Revista Científica da Faculdade de Educação e Meio Ambiente 2(1):13-21, nov-abr, 2011

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AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE PROVOCADA POR SULFATO DE FERRO
ATRAVÉS DO TESTE MICRONÚCLEO EM CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA DE
CAMUNDONGOS

Francisco Carlos da Silva1, Miguel Ângelo de Brito Barros2, Rafaelle Razário

Viana3, Natalia Faria Romão4, Massai de Sousa Oliveira5, Dionatas Ulises de
Oliveira Meneguetti6.

1. Biólogo Bacharelado com ênfase em ecologia, Mestrando em Genética e

Toxicologia Aplicada. Chefe dos laboratórios do Centro Universitário Luterano de
Ji-paraná (CEULJI/ULBRA).
2. Agrônomo, Mestrando em Genética e Toxicologia Aplicada.
3. Bióloga Licenciada, Mestranda em Genética e Toxicologia Aplicada. Docente
do Centro Educacional São Paulo (CEDUSP/ULBRA).
4. Bióloga Bacharelado com ênfase em ecologia, Mestranda em Genética e
Toxicologia Aplicada. Docente do Centro Educacional São Paulo
(CEDUSP/ULBRA).
5. Farmacêutico e Bioquímico, Mestranda em Genética e Toxicologia Aplicada.
Docente do Centro Universitário Luterano de Ji-paraná (CEULJI/ULBRA).
6. Biólogo Bacharelado com ênfase em ecologia, Mestre em Genética e
Toxicologia Aplicada. Docente e Coordenador de Extensão da Faculdade de
Educação e Meio Ambiente (FAEMA).

dionatasmeneguetti@faema.edu.br

RESUMO:
Micronúcleos definem-se como pequenos corpos contendo DNA e localizados no
citoplasma. Os mesmo aparecem na telófase e são resultantes de fragmentos
cromossômicos acêntricos, originados de quebras isocromatídicas, cromatídicas,
ou de disfunções do fuso mitótico, podendo aparecer mais de uma vez por
células. O presente estudo objetivou analisar os efeitos mutagênicos causados
sulfato de ferro utilizado o teste micronúcleo em células da medula óssea de
camundongos, para averiguar a eficácia metodológica a ser aplicada em
pesquisas de toxidade e mutagênicidade de plantas amazônicas, aprovado pelo
(CEP 2010-007A ULBRA). Foram realizadas correlação (PCR/NCE) em 1000
células da medula óssea dos camundongos e contagem de micronúcleos em
2000 (PCEs). Constatou-se através da correlação (PCE/NCE) que houve
citotoxicidade ou depressão celular nas células da medula óssea do camundongo
tratado com (CP), os dados também mostraram que houve atividade mutagênica

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nos camundongos tratados com (CP) já que a média da frequência de
micronúcleos foi de (9,5/1000 PCEs), sendo essa metodologia indicada para
aplicação em estudos de mutagênicidade. É importante ressaltar que esse foi o
primeiro estudo que utilizou a técnica de micronúcleo para análise mutagênica no
estado de Rondônia.

Palavras-chave: Sulfato de ferro, Mutagênicidade e Micronúcleo.

ABSTRACT:
Micronuclei are defined as small bodies containing DNA and localized in the
cytoplasm. The same appear in telophase and are derived from chromosomal
fragments originated from isochromatid breaks, chromatid, or dysfunction of the
mitotic spindle and may appear more than once per cell. This study aimed to
analyze the mutagenic effects caused by iron sulfate, used the micronucleus test
in bone marrow cells of mice to ascertain the effectiveness methodology to be
applied in studies of toxicity and mutagenicity of Amazon plants, approved by
(CEP 2010-007A ULBRA ). were performed correlations (ECP / ECN) in 1000
bone marrow cells of mice and enumeration of micronuclei in 2000 (ECPs). It was
found through correlation (ECP / ECN) that there was cellular cytotoxicity or
depression in the bone marrow cells of mice treated with (CP), the data also
showed that there were mutagenic activity in mice treated with (CP) longer than
the average MN frequency was (9.5 / ECPS 1000), and this methodology suitable
for application in mutagenicity studies. is important to note, this was the first study
using the micronucleus technique for analyzing mutagenic in Rondonia state.

Keywords: Iron sulphate, Mutagenicity and Micronucleus

1. INTRODUÇÃO quase sempre prejudicial,

especialmente em organismos
Mutação é uma alteração multicelulares, nos quais a alteração
súbita e herdável na estrutura do genética está mais inclinada a
material genético e como tal, é uma perturbar o desenvolvimento e a
fonte extremamente importante de fisiologia extremamente complexos e,
variabilidade genética nas finamente, sintonizados, de um
populações de seres vivos (BURNS e organismo (ALBERTS et al., 2002;
BOTTINO, 1991; JORGE, 2005). JORGE, 2005).
Entretanto, em curto prazo e do Micronúcleos definem-se como
ponto de vista de um único pequenos corpos contendo DNA e
organismo, a alteração genética é localizados no citoplasma (Figura 1).

