PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 1

INTRODUÇÃO

O termo cromatografia é atribuído ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett que, no início
do século empregou a técnica para a separação de pigmentos presentes em folhas de plantas, através da
passagem de extratos de folhas, arrastados por éter de petróleo, através de leitos de carbonato de cálcio
finamente dividido. As espécies separadas (clorofilas e xantofilas) apareciam nos leitos como bandas
coloridas, e por isso Tswett chamou o método de cromatografia, do grego chroma (cor) e graphein
(escrever).
A definição de cromatografia dada pela IUPAC em 1993 é a seguinte : “cromatografia é o método
físico de separação no qual os componentes a serem separados se distribuem entre duas fases, uma das
quais estacionária, enquanto a outra se movimenta numa direção definida”. A mistura que contém os
componentes a serem separados é dissolvida na fase móvel. Durante a passagem da fase móvel através da
fase estacionária, alguns componentes são fortemente retidos pela fase estacionária e por isso se movem
lentamente com o fluxo da fase móvel; enquanto isso, outros componentes interagem fracamente com a
fase estacionária, sendo transportados mais facilmente pela fase móvel. Devido a essas diferenças em
mobilidade, os componentes da mistura podem ser separados e analisados de forma qualitativa e/ou
quantitativa, pela própria técnica de cromatografia ou em conjunto com outras técnicas experimentais, tais
como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas.
Existem várias formas de realizar uma separação por meio de um processo cromatográfico. Diversas
combinações são possíveis : a fase estacionária pode ser um sólido, um líquido imiscível à fase móvel ou
um gel, fixado numa superfície plana ou dentro de uma coluna; a fase móvel pode ser um líquido, um gás,
ou um fluído supercrítico (um vapor pressurizado, em temperatura acima de sua temperatura crítica, que
possui a vantagem de ter menor viscosidade que o líquido, mas mantendo as propriedades de interação
com os solutos). Detalhes sobre algumas dessas formas são disponíveis nas referências apresentadas ao
final do texto, ficando este texto restrito apenas á apresentação de aspectos mais gerais da técnica.
Dentre os métodos modernos de análise química, a cromatografia é um dos mais empregados,
encontrando aplicações nos mais variados ramos da pesquisa científica e tecnológica, devido à capacidade
que possui de separar espécies químicas, de forma seletiva e específica.

CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Os métodos cromatográficos podem ser classificados de duas formas. A primeira, mais simples, é
baseada na forma pela qual as duas fases são colocadas em contato. Segundo esse critério, os métodos
poderiam ser classificados em duas categorias :
Ø cromatografia em coluna, na qual a fase estacionária é mantida dentro de um tubo, em geral bastante
estreito, dentro do qual a fase móvel é forçada por efeito de pressão ou pela efeito da gravidade;
Ø cromatografia planar, na qual a fase estacionária é suportada numa superfície plana ou nos
interstícios de um papel. A fase móvel se move através da fase estacionária por efeito da capilaridade
ou da gravidade.
Outro critério de classificação, mais fundamental, é baseado nos tipos de fases estacionárias e
móveis, e nos mecanismos envolvidos nas transferências de solutos entre as fases.
A fase estacionária pode ser sólida ou líquida. No caso de fase estacionária líquida, o líquido pode
simplesmente estar espalhado sobre um suporte sólido ou então estar imobilizado sobre este. Neste último
caso, a fase líquida pode ser chamada de “fase ligada”. A fase móvel pode ser líquida, gasosa ou um
fluído supercrítico.
Os mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatográficos são mencionados na
Figura 1, a seguir.

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Adsorção : processo baseado em interações eletrostáticas, dipolares

(Van de Waals, por exemplo) ou pontes de hidrogênio, que ocorrem
entre grupos ativos presentes na superfície da fase estacionária sólida
e a fase móvel. Em processos cromatográficos, a adsorção é sempre
reversível (a dessorção do soluto implica na volta deste à fase
móvel).

Partição : quando a fase estacionária é um líquido, espalhado na

superfície de um suporte sólido e inerte ou nas paredes de um
tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção, ou partição,
que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da
amostra na fase estacionária.

Troca Iônica : a fase estacionária é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais
ionizáveis (catiônicos ou aniônicos). A fase móvel é, geralmente, uma solução iônica com propriedades
tamponantes, escolhidas de forma a ser compatível com o tipo de trocador usado.

Bioafinidade : utiliza grupos funcionais, ligados quimicamente à

matriz estacionária, que possuam especificidade biológica. Esses
grupos retiram da fase móvel somente as suas espécies
complementares, deixando passar todas as outras espécies.

Exclusão : baseia-se em um processo puramente mecânico. A fase

estacionária é uma matriz de composição inerte, com textura
(superfície e distribuição de tamanhos de poros) controlada. Os
componentes presentes na fase móvel podem ser separados porque os
menores são capazes de penetrar facilmente em todos os poros da
fase estacionária, equilibrando-se com a fase móvel que também
entra nos poros, enquanto as maiores são excluídas, acompanhando a
fase móvel que fica fora dos poros. As moléculas com tamanho
intermediário entre esses dois extremos migram com velocidades
variáveis, sendo que possuem penetração seletiva nos poros, entrando
em alguns, mas não em todos.

