Estudando o Genoma

Sequenciamento do DNA
Definio: Processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos
que constituem a molcula de DNA) em uma amostra.
Mtodos de sequenciamento:
Um dos mais utilizado o chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como de
terminadores de cadeia ou de Sanger; ele constitui a base da metodologia empregada no
sequenciamento do genoma humano.
Frederick Sanger (Rendcombe, Gloucestershire, 13 de Agosto de
1918) um bioqumico ingls.
Fez Bacharelado em cincias naturais (1939) e doutoramento
em 1943
Sanger descobriu a sequncia completa de aminocidos de
insulina, em 1955, provando que as protenas tm estruturas
definidas
Recebeu o Nobel de Qumica de 1958, por ter determinado a
estrutura molecular da insulina. Conjuntamente com Walter
Gilbert, recebeu novamente o Nobel de Qumica de 1980, por
estudos sobre o DNA.

1977- Tcnica de sequenciamento de DNA -mtodo enzimtico, dideoxi ou de trmino da cadeia
Princpio da tcnica: Sntese enzimtica de uma fita complementar, cujo crescimento
interrompido pela adio de um dideoxinucleotdeo
Sua estratgia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o
ltimo nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da
reao devero tambm portar uma marca que permita detect-los na etapa de anlise.
Resumidamente, o processo realizado a partir de uma cadeia simples (no dupla) do DNA a ser
sequenciado; esta servir de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hlice.
Isto obtido pela desnaturao da molcula nativa .
A reao de sntese se processa em condies inicas e de pH apropriadas, na
presena da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotdeos sob a
forma de 3-desoxinucleotdeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um
deles marcado radioativamente com P ; um dos mais utilizado o dATP P (fig 2a).
Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente
necessrio tambm, a presena na reao, de um pequeno fragmento de DNA sinttico
(XXX) complementar a uma regio conhecida (YYY) na extremidade 3 do DNA molde;
estas caractersticas permitiro sua hibridizao no local mencionado, e fornecero um
ponto de partida para a replicao do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou
primer", quando marcado, poder ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA
recm sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo que ele
executado em quatro reaes separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente
pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de
anlogo, 2, 3-didesoxinucleotdeo trifosfatos (ddNTPs) .

