Nilai

Laporan Akhir

LEMBAR KERJA PRAKTIKUM

ANALISIS KADAR KAFEIN DALAM SEDIAAN TABLET

MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(HPLC)

KELOMPOK B2-2

NAMA NIM
NANDA RAHMA S I1C020002
DAFFA FERDIANSYAH I1C020038
FADILLAH FATMAWATI I1C020052
ALFAIKAR WILDAN A I1C020064
SALSABILA PUTRI AULIA I1C020084

DOSEN PEMBIMBING PRAKTIKUM: Dr.nat.techn. apt. Hendri Wasito, M.Sc.

LABORATORIUM KIMIA FARMASI

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
2022
SKEMA KERJA

1. Pembuatan Larutan Fase Gerak Metanol

2. Pembuatan Larutan Fase Gerak Buffer Asam Asetat

3. Pembuatan Larutan Stok

4. Pembuatan Larutan Analit Atau Sampel

5. Injeksi Larutan Analit

6. Pembuatan Kurva Baku

7. Penetapan Kadar
FORM DATA PENGAMATAN
1. Preparasi Larutan Standar Kafein
Bobot (mg) Volume (L) Konsentrasi Larutan
Stok (ppm)

Kafein 100 0,1 1000

Cara perhitungan :
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 (𝑚𝑔)
Konsentrasi larutan stok (ppm) = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 (𝐿)
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 (𝑚𝑔) = 1000 𝑝𝑝𝑚 × 0, 1 𝐿 = 100 𝑚𝑔
Konsentrasi 1000 ppm dalam 100 mL → 100 mg kafein murni dilarutkan
sampai 100 mL dengan metanol 50 %

2. Pengenceran Larutan Standar Kafein

Konsentrasi yang diinginkan Volume akhir (mL) Volume awal (mL)
(ppm)

100 1 0,1

200 2 0,2

300 3 0,3

400 4 0,4

500 5 0,5
Perhitungan pengenceran
M1 . V1 = M2 . V2
● 100 ppm
𝑀1. 𝑉1 = 𝑀2. 𝑉2
100. 1 = 1000. 𝑥
𝑥 = 0, 1 𝑚𝐿
● 200 ppm
𝑀1. 𝑉1 = 𝑀2. 𝑉2
 200. 1 = 1000. 𝑥
𝑥 = 0, 2 𝑚𝐿
● 300 ppm
𝑀1. 𝑉1 = 𝑀2. 𝑉2
300. 1 = 1000. 𝑥
𝑥 = 0, 3 𝑚𝐿
● 400 ppm
𝑀1. 𝑉1 = 𝑀2. 𝑉2
400. 1 = 1000. 𝑥
𝑥 = 0, 4 𝑚𝐿
● 500 ppm
𝑀1. 𝑉1 = 𝑀2. 𝑉2
500. 1 = 1000. 𝑥
𝑥 = 0, 5 𝑚𝐿

3. Pembuatan Kurva Baku

Konsentrasi larutan Luas Area Waktu Retensi Titik Puncak
standar (ppm)

100 5288.5361 2.348 1095.8387

200 9786.4004 2.358 2073.3640

300 14582.3564 2.352 2796.4954

400 16031.6338 2.354 2913.7185

500 17983.4316 2.353 3006.1216

Persamaan regresi linier
y = a + bx (y = Luas Area ; x = Konsentrasi)
y = 3243,964 + 31,635x; r = 0,971
4. Preparasi Sampel
Bobot sampel (mg) Bobot wadah (mg) Bobot wadah + Bobot sampel (mg)

837,3 mg bodrex (50 mg kafein) 0 837,3 mg bodrex (50 mg kafein)

5. Pembuatan Larutan Sampel

Konsentrasi yang diinginkan Volume akhir (mL) Volume awal (mL)
(ppm)

250 10 2,5
Perhitungan pengenceran
M1 . V1 = M2 . V2
250. 10 = 1000. 𝑥
𝑥 = 2, 5 𝑚𝐿

6. Kadar Kafein
Konsentrasi Luas area
(ppm)
Rep.1 Rep.2 Rep.3

250 11934,9863 - -
Persamaan regresi linier
y = 3243,964 + 31,635x; r = 0,971
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎−3243,964
Konsentrasi sampel (Cs) = 31,635
 11934,9863−3243,964
Konsentrasi sampel (Cs) = 31,635
= 274, 728 𝑝𝑝𝑚
Jumlah kadar (C) = Konsentrasi sampel (Cs) × Faktor pengenceran (Fp) × Volume
sampel (V dalam liter)
10 𝑚𝐿
= 274,728 ppm × 2,5 𝑚𝐿
× 0,01 L
= 10,989 mg
𝐶𝑠 × 𝐹𝑝 × 𝑉
% Kadar = 𝑘𝑙𝑎𝑖𝑚 𝑙𝑎𝑏𝑒𝑙
× 100%
10,989 𝑚𝑔
= 50 𝑚𝑔
× 100%
= 21,978%