Figura 1 – Representação esquemática dos mecanismos que podem estar envolvidos em processos
cromatográficos

Processos cromatográficos que utilizam fases estacionárias líquidas quimicamente ligadas a um

suporte sólido também podem apresentar um mecanismo de separação que é um compromisso entre
adsorção (sobre sítios ativos do suporte sólido) e partição (que ocorre na fase líquida quimicamente
ligada). A contribuição relativa de cada mecanismo depende da quantidade relativa de cada tipo de grupo
funcional existente.
Uma classificação dos métodos cromatográficos, retirada de Collins et al. (1990), é apresentada na
Tabela I

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Tabela I - Classificação dos métodos cromatográficos, retirada de Collins et al. (1990)

TÉCNICA PLANAR EM COLUNA

Fase Móvel Líquida Gasosa Fluido Supercrítico Líquida

Fase Estacionária líquida sólido ligada líquida sólido ligada sólido ligada líquida sólido ligada

Tipo de Cromatografia CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB

Sigla em Nome da Técnica Sigla em Nome da Técnica

Português Português

CP cromatografia em papel CSFL cromatografia supercrítica com fase ligada

CCD cromatografia em camada delgada CLL cromatografia líquido-líquido

CCD cromatografia em camada delgada CLS cromatografia líquido-sólido

CGL cromatografia gás-líquido CE cromatografia por exclusão

CGS cromatografia gás-sólido CLFL cromatografia líquida com fase ligada

CGFL cromatografia gás-fase ligada CTI cromatografia por troca iônica

CSS cromatografia supercrítica com fase estacionária sólida CB cromatografia por bioafinidade
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PRINCÍPIOS BÁSICOS DA CROMATOGRAFIA

Não será possível tratarmos de todos os métodos cromatográficos ao longo deste texto. Assim sendo,
trataremos apenas de métodos de cromatografia em colunas. Normalmente, esse método procede com um
fluxo contínuo da fase móvel, que permanece até que todos os componentes da mistura em análise tenham
saído da coluna e tenham sido detectados. A Figura 2 mostra esquematicamente como duas substâncias A
e B podem ser separadas numa coluna por eluição. A eluição envolve o transporte das espécies através da
coluna pela adição contínua de fase móvel fresca (também chamada de gás ou líquido de arraste). No
instante inicial da análise ( t = t0 ), uma pequena quantidade da amostra, que pode inclusive estar diluída
na fase móvel, é introduzida na coluna, em geral através de uma seringa manual ou de uma sistema de
injeção automático, no menor intervalo de tempo possível. Conforme são transportados pela fase móvel,
que entra de forma contínua na coluna, os componentes A e B da mistura vão se distribuindo ao longo das
duas fases, e começa a se acentuar a separação entre os componentes ao longo das fases estacionária e
móvel. Com o correr do tempo – que implica na adição de maiores quantidades de fase móvel fresca – o
componente que interage mais fracamente com a fase estacionária vai sendo preferencialmente arrastado
pela fase móvel. Isso ocorre porque a velocidade de arraste de um componente ao longo da coluna
depende da fração de tempo que esse componente passa em cada fase : um componente que interage
fracamente com a fase fixa, passa pouco tempo ligado à ela, permanecendo a maior parte do tempo na
fase móvel. Idealmente, as diferenças entre velocidades de arraste leva à separação dos componentes da
mistura em análise em bandas ou zonas da coluna. Com a continuação da passagem de fase móvel, as
diferentes bandas vão se movendo ao longo da coluna, até atingir o seu final, onde são coletadas e/ou
detectadas.
Se um detetor que responde à presença dos compostos da mistura é colocado no final da coluna e o
seu sinal ao longo do tempo é registrado em função do tempo (ou em função de uma outra variável
significativa, como por exemplo o volume de fase móvel adicionado), uma curva apresentando uma série
de pico, chamada cromatograma, é obtida. Uma curva desse tipo é mostrada na parte inferior da Figura 2.
A curva pode ser utilizada tanto para obtenção de dados qualitativos e quantitativos : a posição dos picos
ao longo do eixo do tempo pode servir para identificação qualitativa dos compostos da amostra, enquanto
que as áreas sob os picos fornecem informações a respeito das quantidades relativas de cada um dos
componentes da mistura. A Figura 3 mostra os dados que podem ser obtidos a partir de um cromatograma
e seus respectivos símbolos.

Figura 2 – (a) Representação

esquemática mostrando a separação de
uma mistura de componentes A e B
através de uma coluna cromatográfica,
por eluição. (b) Curva do sinal de
saída do detetor (cromatograma).

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FATORES ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS

TERMOS DE RETENÇÃO

Coeficiente de Distribuição ( K )

A eficiência da separação que pode ser conseguida numa coluna cromatográfica depende das
velocidades com a quais as diversas espécies atravessam a coluna (em outras palavras, a velocidade com
que cada espécie é eluída). Essas velocidades são determinadas pelas magnitudes das constantes de
equilíbrio das reações que regem as distribuições das diversas espécies entre a fase móvel e a fase
estacionária.
Frequentemente, o tipo de equilíbrio envolvido em cromatografia pode ser descrito por equações
simples, descrevendo o fenômeno de transferência de um soluto entre a fase móvel e a fase estacionária.
Poderíamos escrever, para um composto A, a seguinte reação:
ß
A fase móvel à
A fase estacionária
A constante de equilíbrio K para essa reação é chamada de coeficiente de distribuição ou coeficiente
de partição, e pode ser definido como

K = ( C E / CM ) (1) onde CE e CM representam as concentrações molares do composto A nas

fase estacionária e móvel, respectivamente.

Idealmente, o coeficiente de distribuição K é constante ao longo de uma larga gama de

concentrações, e processos cromatográficos baseados nessa hipótese são chamados de processos
cromatográficos lineares. Toda a discussão que será feita ao longo deste texto será limitada a esses
processos.

Tempo de Retenção ( tR ) e tempo de retenção corrigido ( t’R )

O tempo de retenção é o tempo gasto por um componente desde a sua injeção na coluna até a sua
detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o tempo que um componente fica no
sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um
cromatograma típico, com a presença de um três componentes. O tempo indicado em primeiro lugar no
cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o
detetor: esse tempo é chamado de tempo morto (“dead time”, tM ), e normalmente é determinado por
algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária.
Quando tal composto não existe na mistura, é conveniente adicioná-lo, uma vez que é muito importante
saber-se quanto tempo leva a fase móvel sem nenhum composto diluído para atravessar toda a coluna. No
caso de cromatografia gasosa, esse tempo também pode ser determinado por alguma perturbação de
pressão no sistema no momento da injeção, que aparece no cromatograma como uma perturbação na linha
de base, de forma similar ao pico indicado na figura. Para a determinação dos tempos de retenção
corrigidos (t’R) é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente
descontando o seu valor do valor do tempo de retenção.