Estes anlogos conhecidos como terminadores quando incorporados cadeia nascente, por
no apresentarem 3OH que permita formar ligao com o prximo dNTP a ser adicionado,
bloquear todo processo. Como todos os nucleotdeos normais (dNTPs) esto presentes, o
alongamento da cadeia prosseguir at que a enzima DNA-polimerase insira um anlogo
(ddNTP). Consequentemente, haver parada imediata da reao de sntese no ponto em que
seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molcula estar marcada com P. Os
fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resduo final conhecido, pois se sabe em que
tubo de reao o anlogo foi adicionado, so separados por tamanho em gel de poliacrilamida
individualmente: um canal de anlise para cada reao. O gel transferido para um suporte
de nitrocelulose (filtro).
Aps auto-radiografia a ordem dos nucleotdeos, na cadeia de DNA recm sintetizada, pode ser
visualizada e obtida diretamente; esta complementar da molcula sequenciada: que serviu
de molde. Levando estas observaes em considerao, possvel conhecer a sequncia de
nucleotdeos do DNA sequenciado de 3para 5 partindo-se da parte inferior para a superior do
gel.
Terminadores de cadeia:
Dideoxinucleotdeos
Nucleotdeos
normais
Terminadores
de cadeia
Se o OH no est presente a sequencia terminada
Misturando com cuidado os dideoxinucleotdeos terminadores podemos determinar a
sequencia do DNA
Azidotimidina (AZT) uma droga usada no tratamento da AIDS.
AZT, tambm chamado zidovudina basorvido pelas clulas aonde convertido em trifosfato. A
transcriptase reversa do HIV prefere o AZT trifosfato do que o nucleotdeo normal (dTTP). Como
o AZT no possui o grupamento 3 -OH, a sntese do DNA pela transcriptase reversa
paradaquando o AZT incorporado na fita crescente. Felizmente, as DNA polimerases das
clulas do hospedeiro preferem o dTTP, assim os efeitos colaterais da droga no so to severos
como seria de se esperar.
A lamivudina, que tambm um anlogo dos
dideoxinucleosdios, sofre fosforilao intracelular,
dando origem ao metablito ativo, trifosfato de
lamivudina, que assim como a zidovudina age
inibindo a atividade da transcriptase reversa.
Mtodo de sequenciamento de Sanger
Reagentes para um sequenciamento:
1) DNA de fita simples (molde a ser sequenciado)
2) Primer (1 s)
3) todos os nucleotdeos normais (dNTPs)
misturados com um ddNTP-terminador de cadeia
4) DNA polimerase
Primer para a
replicao
Fita a ser sequenciada
Preparao de 4 misturas de reao;
cada uma com um nucleotdeo
terminador de cadeia
Separao dos
produtos por
eletroforese
Tentando compreender....sequenciamento de DNA pelo mtodo Sanger
Leitura da sequencia como
bandas complementares
contendo fitas marcadas
Sequenciamento Manual
Gis de sequenciamento
Gel de poliacrilamida
O mtodo pode ser automatizado atravs de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com softs que lm
sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitir executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se
simultaneamente os 4 didesoxinucleotdeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescncia. Como cada reao
(A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um nico
canal do gel de sequenciamento . O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, aps iluminao com um
feixe de laser, identificar os produtos baseado na diferena de comprimento de onda. A luz emitida detectada por
escaneamento do gel e a sequncia deduzida por computador (4c). Variveis mais modernas, consequentemente mais
rpidas e poderosas, incluem a robotizao total do processo com a incluso das etapas de purificao e da reao de
sntese da cadeia do DNA
Evoluo: Anos 80 seqenciador semi-automtico
Substituio das tcnicas de deteco por radioatividade pelo
uso de marcadores fluorescentes
Radioistopos danosos sade, dificuldade de automao
Fluorfos sistema de deteco que permite a leitura automtica das
seqncias
Preparao do gel e aplicao das amostras
Utilizao ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente durante a eletroforese
Corantes fluorescentes reaes no mesmo poo no gel
Procedimento:
O DNA a ser sequenciado preparado como fita
simples
Essa fita misturada com:
1) Uma mistura com todos os nucleotdeos normais
(desoxirribonucleotdeos) em excesso
dATP, dGTP, dTTP e dCTP
2) Uma mistura de todos os dideoxinucleotdeos,
cada um em quantidades limitantes, marcado com
uma cauda fluorescente com diferentes cores:
ddATP, ddGTP, ddTTP e ddCTP
3) DNA polimeraseI
Eletroforese, usando um laser para
ativar os dideoxinucleotideos
fluorescentes e um detector para
distinguir as cores
No final da incubao os fragmentos so separados por
tamanho. A resoluo to boa , que a diferena de 1
nucleotdeo suficiente para separar um fragmento do
outro. Cada um dos ddNTPs fluoresce uma cor
diferente quando iluminado por um laser e um scanner
automatico faz a impresso da sequencia
ABI Prism 310 Genetic Analyzer Sequenciador
Automtico de DNA
MegaBACE 1000
Marca: Molecular Dynamics

