Sequenciamento de novas gerações e suas

aplicações

Nome: Willian Natan Cabral Bach R.A.:18059843

Nome: Mauricio H. Goulart Nakamatsu R.A.:18055843

Sequênciamento de DNA
Em termos moleculares, é indubitável que a molécula de DNA é conhecida
através da leitura de sua sequência de nucleotídeos. Ou seja, a função de um gene é
determinado pelas sequências de genes conhecidos. Sendo assim, a informação da
sequência de nucleotídeos é importante para determinar a presença de mutações de
um só par de bases.

Em um contexto histórico no que tange a revolução genética, duas técnicas

foram precursoras na corrida pelo entendimento da sequência do material genético, o
método químico de degradação de bases e o método didesoxinucleotideo ou
terminação do fragmento que são baseados na produção de um conjunto de fitas
simples de DNA que são separadas pelo princípio de eletroforese. No entanto, quando
comparadas as duas técnicas, o método de Sanger(didesoxinucleotideo), que recebeu
o prêmio Nobel, é o mais usado devido as interpretações de seus dados serem mais
visíveis.

O método de Sanger tem uma importante fase em que há o término da junção

do DNA. Sendo assim, a primeira etapa no procedimento laboratorial padrão para o
sequenciamento didesoxinucleotideo de DNA envolve a helicoidizacão de um
oligonucleotideo(primer) sintético a um segmento predeterminado de um filamento do
vetor de clonagem perto do sítio de inserção do DNA clonado. Um primer, que fornece
um grupo 3’ hidroxila para o início d6a síntese de DNA, geralmente tem de 17 a 24
bases de tamanho, para garantir que faça pares de bases com uma sequência
específica complementar. Primers mais curtos podem fazer pares de bases com mais
de uma sequência no DNA construído, o que produziria varios sítios de início,
logicamente, o grupo 3’ hidroxila do primer “sinaliza” no sentido do DNA a ser
sequenciado. A amostra do DNA marcada com primer é dividida em quatro tubos de
reação separados. Cada tubo contém quatro desoxirribonucleotideos (dATP, dCTP,
dGTP e dTTP), um dos quais é radiomarcado; um dos quatro didesoxinúcleotideo
(ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP); e a DNA polimerase. Nessa amostra, é
necessário que haja uma medida ajustada de cada didesoxinúcleotideo em cada tubo
da reação, para que seja incorporado à cadeias crescentes em cada sítio possível, e
não apenas na primeira ocorrência do nucleotídeo complementar do filamento molde.
Portanto, o reflexo disso é a síntese enzimática do DNA, fazendo com que cada tubo
da reação conterá um conjunto único de oligonucleotideo, cada uma com uma
sequência primer. Logo, a síntese de DNA só é compassado quando sofre adição de
formamida, que também impede que os filamentos formem pares de bases. Em
seguida, os conteúdos são separados através de tubos contendo poços de um gel de
poliacrilamida, surtindo efeito na separação das moléculas de DNA por eletroforese.

É válido lembrar que esse método de Frederick Sanger tem a vantagem de

exatidão da base gerada, devido à alta qualidade de sequências para longos pedaços
de DNA. No entanto, constata desvantagens de permanecer com alto custos e não ser
capaz de gerenciar um genoma inteiro ou um metagenoma.

SEQUENCIAMENTO DE NOVAS GERAÇOES

O NGS é uma tecnologia de sequenciamento que possui uma estratégia
diferente, mas em geral podemos identificar etapas comuns entre todos os
sequenciadores; 1: preparo da amostra, amplificação da biblioteca e sequenciamento.
Preparo da amostra, primeiro o DNA é fragmentado por um processo químico,
mecânico ou enzimática. Cada um desses fragmentos é chamado de template. Após a
fragmentação, adaptadores, sequências artificiais conhecidas, são incorporados ao
template. Nessa etapa é possível combinar diferentes amostras em uma mesma
reação de sequênciamento através do uso de adaptadores. Depois de ligados esses
adaptadores, as amostras são misturadas, amplificadas e sequenciadas juntas. Após
isso, no processo de sequênciamento, essa parte do adaptador é lida e as amostras
são separadas computacionalmente. Um outro tipo de de biblioteca são as de Long
Mate-Pair, ou LMP. Nesse caso, são gerados templates maiores, da ordem de
algumas kilobases. São ligados adaptadores complementares nas pontas do template
e ele é circularizados. Em seguida é feita uma digestão enzimática que gera um único
fragmento com as duas pontas do template separadas adaptador interno. Apesar de
ser um processo mais trabalhoso para o preparo de uma bibliotecas simples de
fragmentos, o LMP permite a detecção de variações estruturais em projetos de
ressequenciamento e de geração de scaffolds em projetos de novo sequenciamento.