Relação entre Tempo de Retenção e Coeficiente de Distribuição

As velocidades lineares de um soluto ( v ) e das moléculas da fase móvel ( u ) podem ser dadas,
respectivamente, por :

v = ( L / tR ) (2) u = ( L / tM ) (3)
onde L é o comprimento da coluna cromatográfica.

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Assumindo que um soluto se move ao longo da coluna cromatográfica com a mesma velocidade da
fase móvel quando nela está dissolvido, e que ele se encontra praticamente parado quando está retido na
fase estacionária, poderíamos expressar a sua velocidade linear na coluna por
v = u x (fração do tempo que o soluto permanece na fase móvel).

Essa fração, no entanto, pode ser igualada ao número de moles de soluto na fase móvel dividido pelo
número total de moles do soluto que foi injetado na coluna. Dessa forma :

v = u x [ ( CM VM ) / ( CM VM + CE VE ) ] = u x { [ ( 1 / [ 1 + ( CE VE / CM VM ) ] } (4)
onde VM e VE são os volumes ocupados na coluna, respectivamente, pelas fases móvel e estacionária

Substituindo a equação (1) na equação (4), chegamos a :

v = u x { [ ( 1 / [ 1 + ( K VE / V M ) ] } (5)

Figura 3 – Um cromatograma típico de uma mistura de três componentes, indicando os dados que podem ser
obtidos e seus símbolos.

Substituindo as equações (2) e (3) na equação (5), e chamando o termo ( K VE / VM ) de fator de

capacidade k’, chegamos a :
( L / tR ) = ( L / tM ) x [ 1 / ( 1 + k’ ) ] (6)
que, rearranjada, define a relação entre os tempos de retenção e o coeficiente de distribuição:
k’ = ( K VE / VM ) = (tR – tM) / tM (7)
Para cada soluto, pode-se escrever a equação (7), e os valores obtidos serão específicos para cada par
(soluto - fase móvel).

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FATORES ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS

TERMOS DE SEPARAÇÃO

Os termos que acabaram de ser calculados, chamados termos de retenção, são característicos de cada
soluto. Quando estão envolvidos mais um tipo de componente na amostra a ser analisada, também podem
ser calculados os chamados termos de separação.

Fator de Separação e Retenção Relativa

O fator de separação ( α ) é calculado pela razão entre os coeficientes de distribuição (K) de dois
compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma, e pode ser relacionado também com os
fatores de capacidade (k’) e tempos de retenção :

α = KB / KA = k’B / k’A = = (tRB – tM) / (tRA – tM) (8)

Um outro termo, a retenção relativa ( r L,p ) , envolve a razão de tempos de retenção do componente
e de um padrão, respectivamente. A retenção relativa é usada para identificação de substâncias e pode ser
calculada para quaisquer picos no cromatograma, livre da restrição de serem adjacentes.

Resolução

Uma outra medida quantitativa de separação de dois componentes consecutivos num cromatograma
é a resolução ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e calculada a partir da distância que separa os
máximos dos picos divididos pela média das larguras de suas respectivas bases, conforme apresentado na
Figura 4. A resolução de uma coluna é uma medida quantitativa de sua habilidade em separar dois
solutos, e é definida por :

RS = ( tRB – tRA ) / [ ( WA / 2 ) + ( WB / 2 ) ] = 2 ( tRB – tRA ) / ( WA + WB ) (9)

Figura 4 – Separações em três resoluções diferentes

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EFICIÊNCIA DE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA

Métodos para a estimativa da eficiência de uma coluna

Dois termos, que estão relacionados entre si, são comumente usados para uma estimativa quantitativa
da eficiência de uma coluna cromatográfica : são eles o número de pratos teóricos N e a altura
equivalente a um prato H, que se relacionam pela equação (10) a seguir :

N=L/H (10)
onde L é o comprimento da zona preenchida pela fase estacionária na coluna cromatográfica.

Um prato teórico pode ser considerado uma etapa de equilíbrio no processo de distribuição de um
componente dado entre as duas fases (móvel e estacionária), de forma análoga ao prato teórico de uma
coluna de destilação. Quanto maior o número de pratos, mais etapas de equilíbrio existiriam e, dessa
forma, melhor seria a separação entre compostos no processo cromatográfico.
Duas equações podem ser utilizadas para estimar N, e nenhuma delas terá seu desenvolvimento
detalhado neste texto (maiores informações podem ser obtidas nas referências mencionadas na literatura
comentada). Ambas utilizam informações retiradas do cromatograma experimental, que podem ser vistas
nas Figuras 3 e 4 : a primeira equação (11), utiliza o tempo de retenção tR e a largura na base W; a
segunda equação (12), considerada por alguns autores como mais confiável que a anterior, utiliza não
mais a largura do pico na sua base, mas na sua meia altura, Wh.

N = 16 ( tR / W ) 2 (11) N = 5,545 ( tR / Wh) 2 (12)

A estimativa de H pode ser feita substituindo-se o valor de N calculado na equação (10), uma vez
que o comprimento L normalmente é conhecido. Se no cálculo, no lugar do tempo de retenção tR for
usado o tempo de retenção corrigido t’R, o número de pratos é chamado de número de pratos efetivo.
O número de pratos teóricos e a altura equivalente a um prato são largamente empregados na
literatura e por fabricantes de equipamentos para avaliar o desempenho de colunas. No entanto, para que
esses números tenham algum significado na comparação de duas colunas, é fundamental que eles tenham
sido determinados nas colunas em comparação nas mesmas condições de ensaio e, principalmente, que
tenham sido determinados para o mesmo componente.
No entanto, apesar de serem frequentemente utilizados, deve-se atentar para o fato de que o uso
desses dois termos pode induzir a um erro: de fato, numa coluna cromatográfica, jamais são atingidas
condições de equilíbrio, uma vez que durante a operação uma das fases está em movimentação constante.

