BAB 2.

KROMATOGRAFI

2-1

KONSEP KROMATOGRAFI
Pengertian Awal
Kroma = warna; Graf (grafi) = tulisan, gambar
Teknik kromatografi diartikan sebagai suatu metoda yang digunakan
untuk memisahkan campuran komponen atau fraksi sejenis menjadi unit-unit
yang terpisah satu dengan yang lain yang didasarkan pada perbedaan sifat
masing-masing.

Perbedaan

yang

dimaksud

dapat

berupa

perbedaan

kelarutannya di dalam pelarut, perbedaan kemampuannya menyerap atau

terikat pada komponen lain, perbedaan muatan ionik, ukuran molekul, dan lain
sebagainya.
Sejarah Kromatografi
Seorang ilmuwan botani dan Rusia, Michael Tswett, pada tahun 1906
dengan suatu percobaan dapat mernisahkan zat warna hijau yang terdapat
pada daun menjadi beberapa komponen. Karoten (kuning oranye/pucat),
feofitin (him keabu-abuan, kadang-kadang tidak tampak), klorofil-b (hijau tua),
klorofil-a (biru kehijauan), dan xantofil (kuning) dapat dipisahkan melalui tabung
yang diisi dengan bubuk kalsium karbonat dan dielusi dengan petroleum eter.
Teori Dasar
1.

Polaritas: sifat yang menunjukkan kecenderungan suatu senyawa untuk

mengumpul/mengelompok pada satu kutub.

2.

Besarnya polaritas dinyatakan dengan konstanta dielektrika (suatu tetapan

yang menunjukkan besarnya gaya saling tarik antara dua muatan elektrik
pada suatu jarak tertentu di dalam ruang vakum atau di dalam suatu
medium pada suhu tertentu).

3.

Seri eluotropik berbagai pelarut, suatu daftar yang menunjukkan besarnya

konstanta dielektrika berbagai senyawa. Udara = 1,00 ; Heksan = 1,874 ;
klorobenzena = 5,9 ; ammonia cair = 15,5 ; air = 80,2 ; asam sianida = 95.

4.

Dua atau lebih pelarut organik dapat dicampur untuk mendapatkan

polaritas tertentu. Micible (misibel) adalah pelarut-pelarut yang dapat
bercampur satu sama lain tetapi tidak saling melarutkan. Immicible
(imisibel) adalah pelarut-pelarut yang tidak dapat bercampur dan tidak
saling melarutkan satu terhadap yang lain.

Universitas Gadjah Mada

5.

Prinsip like disolve like: senyawa atau komponen yang polaritasnya sama
atau hampir sama akan selalu bersama-sama, tetapi yang polaritasnya
berbeda akan selalu berjauhan, ada jarak, atau saling menolak.

6.

Percobaan Craig mengembangkan pemisahan komponen-komponen

dalam pelarut melalui suatu tangki (kolom).

Istilah Dalam Kromatografi

1. Fase diam (stationer phase), yaitu bahan yang digunakan dalam
kromatografi yang tidak bergerak dan membentuk pelat-pelat teoritis. Fase
diam dapat berupa padatan, cairan, ataupun gas.
2. Fase bergerak (moving phase, mobile phase), yaitu bahan yang digunakan
dalam kromatografi yang kedalamnya dilarutkan (terdapat) campuran
komponen yang akan dipisahkan, yang bergerak sepanjang fase diam.
Fase bergerak dapat berupa cairan maupun gas.
3. Penyangga atau matrik (support), yaiu bahan padat yang digunakan pada
kromatografi untuk menahan fase diam yang berupa cairan atau gas
supaya tidak bergerak.
4. Penyerap (sorbent), yaitu bahan padatan yang berfungsi sebagai
penyangga sekaligus sebagai fase diam.
5. Solut (solute), adalah komponen-komponen yang terdapat dalam bentuk
campuran dalam pelarut yang akan dipisahkan melalui sistem kromatografi.
6. Pengembang (developer) atau eluen (eluent), adalah pelarut/larutan yang
digunakan untuk mengelusi carnpuran komponen yang sudah ada di dalam
sistem kromatografi supaya dapat bergerak sepanjang pelat-pelat teoritis
(kolom).
7. Eluat, yaitu pengembang atau eluen yang keluar dan sistem kromatografi
yang secara periodik mengandung komponen-komponen yang sudah
terpisahkan.
8. Elusi ialah pekerjaan atau usaha untuk menjalankan komponenkomponen
dalam pelarut untuk bergerak sepanjang kolom dalam sistem kromatografi
dengan cara mengalirkan eluen.
9. Pemuatan (loading) sampel, yaitu pekeijaan menempatkan sejumlah larutan
sampel yang mengandung komponen-komponen yang akan dipisahkan ke
dalam ruang sampel yang ada pada peralatan kromatografi.

Universitas Gadjah Mada

10. Volume retensi (retention volume, void volume, hold-up volume), ialah
jumlah larutan pengelusi (fase bergerak) yang memenuhi rongga-rongga
dan pori-pori dalam kolom (matrik).
11. Volume bed (bed volume) adalah jumlah larutan pengelusi ditambah
dengan volume kolom.
12. Volume pengelusi (elution volume) ialah jumlah larutan pengeluasi yang
harus ditambahkan ke dalam sistem kromatografi untuk menghasilkan
(mengeluarkan dari kolom) sebuah puncak kromatogram.
13. Kolom adalah sejumlah matnik yang dimasukkan ke dalam tabung untuk
kromatografi.
14. Kromatogram adalah respon detektor dalam bentuk grafik di antara sumbu
respon versus waktu retensi atau dalam bentuk noda-noda di atas bahan
penyerap atau fase diam.
Sistem dalam Kromatografi
1. Sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan
polaritas pada matrik (fase diam). Sistem ini terjadi pada kromatografi yang
menggunakan fase diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam
dan fase bergeraknya berupa gas, fase diam berupa cairan sedangkan fase
bergerak berupa gas, atau fase diam berupa gas sedangkan fase diamnya
berupa cairan.
2. Sistem adsorpsi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan pada
kecenderungan komponen-komponen mengadakan adsorpsi pada matrik
(fase diam). Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase
diam berupa padatan sedangkan fase bergeraknya berupa cairan atau gas.
3. Sistem normal (normal phase) yaitu kromatografi yang menggunakan fase
diam bersifat polar dan fase bergeraknya bersifat non-polar.
4. Sistem sungsang atau sistem terbalik (reversed phase) jika dalam
kromatografi digunakan fase diam bersifat non-polar sedangkan fase
bergeraknya bersifat polar.
5. Sistem penukar ion (ion exchange) ialah sistem kromatografi yang
menggunakan dasar perbedaan muatan antara komponen yang dipisahkan
dengan muatan matriknya.
6. Sistem afinitas ialah pemisahan komponen dengan kromatografi yang
mendasarkan pada perbedaan afinitas (kemampuan bergabung) untuk
mengadakan ikatan dengan fase diam.