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Os mesmo aparecem na telófase e isocromatídicas, cromatídicas, ou de
são resultantes de fragmentos disfunções do fuso mitótico, podendo
cromossômicos acêntricos, aparecer mais de uma vez por
originados de quebras células (RIBEIRO et al., 2003).

Figura 1. Formação de micronúcleos em células (UFMG, 2011)

O teste de micronúcleos é um normocromáticos um eritrócito

dos testes mais utilizados para maduro, sem ribossomos (CHOY,
detecção de agentes clastogênicos 2001).
(quebram cromossomos), e de Porém é necessária a divisão
agentes aneugênicos (induzem celular após a mutagênese sendo
aneuploidia ou segregação assim o cultivo celular é
cromossômica anormal) imprescindível ou então o uso de
(MACGREGOR et al., 1987; células em constante multiplicação
HAYASHI et al., 1994). como as de medula óssea. (VILELA
Normalmente sua presença é et al., 2003).
analisada em eritrócitos Sua sensibilidade e precisão
policromáticos, um eritrócito imaturo, juntamente com a detecção de perda
em um estágio intermediário de cromossômica caracterizam as
desenvolvimento, que ainda contém principais vantagens do teste de
ribossomos, de medula óssea de micronúcleos (RIBEIRO, 2003).
camundongos, mas pode, também, O presente estudo objetivou
ser analisada em eritrócitos analisar os efeitos mutagênicos

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causados sulfato de ferro utilizado o
Os testes foram realizados em
teste micronúcleo em células da
dois camundongos, sendo um
medula óssea de camundongos, para
controle negativo com aplicação de
averiguar a eficácia metodológica a
H2O e outro controle positivo com
ser aplicada em pesquisas de
aplicação de agente mutagênico. A
toxidade e mutagênicidade de
aplicação se deu por gavage (dose
plantas amazônicas, aprovado pelo
oral), de 5mg/kg de H2O (controle
(CEP 2010-007A ULBRA).
negativo) e 5mg/kg do agente
mutagênico sulfato de ferro (controle
2. MATERIAIS E MÉTODOS positivo), 24 horas antes do inicio dos
testes (Figura 2).
2.1. Tratamento dos animais

Figura 2. A – Pesagem dos camundongos. B – Aplicação por gavage do sulfato

de ferro. (Imagens: Dionatas Meneguetti)

2.2. Preparo do tampão fosfato da solução (A), adicionou-se 27,6

gramas de fosfato de potássio
Foram preparadas as soluções monobásico anidro KH2PO4, por litro
(A e B) em separado. Para preparo do H2O destilada. Já na solução (B)

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adicionou-se 35,6 gramas de fosfato cortes, o primeiro na parte mais dura
de sódio bibásico NA2PO4.7H2O, e o segundo do lado oposto, sendo a
por litro do H2O destilada. Em coleta de medula óssea realizada
seguida juntou-se 16,5ml da solução com auxilio de uma seringa de
(A) com 46ml da solução (B) e insulina, no sentido de caminhamento
acrescentou-se 37,5ml de H2O da medula óssea.
destilada, completando os 100ml do
tampão fosfato que estava com PH =
5,8. 2.5. Preparo da lâmina

Foi preparada uma lâmina de

2.3. Preparo do corante cada fêmur, com um total de quatro
laminas, sendo duas controle positivo
Adicionou-se 90ml de tampão e duas controle negativo. Adicionou-
fosfato e 10ml de Giemsa. A se uma gota de 10µl de soro fetal
coloração serve para diferenciar bovino por lamina, onde foi feito a
eritrócito policromático (PCE) de homogeneização (com o auxilio de
eritrócito normocromático (NCE) uma espátula) da medula óssea e em
(Figura 3). Eritrócitos policromáticos seguida feito o esfregaço. As laminas
(PCE) se coram de azul claro e ficaram em repouso (secando) ao ar,
eritrócitos normocromáticos se coram em temperatura ambiente por
de vermelho-telha. (RIBEIRO et al, aproximadamente 30 minutos.
2003). Posteriormente as laminas foram
fixadas sendo imersas no metanol
por 10 minutos e coradas por 7
2.4. Coleta da medula óssea minutos no corante preparado
anteriormente, ambas em cubeta.
Os camundongos foram Decorrido o tempo retirou-se as
sacrificados por decapitação com o laminas da cubeta, sendo as mesmas
uso de tesoura cirúrgica, a mesma lavadas com H2O destilada para
que foi utilizada para retirar os remover o excesso, e deixadas secar
fêmures, onde foram feitos dois ao ar em temperatura ambiente.

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2.6. Microscopia – Análise de Foram analisadas 04(quatro)
micronúcleos laminas: as de numero 1 e 2 controle
negativo, 3 e 4 controle positivo. A
A contagem de micronúcleos contagem iniciou-se com 500 células
se deu em 2000 células de medula de PCE e NCE onde é feito sua
óssea do camundongo, sendo 1000 correlação e a quantidade de
em cada fêmur. A visualização das micronúcleos em PCE,
laminas foi feita em óleo de imersão, posteriormente a contagem continuou
com objetiva de 100X e ocular 10X. apenas com PCE e micronúcleos até
um total de 1000 células (Figura 3).