Efeito da vazão da fase móvel na eficiência de uma coluna

A eficiência na separação que pode ser alcançada numa coluna depende, dentre outros fatores, do
tempo médio de contato entre as fases móvel e estacionária. Esse tempo, por sua vez, depende da vazão
da fase móvel e do diâmetro da coluna (que, juntos, determinam a velocidade de escoamento da fase
móvel ao longo da coluna). Ora, a vazão da fase móvel é um parâmetro facilmente ajustável, e por isso
torna-se interessante observar como varia a eficiência de uma coluna com essa vazão. Esse estudo é feito
normalmente através da determinação de H ( com o uso das equações (10) a (12) ) para diversos valores
de vazão ou de velocidade de escoamento. Dados típicos de estudos desse tipo são apresentados nos
gráficos da Figura 5. Ambos apresentam mínimos para H, que correspondem a valores máximos de
eficiência, para baixos valores de vazão ou velocidade de escoamento da fase móvel.
Como podemos ver na figura, os valores de mínimos para cromatografia líquida e gasosa são bem
diferentes, sendo que a velocidade correspondente a um valor de H mínimo para cromatografia em fase
líquida é significativamente menor do que no caso da cromatografia gasosa. No entanto, essa vantagem da
cromatografia líquida acaba não se tornando uma vantagem prática porque raramente é viável o emprego
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PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 9

de colunas muito longas em cromatografia líquida (o mais comum é terem entre 25 cm e 1m), devido à
queda de pressão ao longo da coluna com o escoamento do líquido (a chamada perda de carga). Já no
caso da cromatografia gasosa, é muito comum serem utilizadas colunas de 50m ou mais de comprimento.
Dessa forma, o número total de pratos teóricos – e, consequentemente, a eficiência – é frequentemente
maior em cromatografia gasosa que em cromatografia líquida.

OTIMIZAÇÃO DO DESEMPENHO DE UMA COLUNA

A estratégia a ser empregada para se conseguir realizar com sucesso a identificação de compostos
presentes numa mistura por meio de uma separação cromatográfica pode ser exemplificada pelas
seguintes etapas :

(a) Seleção do método cromatográfico a ser empregado.

Figura 5 – Efeito da velocidade de escoamento da fase móvel na altura de um prato teórico para
cromatografia líquida e gasosa.

(b) Seleção do método cromatográfico a ser empregado.

(c) Seleção ou preparação da coluna adequada ao método e à mistura a ser separada (determinação do
diâmetro da coluna e escolha da fase estacionária).
(d) Seleção das condições operacionais para um teste preliminar (escolha da fase móvel, da sua vazão, da
temperatura, etc...).
(e) Realização de um teste preliminar.
(f) Avaliação do teste preliminar e estudo das mudanças a serem feitas (caso necessárias) para se atingir
a resolução desejada com um tempo de ensaio mínimo.
(g) Estabelecimento das novas condições de ensaio (se necessárias) para a obtenção da resolução
desejada no tempo de ensaio desejado.
(h) Se não forem atingidos os objetivos, avaliar a possibilidade de trocar a técnica escolhida inicialmente,
ou então de empregar condições especiais de análise.

Vamos a seguir desenvolver uma série de equações que serão extremamente úteis como guias para
escolha de condições operacionais que podem permitir que sejam atingidos os principais objetivos de uma
análise por cromatografia : uma separação clara de compostos, com um ensaio que dure o mínimo de
tempo possível.

α) na resolução
Efeito dos fatores de capacidade (k’) e de seletividade (α

Quando dois compostos se movem através de uma coluna de forma muito semelhante, no
cromatograma eles poderão ser representados por picos muito próximos, podendo inclusive se confundir,
como já foi visto na Figura 4. Uma coluna eficiente é aquela capaz de separar esses compostos, ou seja,
aquela capaz de resolver esses picos. Vamos agora apresentar as equações que relacionam a resolução
com as constantes de equilíbrio das reações que regem as distribuições das espécies entre a fase móvel e a
fase estacionária, representadas pelos fatores de capacidade e seletividade.

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Para o desenvolvimento dessas equações, assumimos que estamos lidando com compostos A e B que
apresentam tempos de retenção tão próximos que podemos assumir que WA = WB ≈ W. A equação (9)
torna-se então :
RS = 2 ( tRB – tRA ) / ( 2W ) = ( tRB – tRA ) / W (13)

Da equação (11) podemos tirar uma relação entre W, tR e N. Se aplicarmos essa relação para o
composto B, e a substituirmos na equação (13), chegamos à equação (14), que pode ser rearranjada em
termos dos fatores de capacidade ( usando a equação (7) ), resultando na equação (15) :
RS = [ ( tRB – tRA ) / tRB ] x ( √N / 4 ) (14)
RS = [ ( k’A – k’B ) / ( 1 + k’B )] x ( √N / 4 ) (15)
A equação (15) ainda pode ser rearranjada de modo a que se possa exprimir a resolução em termos
do fator de seletividade α, se usarmos a equação (8) :
RS = ( √N / 4 ) x [ ( α – 1 ) / α ] x [ ( k’B / ( 1 + k’B )] (16)
Também é interessante obter uma equação que relacione o número de pratos teóricos necessário para
se conseguir uma determinada resolução. Isso pode simplesmente ser feito através de um rearranjo da
equação (16), resultando :
N = 16 RS [ α / ( α – 1 ) ]2 x [ ( 1 + k’B ) / k’B ]2 (17)

Efeito da resolução no tempo de retenção

Um dos objetivos de uma análise cromatográfica é conseguir uma separação clara dos compostos da
mistura analisada (ou seja, uma boa resolução) no mínimo de tempo possível (ou seja, com tempos de
retenção os menores possíveis). É interessante, portanto, chegar a uma equação que relacione o tempo de
retenção e a resolução, de forma a podermos avaliar quais os efeitos das variações de condições de
operação em ambos.
O tempo de duração de uma análise é dado pela tempo de retenção do componente que se move mais
lentamente ao longo da coluna. Chamando esse componente de B, podemos escrever a sua velocidade
linear através da equação (2). Combinando essa equação com as equações (5) e (10), podemos chegar à
expressão :
tRB = [ N H ( 1 + k’B ) ] / u (18)
A equação (18) pode ser combinada com a equação (17), resultando na equação a seguir, que
relaciona o tempo de retenção com a resolução :
tRB = ( 16 RS2 H / u ) x [ α / ( α – 1 ) ]2 x [ ( 1 + k’B )3 / ( k’B )2 ] (19)