Universitas Gadjah Mada

7. Sistem penyaring molekuler (molecular sieve) atau sistem ekslusi bentuk

(size exclussion) jika pemisahan komponen didasarkan pada perbedaan
ukuran (bentuk) atau berat molekulnya. Pada sistem ini molekul-molekul
yang besar (berat molekul tinggi) akan keluar terlebih dahulu karena
molekul-molekul yang kecil mengadakan retensi sementara waktu di dalam
pori-pori matrik.
8. Sistem pasangan ion (ion pairing) jika ke dalam sistem kromatografi
ditambahkan bahan atau komponen yang dapat merubah tegangan ionik
pada matrik atau eluen atau keduanya. Kromatografi ini sering digabungkan
dengan kromatografi fase normal atau kromatografi fase sungsang.
Jenis/Tipe Kromatografi
1. Kromatografi kertas adalah kromatografi yang menggunakan kertas dengan
sifat-sifat tertentu sebagai alat sekaligus media untuk memisahkan
campuran komponen dalam pelarut.
2. Kromatografi lapis tipis ialah kromatografi yang menggunakan matrik yang
dibentuk berupa lapisan tipis pada permukaan lempeng benda padat seperti
kaca, aluminium, atau plastik sebagai media untuk memisahkan campuran
komponen dalam pelarut.
3. Kromatografi kolom yaitu kromatografi yang menggunakan matrik yang
dimasukkan ke dalam tabung sehingga membentuk kolom yang digunakan
sebagai media untuk memisahkan campuran komponen dalam pelarut. Tipe
kromatografi kolom di dalam praktek dapat merupakan:
a. Kromatografi kolom partisi yaitu kromatografi yang menggunakan fase
diam berupa cairan yang diadsorpsikan pada permukaan partikelpartikel matrik dalam kolom dan menggunakan fase bergerak berupa
cairan.
b. Kromatografi kolom adsorpsi yaitu kromatografi yang menggunakan
fase diam berupa padatan sekaligus sebagai matrik yang dimasukkan
ke dalam suatu tabung dan menggunakan fase bergerak berupa cairan.
c. Kromatografi gel

yaitu

kromatografi

yang

menggunakan

bahan

penyangga padatan sebagai penyaring molekuler komponen.

d. Kromatografi gas cairan yaitu kromatografi kolom yang mengunakan
fase diam berbentuk cairan dan fase bergerak berbentuk gas.

Universitas Gadjah Mada

e. Kromatografi gas padatan yaitu kromatografi kolom yang menggunakan

fase diam berupa padatan dan fase bergerak berupa gas.
f.

Kromatografi kolom tekanan tinggi yaitu kromatografi kolom partisi atau

adsorpsi yang menggunakan tekanan tinggi untuk mempercepat laju
gerakan larutan pengelusi dan pemisahan komponen. Dalam praktek
misalnya adalah HPLC (high performance liquid chromatography).

4. Elektroforesis adalah pemisahan komponen-komponen yang didasarkan

pada perbedaan muatan ion antara satu komponen dengan yang lain
melalui suatu matrik di dalam lingkungan medan listrik. Sebagian ahli
memandang elektroforesis tidak termasuk dalam golongan kromatografi.
5. Kombinasi

kromatografi

dengan

elektroforesis

atau

dengan

spektrofotometri.
Hukum Distribusi

K = koefisien distribusi = koefisien partisi = kelarutan relatif;

k = konsentrasi solut

Faktor Retardasi (Rf)

Jika Vs dan Vm masing-masing adalah banyaknya (volume) fase diam dan fase
bergerak, maka pada fase bergerak:

Dan pada fase diam,

Universitas Gadjah Mada

c = faktor kapasitas (besarnya setara dengan rasio jumlah solut yang berada di
dalam fase diam dan yang berada di dalam fake bergerak)

Di dalain praktek Rf digunakan untuk menentukan lokasi solut dalam sistem

kromatografi:

Vh = volume eluen yang diperlukan untuk mengisi kolom (hold-up volume)

Vr = volume eluen yang diperlukan untuk kromatogram (volume retensi).
mengelusi keluarnya
Pada kromatografi kertas dan lapis tipis lainnya besarnya Rf:

As = L x W= luas fase diam pada pada kertas atau lapis tipis

Lm = jarak yang ditempuh oleh fase bergerak
Ls

= jarak yang ditempuh oleh fase diam

W = lebar kertas atau lapis tipis

Pada kromatografi kolom besarnya Rf:

Rf dapat diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut (Am) dan jarak tempuh
fase bergerak/larutan pengelusi (Am+KAs) pada kertas atau lapis tipis, yaitu:

Waktu Retensi
Waktu retensi (tr) = lamanya solut tinggal di dalam sistem kromatografi = waktu
yang diperlukan untuk mengeluarkan solut dan dalam ke luar kolom = waktu

Universitas Gadjah Mada

yang diperlukan untuk membentuk puncak kromatogram sejak sampel

diaplikasikan.

L =

panjang kolom, F = kecepatan solut

bergerak

melalui kolom

(mengekspresikan kecepatan aliran fase bergerak), tm = waktu yang diperlukan

solut untuk menempuh jarak di dalam kolom sampai keluar dan kolom. Jika
kecepatan mengalir fase bergerak konstan, maka:

sehingga Rf dalam sistem kolom dapat ditentukan berdasarkan:

Jumlah pelat teoritis (n) dapat dihitung (lihat Gambar):

Teori Lapisan (Pelat)

Ekivalensi pelat teoritis (EPT), high equivalent to a theoritical plate (HETP) =

rasio antara panjang kolom dengan jumlah pelat teoritisnya,

Jika nilai ekivalensi pelat teoritis kecil maka menguntungkan karena akan
menghasilkan kromatogram yang ideal.

Universitas Gadjah Mada

Menurut Van Deemter dan Gidding:

A = konstanta Eddy diffusion,

B = konstanta difusi longitudonal
C = konstanta keseimbangan dinamis
F = kecepatan aliran linear fase bergerak.

Efisiensi Kromatografi

Menurut Van Deemter dan Gidding:

Resolusi

= resolusi

Atr

= jarak antara dua puncak yang memisah

WA = lebar garis dasar puncak A

WB = lebar garis dasar puncak B

Universitas Gadjah Mada

Pengaruh berbagai faktor terhadap resolusi kromatogram.

(a) Pemisahan pada kolom pendek dengan sedikit lapisan teoritis.
(b) Kondisi (a) tetapi suhu dinaikkan, resolusi bertambah baik.
(c) Pemisahan pada kolom panjang dengan lapisan teoritis banyak.
(d) Kondisi (c) tetapi suhu dinaikkan, resolusi bertambah baik.
Tailing Dan Fronting

Universitas Gadjah Mada

Tipe-tipe kromatogram (a) kromatogram berbentuk kurva Gaussian yang

terbentuk pada kromatografi kolom, (b) kromatogram berbentuk noda (spot)
yang terbentuk pada kromatografi kertas dan lapis tipis.
Dalam praktek sering terjadi tailing dan fronting, salah satu sebabnya adalah
terlalu banyak sampel dimuatkan pada sistem (overloading).

Identifikasi dan Analisis Kuantitatif

Evaluasi secara kuantitatif dilakukan sesudah evaluasi kualitatif.
1. Dengan menggunakan alat yang disebut dengan planimeter.
2. Dengan menghitung berat kromatogram.
3. Dengan menghitung luas kromatogram.
4. Dengan mengukur tinggi dan lebar kromatogram pada tengah-tengah
ketinggiannya, kemudian mengalikan keduanya satu dengan yang lain.
5. Dengan menggunakan integrator/recorder yaitu alat yang bekerja secara
elektronik yang dirancang secara khusus untuk keperluan tersebut
(penghitungan luas kromatogram).