SEQUENCIAMENTO AUTOMTICO
Seqenciadores automticos avano para a genmica, poucas centenas de pb
Seqenciadores de capilares - duas vezes mais rpidos, completamente automatizados
Associao de capilares preenchidos com gel a um sistema de deteco atravs de fluorescncia
confocal excitada por laser
Imagem obtida aps o seqenciamento de DNA. Cada pico colorido representa um
nucleotdeo na seqncia do DNA.
Um cromatograma da sequencia de DNA. O computador l os picos coloridos como uma das 4
bases, traduzindo apenas quando o sinal forte.
'Y' representa uma base que ambgua tanto existem 2 sinais conflitantes ou no existe
nenhum sinal quando se espera por um. As setas cinza mostram aonde o computador iria
esperar ler uma base. <http://www2.perkin-elmer.com:80/ga/uu0901/770901.html>
Projeto genoma Humano
Objetivos: Identificar os 20.000-25.000 genes do genoma humano do ponto de vista fsico
e funcional
Determinar os 3 bilhes de nucleotdeos do DNA humano
Estocar esta informao em bancos de dados
Melhorar as ferramentas de anlise de dados
Transferir tecnologia
Incio em 0utubro de 1990, trmino em 2003 (13 anos); a expectativa era de 15 anos
Custo 3,8 bilhes de dlares
Fundado em 1990 pelo United States Department of Energy e U.S. National Institutes of Health. Alm dos
USA, o consrcio internacional compreendeu geneticistas do Reino Unido, Frana, Alemanha, Japo, China, e
India.
Site do projeto: http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
Craig Venter (head of Celera Genomics), Ari Patrinos (director of
DOE Human Genome Program and Biological and Environmental
Research Program), and Francis Collins (director, NIH National
Human Genome Research Institute).
Impactos na medicina
Diagnstico gentico
Testes com base no DNA esto entre as primeiras aplicaes comerciais das novas descobertas genticas
Podem ser usados para diagnosticar e confirmar doenas, at mesmo em indivduos assintomticos; prover
um prognstico sobre o curso da doena; e , com variados graus de acurcia, predizer o risco de doenas
futuras em indivduos saudveis ou de seus filhos
Testes Genticos no mercado ex. Distrofia muscular miotnica e de Duchenne. Fibrose cstica,
neurofibromatose do tipo1, doena de Huntington
Limitaes: Os testes podem no detectar todas as mutaes presentes na populao (algumas nem foram
descobertas)
Faltam ainda tratamentos efetivos ou medidas preventivas para diversas doenas
Tomar conhecimento do risco de uma doena futura pode produzir impactos emocionais e psicolgicos
significativos ; Pode por em risco determinados grupos da populao

Myriad Genetics holds the exclusive right to test for cancer-causing mutations on the BRCA1 and
BRCA2 genes.
Read more: http://www.forward.com/articles/112419/#ixzz1b3xaJPD7


Mais de 100,000 pessoas morrem a cada ano dos efeitos adversos a
medicamentos que podem ser benefico aos outros. Outras 2,2 milhes
experimentam srias reaes, enquanto outras no respondem de forma
alguma. Variantes nos genes envolvidos no metabolismo de drogas,
particularmente na famlia multignica do citocromo p450, so o foco de
pesquisas na rea.
Enzimas codificadas por estes genes so responsveis pelo metabolismo da
maioria das drogas usadas hoje, incluindo diversas para o tratatemnto de
doenas psiquitricas, neurolgico e cardiovasculares. A funo da enzima
afeta as respostas dos pacientes a droga e a dose. Avanos futuros iro
permitir o teste rpido do gentipo do paciente e guiar o tratemento para as
drogas mais efetivas (e com menos efeitos colaterais)
Informaes genmicas e tecnologias tambm tornaro o desenvolvimento de novas drogas
mais rpido, barato e mais efetivo. A maioria das drogas de hoje feita com base em 500
alvos moleculares; o conhecimento dos genes envolvidos nas doenas, vias de doenas e
reposta a drogas ir levar a descoberta de milhares de novos alvos.
Outras aplicaes: deteco de patgenos, desenvolvimento de novas fontes de energia
(biocombustveis), monitoramento ambiental, estudos evolutivos, identificao por DNA
(forense), melhoramento gentico de plantas e animais, desenvolvimento de biopesticidas,
novas vacinas,...
Farmacogenmica
Mtodos modernos de sequenciamento -454 (sequenciamento de ltima gerao)
Um novo mtodo de sequenciamento de DNA, usualmente chamado de pirosequenciamento,
foi desenvolvido pela Roche Applied Sciences . Atravs deste mtodo, pode-se sequenciar
genomas de organismos diversos de uma maneira muito mais rpida e barata
Piroseqenciamento tempo real,
seqenciamento por sntese
DNA genmico fragmentado (400-600pb)
DNA convertido fita simples e ligado adaptadores
Faz-se um PCR de emulso
1 bead + 1 DNA por hibridizao com o adaptador
As beads so encapsuladas em vesculas lipdicas
Cada bead contm 107 molculas de DNA idnticas