Otimização do Desempenho – Considerações Gerais

As equações (16) e (19) podem servir de “guias” para a escolha das condições operacionais que
devem ser empregadas para que os objetivos de uma boa análise sejam atingidos : uma separação nítida
com o mínimo de tempo de análise. As duas equações são compostas por três termos:
(a) o primeiro termo é relacionado com efeitos cinéticos que podem levar ao alargamento dos picos no
cromatograma ( √N ou H/u );
(b) o segundo termo está relacionado com a termodinâmica dos constituintes a serem separados, e é um
termo de seletividade que só depende das propriedades dos compostos analisados;
(c) o terceiro termo também está relacionado com a termodinâmica dos constituintes, e é um termo de
seletividade que depende das propriedades tanto dos compostos analisados quanto da coluna.
Na busca pelas condições operacionais otimizadas, deve-se sempre ter em mente que alguns
parâmetros fundamentais ( α, k’ e N ou H ) podem ser ajustados de forma mais ou menos independente.
Essa será a discussão feita a seguir, e o efeito das alterações desses parâmetros na resolução é
exemplificado na Figura 6.
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Otimização do Desempenho – Variação em N ou em H

Uma forma evidente de aumentar a resolução de uma coluna é aumentar o número de pratos teóricos.
Se isso for feito simplesmente pelo aumento do comprimento da coluna, normalmente o tempo de ensaio
aumenta muito. É, portanto, muito mais interessante tentar alterar condições de operação que levem a
uma diminuição da altura equivalente a um prato : H pode ser alterado através de mudanças na vazão da
fase móvel, no tamanho de partículas da fase estacionária (que leva a mudanças nas características de
escoamento da fase móvel), na viscosidade da fase móvel (e, portanto, por alterações na temperatura de
operação, que afetam a viscosidade) e na espessura de filme de líquido recobrindo a superfície da fase
estacionária (caso a fase estacionária seja constituída por esse conjunto fase sólida-líquido adsorvido). O
efeito do aumento de N na melhoria da resolução, quando feito de forma adequada (que mantém ou altera
muito pouco o tempo de retenção), pode ser visto na Figura 6.

Figura 6 – Efeito de mudanças em α, k’ e N

na resolução de dois picos adjacentes

Otimização do Desempenho – Variação no fator de capacidade (k’)

Frequentemente a separação pode ser bastante melhorada através da manipulação do fator de

capacidade. Um aumento no fator de capacidade geralmente melhora a resolução, porém com aumento do
tempo de análise. A Figura 7 apresenta dois gráficos mostrando as variações da resolução e do tempo de
análise com o fator de capacidade, utilizando as equações (16) e (19) modificadas, apresentadas abaixo,
com todos os termos que não contém k’B englobados nos termos Q e Q’, assumidos como se mantendo
aproximadamente constantes. Pela observação da figura fica claro que valores de k’B maiores de 10
devem ser evitados, uma vez que levam a ganhos muito pequenos em resolução com grandes aumentos de
tempo de análise, o mesmo ocorrendo para valores de k’ muito pequenos, uma vez que a resolução nesses
casos cai muito. O mínimo na curva do tempo ocorre para um valor de k’B da ordem de 2. Dessa forma,
valores adequados de k’B, que proporcionam boa resolução com tempos de análise curtos se situam na
faixa de 1-5. De qualquer modo, melhorias na resolução com frequência acarretam um pouco de aumento
no tempo de análise, como pode ser visto na Figura 6.

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PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 12

RS = Q x [ ( k’B / ( 1 + k’B )] (16’)

tRB = Q’x [ ( 1 + k’B )3 / ( k’B )2 ] (19’)

Figura 7 – Efeito do fator de capacidade k’B na resolução e no tempo de retenção. É assumido que Q e
Q’ permanecem aproximadamente constantes com as variações em k’B. As equações são dadas acima.

Normalmente, a maneira mais fácil de melhorar a resolução é através da otimização do valor de k’ .

Para fases móveis gasosas, k’ geralmente é alterado através do aumento da temperatura. Para fases
móveis líquidas, a mudança na composição do solvente frequentemente permite manipular k’ de forma a
conseguir melhores separações. Um exemplo desse procedimento pode ser visto na Figura 8.

Figura 8 – Efeito da variação do solvente em cromatogramas

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PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 13

Otimização do Desempenho – Variação no fator de seletividade ( α )

Quando o valor de α é próximo de um, a otimização dos valores de k’ e um aumento em N não é

suficiente para se garantir uma separação satisfatória num tempo curto. Nessas circunstâncias, deve-se
tentar conseguir aumentar α mantendo o valor de k’ dentro da faixa ótima de 1-10. Pode-se tentar
conseguir isso :
(a) através de mudanças na composição da fase móvel – um exemplo onde essa opção funciona é o da
separação de anisol (C6H5OCH3) e benzeno (C6H6). Quando a fase móvel é uma mistura 50% água-
50% metanol, os valores de k’ são respectivamente 4,5 e 4,7 mas α é igual a 1,02. Se essa fase móvel
for trocada por uma mistura 37% tetra-hidrofurano – 63% água, os valores de k’ se alteram para 3,9 e
4,7 (ainda dentro da faixa recomendada), mas α sobe para 1,20. No primeiro caso há superposição
nos picos do anisol e do benzeno, o que não ocorre no segundo caso.
(b) mudando o pH da fase móvel – muito interessante para separações envolvendo ácidos e/ou bases.
(c) mudando a composição da fase estacionária – opção normalmente menos conveniente que as
anteriores, mas muito eficiente, podendo ser tentada caso o laboratório possua várias colunas
diferentes à disposição para instalação no cromatógrafo.
(d) mudando a temperatura da coluna – isso funciona bem em cromatografia de troca iônica, mas tem
pouco efeito no aumento do valor de a para cromatografia líquido-líquido e líquido-sólido.
(e) partindo para o uso da incorporação de compostos especiais à fase estacionária – um exemplo bem
conhecido é o da separação de olefinas com o uso de uma fase estacionária sólida inorgânica
impregnada com sais de prata, que leva à formação de complexos entre íons prata e compostos
orgânicos insaturados.
A otimização do valor de α, levando a uma melhoria na resolução, acarreta a alteração no tempo de
retenção de um dos dois compostos em análise, conforme pode ser visto na Figura 6.