Presisi metoda pengukuran kromatogram

Universitas Gadjah Mada

Standar
Merupakan faktor koreksi untuk memperoleh konsentrasi yang sebenarnya
1. Metoda standar eksternal jika pengelusian standar dan sampel dilakukan
terpisah (sendiri-sendiri) dengan kolom dan kondisi yang sama. Senyawasenyawa yang digunakan sebagai standar sama dengan komponenkomponen yang ada pada sampel sehingga waktu retensi standar dan
sampel akan sama. Untuk menghitung konsentrasi komponen dalam
sampel:

Kurva standar hubungan antara luas area dengan konsentrasi

2. Metoda standar internal jika standar dan sampel dielusikan bersama-sama
pada kolom yang sama. Standar yang digunakan merupakan senyawa seri
dari komponen-komponen sampel dan yang kromatogramnya tidak muncul
pada sampel (senyawa yang digunakan untuk standar internal tidak
terdapat pada sampel).
3. Metoda spiking ialah penggunaan standar internal dimana senyawa yang
digunakan sebagai standar internal terdapat di dalam sampel.
2-2

KROMATOGRAFI KOLOM PARTISI

Sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas
perbedaan polaritas pada matrik (fase diam). Sistem ini terjadi pada
kromatografi yang menggunakan fase diam dan fase bergeraknya berupa
cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa gas, fase diam berupa cairan
sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam berupa gas sedangkan
fase diamnya berupa cairan.
Peralatan
Kromatografi kolom partisi menggunakan suatu tabung yang terbuat dari
kaca, nilon, fiberglass, atau logam tahan karat. Pada bagian bawah (dasar)

Universitas Gadjah Mada

tabung diberi penahan (glasswool dan atau pasir) untuk menahan bahan
penyangga supaya tidak keluar dan tabung. Di bagian bawah tabung terdapat
pipa bergaris tengah kecil, dapat dilengkapi dengan keran yang dapat dibuka
atau ditutup untuk mengalirkan atau menghentikan aliran pelarut dan dalam
tabung. Tabung kemudian diisi dengan kolom yang sudah disiapkan terlebih
dahulu. Tinggi kolom paling sedikit 20 kali diameternya. Pada bagian atas
tabung ditempatkan reservoir eluen. Cara mengoperasikan peralatan adalah
dengan mengelusi sampel yang diletakkan di atas kolom. Elusi dihentikan jika
diperkirakan semua komponen telah terpisahkan.
Bahan Penyangga (Matrik = Kolom)
Bahan penyangga dan sifatnya yang banyak digunakan pada
kromatografi kolom partisi antara lain seperti pada Tabel 1.
Tabel 1
Bahan penyangga komersial untuk kromatografi kolom

Universitas Gadjah Mada

Preparasi Bahan Penyangga

Untuk bahan penyangga berupa tanah diatome atau gel silika, maka
bahan penyangga ini harus dicampur dengan fase diam yang akan digunakan
dengan perbandingan 0,5-1,0 bagian fase diam dengan 1,0 bagian bahan
penyangga. Pencampuran harus baik, misalnya dengan menggunakan mortar
atau blender sehmgga akan dihasilkan semacam pasta atau bubur yang tidak
terlalu basah tetapi juga tidak kering. Fase diam yang akan digunakan
kemudian ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut sehingga terjadi sluri.
Setelah itu sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan pengaduk berbentuk
cakram yang diameternya lebih kecil sedikit daripada diameter tabung. Pada
pusat cakram diberi tangkai panjang. Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung
dan digerakkan berkali-kali sepanjang tabung ke atas dan ke bawah, maka
cakram akan dapat bergerak leluasa, dan sluri akan dapat bergerak melalui
sela-sela cakram dengan dinding tabung. Gerakan cakram harus perlahanlahan, dilakukan beberapa kali. Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase
diam dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung.
Untuk kolom selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam aseton.
Campuran kemudian dituangkan ke dalam tabung. Kelebihan aseton
dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Kolom
kemudian dicuci dengan fase bergerak sampai teijadi keseimbangan. Kadangkadang sebelum dicuci dengan fase bergerak, dicuci terlebih dahulu dengan air
berlebihan.
Teknik Elusi
Ada beberapa cara mengeluasi sampel. Yang pertama dengan cara bertahap
(batch elution atau stepwise elution), yaitu mengelusi kolom dengan suatu jenis
pelarut (dapat merupakan campuran dua macam atau lebih pelarut) sampai
sejumlah volume eluat tertentu dikumpulkan, kemudian elusi dilanjutkan
dengan jenis pelarut lain dengan cara yang sama, demikian seterusnya dengan
jenis pelarut yang lain lagi sampai selesai. Keuntungan dengan menggunakan
cara ini adalah mudah dilakukan penyeimbangan (conditioning) kolom. Dengan
demikian fraksi fraksi yang ingin dipisahkan dapat dielusi dengan sesedikit
mungkin eluen.
Cara yang kedua adalah mengalirkan eluen secara berterusan (continuous
elution). Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan pompa peristaltik atau

Universitas Gadjah Mada

secara sederhana dengan meletakkan tangki penyedia freservoir) pelarut tepat

di atas kolom.
Cara yang ketiga adalah mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih
pelarut sekaligus dengan rasio yang berubah selama elusi. Cara ini lazim
disebut sebagai pengelusian bertingkat (gradient elution). Dengan cara ini
konsentrasi suatu pelarut dapat dinaikkan atau diturunkan secara bertahap
selama proses elusi berlangsung. Jadi seandainya eluen yang digunakan terdiri
atas dua macam pelarut, A dan B, maka konsentrasi A dapat dibuat naik secara
bertahap sedangkan konsentrasi B secara otomatis akan menurun, atau dibuat
sebaliknya. Yang dapat dibuat bertingkat bukan hanya rasio antara pelarutpelarut yang digunakan tetapi juga misainya dapat konsentrasi garam, nilai pH,
polaritas, dan sebagainya. Pelaksanaan elusi bertingkat dapat dikerjakan
dengan dua tanghki yang dihubungkan menjadi satu. Tangki kedua dilengkapi
dengan keran untuk mengeluarkan isinya, yang terhubungkan dengan kolom.
Tipe kenaikkan bertingkatnya dapat berbeda jika ukuran tangki pertama dan
kedua berbeda. Jika ukuran kedua tangki sama besarnya, maka perubahan
gradien akan tetap (konstan) atau mengikuti garis linear. Jika ukuran tangki
pertama lebih besar atau lebih kecil daripada ukuran tangki kedua, maka
perubahan gradien masing-masing pelarut akan berlangsung makin menurun
atau menaik, tidak mengikuti garis linear.

Universitas Gadjah Mada

Penggunaan
Kromatografi kolom partisi banyak digunakan untuk memisahkan berbagai
komponen yang terdapat dalam bahan pangan dan pakan termasuk juga bahan
hasil pertanian pada umumnya, antara lain:
1.

Asam-asam lemak C2-C8, dengan fase diam campuran air dan asam sulfat
dengan perbandingan tertentu, dan fase bergerak campuran kloroform dan
n-butanol.

2.

Senyawa-senyawa

golongan

lipida,

dengan

fase

diam

campuran

trikiorometan dan alkana dan fase bergerak 2-propana.

3.

Karbohidrat dan glukosida dengan fase diam 1,2-etanadiol monometileter

dan fase bergerak 2-propana.

4.

Golongan fenol dengan fase diam berupa air dan fase bergerak campuran
metanol, n-butanol, dan kloroform.

5.

Untuk memisahkan aidrin-dieldrin (keduanya adalah insektisida) dengan

fase diam nitrometan dan fase bergerak n-heksana.

2-3 KROMATOGRAFI KOLOM ADSORPSI

Berbeda dengan kromatografi partisi, maka dalam kromatografi adsorpsi yang

menjadi fase diam adalah berupa padatan yang sekali gus juga berperan
sebagai penyangga. Permukaan partikel-partikel penyangga mempunyai sifat
aktiv yang dapat mengikat komponen-komponen atau molekul-molekul tertentu.
Pengikatan komponen-komponen tersebut dapat disebabkan karena interaksi
ionik (elektrostatik), gaya Van der Wals, atau tenaga-tenaga lainnya mau pun
kombinasinya. Selama kromatografi berlangsung akan terjadi penyerapan
molekul-molekul yang dipisahkan (solut) yang terdapat dalam larutan pada
permukaan

penyangga.

Kekuatan

penyerapan

dipengaruhi

oleh

sifat

penyangga dan solut. Pada umumnya penyangga merupakan komponen yang

mempunyai polaritas tinggi, sehingga penyerapan solut pada permukaan
penyangga sangat tergantung pada polaritas solut. Komponen-komponen yang
mempunyai polaritas tinggi akan terikat kuat pada permukaan penyangga,
sedangkan yang polaritasnya rendah kurang kuat atau tidak terikat pada
permukaan penyangga.
Sebagai bahan penyangga harus dipilih sesuai dengan komponen-komponen
yang akan dipisahkan. Dalam praktek pada umumnya sering digunakan

Universitas Gadjah Mada

alumina yang dapat digunakan untuk memisahkan hanipir semua komponen

organik.
Sifat eluen atau pelarut juga berpengaruh pada kromatografi adsorpsi.
Umumnya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah. Kekuatan pelarut
mengelusi komponen-komponen yang terikat pada penyangga meningkat
dengan meningkatnya polaritas.