1 bead + 1 DNA por hibridizao com o adaptador

1.6 million well PicoTiterPlate(TM), which allows for the parallel sequencing of DNA segments
separated in different wells.
The DNA-containing beads are then enriched and loaded onto the
PicoTiterPlate(TM) for a massively parallel sequencing analysis of the attached DNA
fragments
A reao de sequenciamento baseada na deteco do pirofosfato, que formado no processo
de acoplamento de um nucleotdeo a um primer de DNA existente pelaDNA polimerase.
A enzima LUCIFERASE usada para catalizar a hidrlise de uma molcula de pirofosfato em 2 orto-fosfatos
e 1 fton. Existem diversos passos, na qual os 4 nucleotdeos so individualmente ciclados dentro de uma
cmera de fluxo que consiste na PicoTiterPlate(TM) com as beads e uma cmera CCD. Cada etapa de
nucleotdeo separada por uma etapa de lavagem. Este tipo de sequenciamento foi chamado tambm de
sequenciamento por sntese, j que cada adio de um nucleotdeo a uma cadeia de oligonucleotdeos
existente monitorada pela emisso de luz.
Pirossequenciamento
intensidade
Etapa 1: Carregar as beads contendo o DNA
Etapa 2:Injetar os dNTPs, detectar o sinal de luz
Pirossequenciamento
O registro da quantidade de luz emitida em cada ciclo permite o assesso ao numero de
nucleotdeos adicionados por ciclo. 400.000 reaes so gravadas em uma placa 70x70 mm
PicoTiterPlate(TM), resultando em20 a 40 Mb (milhes de bases) de alta qualidade.

O 454 da Roche tem a abilidade de sequenciar 400 a 600 milhes de pares de bases por
corrida com o tamanho de 400-500 pares de bases
http://www.roche-applied-science.com/publications/multimedia/genome_sequencer/flx_multimedia/wbt.htm
Filme:
ION Torrent
O sequenciamento por Chips Semicondutores a nova tecnologia da Life Technologies. Atravs
da deteco da alterao do pH provocada pela liberao de ons hidrognio (H+) durante a
polimerizao do DNA, o sistema Ion Torrent capaz de determinar a sequncia da molcula em
estudo, transformando o sinal qumico em sinal digital. A simplicidade do sistema, que elimina a
necessidade de utilizao de nucleotdeos modificados, de lasers, scanners e cmeras elimina
inmeras etapas propensas a erros e garante uma alta acurcea ao sistema (99,5% no dado
bruto). A tecnologia atual permite a obteno de at 100 M bases de dados em uma nica
corrida e consume no mais de 2 horas no equipamento. O sistema garante ainda uma
cobertura homognea da sequncia em estudo, at mesmo em regies difceis de sequenciar,
como regies ricas em contedo GC e regies de homopolmeros.
Anlise de milhes de pares de bases, requer o use de clusters de computadores rodando em
sistemas operacionais Unix e Linux
Aplicaes
Sequenciamento do genoma completo (sequenciamento de novo e resequenciamento)
Sequenciar o genoma inteiro de um organismos, por exemplo, homens, ces, camundongos, vrus ou
bactrias.
Em junho de 2006, a 454 Life Sciences lanou um porjeto com o Max Planck Institute para Antropologia
Evolutiva, para sequenciar o genoma do homem de Neanderthal. Em setembro de 2008 o genoma
mitocondrial completo do Neandertal estava sequenciado, estabelecendo uma divergncia com os humanos
a 660,000 +/- 140,000 anos, e o genoma completo foi publicado em 2010, usando uma combinao do
454 e Illumina
Mounted Neanderthal skeleton, American Museum of
Natural History
Membros extintos do gnero homo, so
classificados como subespcies dos homens
modernos (Homo sapiens neanderthalensis)
Sequenciamento do transcriptoma
Transcriptoma o conjunto de transcritos de um determinado organismo
Compreende o conjunto de todas as molculas de RNA incluindo o RNAm, RNAt, RNAr e todos
os RNAs no codificadores produzidos por uma ou uma populao de clulas
Pode variar com as condies ambientais (ao contrrio do nosso genoma)
Como inclui todos os mRNAs transcritos na clula, o transcriptoma reflete os genes que esto
sendo expressos em qualquer momento, com excesso do mRNA que ser degradado
(atenuao transcricional)
Estudar o transcriptoma nos permite descobrir novos genes, novas variantes (mutaes), SNPs
(polimorfismos de 1 nico nucleotdeo)etc

Metagenmica
o estudo dos metagenomas,
material gentico recuperado
diretamente de amostras
ambientais
Mtodo independente de cultivo
O sequenciamento de amostras
de DNA ambiental (geralemnte do
gene do rRNA 16S) produz um
perfil da diversidade microbiana
presente na amostra