O Problema Geral da Eluição

A Figura 9 mostra um cromatograma hipotético obtido a partir de uma mistura de seis componentes,
constituída de três “pares” de componentes, que possuem coeficientes de distribuição bastante diferentes
entre si. Na curva (a), as condições operacionais foram ajustadas de modo a que os fatores de capacidade
para os compostos 1 e 2 ( k’1 e k’2 ) tenham valores situados na faixa ótima, entre 2 e 5. Essas condições
operacionais, no entanto, fazem com que os valores de k’ para os outros componentes sejam muito
superiores aos valores ótimos, o que leva a um tempo de retenção (e, consequentemente, um tempo de
análise) extremamente elevado. Além disso, os picos correspondentes aos compostos 5 e 6 aparecem de
tal forma alargados que pode ser difícil a determinação clara dos valores a eles relacionados (tempos de
retenção e larguras na base ou à meia altura, por exemplo).
A curva (b) mostra o que ocorreria ao cromatograma caso as condições operacionais fossem
adaptadas para otimizar a resolução do par 5-6 e o tempo de ensaio : nesse caso, a resolução dos outros
dois pares seria totalmente inadequada. Na curva (c) observa-se o que aconteceria caso as condições
fossem otimizadas para o par 4-5 : embora nesse caso o tempo de análise fosse mais adequado que no
caso (a), a resolução do primeiro par não seria adequada.
Esse fenômeno exemplificado acima é extremamente comum, de forma que em condições práticas é
muito difícil conseguir-se realizar uma separação de uma mistura um pouco mais complexa utilizando as
mesmas condições operacionais ao longo de todo o ensaio. O procedimento mais comum é o alterar as
condições operacionais ao longo da separação, de modo a otimizar a resolução passo a passo ao longo do
ensaio, por exemplo alterando os valores de k’ continuamente. No caso do exemplo esquematizado na
Figura 9, o que poderia ser feito é o seguinte : o ensaio seria iniciado nas condições de melhor resolução
para o par de compostos 1-2; imediatamente depois da eluição do composto 2, as condições operacionais
seriam alteradas para aquelas ótimas para o par 3-4, e, após a saída do composto 4, a separação seria
completada nas condições ótimas para o par 5-6. Tal procedimento operacional, apesar de mais complexo,
levaria a uma boa resolução de todos os compostos da mistura num tempo mínimo.

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A alteração de valores de k’ se faz normalmente através da mudança na composição da fase móvel

em cromatografia líquida, e através da alteração programada de temperatura em cromatografia gasosa.
Um belo exemplo das potencialidades desse último procedimento pode ser visto na Figura 10.

Figura 9 – Ilustração do “problema geral da eluição” em cromatografia

ANÁLISE QUANTITATIVA

A cromatografia vem apresentando crescente utilização como ferramenta analítica devido à sua
simplicidade, ao custo relativamente baixo, à vasta gama de aplicações possíveis e à possibilidade de
fornecer dados quantitativos confiáveis. Este último item discutirá justamente alguns aspectos gerais a
respeito da obtenção de dados quantitativos, que são comuns a todas as variações dessa técnica
experimental.
A análise quantitativa está baseada na comparação das alturas ou das áreas dos picos
correspondentes aos compostos presentes nas misturas sob análise com aqueles obtidos a partir de um ou
mais padrões. Se as condições operacionais forem bem controladas, esses parâmetros (altura e área dos
picos) variam linearmente com a composição.

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Figura 10 – Exemplo do efeito da temperatura em cromatografia gasosa. (a) análise isotérmica a 45oC;
(b) análise isotérmica a 145oC; (c) análise em programação de temperatura, indo de 30oC até 180oC
(temperaturas indicadas no eixo em anexo).

Análise baseada na altura dos picos e na área dos picos

A altura de um pico é determinada entre o ponto máximo do pico e a sua base, que é determinada
traçando-se uma linha que conecta a linha de base do cromatograma dos dois lados do pico, conforme
indicado na Figura 3. Essa medida normalmente pode ser feita com uma boa precisão.
Como já foi visto na Figura 9, tanto a altura quanto a largura dos picos (a altura dos picos é
inversamente proporcional à sua largura) podem ser alteradas ao longo do cromatograma em função das
condições operacionais. Dessa forma, medidas quantitativas precisas só podem ser conseguidas se as
condições operacionais não levarem a alterações na forma dos picos dos compostos e dos padrões. Para
evitar esse problema, pode-se fazer a análise quantitativa baseada não na altura dos picos, mas na área dos
picos, que é independente de efeitos de alargamento como os exemplificados na Figura 9. Dessa forma, as
áreas são medidas mais confiáveis do que as alturas, mas são determinadas com maior dificuldade que as
alturas (especialmente se o cromatógrafo for antigo, e não contar com interface adequada com
computador, o que ainda ocorre em muitos laboratórios pelo Brasil). Dessa forma, quando não existirem
limitações devidas a alargamento de picos, medidas de altura podem ser usadas para análise quantitativa.

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Caso o equipamento possua coleta digital de dados e esteja interfaciado a um computador,

normalmente a determinação da área dos picos não apresenta grandes problemas, e esse deve ser o
parâmetro utilizado para análise quantitativa.