Um artefato que pode surgir nessa etapa são as duplicações de reads

causadas por artefatos de PCR. Esses artefatos podem gerar distorções na cobertura
do genoma e impactar as análises de variações do genoma ou de expressão do
transcriptoma. A amplificação de bibliotecatem como objetivo gerar em um pequeno
espaço físico de milhares de cópias de cada fragmento de DNA produzido na etapa de
preparo da amostra. O objetivo dessa amplificação é aumentar a fonte de sinal
luminoso para a maioria dos sequenciadores, e iônico no o caso do Ion Torrent, que
será detectado na etapa de sequenciamento. O primeiro processo de amplificação
desenvolvido para esse propósito foi o PCR de emulsão. Nele são criados milhões de
micro reatores em uma emulsão de óleo.Esses fragmentos, servem para fixar os
clones do template na esfera e também como primer para a reação de PCR. Portanto,
o que importa é que o fator que afeta a etapa de amplificação é a quantificação do
DNA. Se o DNA for subquantificado, ou seja, existe mais DNA na amostra do que o
reportado. Por outro lado, se o DNA for quantificado, ou seja, se existe menos DNA do
que o reportado, o resultado vai ser uma quantidade muito pequena de beads com
fragmentos.

Plataforma 454: O princípio desta tecnologia foi proposto por Hyman (1988), mas
somente em 2005 tivemos o primeiro sequenciador de segunda geração. Essa
tecnologia dispensa a clonagem e tem baixo custo (comparado a outros métodos
existentes), e o sistema de sequenciamento é cerca de 100 vezes mais rápido quando
comparado ao método de sequenciamento padrão de Sanger. A eficiência e rapidez
da técnica foram comprovadas pelo ressequenciamento do genoma da bactéria
Mycoplasma genitalium com 96% de cobertura e 99.96% de precisão num único
processamento de quatro horas. Este método pode ser dividido em três etapas:

a) preparo da amostra, b) PCR em emulsão e c) sequenciamento. Na primeira etapa,

o DNA é fragmentado aleatoriamente por nebulização, sendo selecionados os
fragmentos com tamanho adequado. Em seguida, liga-se dois adaptadores (A e B) às
extremidades dos fragmentos selecionados. Em “b”, os fragmentos obtidos são ligados
à microesferas magnéticas por meio do pareamento do adaptador B com sequências
curtas complementares presentes na superfície da microesfera, onde ocorrerá a
amplificação deste fragmento. O adaptador A, por sua vez, servirá de molde para
anelamento do primer responsável pelo início da amplificação. Desta forma, estas
microesferas agem como reatores de amplificação individual produzindo milhares de
cópias de um único molde. Na última etapa, estas microesferas são adicionadas a
uma placa de modo que cada orifício da placa receba uma única microesfera.
Posteriormente são adicionados os reagentes necessários para amplificação do DNA.
Pirofosfato inorgânico (PPi) é liberado a cada incorporação de um nucleotídeo
complementar a fita molde. Este PPi livre é convertido. Como consequência desta
reação, temos a emissão de luz. Desta forma, cada incorporação de nucleotídeos à
cadeia de DNA nascente emitirá luz, imediatamente convertida em pirogramas. A
interpretação destes “pirogramas” permite identificar a sequências de nucleotídeos do
DNA molde, portanto, esta técnica baseia-se na detecção de fótons de luz produzidos
em quantidade proporcional ao número de nucleotídeos incorporados a cadeia de
DNA nascente. Não obstante, a quantidade de luz emitida após a incorporação do
quarto homopolímero não é mais linear ao número de nucleotídeos incorporados,
sendo este um problema desta técnica. Além disso, há uma limitação consistente na
geração de quimeras que são sequencias de DNA provenientes da ligação de dois
fragmentos distintos.