Peralatan
Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan tabung seperti halnya pada
kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan
penyiapan kolom partisi. Partikel-partikel penyangga dibuat sluri dengan
menggunakan pelarut yang akan digunakan sebagai fase bergerak, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung dan dibiarkan beberapa waktu lamanya supaya
partikel-partikel penyangga mengendap. Cara memuatkan sampel, teknik
mengelusi, dan pengumpulan fraksifraksi, serta cara-cara analisisnya sama
dengan yang telah diterangkan pada kromatografi kolom partisi. Komponen
yang keluar kolom terlebih dahulu tergantung pada sistem kromatografi yang
digunakan. Pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase normal, maka yang
keluar kolom lebih awal adalah komponen yang mempunyai sifat lebih nonpolar
daripada komponen-komponen yang membentuk puncak kromatogram lebih
akhir. Sebaliknya pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase sungsang,
maka yang membentuk puncak kromatogram lebih awal adalah komponen
yang bersifat lebih polar danpada yang kemudian.

2-4 KROMATOGRAFI GEL

Pada kromatografi gel, partikel-partikel yang dipisahkan berupa molekulmolekul

berdasarkan pada ukurannya. Oleh karenanya kromatografi gel sering kali
disebut dengan kromatograli penyaring molekuler. Yang bertindak sebagai
penyaring adalah suatu kolom gel yang dipersiapkan dan bahan-bahan
tertentu, misalnya dekstran. Perbedaannya dengan penyaringan biasa adalah
bahwa dalam kromatografi gel molekul-molekul yang berukuran besar akan
lobs lebih dahulu, sedangkan molekul-molekul yang kecil ukurannya akan
muncul lebih akhir.

Universitas Gadjah Mada

Bahan Penyangga (Kolom)

Suatu gel adalah jaringan tiga demensi yang biasanya mempunyai struktur
acak dan suatu komponen bahan. Persyaratan utama gel yang dapat
digunakan pada kromatografi gel adalah yang inert, artinya tidak bereaksi
dengan atau mempengaruhi sifat-sifat molekul-molekul yang dipisahkan atau
dengan komponen-komponen pelarut atau larutan penyangga yang digunakan.
Di samping itu gel juga harus tidak bermuatan (positif atau negatif) . Tiga
macam gel yang banyak digunakan pada kromatografi gel adalah dekstran,
agarosa, dan poliakrilamida. Dekstran merupakan polisakarida dengan sub-unit
penyusunnya adalah glukosa. Komponen-komponen dekstran adalah glukosa
yang membentuk ikatan satu sama lain dan bercabang pada ikatan -1,6glikosidik. Gel dekstran banyak dijual beikan dengan nama komersial antara
lain Sephadex yang dibuat oleh Pharmacia Fine Chemicals, Inc.
Agar merupakan polisakarida yang diperoleh dan tanaman rumput laut yang
berwarna merah. Ada dua jenis agar, yaitu agarosa yang berisfat netral dan
agaropektin yang mengandung gugus asam (gugus karboksilat, -COOH) dan
gugus sulfat. Agarosa merupakan polimer D-galaktosa dan 3,6-anhidro- 1galaktosa, membentuk gel melalui ikatan hidrogen yang ada. Agarosa
diperdagangkan dengan berbagai nama, antara lain Sepharose yang diproduksi
oleh Pharmacia Fine Chemicals, Inc. dan Biogel yang diproduksi oleh Bio-Rad
Laboratories. Agaropektin jarang digunakan dalam kromatografi gel.
Gel poliakrilarnida dibuat dengan mencampur akrilamida (CH2+=CH-CO-NH2)
dengan

N,N-metilenabisakrilamida

(H2C=CH-C(=O)-NH-CH2-NH-

C(=0)-

CH=CH2). Salah satu gel poliakrilamida yang dipasarkan adalah Bio-gel-P yang
diproduksi oleh Bio-Rad laboratories.
Penyiapan kolom untuk kromatogrfai gel hampir tak ada bedanya dengan
penyiapan kolom untuk kromatografi adsorpsi atau partisi. Berikut ini diberikan
beberapa petunjuk cara menyiapkan kolom dan beberapa gel.
1. Gel dekstran.- Butiran-butiran dekstran (BM 40.000) sebanyak 500g
dicampur dengan 200m1 aquades dan 300ml larutan 5N NaOH. Selanjutnya
135g epiklorohidrin ditambahkan sambil dilakukan pengadukkan. Campuran
kemudian dipanaskan pada suhu 400C sambil terus diaduk sampal menjadi
sluri, yang kemudian dapat dituangkan ke dalam tabung kromatografi.
Setelah 1 jam biasanya kolom siap untuk digunakan.

Universitas Gadjah Mada

2. Gel agarosa.- Agar dicampur dengan aquades sehingga memperoleh

konsentrasi seperti yang diinginkan. Kemudian dilakukan pemanasan pada
suhu 1200C selama 20 menit dengan menggunakan otoklav. Setelah itu
didinginkan sampai tampak larutan gel mulal menjadi kental (viscus), dan
segera dimasukkan ke dalam tabung kromatografi. hasil kolom akan menjadi
lebih baik, jika larutan gel dalam keadaan panas disaring terlebih dahulu
dengan menggunakan penyaring hampa. Setelah itu filtrat gel dibiarkan agak
dingin lalu dimasukkan ke dalam tabung kromatografi.
3. Gel poliakrilamida.- Akrilamida sebanyak 57g dan N,Nmetilenabisakrilamida
sebanyak 3g dilarutkan bersama-sama 500 ml air (aquades). Udara di dalam
air terlebih dahulu sudah harus dihilangkan dengan cara degassing selama
10 menit. Air juga dapat diganti dengan larutan penyangga (buffer) yang
sama dengan yang akan digunakan untuk mengelusi kolom, tetapi pH
larutan penyangga hendaknya sedikit di atas nilai 6,0 dan telah dilakukan
degassing selama 2-3 menit. Adanya oksigen di dalam air atau larutan
penyangga dapat menghambat polimerisasi akrilamida. Degassing dapat
dilakukan dengan cara menghembuskan gas nitrogen atau hidrogen melalui
pipa berdiameter kecil ke dalam air atau larutan penyangga, atau dengan
cara menghampakan udara di dalam wadah yang berisi air atau larutan
penyangga tersebut. Kemudian 1 ml dimetilaminopropionitril dan 1 g
ammonium

persulfat

ditambahkan

ke

dalamnya

sambil

dilakukan

pengadukan. Sluri kemudian dimasukkan ke dalam tabung kromatografi.

Biasanya dalam waktu 10 menit kolom sudah siap untuk digunakan, tetapi
lebih baik (dianjurkan) menggunakannya setelah beberapa jam kemudian.
Kromatografi gel mempunyai keuntungan dan kerugian antara lain dalam
operasinya gel hampir tak dipengaruhi oleh suhu, pH, tegangan ionik, dan
komposisi larutan penyangga. Pengaruh adsorpsi hampir tidak ada sehingga
tidak mempengaruhi sifat-sifat komponen yang dipisahkan. Pada kromatografi
gel, pita-pita (daerah, zona) pemisahan lebih tegas dan sempit daripada yang
terjadi pada teknik-teknik kromatografi lainnya.
Gaya gravitasi mempengaruhi kecepatan pemisahan. Oleh karena itu
kromatografi gel berjalan lambat. Molekul-molekul yang kecil akan tidak muncul
atau munculnya memerlukan waktu yang sangat lama. Untuk mengatasi hal
tersebut

dapat

diberikan

tekanan

untuk

mempercepat

aliran

eluen.