Calibração e Padrões – Padrões Internos

A realização de análise quantitativa de forma precisa envolve a preparação de uma série de soluções-
padrão com concentrações, na medida do possível, varrendo uma faixa de concentrações na mesma ordem
de grandeza das concentrações existentes na amostra a ser analisada. Essas soluções-padrão são
analisadas na mesma coluna que será utilizada para a análise das amostras, nas mesmas condições
operacionais. As áreas dos picos correspondentes a cada concentração de solução-padrão podem, dessa
forma, ser obtidas, e uma curva de calibração pode ser construída. Essa curva deve ter a forma de uma
reta passando pela origem.
A maior fonte de erro desse procedimento vem da incerteza no volume injetado na coluna, uma vez
que frequentemente volumes muito pequenos (da ordem de µL) são utilizados, o que dificulta a
reprodutibilidade , mesmo com a utilização de microseringas muito precisas. Essa situação é acentuada
quando amostras líquidas devem ser injetadas em sistemas de cromatografia gasosa, precisando ser
vaporizados imediatamente após a injeção : nesses casos, podem ocorrer grandes variações nos volumes
realmente injetados na coluna. Os erros podem ser reduzidos com o uso de válvulas automáticas de
injeção, mas dificilmente pode-se alcançar imprecisões menores que 1-2%.
A forma mais precisa de operação envolve o uso de padrões internos, uma vez que as imprecisões
devidas ao processo de injeção serão, nesse caso, as mesmas tanto para a amostra em análise quanto para
o padrão. Nesse procedimento, uma quantidade de uma substância-padrão, determinada com a precisão
adequada, é injetada juntamente com a amostra a ser analisada, e a relação entre os picos dos
componentes da amostra e do padrão é utilizada como parâmetro analítico. Para que esse método
funcione bem, é necessário que o pico referente ao padrão apareça bem separado de todos os outros picos
do cromatograma, ou seja, a sua resolução deve ser alta (RS >1,25). Com o uso de um padrão interno
adequado, precisões melhores que 1% podem ser obtidas.

O método de normalização de áreas

Uma outra abordagem que tenta diminuir as incertezas envolvidas é o uso desse método. A eluição
completa de todos os componentes da amostra é necessária, e as áreas de todos os picos é computada. A
seguir, as áreas são corrigidas por meio dos fatores de resposta do detetor para cada tipo de componente
(esses fatores, ou são fornecidos pelos fabricantes dos cromatógrafos, para cada tipo de detetor, ou então
são determinados em laboratório), e a concentração relativa de cada composto é determinada pela relação
entre a área de cada pico e a área total. O exemplo a seguir ilustra a aplicação desse método.
Exemplo: Os dados a seguir foram obtidos de um cromatograma de uma mistura de álcoois butílicos (os
fatores de correção do detetor foram obtidos a partir de experimentos realizados com quantidades
conhecidas dos álcoois puros)
Álcool Área do Pico (cm2) Fator de Resposta do Detetor Área Normalizada (cm2)
n-butílico 2,74 0,603 2,74 / 0,603 = 4,54
i-butílico 7,61 0,530 7,61 / 0,530 = 14,36
s-butílico 3,19 0,667 3,19 / 0,667 = 4,78
t-butílico 1,66 0,681 1,66 / 0,681 = 2,44
Área Total = 26,12

Os valores das porcentagens relativas de cada álcool na mistura seriam, portanto :

% álcool n-butílico = (4,54 / 26,12) x 100 = 17,4%
% álcool i-butílico = (14,36 / 26,12) x 100 = 55,0%
% álcool s-butílico = (4,78 / 26,12) x 100 = 18,3%
% álcool t-butílico = (2,44 / 26,12) x 100 = 9,3%
100,0%
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DETETORES

Muitos tipos de detetores (mais de uma dezena) existem e são utilizados nas diversas modalidades de
cromatografia. Foge ao objetivo deste texto uma descrição dos detetores existentes, e informações a esse
respeito podem ser encontradas nas referências citadas na literatura comentada. Apenas serão
mencionadas a seguir algumas características do que seria o “detetor ideal”:
(a) Sensibilidade adequada. O que seja isso não pode ser descrito em termos quantitativos, uma vez que o
que seria o “ adequado” difere de detetor para detetor. Pode-se dizer apenas que, atualmente, os
detetores atuais são capazes de detectar dentro de uma faixa de 10-8 a 10-15 g de composto analisado
por segundo.
(b) Boa estabilidade e reprodutibilidade.
(c) Resposta linear em várias ordens de grandeza de concentração de compostos analisados.
(d) Temperatura de operação podendo ir desde a temperatura ambiente até pelo menos 400oC
(temperaturas elevadas são comuns em comatografia gasosa).
(e) Pequeno tempo de resposta, independente da vazão da fase móvel.
(f) Fácil de usar e confiável (e, na medida do possível, à prova de falhas, mesmo quando utilizado por
iniciantes).
(g) Similaridade de resposta a todos os compostos (fator de resposta elevado e constante ao longo de uma
faixa elevada de concentrações), ou então respostas seletivas e previsíveis ao longo das diversas
classes de compostos analisados.
(h) Detecção não destrutiva da amostra.
(i) Baixo custo.

É evidente, e não é necessário enfatizar muito, nenhum detetor apresenta todas essas características.