Plataforma illumina: O advento do método da Plataforma Illumina foi decorrente do

trabalho de quatro companhias inspiradas na metodologia proposta por Turcatti. Esta
parceria trouxe resultados significativos no desenvolvimento do sequenciador Illumina
Genome Analyser. Por outro lado, esta metodologia é análago ao método proposto por
Sanger, pois temos em ambas a síntese de uma fita complementar ao DNA alvo
utilizando DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes
fluorótofos. A fluorescência emitida após a incorporação de cada nucleotídeo é
registrada como imagem e no final, através de uma decodificação destas imagens,
tem se a sequência de interesse. Como toda técnica de sequenciamento de segunda
geração, é preciso primeiro preparar as bibliotecas contendo o DNA a ser
sequenciado. Logo, o DNA é clivado, e em ambas as extremidades, os fragmentos de
tamanhos apropriado são selecionados e ligados a adaptadores. Estas bibliotecas
podem ser de dois tipos: paired-end, que proporciona o sequenciamento nas duas
extremidades de reads com tamanho entre 200 e 500 nucleotídeos; e mate-pair que
também sequencia as duas extremidades de reads maiores (de 2000 a 5000
nucleotídeos). Neste caso, é imprescindível um passo extra, pois a eficiência de
ligação destes reads grandes na flowcell (placa de vidro) é baixa. O truque é ligar na
placa de vidro apenas as extremidades destes fragmentos maiores. O kit desenvolvido
pela Illumina contorna, de maneira simples, este problema. Esta segunda biblioteca
direciona a montagem de regiões repetitivas além de proporcionar a ligação e
ordenação de contigs. Adaptadores são ligados às extremidades dos fragmentos de
tamanho apropriado durante a preparação da biblioteca. Estes fragmentos são fixados
na placa distantes o suficiente para que, após a amplificação, exista somente um tipo
de fragmento dentro do cluster, que geralmente é formado por mais de um milhão de
cópias do mesmo fragmento. Os adaptadores têm a principal função de imobilizar os
fragmentos fita simples, pela hibridização a primers complementares, numa placa de
vidro onde acontecerá todo o processo. Após a fixação, o adaptador da extremidade
livre liga-se ao primer complementar adjacente na placa de vidro. A alta densidade de
primers ligados a flowcell facilita esta ligação que tem a função de iniciar a extensão
da fita de DNA nascente, pela DNA polimerase, ao encontrar um OH livre na
extremidade do primer livre. Na primeira etapa são fornecidos apenas nucleotídeos
não marcados que proporcionará a extensão de uma fita de DNA complementar ao
DNA molde fixado na placa. A extremidade desta fita recém-sintetizada se anela ao
primer na extremidade da fita molde formando uma estrutura em ponte que dá nome
ao processo de amplificação. Posteriormente ocorre uma elevação de temperatura no
suporte sólido desnaturando e linearizando as duas fitas que encontram outros dois
primers reiniciando o processo (segundo ciclo). A clonagem in vitro é finalizada após
35 ciclos, resultado em milhares de clusters. Na segunda etapa, após os 35 ciclos de
sequenciamento, são adicionados, ao longo de toda a extensão da placa, uma solução
contendo os quatro tipos de nucleotídeos terminadores marcados com fluorescência.
Quando necessário estes nucleotídeos, contendo os fluoróforos, são adicionados as
respectivas cadeias de DNA nascente em cada um dos clusters. Em seguida, ocorre a
excitação do fluoróforo por feixes de raios laser fazendo com que os nucleotídeos
emitam uma fluorescência que tem sua intensidade proporcional ao número de
representantes (fragmentos) dos clusters. Uma imagem, contendo a cor da
fluorescência, é capturada para cada posição dos clusters na placa de vidro. Em
seguida, a extremidade 3’ é desbloqueada com consequente remoção dos reagentes
em excesso e do fluoróforo do nucleotídeo incorporado no ciclo anterior, permitindo o
início de um novo ciclo. Este processo é continuo e se repete até que todas as bases
de um determinado fragmento sejam determinadas. Assim, temos um sistema de
amplificação totalmente diferente dos outros métodos de sequenciamento de segunda
geração que é baseado em PCR em emulsão.
 O processo de sequenciamento de dois instrumentos diferentes que têm
abordagens completamente diferentes: o Ion Torrent e o SOLiD.

Ion Torrent: Nesse método, a maioria dos sequenciadores utiliza apenas uma
DNA polimerase para gerar a fita complementar ao template, bases marcadas por
fluoroforos, e câmeras a detecção. O Ion Torrent é diferente pois a sua detecção é
reflexo de um processo direto, ou seja, a reação de polimerização gera naturalmente
um H+3, ou seja, um próton, que altera o pH do meio. Essa alteração do pH é
detectada por um transistor ISFET e convertida em um sinal elétrico.