Figura 3. A - Eritrócito policromático (PCE) com dois micronúcleos. B - eritrócito

policromático (PCE) com um micronúcleo. (Imagens: Dionatas Meneguetti).

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES Essa diminuição na proporção

de (PCE) em relação a (NCE) é um
A correlação (PCE/NCE) no parâmetro que mostra que ouve
(CN) foi de 1,04 e no (CP) foi de 0,65 citotoxicidade ou depressão celular
conforme (Tabela 1). no camundongo tratado com (CP)
(SHAHRIM et al., 2006).

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Tabela 1. Relação (PCE/NCE) em células da medula óssea dos camundongos.
Laminas Numero de células (NCE) (PCE) Correlação (PCE/NCE)
1 500 265 235 0,89
C- 2 500 225 275 1,22
Total 1000 490 510 1,04
3 500 319 181 0,57
C+ 4 500 286 214 0,75
Total 1000 605 395 0,65

A quantidade de (MN/1000 mutagênica, tendo em vista que a

PCEs) no (CN) foi de 2 e no (CP) foi frequência normal de (MN) é de até 3
de 9,5 conforme (Tabela 2), (MN/1000 PCEs). (RABELLO-GAY et
mostrando que o (CN) funcionou e al., 2003; SILVA et al., 2003).
que o (CP) provocou uma ação

Tabela 2. Micronúcleos em (PCEs) da medula óssea dos camundongos.

Laminas Numero de células (MN/1000 PCEs)
1 1000 2
C- 2 1000 2
Total 2000 2
3 1000 11
C+ 4 1000 8
Total 2000 9,5

4. CONCLUSÃO citotoxicidade ou depressão celular

nas células da medula óssea do
Constatou-se através da camundongo tratado com (CP), os
correlação (PCE/NCE) que houve dados também mostraram que houve

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atividade mutagênica nos During Routine Toxicity Testing in
Mice. In: HAYES, A.W; SCHNELL
camundongos tratados com (CP) já
R.C; AND MIYA, T.S. Developments
que a média da frequência de in Science and Practice of
Toxicology. Ed Elsevier,
micronúcleos foi de (9,5/1000 PCEs),
Amsterdam. 555–558, 1983.
sendo essa metodologia indicada
para aplicação em estudos de 5. MALUF, S.W., ERDTMANN, B.
Biomonitorização do Dano Genético
mutagênicidade. É importante em Humanos. In: SILVA, J;
ressaltar que esse foi o primeiro ERDTMANN, B; HENRIQUES, J.A.P.
Genética Toxicológica. Ed Alcance.
estudo que utilizou a técnica de Porto Alegre, 2003.
micronúcleo para análise mutagênica
6. Neto, J.X.A., Medeiros, F.P.M.
no estado de Rondônia. Melo, A.J.M; Silva, J.C., Dantas, J.P.
Avaliação do efeito mutagênico da
palma forrageira (Opuntia fícus-indica
Mill) através do Teste de
5.REFERÊNCIAS Micronúcleos em medula óssea de
ratos (Rattus novergicus, linhagem
BIBLIOGRÁFICAS Wistar) in vivo. Rev Bio Ciên Terra,
5:(2), 2005.
1. ALBERTS, B. Fundamentos da
7. RABELLO-GAY, M. N., SILVA, J.
Biologia Celular. Ed Artmed. Porto
C., SILVA, S. Avaliação do possível
Alegre, 2002. BURNS, G. W;
efeito genotóxico do Gergelim
BOTTINO, P. J. Genética. Editora
(Sesamum indicum L.) através do
Guanabara Koogan. 6ª edição. Rio
Teste de Micronúcleos, em medula
de Janeiro, 1991.
óssea de ratos (Rattus novergicus,
linhagem Wistar). Monografia.
2. CHOY, W.N. Regulatory Genetic Universidade Estadual da Paraíba.
toxicology tests. In: Genetic Campina Grande, 2003.
Toxicology and Cancer Risk
Assessment (Choy, W.N. ed.),
8. RIBEIRO, L. R., SALVADORI, D.
Marcel Dekker, Inc, New York, 93-
M. F., MARQUES, E. K. Mutagênese
113, 2001.
Ambiental. Ed Ulbra. Canoas, 2003.
3. HAYASHI, M., TICE, R.R., MAC-
9. SHAHRIM, Z., BAHARUDDIN, P.
GREGOR, J.T. In vivo rodent
J. N. M., YAHYA, A., MUHAMMAD,
erytrocite micronucleus assay.
H., BAKAR, R. A., ISMAIL, Z. The in
Mutagênese Ambiental. Ed Ulbra.
vivo rodent micronucleus assay of
Canoas, 2003.
kacip fatimah (Labisia pumila) extract.
Trop Biomed, 23: 214-219, 2006.
4. MAC-GREGOR, J.T. Micronuclei in
Circulating Erythrocytes: A Rapid
Screen for Chromosomal Damage

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10. UFMG. Micronúcleos.
Disponível em
<http://www.icb.ufmg.br/biq/prodap/2
003/micronucleos/sobremn.html>
Acesso em 08/01/2011.

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