Kromatografi gel merupakan cara yang terbaik untuk memisahkan komponen-

Universitas Gadjah Mada

komponen berdasarkan berat molekulnya dengan recovery sempurna ( 100%),

mempunyai reprodusibeitas (hasil yang sama pada banyak pengulangan)
tinggi, dan dapat digunakan untuk keperluan analisis dan preparatif dan
memerlukan waktu yang pendek serta tanpa memerlukan biaya yang mahal.
Komponen-komponen dengan selisih berat molekul kecil dapat dipisahkan
dengan cara ini dengan hasil yang sangat balk.

Penggunaan
Pada umumnya kromatografi gel digunakan untuk mengestimasi berat molekul
komponen-komponen bahan. Untuk ini diperlukan beberapa standar dengan
berat molekul yang bervariasi dan diketahui. Dalam praktek, yang sering
dikerjakan adalah menggunakan standar dengan berat molekul 103-106 dalton.
Standar dilarutkan dalam pelarut kemudian dielusikan ke dalam kolom. Standar
dengan berat molekul tinggi akan keluar membentuk puncak kromatogram
terlebih dahulu, makin kecil berat molekulnya akan lama membentuk puncakpuncak kromatogram, dan yang paling kecil berat molekulnya akan keluar
membentuk puncak kromatogram paling akhir. Dengan demikian akan dapat
dibuat suatu kurva yang menunjukkan hubungan antara waktu retensi dengan
berat molekul.
2-5 KROMATOGRAFI GAS

Ada dua macam kromatografi gas, yaitu kromatografi gas cairan (gas liquid
chromatography,

GLC)

dan

kromatografi

gas

padatan

(gas

solid

chromatography, GSC). Fase diam pada kromatografi gas cairan adalah cairan
yang mempunyai titik didih tinggi yang ditahan/diikatkan pada penyangga.
Pemisahan komponen pada kromatografi gas cairan asarkan pada proses
sorpsi partisi. Pada kromatografi gas padatan diam yang digunakan adalah
padatan yang sekaligus berfungsi gai bahan penyerap.

Universitas Gadjah Mada

Peralatan

Fase Diam
Persyaratan untuk fase diam harus innert terhadap sampel, bahan penyangga,
dan bahan tabung, dan tidak mudah menguap (nonvolatile), stabil pada suhu
operasi kromatografi, mempunyai kemurnian tinggi, tidak tercampur oleh bahan
lain. Fase diam ada yang bersifat polar misalnya poliester yang berat
molekulnya tinggi, golongan ester, carbowax, amin, dan yang berisfat non-polar
misalnya hidrokarbon, minyak (lemak), silikon. Pada penggunaannya sebaiknya
digunakan fase diam yang mempunyai sifat kimiawi mirip dengan komponenkomponen yang dipisahkan. Perbedaan polaritas akan menyebabkan tailing
atau fronting. Pemisahan hidrokarbon dengan menggunakan squalane atau
lemak siikon DC200, Pemisahan komponen-komponen yang mempunyai
polaritas yang bervariasi, diperlukan beberapa kali uji coba fase diam dengan
menggunakan fase bergerak yang berbeda-beda sebelum digunakan untuk
sampel.

Universitas Gadjah Mada

Tabel 2.
Berbagai jenis fase diam untuk kromatografi gas

Fase Bergerak
Merupakan gas pembawa yang ditempatkan dalam tabung bertekanan tinggi
(rata-rata 40 psi) untuk menghasilkan kecepatan aliran gas 10-100cm3/menit.
Gas pembawa harus murni (tidak mengandung uap air, hidrokarbon, atau gasgas lain). Yang populer adalah nitrogen, gas argon, gas helium, dan gas
hidrogen. Penggunaanya tergantung pada jenis detektor yang digunakan,
ketersediaan gas, dan biaya/harga.
Bahan Penyangga
Fungsi bahan penyangga untuk kromatografi gas cairan adalah sebagai bahan
yang mengikat/menahan fase diam berbetuk cairan atau gas, sedangkan pada
kromatografi gas padatan berfungsi sebagai fase diam. Persyaratan untuk
bahan penyangga adalah innert, murni (tidak tercampur bahan lain, dan logam,

Universitas Gadjah Mada

tidak mengandung silanol (Si-OH)). Sebelum digunakan bahan penyangga

hams dicuci dengan larutan asam atau basa untuk menghilangkan cemaran
logam, dilakukan silanasi untuk mengubah gugus Si-OH menjadi Si-O-Si(CH3)3.
silanasi dapat dilakukan dengan mencuci bahan penyangga dengan dimetil
dikiorosilan atau dengan heksametildisilazan.
Bahan penyangga pada kromatografi gas cairan yang populer adalah tanah
diatome dan silika yang di dalam perdagangan dipasarkan sebagai celite,
chromosorb, dan stermachol. Bahan penyangga pada kromatografi gas
padatan umumnya adalah gel silika atau bahan-bahan yang digunakan untuk
kolom pada kromatografi gel.
Makin kecil partikel bahan penyangga akan makin tinggi efesiensinya. Bahan
penyangga berukuran 80/ 100 mesh - 100/200 mesh banyak digunakan untuk
kolom yang bergaris tengah 3mm atau 0,1251n, bahan penyangga berukuran
40/60 mesh 60/80 mesh digunakan untuk kolom yang bergaris tengah lebih
besar (misalnya 6mm atau O,25in).
Jumlah fase diam yang dapat ditahan oleh bahan penyangga berpengaruh
pada pemisahan. Jumlah 15-30% w/w akan menghasilkan lapisan film yang
tebal, pemisahan sukar terjadi, jumlah 1-10% w/w merupakan jumlah yang
ideal, pemisahan sempurna, sedangkan jumlah kurang dan 1% menyebabkan
sampel overloading, dapat menyebabkan tailing atau pun fronting.
Kolom
Kolom yang dapat digunakan pada kromatografi gas ada dua macam, yaitu
kolom tertutup (packed column) dan kolom terbuka(open-tubular column atau
capillary column). Kolom tertutup berukuran panjang 1- 20m, diameter 3-10mm
atau

0,125-0,375in.

Garis

tengah

kolom

sangat

menentukan

kapasitas/kemampuannya. Kolom tertutup umumnya mempunyai lapisan

teoritis kurang daripada 10.000 (rata-rata 1000- 3000/ 1m). Kolom terbuka
berukuran panjang 10-50m, diameter 0,2-1,2mm. Cara preparasi kolom terbuka
ada dua macam, yaitu wallcoated open tubular (WCOT, melapisi langsung
dinding bagian dalam tabung dengan fase diam berbentuk cairan) dan supportcoated open tubular (SCOT, melapisi dinding bagian dalam tabung dengan
sluri campuran bahan penyangga dengan fase diam). WCOT bergaris tengah
0,25mm, panjang 50- 150m, ketebalan lapisan fase diam 1pm. SCOT bergaris
tengah rata-rata 0,5mm, panjang 16m, jumlah lapisan teoritis 600.000 (rata-rata

