9 Isolasi Dan Purifikasi Protein

BIOTEKNOLOGI FARMASI
FA 403
SOGANDI, S.Pd.,M.Si
SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45
Enzim ?
Biokatalis yang dapat mempercepat reaksi

Terdapat ribuan enzim dengan tipe/jenis
berbeda, dan mengkatalisis reaksi yang berbeda
Terdapat pada semua organisme dan dapat

ditingkatkan bila digunakan dalam proses industri
Komponen penyusun Enzim

Enzim adalah protein, tersusun dari asam asam amino
(100-1000)
Asam asam amino saling terikat satu dengan lainnya
membentuk rantai panjang, dapat melipat, menghasilkan
struktur 3D yang unik
Sumber Enzim / Protein

Enzim dari mikroba
diaplikasikan mulai dari makanan hingga untuk
penelitian biologi molekuler
umumnya aktif pada pH 3.0 - 9.0, sedangkan
enzim dari hewan pH 5.0
enzim pertama yang telah diperdagangkan adalah

DNA polymerases and enzim enzim restriksi
Enzim yang berbeda mempunyai bentuk dan

fungsi yang berbeda, karena berbeda jenis
asam amino yang menyusunnya
Enzim dari Jaringan dan Hewan
Sumber Enzim / Protein

Enzim dari Mikroorganisme Rekombinan
aktivitas enzim rendah (wild type)
bakteri, jamur dan ragi (misalnya, Bacillus, Streptomyces,

Aspergillus, Saccharomyces sp
dihasilkan menggunakan teknologi rekombinan
Pemurnian,,,
memahami apa yang terjadi di dalam sel dan antara sel.
Enzim /protein murni diperlukan untuk mempelajari reaksi,
kinetika, regulasi, dll
memahami penyimpangan dalam proses metabolisme atau
regulasi normal, dll (mis enzim yang abnormal/protein
seperti globins -> thalassemia dan penyakit sel sabit).
membuat desain obat, berdasarkan struktur 3D-protein.
banyak protein/enzim memiliki nilai tambah, sebagai
biocatalysts (protease, lipase, glukosa isomerase), terapi
(insulin, interleukin), dll
Ekstrak dari sel atau jaringan (mungkin berisi lebih dari

1000 protein yang berbeda dan banyak biomolekul
lainnya
untuk produksi perlu dipilih jaringan yang memiliki

jumlah besar
gunakan jaringan segar atau segera ditempatkan
dalam larutan es (keadaan selalu dingin, 40C)
untuk sel-sel bakteri disentrifugasi pada 16.000 g dan
dipisahkan dari media pertumbuhan dan Pelet (sel
bakteri) disuspensi dalam buffer
General Flow Chart of Purification

Animal tissue
Plant materials
Grinding
Extraction
Microorganisms
Fermentation
Extracellular
enzymes
Intracellular
enzymes
Disruption
Filtration
Concentration
Purification
Pure Enzyme
SOGANDI, S. Pd., M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45
Extracellular
enzyme
Isolasi Enzim
Break open cells by
grinding or ultra-sonics
Filter
Intracellular
enzyme
Cell biomass (useful

waste product)
Enzyme in
solution
Concentrate by evaporation at
low temperature and pressure or
by osmosis
Crude enzyme in solution eg

protease in chemical industry
Precipitate
Powdered crude enzyme eg

pectinase
Chromatography
Pure enzyme for medicine eg

glucose oxidase
Pemecahan Sel
Cara lemah:
Lisis sel, tek osmosis
Enzim, lisosim, lipase
Otolisis, scr kimia dgn toluen
Homogenisasi, porter elvehjem
Cara keras:
French press (sel ditekan,
20000 psi)
Ultrasonikasi
Cara sedang:
Homogenisasi, waring blender
Penggerusan campur serbuk
gosok pasir
Pengendapan
Pemisahan berdasarkan ukuran molekul
Pemisahan berdasarkan muatan
Pemisahan berdasarkan interaksi spesifik
dengan biomolekul lainnya
Pemisahan berdasarkan prinsip lainnya
Pengendapan ammonium sulfat

Filtrasi gel
Kromatografi penukar ion
Kromatografi afinitas
Kromatografi interaksi hidrofobik, kromatografi
hidroksiapatit
Ultrafiltrasi: Suspensi protein dilewatkan saringan

ultra halus. Air dan garam dapat lewat, protein
tertinggal
Garam berkompetisi
dengan air
Protein mengalami agregasi
melalui interaksi van der
Waals dan hidrofobik dan
mengendap dalam bentuk
native
%kejenuhan (NH4)2SO4
Dialisis: Suspensi protein yang mengandung garam dimasukkan

kantong dialisis yang memiliki pori ultra halus.
Air (yang melarutkan garam) bebas melalui pori, sedangkan protein
tertinggal
Muatan: Kromatografi Penukar Ion