7. Spektrum
PEMBAHASAN

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu teknik

pemisahan yang secara umum sudah digunakan dengan tujuan untuk menganalisis dan
memurnikan suatu senyawa yang berada pada suatu sampel organik, anorganik, atau senyawa
biologis. Instrumen ini paling sering digunakan pada penetapan analisis kadar senyawa asam
amino, asam nukleat, senyawa aktif pada obat, produk sisa sintesis, dan produk degradasi
pada sediaan farmasi. Pada dasarnya memiliki prinsip kerja yang mana zat terlarut akan
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi atau polaritas yang setiap solut akan melewati kolom
kromatografi dan akan dideteksi pada detektor yang sesuai untuk dilihat kromatogramnya
(Gandjar dan Rohman, 2012).
Langkah pertama pada prosedur kali ini, yaitu mempersiapkan dan membuat fase
gerak yang dibutuhkan. Terdapat dua fase gerak, yaitu methanol (botol A) dan buffer asam
asetat 1% (botol B). Fase gerak yang perlu disiapkan, yaitu buffer asam asetat 1% dengan
mengambil asam asetat 1% sebanyak 2,5 mL menggunakan pipet dan dimasukkan ke labu
ukur 250 mL. Pengambilan asam asetat dilakukan pada lemari asam dengan tujuan agar
menghindari kontaminasi dan karena asam asetat bersifat mudah menguap serta memiliki
aroma yang kurang sedap. Setelah itu, ditambahkan aquades hingga tanda batas atau setara
dengan 250 mL. Lalu dilakukan filtrasi dengan vacuum filter yang dilengkapi dengan
pemfilter nylon paper 0,45 μm dan dipindahkan ke labu Erlenmeyer. Kemudian disonikasi
selama 10 menit. Sonikasi ini bertujuan agar campuran fase gerak tercampur secara homogen
dan sempurna (Sukma dan Fajri, 2019). Setelah itu, mulut labu Erlenmeyer ditutup
menggunakan aluminium foil agar tidak terjadi penguapan yang berlebihan dan kontaminasi.
Langkah kedua yaitu preparasi tablet kafein yang akan digunakan untuk larutan stok.
Penimbangan tablet yang mengandung kafein dilakukan dan dicatat hasil penimbangannya
yang didapat sebesar 1.674,6 mg untuk 2 tablet dan 844,5 mg untuk 1 tablet. Setelah itu
dihaluskan tablet menggunakan mortar dan stamper hingga didapatkan serbuk, lalu ditimbang
kembali sehingga didapatkan bobot serbuk sebesar 837,3 mg. Setelah itu sebanyak 837,3 mg
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL yang dilarutkan dengan pelarut metanol 50% hingga
tanda batas kemudian disonikasi selama 5 menit agar homogen serta divortex.
Pada sampel masing-masing kelompok, diambil 2,5 mL dan diencerkan dengan
methanol 50% untuk ditempatkan pada labu ukur 10 mL. Setelah itu, dihomogenkan dengan
digojog dan divortex. Setelah itu, dilakukan preparasi pada instrumen HPLC dengan
menyiapkan detector, sistem komputer, dan kedua fase gerak (metanol pada botol a dan
buffer asam asetat 1%). Sampel yang sudah diencerkan, dimasukkan ke dalam vial melalui
syringe yang dihubungkan dengan nylon membrane 0,45 μm.
Langkah selanjutnya, yaitu menginjeksikan larutan analit sebesar 20 μl dengan flow
rate 1 mL/menit; temperatur kolom sesuai pada kondisi ruang; dan menggunakan fase diam
C-8 serta fase gerak isokratik pada perbandingan metanol : buffer asam asetat 1% (50 : 50).
Fase gerak tersebut diletakkan pada wadah yang bersih dan inert agar tidak menimbulkan
reaksi lain yang terjadi dengan sampel. Fase gerak harus di-degassing (teknik penghilangan
gas) sebelum digunakan agar tidak menimbulkan penumpukan gas dengan komponen lain
terutama di detektor yang akan mempengaruhi hasil analisis. Pelarut yang digunakan pada
fase gerak diharuskan menggunakan pelarut dengan grade yang tinggi (grade HPLC) karena
