Modul 11

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

A. Kompetensi Dasar
Kompetensi dasar yang harus dicapai mahasiswa dalam modul ini adalah
memahami analisis secara kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).
B. Materi Pokok
Materi pokok yang harus dipelajari lebih mendalam untuk membantu
memperoleh kemampuan-kemampuan tersebut adalah:
1. Dasar teori
2. Instrumentasi
3. Analisis kualitatif dan kuantitatif
C. Uraian Materi Pokok
Dasar Teori
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan teknik pemisahan modern yang didasarkan
pada perbedaan distribusi molekul-molekul komponen diantara fasa gerak dan
fasa diam yang kepolarannya berbeda. Fasa gerak berupa cairan dan fasa diam
cairan atau padatan. Beberapa teori yang berlaku pada kromatografi gas berlaku
juga untuk HPLC, seperti kapasitas dan efisiensi.
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa, fasa
gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara
solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat
berinteraksi dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap
komponen yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor dan direkam dalam
bentuk kromatogram.
HPLC dapat digunakan untuk pemisahan senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis. Bahkan untuk beberapa senyawa organik yang
mudah terurai (labil) pada pemanasan dapat dianalisis dengan HPLC karena
dilakukan pada suhu kamar. Oleh sebab itu HPLC merupakan teknik pemisahan
paling populer yang sering digunakan saat ini. Jenis retensi solut merupakan
dasar dalam HPLC karena pemisahan senyawa bergantung pada jenis dan
kekuatan interaksi solut dengan fasa diam. Berdasarkan mekanisme retensi
tersebut, HPLC terbagi menjadi beberapa jenis yaitu adsorbsi, partisi, fasa
terikat, eksklusi ukuran, dan penukar ion. Setiap mekanisme dapat diterapkan
menjadi suatu metode HPLC.

Instrumentasi
Rangkaian dasar instrumentasi HPLC disajikan pada gambar 11.1 berikut
ini.

Gambar 11.1 rangkaian dasar instrumentasi HPLC

(sumber: Harvey D. 2000:579)
Instrumentasi HPLC tersebut dijelaskan sebagai berikut:
1) Fasa gerak
Fasa gerak berupa zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam HPLC,
selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran, fasa gerak juga
dapat berinteraksi dengan analit-analit. Zat cair yang akan digunakan sebagai
fasa gerak harus memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut:
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
b. Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram.
c. Zat cair harus jernih untuk menghindari penyumbatan pada kolom.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
e. Zat cair tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP.
f. Sesuai dengan detektor.
Berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, sistem HPLC
dikelompokkan atas HPLC fasa normal dan fasa terbalik. HPLC fasa normal jika
fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya. Sedangkan HPLC fasa terbalik
jika fasa diam lebih non polar daripada fasa geraknya.
2) Pompa
Pompa berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang
berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi
persyaratan: (1) menghasilkan tekanan sampai 600 psi; (2) keluaran bebas pulsa
(getaran); (3) kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit; (4) bahan tahan
korosi; (5) dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi.
Jenis-jenis pompa pada HPLC terdiri dari pompa reciprocating, pompa
2

displacement, dan pompa pneumatic yang masing-masing memiliki karakteristik

tersendiri.
3) Injektor
Teknik pemasukan cuplikan dalam HPLC ini meliputi injeksi syringe,
injeksi stop-flow, dan kran cuplikan. Jenis pemasukan cuplikan dengan kran
cuplikan ini paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam
aliran fasa gerak dengan kran cuplikan perlu dua langkah, yaitu (1) sejumlah
volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih
berada dalam loop; (2) kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi
injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Adapun
injektornya sendiri harus memenuhi syarat-syarat berikut:
a. dapat memasukkan analit ke dalam kolom.
b. dalam bentuk sesempit mungkin untuk menghindari pelebaran puncak
c. mudah digunakan.
d. keberulangan tinggi.
e. dapat bekerja meskipun ada tekanan balik.
4) Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang
terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom merupakan tempat berlangsungnya
pemisahan komponen campuran. Syarat kolom adalah:
a. bahan kolom kuat dan tidak mudah berkarat.
b. partikel Isi kolom berdiameter kecil (510m).
c. ukuran seragam, bulat, berpori.
d. efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<).
e. tahan terhadap tekanan tinggi.
f. menghasilkan puncak simetri dan sempit.
Kolom berdasarkan fungsinya terdiri dari kolom utama dan kolom
pengaman. Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung
keperluan. Kolom utama (kolom analitik) ini berfungsi sebagai tempat terjadinya
pemisahan campuran yang diletakkan setelah sistem pemasukan cuplikan.
Sedangkan kolom pengaman diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan.
Kolom pengaman (pra kolom/guard column) berfungsi untuk menyaring kotoran
yang terbawa dalam fasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka
menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian,
kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan.
5) Detektor
Detektor berfungsi mendeteksi solut-solut yang keluar dari kolom analitik.
Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis, yaitu detektor umum
memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut.
Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solut yang
tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat umum terhadap
solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan.

Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

HPLC dapat diterapkan dalam analisis kualitatif dan kuantitatif suatu
sampel, dengan teknik yang tidak berbeda seperti pada GC. Pengukuran pada
HPLC dapat dilakukan dalam dua mode operasional yaitu mode isokratik dan
mode gradien. Mode isokratik dilakukan dengan membuat komposisi fasa gerak
yang tetap selama pengukuran berlangsung. Sedangkan mode gradien dilakukan
dengan membuat komposisi fasa gerak yang divariasikan selama pengukuran
berlangsung (dengan mengatur kecepatan alir masing-masang pelarut sehingga
perbandingan kedua pelarut berbeda pada setiap saat).
Kromatografi partisi terutama dengan fasa terikat banyak digunakan dalam
pemisahan berbagai jenis cuplikan, seperti dalam bidang farmasi, biokimia,
produk makanan, polutan, kimia forensik, dan kedokteran. Kromatografi absorbsi
digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa berisomer. Kromatografi penukar
ion bermanfaat untuk memisahkan molekul-molekul bermuatan terutama ion-ion.
Sedangkan kromatografi eksklusi ukuran berguna untuk memisahkan molekulmolekul dengan berat molekul besar seperti polimer.
Berikut ini contoh kromatogram untuk analisis asetaminopen, asam salisilat,
dan kafein.

Gambar 11.2 Aplikasi HPLC pada analisis asetaminopen, asam salisilat, dan
kafein (sumber: Harvey D. 2000:587)
D. Rangkuman
Kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC merupakan pengembangan
kromatografi kolom konvensional. HPLC merupakan teknik pemisahan modern
yang didasarkan pada perbedaan distribusi molekul-molekul komponen diantara
fasa gerak (cairan) dan fasa diam (cairan atau padatan) yang kepolarannya
berbeda. Berdasarkan mekanisme retensi solut, HPLC terbagi menjadi beberapa
jenis yaitu adsorbsi, partisi, fasa terikat, eksklusi ukuran, dan penukar ion.
4

Instrumentasi HPLC terdiri dari fasa gerak, pompa, injektor, kolom, dan
detektor. Seperti pada kromatografi gas, HPLC juga dapat diterapkan dalam
analisis kualitatif dan kuantitatif suatu sampel dengan teknik yang serupa.
Pengukuran pada HPLC dapat dilakukan dengan mode isokratik dan mode
gradien.
E. Latihan/Tugas
Kerjakan latihan berikut untuk memperdalam pemahaman Anda
mengenai materi kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).
1. Suatu campuran yang terdiri dari 9 senyawa aromatik (fenol, p-nitrofenol,
p-kresol, 2,5-xylenol, metilbenzoat, anisol, benzena, fenolat, dan toluena)
dipisahkan dengan HPLC. Hasil simulasi pemisahan menggunakan
program komputer dari seraphin menunjukkan kromatogram seperti di
bawah ini. (A) dilakukan dengan mode isokratik menggunakan fasa gerak
40% metanol dalam air dan (B) mode gradien dengan komposisi awal fasa
gerak 40% metanol dalam air dan komposisi akhir fasa gerak 90% metanol
dalam air. Interpretasikan masing-masing kromatogram tersebut!

2.

Mengapa teknik pemasukan cuplikan kran cuplikan paling banyak

digunakan dibandingkan teknik pemasukan cuplikan lainnya?

Petunjuk Jawaban Latihan!

1. Berdasarkan gambar A (mode isokratik) terlihat bahwa setelah 95 menit
pengukuran berlangsung hanya muncul 6 peak dari 9 senyawa yang ada
dalam campuran. Sedangkan pada gambar B (mode gradien) terlihat
pemisahan campuran berlangsung selama 20 menit dan peak yang muncul
juga ada 9. Artinya dengan mode gradien ini pemisahan senyawa terjadi
secara sempurna dalam waktu yang tidak terlalu lama.
2. Teknik pemasukan cuplikan kran cuplikan paling banyak digunakan
karena mudah dioperasikan, mempunyai loop dengan ukuran volume yang
dapat diganti sesuai keperluan, dan paling penting lagi tahan terhadap
tekanan tinggi.
5

F. Tes Mandiri
1. Jelaskan persamaan antara metode HPLC dan kromatografi gas! Tuliskan
juga keuntungan metode HPLC dan metode kromatografi gas!
GLOSARIUM
Kromatografi cair kinerja tinggi
mode isokratik
mode gradien
DAFTA PUSTAKA
Braithwaite A & Smith FJ. 1999. Chromatographic Methods 6ed. Netherlands
: Kluwer Academic Publishers.
Harvey D. 2000. Modern Anayitical Chemistry. USA: McGraw-Hill
Companies, Inc.
Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundanentals of
Analytical Chemistry. Eighth Edition. USA: Thomson Learning, Inc.
Skoog, Holler & Nieman. 1998. Principles of Instrumental Analysis 5ed.
Philadelphia: Saunders College Pub.
Sumar Hendayana, et.al. 1994. Kimia Analitik Instrumen, Semarang: Penerbit
: IKIP Semarang.