Kepolaran: Kromatografi Interaksi Hidrofobik
Ukuran: Dialisis, Ultrafiltrasi, Gel elektroforesis,
Kromatografi Filtrasi Gel, Ultrasentrifugasi
Spesifisitas: Kromatografi afinitas
CH2-COOCH2-COO
+
+
Positively
charged (basic)
protein or enzyme
CM cellulose
cation exchanger
CH2-CH2 -NH+(CH2CH2) CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)

DEAE cellulose
anion exchanger
Negatively
charged (acidic)
protein or enzyme
CH2-COO
CH2-COO-
CM cellulose
cation exchanger
+
+
Positively charged protein

or enzyme bind to the
column
Negatively
charged proteins
pass through the
column
CH2-COO- +
CH2-COO-
+
+
+ Increasing
[NaCl] of the
elution buffer
CM cellulose
cation exchanger
CH2-COO- Na+ Na+2

CH2-COO- Na+
CM cellulose
cation exchanger
Na+2
ClCl- +
+
Cl+
Cl +
Elusi dengan gradien NaCl dan

Kromatogram kolom penukar kation
Jenis matriks penukar ion
size
Molecular mass
(daltons)
10,000
30,000
100,000
flow
flow
flow
flow
flow
Tahap pemisahan dan Kromatogram

kolom kromatografi filtrasi gel
Jenis matriks filtrasi gel
1. Ditentukan aktivitas enzim

2. Dibuat tabel pemurnian
3. Dilakukan metode metode fisik:
SDS-PAGE, filtrasi gel
Aktivitas enzim: dinyatakan dalam Unit (U)
definisi: jumlah produk yang dihasilkan
per ml enzim per menit pada kondisi optimum
2. Tabel Pemurnian
Setiap tahap pemurnian diukur:
volume enzim (ml)
Total enzyme (U):
kadar protein (mg/ml)
Aktivitas (U.ml-1) x vol(ml)
aktivitas enzim (U/ml)
Aktivitas Spesifik (U.mg-1):
Aktivitas (U.ml-1) / protein (mg.ml-1)
Yield (%):
Enzim total setelah tahap pemurnian
Per enzim total sebelum pemurnian
Kemurnian :
Aktivitas spesifik enzim setelah pemurnian
per aktivitas spesifik sebelum pemurnian
Tahap
Vol
(ml)
Total akt
(U)
Total prot
(mg)
Akt spe
(U/mg)
Yield
(%)
Kemurnian
CE
500
3000
15000
0,2
100
AS
100
2400
4000
0,6
80
3,0
IEC
45
1440
500
2,9
48
14,5
GF
50
1000
125
8,0
33
40,0
CE: Crude cell extract

AS: ammonium sulfate fractionation
IEC: ion exchange chromatography
GF : gel filtration
Terima Kasih

9 Isolasi Dan Purifikasi Protein

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

9 Isolasi Dan Purifikasi Protein

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

9 Isolasi Dan Purifikasi Protein

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

BIOTEKNOLOGI FARMASI

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Biokatalis yang dapat mempercepat reaksi

Terdapat pada semua organisme dan dapat

Komponen penyusun Enzim

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Sumber Enzim / Protein

enzim pertama yang telah diperdagangkan adalah

Enzim yang berbeda mempunyai bentuk dan

Enzim dari Jaringan dan Hewan

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Sumber Enzim / Protein

bakteri, jamur dan ragi (misalnya, Bacillus, Streptomyces,

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Ekstrak dari sel atau jaringan (mungkin berisi lebih dari

untuk produksi perlu dipilih jaringan yang memiliki

General Flow Chart of Purification

SOGANDI, S. Pd., M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Cell biomass (useful

Crude enzyme in solution eg

Powdered crude enzyme eg

Pure enzyme for medicine eg

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Pengendapan ammonium sulfat

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Ultrafiltrasi: Suspensi protein dilewatkan saringan

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Dialisis: Suspensi protein yang mengandung garam dimasukkan

Muatan: Kromatografi Penukar Ion

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

CH2-CH2 -NH+(CH2CH2) CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)

SOGANDI, S. Pd., M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Positively charged protein

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

CH2-COO- Na+ Na+2

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Elusi dengan gradien NaCl dan

Jenis matriks penukar ion

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd., M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd., M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd., M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Tahap pemisahan dan Kromatogram

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Jenis matriks filtrasi gel

1. Ditentukan aktivitas enzim

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

CE: Crude cell extract

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

SOGANDI, S. Pd.,M. Si| BIOTEKNOLOGI FARMASI| UTA45

Anda mungkin juga menyukai