grand rôle dans la réduction du degré des
plants bactérisés, mais qui reste faible par symptômes allons jusqu’ à 63% chez tous les
rapport au témoin. Une stabilité remarquable plants bactérisés par rapport aux témoins
des taux de sévérité a été notée chez tous les positifs où la totalité des plants inoculés sont
traitements bactérisés, avec des taux finaux ne flétris totalement (mortalité) (Fig. 4).
dépassant pas 38 % par rapport au témoin
(91%).
Figure 4: Evolution des indices de Mckinney (%)

AP : lyophilisé Avec agent Protecteur, SP : Lyophilisé Sans agent Protecteur, Cr : non lyophilisé
760
DISCUSSION agissant en même temps sur plusieurs isolats

fongiques de différents genres (Fusarium,
L'utilisation de micro-organismes Rhizoctonia, Vertcillium et Pythium) [21]. La
bénéfiques comme biopesticides, pour réduire variabilité de l'activité antagoniste des souches
les maladies sur diverses plantes d’interêt de Pseudomonas dans les milieux testés
agronomique, est considérée comme l'une des suggère une diversité dans les mécanismes
méthodes les plus prometteuses dans les impliqués dans le contrôle biologique [7]. En
pratiques de gestion des cultures. Dans la plus du déterminisme plurifactoriel de
présente étude, nous avons évalué l'efficacité, l'antagonisme, nos résultats soulignent la
in vivo et in planta, de souches de possibilité d'une large et non spécifique
Pseudomonas fluorescents lyophilisées en tant efficacité contre l’isolat de F. oxysporum (Fol
qu'agents de lutte biologique contre F. ). Ces souches rhizobactériennes sont
oxysporum f.sp lycopersic. caractérisées par des potentialités variables, en
Les isolements réalisés à partir de sols termes de production de métabolites impliqués
rhizosphériques, du palmier dattier et d’arbres dans le biocontrôle comme la synthèse de
fruitiers du sud algérien, ont permis de siderophores, de phénazines et de HCN.
constater la richesse de ce biotope en activité Dans l'ensemble, les rhizobactéries les plus
microbienne. Bien que ces rhizobactéries sont actives sont F21, PI9 et BB10 et en dernière
ubiquitaires et d'une adaptation relativement position BB6 et leurs activités antagonistes
facile, ce constat témoigne de la disponibilité peuvent être corrélées avec leur métabolisme,
de conditions pouvant déterminer des niches notamment leurs métabolites secondaires
écologiques microbiennes. L’hétérogénéité (phénazines). Cependant, l’origine
rencontrée dans ces isolements bactériens rhizosphérique des souches bactériennes ne
dénote que la classification des Pseudomonas semble pas jouer un rôle prépondérant dans
spp. fluorescents reste toujours sujette à leurs activités antagonistes in vitro [25].
beaucoup de divergences. Dans notre étude Malgré l’apparition et l'évolution de l’infection
nous avons noté l'absence d'une concordance chez tous les traitements étudiés, les situations
entre l'identification taxonomique et les classes de bactérisation ont influencé positivement le
phénotypiques. Des constats similaires ont été développement des plants de tomate en
rapportés dans d'autres travaux [28] qui réduisant la maladie avec des degrés
soulignent les limites des méthodes appréciables. Les plants bactérisés montrent
phénotypiques dans la classification des une tolérance à la fusariose vasculaire, se
Pseudomonas fluorescents. manifestant par un ralentissement de la
Malgré la différence dans la composition cinétique de la maladie par rapport aux
chimique du milieu et son influence sur la témoins positifs, qui sont caractérisés par une
synthèse des métabolites, qui peuvent avoir progression assez rapide et vigoureuse. Chez
une fonction majeure dans l'effet d'inhibition; les pants bactérisés avec les deux souches F21
les trois milieux de culture utilisés ont permis et BB6, lyophilisées avec cryoprotecteur, la
de révéler des activités antagonistes chez les maladie a enregistré une forte réduction,
quatre souches bactériennes testées. Nous respectivement, de 63% et 62%. La réduction
avons noté que le milieu KB favorisait la de la sévérité de la maladie causée au cours de
synthèse de sidérophores, contrairement aux notre essai peut s’expliquer par plusieurs
milieux PD et PD + KB. L'inhibition de la mécanismes de bioprotection. Il apparait
croissance mycelienne observée sur ces deux clairement que ces mécanismes responsables
milieux suggèrent que l'inhibition observée des effets de certaines souches de
n'était pas due à l'action des sidérophores, mais Pseudomonas reposent sur leurs activités
que d'autres mécanismes ont été développés antagonistes par la production des métabolites
par les bactéries, contrairement à l’inhibition secondaires à l’encontre des agents
observée sur les milieux KB, qui peut être phytopathogènes. Il a été déjà confirmé que ces
corrélée avec la présence des sidérophores. trois souches de Pseudomonas (BB6, BB10 et
Il a déjà été démontré que l'action antagoniste F21) produisent des sidérophores, de l’acide
de ces mêmes souches ne semblait pas cyanhydrique, des phosphatases, des
spécifique à l'agent pathogène mais dépendait Phénazines et d’autres enzymes de
plutôt du milieu de culture. Dans certains cas, dégradations de parois cellulaire chez les
une efficacité à large spectre a été observée, champignons (protéases, chitinases, cellulases,
et pectinases) [17 ].
761
Les PGPR antagonistes des champignons CONCLUSION

