Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance

liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik
kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan
tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya,
HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan
yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya
merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna
untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap
senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu
dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta
integrator
kita
akan
mendapatkan
kromatogram.
Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak
suatu senyawa.

pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al.

spektrofotometrik (absorpsi sinar UV atau tampak,
fluorometri, penggunaan senyawa pendar/fluoresen, senyawa
elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi).

Prinsip Dasar HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis.
Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen
dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama
yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama
adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah
proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat
penting dalam keberhasilan proses analisa.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007,

HPLC adalah alat untuk mengalisa kandungan bahan kimia,
baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. HPLC sendiri
singkatan dari High Performance Liquid Chromatography.
Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi kandungan
antibiotik pada susu
dan daging udang, terutama
kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula untuk kegiatan
perikanan lainnya.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007,

prinsip kerja dari HPLC adalah pemisahan absoprsi dan
desorpsi yang berulang kali dari komponen yang dipisahkan.
Pada saat komponen tersebut dibawa oleh fase gerak mengalir
sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena adanya
perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen
yang didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi
dari komponen tersebut antara kedua fasa.

Kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC) Metode pemisahannya didasarkan
pada perbedaan keseimbangan distribusi komponen sampel
antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang
mengalir). Tekanan tinggi diperoleh dari pompa, meningkatkan
mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah absorpsi, partisi,

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan

tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang
menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui
tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih
cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang

berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam
kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih
besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang
melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih
baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi
kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat
digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat
peka. HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8
mm dengan ukuran partikel penunjang 50m sedangkan laju
aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. Aplikasi analisis
HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan
kuantitatif.
Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan
migrasi dengan menggunakan dua fasa. HPLC biasanya
digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi
dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika
molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan pun
juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya
diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara
kuantitatif.
1. Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada
waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan
apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan
standar.

2. Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat
dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar
yang sama
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi)
dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi
tertentu.
Berdasarkan area kromatogram
Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk
signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peakpeak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam
sample.

Sample
yang
mengandung
banyak
komponen
didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak
peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang
lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah
cukup bersih dari impuritis.

fase
gerak),
kemampuan
elusi
meningkat
dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan
elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

SISTEM PERALATAN HPLC

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi

fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien
(komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog
dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi
bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran
yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritas yang luas.

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah

fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat
injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat
digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter
pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih

dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu,
adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk

pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan
bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling
sering
digunakan
adalah
campuran
pelarut-pelarut
hidrokarbon
dengan
pelarut
yang
terklorisasi
atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa
yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut
yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang

umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,

Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

4. Kolom dan Fase diam

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran

fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase
gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu:
pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak
yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe
pompa
dengan
tekanan
konstan.6)

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan

dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

3. Tempat penyuntikan sampel / Injection port

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung
ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju
kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Posisi pada saat memuat sampel
menyuntik sampel

Posisi pada saat

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional

dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang
mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.
yang

utama

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih

kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada
kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10
-100 l/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer
massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas misal sampel klinis.

dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detector
UV-Vis,
detector
fluoresensi
dan
elektrokimia.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor

ini tidak
setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus
silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagenreagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil
atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut
yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika
yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang
bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan
yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa;

Idealnya, suatu
sebagai berikut:

detektor

harus

mempunyai

karakteristik

Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan

reprodusibel.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi
solut pada kadar yang sangat kecil.
Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan pelebaran pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi
solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC
dengan karakteristik detektor seperti berikut :
Sensitifita
s (g/ml)

Kisaran
linier

Fotometer filter

5 x 10-10

104

Spektrofotometer

5 x 10-10

105

spektrometer
photo-diode
array

> 2 x 1010

105

Detektor

Karakteristik

Absorbansi Uv-vis

Sensitivitas bagus,
paling sering
digunakan, selektif
terhadap gugusgugus dan struktur
struktur yang tidak
jenuh.

Fluoresensi

10-12

104

Sensitifitas sangat
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase
bagus, selektif, Tidaknormal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase
peka terhadap
geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
perubahan suhu dan polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kecepatan alir fase
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
gerak.

menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.

Indeks bias

5 x 10-7

104

Elektrokimia
Konduktimetri

10-8

104

Amperometri

10-12

105

Hampir bersifat
Selain
klasifikasi
di
atas,
HPLC
juga
dapat
universal akan tetapi
dikelompokkan
berdasarkan
pada
sifat
fase
diam
dan
atau
sensitivitasnya
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis
sedang. Sangat
sensitif terhadap
HPLC sebagai berikut:
suhu, dan tidak dapat
digunakan pada elusi
1. Kromatografi Adsorbsi
bergradien

Prinsip
kromatografi
adsorpsi
telah
diketahui
sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi
lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
Peka terhadap
perubahan suhu dan menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
kecepatan alir fase silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
gerak, tidak dapat kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada
digunakan pada elusisilika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
bergradien. Hanya
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mendeteksi solutmempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
solut ionik.
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang
Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapiberekor.
timbul masalah
dengan adanya
kontaminasi
elektroda.

JENIS HPLC

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika
yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini
yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbonhidrokarbon
non-polar
seperti
dengan
oktadesilsilana,

oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer

digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan
pemisahannya
adalah
fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril
dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang
bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies
yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam
menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies
yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami
ionisasi
akan
terelusi
lebih
cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat
menukar kation atau anion
dengan suatu fase
gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun
demikian yang
paling
luas
penggunaannya
adalah
polistiren
resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam
beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol
dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan
fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalahmasalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel

ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang

berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi
permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau
menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau
polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati
porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.
Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang
ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih
kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran
ini tidak terjadi interaksi kimia antara solute dan fase diam
seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksiinteraksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam
mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan
muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk

mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks.

DERIVATISASI PADA HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu
analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia
suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC
adalah untuk:
1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan
menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih
baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif.5
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC
adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang
dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus
kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang
gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu
metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu
berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat
sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu
menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat
membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi
dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan
menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk
hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan

deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak

mengganggu
pemisahan
kromatografi.
Berbagai macam
antara lain :

bahan

Gugus
fungsional

penderivat

telah

Reagen untuk dapat

dideteksi dengan UV-Vis

Asam-asam
kaboksilat;
asam-asam
lemak;asamasam fosfat

p-nitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea (PNBDI);
3,5-dinitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea (DNBDI);
p-bromofenasil bromida
(PBPB)

Alkohol

3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); 4dimetilaminiazobenzen-4sulfinil (Dabsyl-Cl); 1naftilisosianat (NIC-1).

Aldehid; keton

p-nitrobenziloksiamin
hidroklorida (PNBA); 3,5dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);

Amin primer

tersedia

Reagen untuk da
dideteksi deng
Fluoresen
4-bromometil-7asetoksikumarin;
4-bromometil-7metoksikumarin;

Dansil hidrazin

Fluoresamin

o-ftalaldehid (OPA
Amin primer
(1o) dan
sekunder (2o)

3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); N-suksinimidil-pnitrofenilasetat (SNPA); Nsuksinimidil-3,5dinitrofenilasetat (SDNPA);

7-kloro-4-nitroben
2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro
nitrobenzo-2-oksa
1,3-diazol (NBD-F

Asam-asam
amino (peptida)

4-dimetilaminiazobenzen-4sulfinil (Dabsyl-Cl); 1naftilisosianat (NIC-1).

Dansil klorida

4-dimetilaminiazobenzen-4sulfinil (Dabsil-Cl)

Fluoresamin

nitrobenzo-2-oksa
1,3-diazol (NBD-F

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit

memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah
analit keluar dari kolom (post-column derivatization).
7-kloro-4-nitrobenzoo-ftalaldehid (OPA)

2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro-4-