Além disso, é valido lembrar que para determinar a sequência é preciso

sincronizar a polimerase com a detecção, tanto no Ion Torrent quanto no 45, essa
sincronização é realizada pelo controle do tipo disponível para a polimerase. Em
seguida, continua a reação, a polimerase necessita de um dCTP, porém esse
reagente não está disponível e, portanto, a reação para e a leitura da incorporação é
feita. Em seguida, ocorre uma lavagem, e a base seguinte é injetada, e assim por
diante em uma série de fluxos.

É importante ressaltar que os sequenciadores que utilizam fluxos de dNTP’s

são os homopolímeros, sequencias contínuas de bases iguais. Nesse caso, todas as
bases do homopolímero vão ser incorporadas em um único fluxo. Felizmente, o sensor
ISFET tem uma resposta bastante linear; portanto, se um A tem um sinal x, um AA vai
ter um sinal aproximadamente 2x, e assim por diante. O último elemento importante, e
que diferencia os sequenciadores da nova geração em relação à anterior, é o
paralelismo da reação e da detecção. No Ion Torrent, esse paralelismo é obtido pelo
uso de chips de silício. Utilizando o processo CMOS, o mesmo utilizado na fabricação
de chips de computador ou sensores de câmeras digitais, são construídos milhões de
poços microscópicos um pouco maiores do que as esferas com fragmentos de DNA,
de forma que, em cada poço, tenha somente uma esfera. No chip, estão também os
transistores IsFET que realizam a detecção da mudança de pH, ou seja, cada poço
possui o seu próprio pH para fazer a detecção do sinal.

SOLiD: Ao contrário de utilizarmos uma polimerase para detectar a incorporação de

cada uma das bases, o SOLiD utiliza octâmeros marcados com fluoróforos para
identificar a sequência alvo. As primeiras 5 bases da probe garantem a especificidade
da ligação da probe com o template, enquanto que as 3 últimas são inosinas que
anelam de maneira inespecífica. Conectado à última, inosina temos o fluróforo que
gerará o sinal luminoso a ser detectado pelo sequenciador

No SOLiD: assim como no Ion Torrent, cada fragmento é amplificado milhares

de vezes na superfície de uma bead. Essas beads são então inseridas e anexadas em
uma lâmina de vidro. É imprescindível obter essa fixação, pois sabemos que o sinal
luminoso que será gerado pelo processo de sequenciamento está vindo da mesma
bead (ou seja, da mesma população de clones geradas de um template) por meio das
coordenadas do ponto luminoso na lâmina.
 A reação de sequenciamento ocorre para cada um dos milhares de clones em
cada uma das centenas de milhões de beads depositadas na lâmina. As etapas dessa
reação são, as seguintes: 1. Na etapa de construção de biblioteca, é adicionado um
primer em cada extremidade de cada fragmento, chamados de P1 e P2. No processo
de sequenciamento é adicionado um primer complementar à P1. A última base desse
primer alinha com a última base de P1. Como temos 4 bases diferentes e uma
estrutura de 5 bases mais 3 inosinas, temos portanto 1024 combinações diferentes de
probes. As probes vão se anelar ao longo do template. Após o anelamento, é
adicionada uma ligase, que vai fixar somente a probe que estiver ao lado de uma
ponta. Após a fixação pela ligase ocorre uma lavagem e todas as probes não fixadas
são removidas. É feita a leitura do floróforo. As três últimas bases da probe, são
removidas junto com um floróforo, criando assim uma ponta livre para fazer a ligação
da próxima probe.