BIBLIOGRAFIA COMENTADA

Os seguintes livros foram utilizados na elaboração deste texto, e podem ser tomados como sendo um
conjunto básico de referências sobre o tema, que possui uma grande variedade de livros e periódicos em
vista da grande gama de aplicações e da variedade de modalidades analíticas.
Ø Skoog, D.A.; Leary, J.J. – Principles of Instrumental Analyseis. 4a ed. Saunders College Publishing.
Philadelphia. 1992. caps. 24-25.
Livro muito interessante, contém os fundamentos de muitas técnicas analíticas. O presente texto
apresenta fundamentalmente a estrutura do capítulo 24. Uma boa referência para quem deseja ter uma
visão geral das técnicas de análise instrumental mais utilizadas atualmente. Apesar de ter sido editado
há quase dez anos, ainda é muito atual.
Ø Collins, C.H.; Braga, G.L.; Bonato, P.S. (coord.) – Introdução a Métodos Cromatográficos. 4a ed.
Campinas. Editora da UNICAMP. 1990.
Livro interessante, contém os fundamentos de muitas modalidades da cromatografia. Uma boa
referência para quem já quer começar a se aprofundar na técnica, e com a vantagem de ser em
português.. Apesar de ter sido editado há dez anos, ainda é atual, porém é menos detalhado que a
próxima referência. Existe em bibliotecas da Poli e na do Instituto de Química.
Ø Braithwaite, A. ; Smith, F.J. – Chromatographic Methods. 5a ed. Chapman & Hall. Londres. 1996.
Este livro é para quem já quer começar a se aprofundar nos métodos cromatográficos. Apresenta
diversas das modalidades da cromatografia de forma bastante acessível, com um detalhamento
suficiente para aqueles que necessitam utilizar a técnica. Recente e mais acessível que a próxima
referência. Existe na biblioteca do Instituto de Química.
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PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 18

Ø Snyder, L.R.; Kirkland, J.J. – Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2a ed. Wiley. Nova
York. 1979.
Este livro é para quem vai se aprofundar em cromatografia líquida. Apresenta fundamentos que são
aplicáveis em diversas das modalidades da cromatografia, com um detalhamento maior do que o das
referências anteriores. No fundo, apresenta os conceitos fundamentais, de uma forma mais detalhada,
e por isso é bastante útil, apesar dos seus mais de vinte anos. Existe na biblioteca do Instituto de
Química.

Para os interessados, existe um número muito grande de referências, tanto na forma de livros, quanto
na de periódicos, a respeito do tema. Os interessados podem conseguir facilmente informações a respeito
consultando o Dedalus, a partir do SIBI/USP, http://www.usp.br/sibi/. Quem não souber nem o que é
Dedalus, nem o que é SIBI, pergunte a uma bibliotecária de qualquer biblioteca da Poli, e ela certamente
vai explicar como funciona.

EXERCÍCIOS

1. Calcule o número de pratos teóricos e o número efetivo de pratos de uma coluna para um composto que
apresente um tempo de retenção (tR) de 3,64 min e uma largura de pico (W) igual a 0,33min. O tempo
morto (tM) é igual a 0,21 min.
2. Usando os dados apresentados na tabela abaixo (tempos de retenção corrigidos, t’R), calcule os valores
do fator de separação ( α ) de cada composto em relação ao alfenol. Interprete esses resultados (em outras
palavras : o que representa α ser menor que 1, igual a 1 ou maior que 1?). Sabendo que o tempo morto é
igual a 43 s, calcule os valores do fator de capacidade k’ para todos os compostos.
Composto tR (min)
amobarbital 3,53
pentobarbital 4,17
fenobarbital 5,11
alfenol 6,31
metaqualona 10,74

3. Calcule H e N para uma coluna de 25 cm de comprimento na qual um composto orgânico apresentou

um tempo d retenção de 9,59 min e uma largura de pico de 1,20 min.
4. Dois compostos A e B foram analisados na mesma coluna mas em condições operacionais diferentes.
Os tempo de retenção e larguras de pico observadas para as três condições são dadas na tabela abaixo.
Pergunta-se:
(a) as resoluções nas três condições;
(b) qual seria a condição operacional mais interessante? Justifique.
(c) que mudanças devem ter sido feitas da condição 1 para a condição 2, sabendo que a análise é de
cromatografia líquida? E se a análise tivesse sido feita em cromatografia gasosa, quais teriam sido as
mudanças?

Condição Operacional 1 Condição Operacional 1 Condição Operacional 1

Composto A Composto B Composto A Composto B Composto A Composto B
tR = 17,50 min tR = 19,55 min tR = 5,73 min tR = 6,36 min tR = 10,52 min tR = 11,36 min
W = 130 s W = 182 s W = 0,56 min W = 0,71 min W = 0,38 min W = 0,48 min

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5. As áreas relativas dos picos dos cinco compostos apresentados na Figura 8, e os respectivos fatores de
resposta do detetor, são dadas abaixo. Calcule a porcentagem relativa de cada composto na mistura.

Composto Área relativa dos Picos Fator de Resposta do Detetor

1 27,6 0,70
2 32,4 0,72
3 47,1 0,75
4 40,6 0,73
5 27,3 0,78

6. Determine as larguras de dois picos, um com tempo de retenção igual a 6,00 min e outro com tempo de
retenção igual a 3,64 min, sendo que o valor do número de pratos teóricos (o mesmo usado para os dois
picos) é igual a 1600. Explique a razão pela qual os valores de largura de picos são diferentes. É coerente
usar no cálculo o mesmo valor de N para os dois compostos?

7. Os dados a seguir foram obtidos em uma cromatografia gás-líquido realizada numa coluna de 24,7cm
de comprimento.

Composto tempo de retenção tR, min largura da base W, min

A 5,4 0,41
B 13,3 1,07
C 14,1 1,16

Sabendo-se que nas condições de operação utilizadas o tempo morto é igual a 3,1 min, pede-se:
(a) o número médio de pratos efetivos e o desvio padrão desse valor médio;
(b) o valor da altura média de prato;
(c) o fator de capacidade para cada um dos três compostos;
(d) a resolução para os pares A/B, A/C e B/C;
(e) o fator de separação para os pares A/B, A/C e B/C;
(f) considerando o par B/C, qual seria o comprimento de coluna necessário para ser atingida uma
resolução igual ao dobro da calculada em (d), considerando-se a altura média de prato aquela
calculada em (b);
(g) considerando o par B/C, qual seria o tempo de ensaio necessário para ser atingida uma resolução
igual ao dobro da calculada em (d), sendo mantidas as mesmas condições de vazão de fase móvel.

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