Kromatografi Cair Tenaga Tinggi

(KCKT) atau biasa juga disebut

dengan High Performance
Liquid Chromatography (HPLC).
 Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan
analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya
terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,
dan kecepatannya untuk sampai ke detektor
(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah.
 Kromatografi Adsorbsi
 Kromatografi fase terikat (Kromatografi
Partisi)
 Kromatografi penukar ion
 Kromatografi Pasangan ion
 Kromatografi Eksklusi Ukuran
 Kromatografi Afinitas
Prinsip kromatografi adsorpsi telah
diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi
lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun
demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya.
Kebanyakan fase diam kromatografi ini
adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling
populer digunakan adalah oktadesilsilan
(ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.
HPLC penukar ion menggunakan fase
diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada
banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat
ionisasinya
Kromatografi pasangan ion juga dapat
digunakan untuk pemisahan sampel-
sampel ionik dan mengatasi masalah-
masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan
yang berlawanan.
Kromatografi ini disebut juga dengan
kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa
dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam
yang digunakan dapat berupa silika atau
polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel),
atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut
yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-
molekul yang ukuran medium, dan terakhir
adalah molekul yang jauh lebih kecil.
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena
interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-
gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam
interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan
untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.
Instrumentasi HPLC pada
dasarnya terdiri atas:
wadah fase gerak
(Reservoir) , pompa, alat
untuk memasukkan sampel
(tempat injeksi), kolom,
detektor, wadah
penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer
atau integrator atau
perekam
 Kegunaan umum HPLC adalah untuk :
pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis ;
analisis ketidakmurnian (impurities) ;
analisis senyawa-senyawa tidak menguap
(non-volatil) ; penentuan molekul-molekul
netral, ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan
pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-
senyawa yang strukturnya hampir sama;
pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah
sekelumit (trace element), dalam jumlah
banyak dan dalam skala proses industri.
 Kelebihan Kelemahan
 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
 Mampu memisahkan molekul-molekul  Sering ada larutan standar yang
dari suatu campuran dengan daya tertinggal diinjektor.
memisah yang tinggi.  Pada kolom dengan diameter rata-rata
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi partikel fase diam dengan ukuran 5 dan
/ kerusakan bahan analisis. 3 mikrometer sela-sela partikel lebih
 Dapat digunakan bermacan-macam mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
detektor dengan kepekaan yang tinggi. seringkali dicuci dan kemurnian larutan
 Kolom dapat digunakan kembali. harus dijaga.
 Waktu analisa cukup singkat.
 HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat
yang tidak mudah menguap dan zat
yang tidak stabil.
 Dapat menganalisis sampel yang kecil
kuantitasnya.
 Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu
kamar.
 Analisis Diazepam dalam darah
 Analisis Anion Nitrat (NO3-)
 Analisis Vitamin C
 Analisis Ekstrak Etanol Rimpang
Tanaman
 Pengukuran Tingkat Kematangan Buah
Manggis
 Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif
Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman
Obat
TERIMAKASIH