Universitas Gadjah Mada

1000-4000/ 1 m). SCOT yang berupa kolom kapiler panjangnya dapat

mencapai 3000m dengan diameter kolom < 0, 1 mm. Kelebihan kolom kapiler
dibanding kolom lainnya adalah pemisahan komponen menjadi lebih tegas,
lebih reprodusibel, dan lebih efisien.
Kolom ditempatkan di dalam oven. Suhu oven merupakan suhu kolom dan
dapat diprogram dan suhu rendah sampai suhu tinggi. Pemrograman dan suhu
tinggi ke rendah tidak umum dikerjakan. Suhu kolom bisa sama bisa tidak sama
dengan suhu injection port. Dapat digunakan prekolom yang ditempatkan
sebelum kolom.
Injection Port
Tempat untuk memasukkan sampel (cair) dinamakan injection port. Cara
memasukkan sampel dapat secara on-column injection atau secara flash
evaporation (biasanya hanya digunakan untuk sampel yang mempunyai titik
didih sangat tinggi). Hexaport adalah ijection port untuk sampel berbentuk gas,
sedangkan injection splitter adalah injection port untuk kolom kapiler. Jumlah
sampel tergantung pada kemampuan/kapasitas kolom dan kepekaan detektor.
Kapasitas kolom kapiler rata-rata 0,01l. Sampel berbentuk cairan (larutan)
encer cukup 0,1-10l, sedangkan sampel berbentuk gas : 1-10ml. Jika
digunakan kolom kapiler, maka jumlah sampel cairan cukup 10-3 - 10-2pl.
Prekolom dapat menampung sampel sampai 20l. Splitter dapat memasukkan
sampel ke dalam kolom kapiler 0,05-0,0001 dan banyaknya sampel yang
diinjeksikan. Untuk memasukkan sampel ke dalam kolom dapat digunakan
automatic sampler. Keuntungannya dapat menghindari terjadinya gelembung
udara dalam siring yang jika diinjeksikan adanya gelembung udara dapat
menyebabkan kromatogram tidak sempurna, dapat mengurangi sisa sampel
yang tertinggal, mengukur jumlah sampel lebih tepat, dapat menghasilkan
kromatogram yang reprodusibel dan lebih presisi daripada jika dilakukan secara
manual. Dengan alat ini juga dapat dilakukan pekerjaan lainnya sementara
pemuatan sampel berlangsung.
Detektor
Fungsi detektor adalah mendeteksi komponen-komponen yang dipisahkan
setelah melalui kolom. Berbagai macam detektor dapat digunakan, antara lain:

Universitas Gadjah Mada

1.

Thermal conductivity detector (TCD) .- Disebut pula katharometer.

Peralatannya terdiri atas sepasang benang logam yang membentuk suatu
jembatan Wheatstone. Cara kerjanya berdasarkan ketergantungan
kecepatan kehilangan panas bahan pada konduktivitas panasnya dan
komposisi gas Iingkungannya. Kepekaan TCD tergantung pada perbedaan
konduktivitas panas antara gas pembawa dalam keadaan murni dan gas
pembawa yang telah digunakan untuk mengelusi kolom sehingga sudah
mengandung

komponen-komponen

dan

sampel.

Makin

besar

perbedaannya makin besar pula sensitivitasnya. TCD jarang digunakan

untuk keperluan analisis kuantitatif. Menghasilkan data yang reliabel,
sensitivitasnya moderat (sedang) saja dan bervariasi untuk masing-masing
komponen yang berbeda. Sensitivitas akan menjadi sangat besar jika
digunakan gas hidrogen atau helium.
Kelemahan TCD kepekaannya non-linear, berubah dengan perubahan
suhu dan kecepatan aliran gas.
2.

Flame ionization detector (FID).- Prinsip kerja berdasarkan adanya

hubungan bahwa konduktivitas elektris suatu gas secara Iangsung
proposional dengan konsentrasi partikel (komponen) yang bermuatan yang
terdapat di dalamnya . FID mempunyai sensitivitas yang sangat tinggi,
reliabelitasnya juga tinggi, dapat digunakan untuk hampir semua komponen
organik kecuali asam format, udara, dan gas-gas organik lainnya.
Kepekaan FID untuk komponen-komponen organik proposional pada atom
karbon yang teroksidasi, sehingga kalau tidak dicermati kadang-kadang
menghasilkan interpretasi yang salah. FID tidak respon terhadap gugusgugus karbon yang teroksidasi seperti misalnya gugus karbonil dan
karboksil. Juga tidak mempunyai respon terhadap eter, gugus halogen,
gugus amin, gugus hidroksil, komponen inorganik yang berasal dan
senyawa-senyawa tersebut yang mudah terionisasi pada api campuran
udara

dan

hidrogen.

Terhadap

gas-gas

karbon

monooksida,

karbondioksida, karbondisuffida (CS2), sulfurdioksida (SO2), hidrogen

sulfida (H2S), ammonia (NH3), NO2, NO, N2O, SiF4, dan SiC14, FID kurang
menunjukkan sensitivitasnya sehingga hal ini sangat menguntungkan jika
bahan-bahan organik runutan (trace) yang terdapat pada sampel dianalisis.
Respon FID sangat dipengaruhi oleh kecepatan aliran gas pembawa, suhu
pembakaran, perbedaan potensial gas pembawa, suhu pembakaran, dan

Universitas Gadjah Mada

perbedaan potensial antara kutub-kutub elektroda. Suhu operasi FID ratarata berkisar antara 100-400oC.
3.

Electron capture detector (ECD).- Prinsip kerjanya berdasarkan perbedaan

kemampuan molekul (komponen) dalam eluat untuk menangkap elektron
yang dihasilkan oleh suatu elektroda radioaktif, yang mengakibatkan
perubahan (penurunan) aliran listrik yang dapat diubah menjadi puncakpuncak kromatogram.

4.

Hidrogen flame detector (HFD) .- Hanya digunakan jika gas hidrogen

sebagai gas pembawa (fase bergerak). Prinsip kerjanya mendeteksi
perubahan warna gas hidrogen pada pembakaran. Dalam keadaan murni,
pembakaran gas hidrogen tidak memberikan warna. Dalam keadaan
mengandung

komponen,

pembakaran

gas

hidrogen

menghasilkan

perubahan warna, yang intensitasnya (tingginya nyala dan luminositas

nyala)

tergantung

pada

konsentrasi

komponen.

Dengan

suatu

thermocouple dapat diukur suhu nyala atau dengan suatu sel foto dapat
diukur kekuatan lumennya. Perlu dicatat bahwa detektor ini tidak sensitif
terhadap komponen-komponen anorganik.
5.

Gas density detector (GDD).- Tidak begitu populer, tetapi mempunyai

kelebihan tanpa memerlukan kalibrasi pada penggunaannya untuk analisis
kuantatif. Prinsip kerjanya seperti TCD, yaitu mengalirkan gas pembawa
melalui

suatu

benang

logam

sirkuit

yang

membentuk

jembatan

Wheatstone. Sensitifitas detektor proposional terhadap perbedaan densitas

sedangkan respon merupakan fungsi linear dan konsentrasi komponen.

2-6 KROMATOGRAFI KOLOM TEKANAN TINGGX (HIGH PERFORMANCE

LIQUID KROMATOGRAPHY, HPLC)

Kelemahan pada kromatografi kolom, baik yang partisi, adsorpsi, atau pun
kromatografi gel, adalah waktu operasinya yang lama. Selain itu waktu yang
lama dapat memberikan peluang kemungkinan terjadinya perubahan sifat pada
komponen atau sampel. Dengan memberikan tekanan yang tinggi, maka aliran
eluen melewati kolom dapat dipercepat sehingga waktu operasi dapat
diperpendek. HPLC sangat fleksibel penggunaannya, dapat digunakan untuk
memisahkan dan menganalisis hampir semua komponen atau senyawa dalam
bahan. Berdasarkan tekanan yang tinggi yang dipergunakan pada HPLC, maka

Universitas Gadjah Mada

seringkali

HPLC

diartikan

sebagai

kepanjangan

dan

high

pressure

chromatography. Tekanan yang digunakan pada HPLC dapat mencapai

5.000psi, bahkan beberapa alat dirancang menggunakan sampai 10.000psi.
Oleh karena HPLC merupakan pengembangan dan kromatografI kolom, maka
tergantung pada kolom digunakan HPLC dapat merupakan kromatografi kolom
partisi, tografi kolom adsorpsi, kromatografi gel, kromatografi penukar ion
Peralatan HPLC
Peralatan HPLC dapat digambarkan secara skematik sebagai berikut.