phytopathogènes, agissent principalement
par la production de métabolites Nos résultats montrent que les
antimicrobiens mais aussi par la souches de Pseudomonas, lyophilisées ou
compétition pour les niches nutritionnelles non avec ou sans agents protecteurs,
rhizosphérique et la stimulation des présentent des potentialités d'utilisation en
défenses de l'hôte (résistance systémique tant qu'agents de lutte biologique vis-à-vis
induite) [26]. D'autres mécanismes de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici,
interviennent directement dans la agent causal du flétrissement vasculaire de
promotion de la croissance des plantes et la tomate. Dans notre travail
modulent l'activité bactérienne dans ses comparativement à d'autres biotopes, il a
activités de bioprotection [27]. La été constaté une diversité taxonomique
réduction de la maladie peut être le (spécifique et intraspécifique) et des
résultat d’une colonisation importante des aptitudes métaboliques particulières dans
racines ou des sites de l’infection par ces le groupe de Pseudomonas spp.
rhizobactéries bénéfiques, ce qui réduit fluorescents et particulièrement chez les
l’espace nécessaire à la croissance du espèces types P. fluorescens et P. putida.
pathogène [6]. Ces caractéristiques Les données in vitro et in vivo soutiennent
expliquent leur aptitude à s’installer en l'hypothèse que l'antagonisme microbien
nombre et durablement sur et à proximité demeure le principal mécanisme dans le
des racines [28]. La colonisation des tissus contrôle biologique des maladies. L’effet
de la plante joue un rôle primordial dans positif des Pseudomonas en générale et
le biocontrôle [29]. Il a été rapporté que spécifiquement lyophilisées en
l'application préalable d'un agent bioprotection est nettement supérieur dans
biologique inducteur (Pseudomonas. la réduction de la sévérité que la réduction
fluorescents) déclenche ou active les du taux d’infection, indiquant que le
mécanismes de défense latents des biocontrôle rend la plante tolérante à la
plantes, en réponse à l'infection avec les maladie en réduisant fortement l’évolution
pathogènes [30, 31]. et en retardant l’apparition des
L’utilisation des souches de Pseudomonas symptômes.
fluorescents lyophilisées avec ou sans
cryoprotection dans le biocontrôle de la RÉFÉRENCE BIBLIOGRAPHIQUE
fusariose vasculaire de la tomate a donné
presque les même résultats qu’avec les [1]. Blancard D., Laterrot H., Marchoux G. &
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préconisée dans le cas des Pseudomonas
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fluorescents vue que c’est une conception biocontrôle de Fusarium oxysporum f.sp
appropriée pour la production de cultures lycopersici sur tomate et Verticillium dahlia
bactériennes concentrées, établie pour sur l’olivier. Thèse Doctorat, Université
préserver les microorganismes en gardant d’Essenia, Oran. 202 p.
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Pour que le la lyophilisation soit oxysporum f. sp. lycopersici et Fusarium
prioritaire et recommandé aux souches de oxysporum f. sp. radicis-lycopersici.
Pseudomonas fluorescents, par rapport (ERVBM) Biochimie, Université
aux autres traitements physiques Abdelmalek Essaadi. Tanger.Maroc.
préexistants, il est suggéré d’assurer une Substances Naturelles et Environnement.
cryoprotection adéquate avant le 352-356.
processus de lyophilisation.
762
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764

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UNIVERSITE SAAD DAHLAB BLIDA

Faculté Des Sciences de la Natures et de la Vie

ETUDE DE QUELQUES CARACTERES PHENOTYPIQUES ET

Devant le jury composé de :

Dj. GUITARNI Professeur, USD Blida 1 Président

LISTE DES TABLEAUX ...............................................................................................