pelarut dengan grade rendah atau kemurnian rendah akan menyebabkan masalah pada
kromatogram karena adanya pengotor dengan terkumpul pada kolom atau tabung yang
sempit sehingga mengakibatkan kekosongan dalam kolom atau tabung tersebut. Hal tersebut
yang mengharuskan penyaringan digunakan pada saat preparasi fase gerak (Gandjar dan
Rohman, 2012). Sampel yang diinjeksikan menggunakan syringe khusus HPLC dilakukan
dengan hati-hati dan tidak boleh terdapat gelembung di dalam syringe, kolom, atau pada loop.
Gelembung yang ada dapat menyebabkan hasil analisis yang didapat tidak presisi dan akurat.
Analisis HPLC ini menggunakan detektor dengan panjang gelombang yang ditentukan
sebesar 275 nm. Setelah itu, dilakukan pembacaan kromatogram yang terdeteksi pada sistem
komputer.
Berdasarkan hasil praktikum, diperoleh waktu retensi kafein dari larutan analit yaitu
2,313 menit. Hasil ini kemudian dibandingkan dengan waktu retensi dari 5 seri larutan
standar kafein yang besarnya berturut-turut yaitu 2,348; 2,358; 2,352; 2,354; 2,353 menit.
Dari hasil yang didapatkan diperoleh variasi selisih waktu retensi berturut-turut yaitu 0,035;
0,045; 0,039; 0,041; 0,04 menit. Berdasarkan literatur, variasi selisih waktu retensi yang
diperbolehkan adalah ≤ 0,05 menit. Jadi, waktu retensi yang didapatkan dari praktikum dapat
diterima dan dalam larutan analit tersebut dapat dipastikan mengandung senyawa kafein
(Rahmawati et al., 2021).
Pada penetapan kadar kafein dilakukan dengan menghitung kadar kafein dalam
sampel tablet parasetamol, perhitungannya didasarkan pada persamaan regresi linier kurva
baku yang diperoleh (Rahmawati et al., 2021). Persamaan regresi linier yang didapatkan
yaitu y = 3243,964 + 31,635x; r = 0,971. Berdasarkan hasil perhitungan penetapan kadar
kafein sampel tablet parasetamol, diperoleh kadar kafein sebesar 21,978% yang mana hasil
ini tidak sesuai dengan literatur dikarenakan kadar rentang yang diterima adalah tidak kurang
dari 98,5% (Kemenkes RI, 2020).
Gambar Hasil Kromatogram HPLC
KESIMPULAN
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu teknik
pemisahan yang digunakan untuk menganalisis dan memurnikan suatu senyawa yang berada
pada suatu sampel organik, anorganik, atau senyawa biologis. Waktu retensi yang didapatkan
pada saat praktikum yaitu ≤ 0,05 menit, sehingga hasil ini dapat diterima dan dalam larutan
analit tersebut dapat dipastikan mengandung senyawa kafein. Pada penetapan kadar kafein,
diperoleh hasil sebesar 21,978%, yang mana hasil ini tidak sesuai dengan literatur
dikarenakan kadar rentang yang diterima adalah tidak kurang dari 98,5% .

DAFTAR PUSTAKA
Gandjar, I. G. dan Rohman, A. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan X. Yogyakarta :
Pustaka Pelajar.
Kemenkes RI. 2020. Farmakope Indonesia Edisi VI. Jakarta: Kemenkes RI.
Rahmawati, A. I. & Wirasti, R. H. 2021. Analisis Kadar Kafein Pada Produk Bubuk Kopi
Murni yang Dihasilkan Di Kabupaten Pekalongan Menggunakan Metode High
Performance Liquid Chromatography (HPLC). Kajen: Jurnal Penelitian dan
Pengembangan Pembangunan, 5(01): 61-78.
Sukma, F. F. dan Fajri, R. 2019. Identifikasi Asam Dehidroasetat dalam Produk Kosmetika
dengan Menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Quimica:
Jurnal Kimia Sains dan Terapan. 1(2):15-17.
LAMPIRAN
1. Penimbangan

2. Persiapan fase gerak buffer asam asetat 1%

- Preparasi ke dalam labu ukur 250 ml

- Filtrasi menggunakan vacuum filtration

- Hasil buffer asam asetat

3. Preparasi Sampel

4. Penginjeksian pada Instrumen HPLC

5. Hasil Kromatogram