Peralatan kromatografi tekanan tinggi (HPLC)

Satu unit peralatan HPLC terdiri atas beberapa komponen, yaitu tangki
penyedia pelarut fase bergerak freservoir), pompa tekanan tinggi, monitor
tekanan, injector, kolom, detektor, dan kolektor. HPLC dioperasikan pada
tekanan

tinggi,

rata-rata

8.000psi,

tetapi

beberapa

peralatan

HPLC

dioperasikan pada tekanan yang lebih besar lagi. . Tekanan yang dihasilkan
oleh pompa harus dapat diamati, dan ini dilakukan dengan peralatan yang
dapat memngendalikan (memonitor) secara langsung besarnya tekanan.
Dengan adanya monitor tekanan, maka besarnya tekanan dapat dikendalikan.
Berbeda dengan tempat pemuatan sampel yang digunakan pada kromatografI
gas, pada HPLC tempat pemuatan sampelnya hams dapat tekanan yang tinggi
sehingga semua sampel yang dapat masuk ke dalam kolom. Alat yang

Universitas Gadjah Mada

digunakan untuk memasukkan sampel pada HPLC dilengkapi dengan katup

injeksi. Alat demikian mempunyai dead volume nol dan dapat menahan
tekanan sampai 5.000psi.
Kolom untuk HPLC dikemas dalam tabung baja tahan karat atau bahan lain
yang inert, dan tahan tekanan tinggi. Kolom ditempatkan di dalam ruang yang
bersuhu tetap (konstan). Jenis kolom yang digunakan tergantung komponenkomponen yang dipisahkan, sistem kromatografi (pasangan ion, normal,
sungsang), jenis kromatografi (partisi, adsorpsi, size exlusion, afinitas, penukar
ion, dil.). Di dalam perdagangan dikenal berbagai macam kolom, misalnya
LiChrosorb, LiChrospher, Perisorb, dan iain sebagainya.
Untuk

mendeteksi

komponen

yang

memisah

digunakan

detektor.

Refraktometer merupakan detektor yang digunakan untuk menera pemisalan

karbohidrat, sedangkan spektrofotometer (uv, uv-vis) merupakan detektor yang
paling banyak digunakan untuk menera protein dan turunannya. Untuk
keperluan ini panjang gelombang yang digunakan pada umumnya adalah
220nm, 254nm, atau 280nm. Detektor fluorometer digunakan untuk mendeteksi
steroida, vitamin, nukleotida, amin.
Kolektor atau penampung eluat digunakan untuk menampung eluat yang sudah
melalui detektor. Beberapa peralatan lainya dapat digabungkan, misalnya alat
pencatat data (recorder), pengontrol pompa dan pemrogram operasi.
2-7 KROMATOGRAFI KERTAS DAN LAPIS TIPIS

Peralatan
Teknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan
penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca, lembaran aluminium,
atau fiberglass. Khusus jika kertas yang digunakan, maka kertas berfungsi
ganda, yaitu sebagai pelat sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas
merupakan selulosa yang dapat menyerap eluen sehingga sistem yang terjadi
adalah partisi. Meski pun demikian peristiwa adsorpsi juga terjadi pada
kromatografi kertas. Jenis kertas yang digunakan pada umumnya adalah kertas
Whatman No. 4, 54, 540, 31, dan No. 17, atau jenis kertas lainnya yang
semacam. Perlu diketahui bahwa kerapatan dan ketebalan kertas akan
berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh
pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. Ukuran kertas yang

Universitas Gadjah Mada

umum digunakan adalah 20 x 20 cm atau 10 x 20 cm. Pada kromatografi lapis

tipis, bahan penyangga dilapiskan pada pelat kaca, logam, atau fiberglass.
Bahan penyangga dapat berupa oksida, oksida hidrat atau bentuk garam.
Sebagai bahan penyangga yang populer digunakan pada kromatografi lapis
tipis adalah golongan aluminium oksida, gel silika, kieselguhr, dan selulosa.
Cara preparasinya adalah mula-mula dengan membuat sluri yaitu mencampur
bahan penyangga dengan aquades. Setelah itu dengan alat khusus sluri
dilapiskan pada permukaan pelat sehingga mempunyai ketebalan yang sama.
Sebelum digunakan lapis tipis harus dipanaskan terlebih dahulu pada suhu
120C selama 60 menit untuk aktivasi. Kini telah banyak lapis tipis yang
diperjual belikan dalam keadaan siap untuk digunakan, baik yang dilapiskan
pada pelat kaca, aluminium mau pun fiberglass.
Gerakan dan pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen)
yang diguriakan. Eluen dapat terdiri atas satu macam pelarut atau campuran
dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak campuran pelarut akan sulit
menjenuhkan lingkungan pelat. Juga perlu diingat bahwa campuran pelarut
harus saling tidak melarutkan atau bersifat immisibel, tetapi sampel harus
mempunyai kelarutan yang tinggi pada eluen. Eluen yang mudah menguap dan
tidak meninggalkan noda pada kertas pada umumnya lebih baik digunakan.
Contoh beberapa pelarut yang sering digunakan pada kromatografi kertas dan
lapis tipis adalah:
1. Untuk pemisahan asam amino digunakan pelarut campuran fenol dan air
(larutan jenuh), campuran n-butanol, asam cuka dan air (4: 1 :5 atau 12:3:5),
campuran n-butanol, piridin dan air (1:1:1).
2. Untuk pemisahan golongan karbohidrat digunakan pelarut campuran dan
etilasetat, piridin, dan air (2 : 1 :2), campuran etilasetat, propanol dan air (6:
1:3), campuran etilasetat, asam cuka dan air (3:1:3).
3. Untuk pemisahan asam lemak digunakan campuran n-butanol dan larutan 1
,5M ammonia (larutan jenuh).
Pemuatan Sampel
Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau lapis tipis harus dibuat larutan
dahulu. Larutan sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada
salah satu tepinya dengan jarak kurang lebih 2, 5 cm dan tepi. Tetesan sampel
diusahakan sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa kapiler, pipet

Universitas Gadjah Mada

mikro, atau siring (spet, jarum suntik berukuran mikro). Sebelum dielusi tetesan
sampel dikering anginkan, jika perlu dapat dikerjakan dengan menghembuskan
udara dengan kipas angin atau alat pengering rambut (hair drier). Yang perlu
dijaga adalah selama pengeringan tidak terjadi perubahan sifat sampel, oleh
karena itu sebaiknya pengeringan dilakukan pada suhu kamar.
Teknik Elusi (Pengembangan)
Ada tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan secara ascending,
descending, dan radial atau horizontal. Teknik ascending merupakan cara yang
paling sederhana. Kertas atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya
setinggi kurang lebih 2,5cm dicelupkan pada eluen yang ditempatkan di dalam
bejana. Eluen akan meresap pada kertas atau bahan penyangga dan bergerak
naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang dikehendaki. Teknik
descending merupakan kebalikan dari teknik ascending. Eluen dialirkan dari
tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen akan bergerak
mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan penyangga secara
perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki. Jika dibanding dengan teknik
ascending, maka teknik descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor
gravitasi berpengaruh pada kecepatan aliran eluen dan gerakan komponen
yang memisah. Ada satu hal yang perlu mendapat perhatian pada teknik
descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas ke bawah. ini dapat
ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas saring
yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen. Pada teknik radial
atau horizontal, sampel diteteskan di sekitar pusat kertas atau lapis tipis. Eluen
dialirkan tepat melalui tengah-tengah kertas sehingga peresapan atau gerakan
eluen akan menyebar ke arah radial.

Universitas Gadjah Mada

Ada pun metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode satu arah (one
way direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda satu
arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel
dimuatkan. Sedangkan pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah
dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku
kertas atau lapis tipis (lihat gambar).