LISTE DES FIGURES ...................................................................................................

LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................................

INTRODUCTION GÉNÉRALE .................................................................................... 1

CHAPITRE I : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................... 5

CHAPITRE II. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE PSEUDOMONAS SPP.

CHAPITRE III : MÉTABOLITES SECONDAIRES .................................................... 62

CHAPITRE IV : FORMULATION DE RHIZOBACTÉRIES PAR LYOPHILISATION 90

DISCUSSION GÉNÉRALE ..................................................................................... 141

CONCLUSION GÉNÉRALE ................................................................................... 147

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................... 151

ANNEXES ............................................................................................................... 185

Titre: Etude de quelques caractères phénotypiques et

Mots clés: Pseudomonas spp fluorescents, identification, métabolites secondaires, lyophilisation,

Exploration of rhizospheric soil samples from various environments in southern

Key words: Pseudomonas spp fluorescents, identification, secondary metabolites,

‫ﺔ‬ÿ‫ﻮ‬ĀĀÿ‫ﺎ‬ÿ ‫ﻂ‬Āÿ‫ﺮ‬Āÿ‫ﻮي ا‬ÿ‫ﺜﺎ‬ÿ‫ﺾ ا‬ÿ‫ﻸ‬ÿ ‫ﺔ‬Āÿ‫ﻮ‬ĀĀ‫ﺠ‬ÿ‫ﺔ وا‬ÿ‫ﻈﻬﺮ‬Āÿ‫ﺼﻔﺎت ا‬ÿ‫ﻌﺾ ا‬ÿ ‫ دراﺳﺔ‬:‫ﻮان‬Ā‫ﻌ‬ÿ‫ا‬

TABLEAU I.1 : MÉTABOLITES SECONDAIRES DES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS ÉTUDIÉS

CHAPITRE I: DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES

I.1. Introduction au genre Pseudomonas

Figure.I.1 : Relations phylogénétiques des protéobactéries, contenant les genres

I.2. Evolution de la taxonomie du genre Pseudomonas

Figure I.2 : Principaux changements dans la taxonomie des Pseudomonas (2212

Les changements les plus profonds dans la taxonomie bactérienne se sont

Actuellement le genre Pseudomonas contient plus de 190 espèces

I.3. Les Pseudomonas spp. fluorescents

I.3.1 Les Pseudomonas spp. fluorescents Phytobénéfiques

spp.fluorescents dans l’amélioration de la croissance et la protection sanitaire des

Figure I. 4 : Boucle de rétroaction représentant l’interaction bénéfique plante-

Les Pseudomonas fluorescents ont développé des mécanismes pour améliorer

I.3.2. Métabolites secondaires phytobénéfiques

Tableau I.1 : Métabolites secondaires des Pseudomonas fluorescents étudiés dans

Métabolites Pseudomonas Phytopathogènes Effets Références

Pseudomonas sp. Diverses

Pseudomonas spp. C. circinans, C. dematium,

1.3.2.1. Phénazines (PHZ)

1.3.2.3. Pyrolnitrine (PRN)

la biosynthèse des PRN est réalisée en quatre étapes séquentielles et nécessite du

1.3.2.4. Pyolutéorine (PLT)

1.3.2.6. Composés peptidiques (CLP)

1.3.2.7. Cyanure d'hydrogène (HCN)

hydroxamates, catécholates de phénol et pyoverdines) (Crowley, 2006). Des

1.3.2.9. Enzymes lytiques

1.3.2.10. Induction de la résistance systémique (ISR)

1.3.2.11. Solubilisation des phosphates

- Composés complexants ou dissolvants les acides organiques, les

Des effets bénéfiques notables après l'inoculation de bactéries solubilisatrices

1.3.2.14. 1-Amino-cyclopropane-1-carboxylate (ACC) désaminase

en α-kétobutyrate et en ammoniac (Glick et al.,1998; Mayak et al.,1999; Grichko et

Figure I.6 : 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC désaminase) chez les PGPR

I.3.3. Quorum sensing (QS) et métabolisme secondaire

Williams, 2009). Ces systèmes de communication permettent ainsi de moduler les

Les propriétés antagonistes et phytostimulatrices des Pseudomonas spp.

I.4. Bioformulations microbiennes phytobénéfiques