APLICAÇOES

1. Um dos trabalhos que melhor constata o potencial das novas plataformas de

sequenciamento foi o conduzido com o eucalipto espécie para a qual pouca
informação genômica é disponível. Vários genótipos e tecidos foram sequenciados
com a plataforma 454, gerando um número maior de genes do que o gerado por
sequenciamento convencional, altamente confiáveis e, muito importante, o
enriquecimento de 37 vezes nas sequências de ESTs disponíveis para o eucalipto nos
bancos de dados públicos. Infere-se, portanto, que a inserção de um novo método
(sequenciamento de EST) relatou certamente uma estratégia de sucesso para
obtenção de informação genômica das plantas a partir das novas plataformas de
sequenciamento, ou seja, permitiu que os problemas de montagem associados às
leituras curtas acabassem, e pode ser ainda mais informativo na análise da leitura de
DNA, uma vez que mais informação é produzida e sequências de baixa expressão são
também amostradas (não há efeito de clonagem bacteriana). Além disso, o custo do
sequenciamento de ESTs é menor com as novas plataformas de sequenciamento,
refletindo na sua independência da construção de bibliotecas de cDNA para cada um
dos tecidos amostrados. Além do banco de ESTs do eucalipto, os bancos de milho,
Medicago sp e arabidopsis também estão sendo enriquecidos com o
pirosequenciamento. O potencial de identificação de novos genes com os novos
sistemas de sequenciamento é especialmente importante quando se deseja conhecer
genes funcionais em tipos celulares restritos. Nesses casos, utilizando os métodos
convencionais de sequenciamento, um grande número de bibliotecas deve ser
construído e muitos ESTs devem ser sequenciados para maximizar a chance de
encontrar os genes de interesse. Já com o sequenciamento livre de clonagem
bacteriana, genes de células específicas podem ser facilmente identificados, como
realizado para as células meristemáticas apicais do milho, que compõem apenas uma
porção do ápice da planta. Um total de 400 novos genes foi identificado em uma única
corrida na plataforma 454, sendo a maior parte deles genes especificamente
expressos nesse tecido.
 O ressequenciamento genômico em plantas é também muito informativo para
estudos de polimorfismo. Indivíduos variantes de arabidopsis foram sequenciados
utilizando a plataforma Solexa para buscar variações genotípicas. A montagem das
leituras curtas da plataforma Solexa foi auxiliada pela informação genômica disponível
para arabidopsis, e o sequenciamento de pequena cobertura (11 vezes em uma única
corrida) utilizado nesse trabalho foi suficiente para detecção de deleções, duplicações
e de SNPs com uma especificidade de 99%. A plataforma 454 também obteve
sucesso ao realizar identificação de SNPs em transcritos das células meristemáticas
apicais de milho. Em uma única corrida, foi possível identificar cerca de cinco mil
SNPs válidos entre os 2.472 genes identificados. O que implica nas novas plataformas
de sequenciamento, em um futuro bem próximo, revolucionarão o conhecimento sobre
o genoma das plantas, principalmente no que concerne ao estudo de variantes
alélicas, SNPs, ao desenvolvimento de marcadores para seleção assistida e à
clonagem baseada em mapeamento, representando uma importante ferramenta no
melhoramento vegetal. Essa revolução será possível com o avanço tecnológico das
próprias plataformas de sequenciamento, produzindo leituras maiores, avanço das
ferramentas de análise de leituras curtas e montagem de sequências. O que parece
estar cada vez mais evidente é, na verdade, o potencial de uso imediato dessas
tecnologias na genômica funcional com o estudo de transcriptoma que vão desde
organismos completos até células individuais. Todas as plataformas de
sequenciamento da segunda geração podem ser utilizadas no sequenciamento de
transcriptoma ou RNA-seq. A maior parte dos estudos de transcriptoma em plantas é
realizada utilizando os micro arranjos de DNA, os quais, além de depender de um
conhecimento genômico prévio e de serem influenciados pelo elevado ruído de fundo,
possuem ainda uma faixa de detecção de expressão limitada quando comparada às
novas plataformas de sequenciamento (~100 vezes versus 9.000 vezes).

O grande sucesso das novas tecnologias na transcriptoma se deve também ao

fato de que estas possibilitam a superação de uma das maiores limitações dos
projetos ESTs – a brusca redução no número de sequências novas amostradas com o
aumento na quantidade de informação sequenciada. No estudo realizado no
transcriptoma de plântulas de arabidopsis, constataram em cerca de 16.000 novos
ESTs ainda não caracterizados no dbESTs dos quais pelo menos 60 representam
genes ainda não anotados, conferindo maior confiabilidade aos dados principalmente
com relação à quantificação dos níveis de expressão gênica, os quais dependem
muito do efeito de amostragem. Um exemplo interessante do efeito de amostragem é
apresentado no estudo do transcriptoma de S. cerevisae com a plataforma Solexa. Um
total de 66 íntrons previamente identificados foram encontrados entre as sequências
expressas na levedura, alguns dos quais foram tão expressos quanto seus éxons
adjacentes.