Metoda pengembangan

Metoda pengembangan

satu arah

dua arah

Universitas Gadjah Mada

Pengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan kaca sepaya
tampak dan luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam tangki akan jenuh
dengan uap eluen. Kejenuhan ruangan termasuk faktor keberhasilan
pemisahan.
Visualisasi Hasil
Setelah perrnukaan eluen mencapai batas yang ditentukan, kertas atau lapis
tipis diambil (diangkat) dan dikeluarkan dari dalam tangki, kemudian
dikeringkan pada suhu kamar sampai semua eluen menguap. Tempat
komponen yang memisah dapat diketahui dengan visualisasi. Ada beberapa
teknik visualisasi yang dapat dikerjakan tergantung pada jenis dan sifat
komponen yang dipisahkan. Visualisasi secara fisik dapat dilakukan dengan
sinar ultra violet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi. Visualisasi dengan
penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya warna pada
komponen. Aflatoksin misalnya akan tampak bersinar putih kehijauan dengan
sinar ultra violet. Visualisasi dapat pula secara kimiawi yang dapat dilakukan
dengan nyemprotkan suatu larutan atau senyawa yang dapat mengadakan
reaksi dengan komponen sehingga timbul wama. Kombinasi visualisasi secara
kimiawi dan secara fisik sering kali juga dilakukan, misalnya pada suhu 100oC,
maka warna ungu akan timbul.
Tabel 3.
Reagent kromogenat untuk visualisasi kromatogram pada teknik kromatografi
kertas dan lapis tipis

Universitas Gadjah Mada

Interpretasi
Secara kualitataif dapat dilakukan dengan menghitung faktor retardasinya. Rf
diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak tempuh larutan
pengelusi pada kertas atau lapis tipis, yaitu:

Untuk mengetahui jenis komponen yang memisah, Rf sampel dicocokan gan Rf

standar yang dielusi dengan cara yang sama.
Interpretasi secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui jumlah masingmasing komponen yang memisah. Hal ini dapat dilakukan dengan mengukur
atau menghitung luas noda yang terbentuk, menimbang potongan masingmasing noda, menganalisis potongan noda secara kimiawi.

2-8 LATIKAN PEMAHAMAN MATERI KROMATOGRAFI

1.

Urutkan senyawa-senyawa organik tersebut di bawah ini berdasarkan

polaritasnya!
a.

Karbohidrat : fruktosa, glukosa, laktosa, sukriosa, amiosa, manosa,

triosa, selulosa, galaktosa, ribosa.

b.

Asam amino: sistein, tirosin, lisin, glism, arginin, glutamin.

c.

Protein : insulin, tripsin, aktin, albumin, pepsin, amilase, hemoglobin,

kasein, ovomukosin, glisinin.

d.

Lipida : asam linoleat, asam oleat, asam butirat, kolesterol, asam

arakhidat, asam kaprat, /3-karoten, r-karoten asam asetat.

2.

Apa bedanya kromatografi adsorpsi dan kromatografi partisi!

3.

Operasi kromatografi kolom dan suatu solut menghasilkan satu puncak

kromatogram dengan waktu retensi 50 menit. Berapakah banyaknya
lapisan

teoritis

pada

sistem

tersebut

kromatografi

tersebut,

jika

kromatogram yang terjadi berbentuk simetris dengan lebar dasar 5 menit?

4.

Jika larutan sampel dielusikan pada suatu kolom menghasilkan tiga puncak
kromatogram dengan waktu retensi masing-masing 20 menit, 24 menit, dan
30 menit, dengan lebar dasar masing-masing 1 menit, 2 menit, dan 5
menit, sedangkan responnya adalah 2,4, 1,9 dan 2,8.

Universitas Gadjah Mada

a. Gambarkan perkiraan kromatogramnya!

b. Hitung banyaknya lapisan teoritis!
c. Interpretasikan efesiensi kolom?
5.

Hitung EPT pada soal no. 3, jika panjang kolom 1 m dan diameternya
2,5cm!

6.

Kromatografi terhadap glukosa dan fruktosa menghasilkan waktu retensi

1,5 menit dan 2,5 menit dengan lebar dasar 0,5 menit pada suatu kolom
dengan lapisan teoritis 4000.
a.

Berapakah resolusinya jika suatu sampel mengandung kedua

komponen tersebut?

b.

Anggap bahwa waktu retensi tidak berubah. Hitung banyaknya lapisan

teoritis yang diperlukan untuk menghasilkan resolusi sebesar 1,0!

7.

Konstanta Van Deemter untuk suatu kolom dengan 4000 pelat teoritis yang
dioperasikan pada suhu 150C diketahui A=0,O8cm, B=0, 15cm2/detik,
dan C=0,03 detik. Berapakah kecepatan aliran fase bergerak pada sistem
kromatografi ? Berapakah nilai minimum ekivalensi pelat teoritis?

8.

Jelaskan faktor-faktor yang diperlukan untuk menghasilkan kromatografi

yang ideal ! Mengapa dalam praktek sulit diperoleh kondisi tersebut?

9.

Dua senyawa A dan B mempunyai koefisien distribusi masing-masing 4,9

dan 4,6 pada suatu kolom. Senyawa yang mana terelusi terlebih dahulu
jika dipisahkan dengan sistem kromatografi tersebut ? Jelaskan mengapa
demikian!

10. Mengapa dapat terjadi tailing dan fronting pada kromatogram dan
bagaimana cara mengatasinya?
11. Sampel biji legum dengan kandungan lemak 4% dipreparasi untuk dikaji
komposisi asam lemaknya. Dan 0,5ml lemak yang diaplikasikan pada
kromatografi kolom partisi diperoleh delapan puncak yang diperkirakan
terdiri atas asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh. Berikut
disampaikan data kromatografi. Hitung komposisi relatif dan komposisi
sesungguhnya dan masing-masing komponen!

Universitas Gadjah Mada

12. Jelaskan cara-cara yang dapat digunakan untuk mengelusi suatu kolom
kromatografi!
13. Desain suatu kromatografi kolom untuk memisahkan karbohidrat dengan
menggunakan fase diam etanadiol monoetileter dan fase bergerak
propana.
14. Komponen fenol dan daun teh dipisahkan dengan kromatografi kolom
partisi dengan menggunakan fase diam air, fase bergerak campuran
metanol, n-butanol, dan kloroform, dengan matrik bubuk selulosa.
Terangkan jenis fenol yang dapat dipisahkan dan gambarkan perkiraan
kromatogramnya jika kandungan semua jenis fenol sama.
15. Kromatografi gel (kolom) digunakan untuk menera berat molekul peptidapept.ida yang diperoleh dan proses hidrolisis protein. Kolom apa saja yang
dapat digunakan ? Bagaimana operasional teknik analisisnya?
16. Apa saja persyaratan yang diperlukan sebagai bahan penyangga yang
digunakan pada kromatografi gas?
17. Bagaimana teknik elusi pada HPLC dan kromatografi lapis tipis?
18. Berikut adalah kromatogram standar asam amino penyusun protein yang
dikromatografi dengan HPLC sistem fase normal. Anda diminta untuk
membaca dan menginterpretasikan kromatogram tersebut!

Universitas Gadjah Mada

Kondisi kromatografi : kolom Zorbax HN2 (250x4,6mm I.D.), fase

bergerak 10mM kalium fosfat pH 4,3 (A) dan avetonitril-air 50:7 v/v
(B), kecepatan 2m1/menit, suhu 35C. 1. PHE, 2. LEU, 3. ISO, 4.
MET, 5. TYR, 6. VAL, 7. PRO, 8. ALA, 9. HYDROXYPROLIN, 10.
THR, 11, GLY, 12. SER, 13. HIS, 14. CYS, 15. ARO, 16. LYS, 17.
HYDROXYLYSINE, 18. GLU, 19. ASP.
19. Terangkan step by step bagaimana memisahkan golongan karbohidrat
(glukosa, fruktosa, dil.) dengan menggunakan teknik kromatografi lapis
tipis.

Universitas Gadjah Mada