2.A cardiomiopatia hipertrófica (CH) é uma doença cardíaca estrutural

primária, caracterizada por hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem dilatação,
geralmente assimétrica e predominantemente septal. Na população geral a
prevalência estimada da CH é de 0,2%, correspondendo a 0,5% de todas as
cardiopatias. Atualmente estão descritas mais de 1400 mutações associadas à CH em
20 genes relacionados com os miofilamentos do sarcômero, o disco-Z e o transporte
de cálcio, sendo que os três mais associados são os genes MYH7, MYBPC3 e
TNNT2, responsáveis por 50% do casos com diagnóstico molecular positivo no Brasil.
Dessa forma, o advento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA de alta
performance promete revolucionar o diagnóstico molecular, tornando mais rápida e
barata a identificação de alterações genéticas, impactando positivamente na custo-
efetividade do manejo diagnóstico e terapêutico de pacientes e famílias com o
diagnóstico de CH.
          O uso frequente de testes genéticos em casos de CH tem aumentado nos
últimos anos em decorrência de benefícios relatados tanto no contexto
individual como no familiar. A princípio, nas situações em que o diagnóstico
clínico é uma certeza, o estabelecimento do defeito molecular reserva-se
apenas a confirmação diagnóstica. Ainda assim, o diagnóstico molecular pode
contribuir como uma evidência em casos em que a confirmação clínica é
incerta como, por exemplo, na existência de hipertrofia limítrofe do VE, em
casos de hipertrofia identificada em atletas (também denominado “coração de
atleta”) e ainda em casos de suspeita de hipertrofia por doenças de depósito.
Porém, uma das principais aplicações da análise genética é o
diagnóstico pré-clínico em indivíduos membros de famílias com histórico da
doença. Uma vez identificada presença de mutação em heterozigose, cada
membro apresenta 50% de chances de herdá-la, o que faz do diagnóstico
molecular uma ferramenta importante na identificação de indivíduos em risco,
principalmente na existência de histórico de morte súbita. Em alguns casos,
esse pode ser a primeira manifestação da doença, sendo que ocorre em 1 a 2% das
crianças e adolescentes e em 0,5 a 1% dos jovens adultos com
mutações causais identificadas 12.
       Contudo, deve-se compreender que o diagnóstico molecular positivo,
especialmente em indivíduos assintomáticos, não significa confirmação clínica
da doença e sim um risco aumentado ao desenvolvimento da mesma. Quando
se tem uma mutação identificada, o rastreamento de familiares se torna uma
estratégia muito importante, pois pode incentivar um acompanhamento
adequado dos indivíduos que possuem a mutação além de assegurar aos
familiares que não a possuem, a ausência de risco de desenvolvimento da
doença. Sabe-se inclusive que mutações em genes sarcoméricos estão mais
associados com idade precoce de diagnóstico, hipertrofia acentuada, histórico
de CH e morte súbita na família. Indivíduos portadores de alterações
nesses genes, principalmente quando no contexto de uma família com CH,
seriam candidatos a um controle mais rígido de fatores de risco de
desenvolvimento e progressão da doença, assim como de uma monitorização
médica mais rigorosa. Ainda assim, pacientes portadores de mais de uma alteração
genética, seja no mesmo gene (heterozigose composta) ou em genes
diferentes (duplo heterozigoto) também estão mais propensos a apresentar um
fenótipo clínico mais grave.
       A identificação de alterações genéticas patogênicas é um fator que
impacta também na custo-efetividade do processo de rastreamento familiar. O
rastreamento genético de pacientes com CH e seus familiares é a estratégia
mais custo efetiva quando comparada ao rastreamento clínico isolado, uma vez
que passam a ser seguidos de forma mais próxima apenas os indivíduos com mutação
confirmada, diminuindo gastos com consultas médicas e exames
laboratoriais por parte dos não portadores. Nesse contexto, o Sequenciamento
de Nova Geração (SNG) se apresenta como uma alternativa promissora, pois
permite a análise de conjuntos de genes de forma rápida, objetiva e mais
barata do que o método clássico de sequenciamento, tornando o rastreamento
molecular uma abordagem exequível no cuidado familiar.
REFERENCIAS:

- http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a505cr1820.pdf

- http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5166/tde-29102015-115502/pt-br.php

- http://lvaruzza.com/files/apostila_bioinfo_2.0.1.pdf

- http://www.bioqmed.ufrj.br/docentes/textos/next-generation-sequencing-estado-
da-arte/

-Uma introdução a genética molecular humana de Jack J. Pasternak