Biologia Celular e Molecular – (Junquera; Carneiro)

Capítulo 2

Estudo morfológico imediato das células: estuda-se células vivas a fresco

(sem coloraçã o) ou com coloraçã o vital.
Estudo morfológico mediato das células: estudam-se as células mortas e em
laminas permanentes através da seguinte ordem: fixaçã o, inclusã o, microtomia,
coloraçã o e montagem.
Lâminas fixadas: Um preparado permanente ideal deveria mostrar as células
com a mesma estrutura microscó pica e composiçã o química que possuíam quando
vivas, mas isso nã o é possível devido aos procedimentos que devem ser seguidos
para a preparaçã o da lâ mina.
1º Procedimento: Fixação: possui como finalidade evitar a autó lise
(destruiçã o da célula por suas pró prias enzimas), impedir a atividade e
proliferaçã o de bactérias, endurecer as células para uma melhor resistência aos
outros procedimentos e aumentar a afinidade das estruturas pelos corantes
utilizados.
Os fixadores utilizados costumam apresentar além das qualidades desejá veis
uma série de deficiências e por isso sã o utilizados em conjunto para que o dano à
célula seja o menor possível. Alguns dos químicos mais utilizados sã o o formol,
glutaraldeido e o tetró xido de ó smio, e os físicos podem ser através do calor,
dessecaçã o e congelamento.
2º Procedimento: Inclusão: possui como funçã o envolver e penetrar o
fragmento bioló gico endurecendo-o e facilitando o corte.
3º Procedimento: Microtomia: para a observaçã o das células é necessá rio
que nela se faça uma série de cortes. Para isso, apó s ser incluída em parafina ou
resinas plá sticas, devem ser levadas a um aparelho chamado micró tomo, que
efetuará cortes de 1 a 6 micrometros de espessura.
4º Procedimento: Coloração: pelo fato de a maioria das organelas celulares
serem transparentes deve haver uma prévia coloraçã o da célula antes do término
da lamina para que se possa distinguir componentes celulares com índice de
refraçã o muito pró ximos. Para isso devem-se usar corantes á cidos para a coloraçã o
de estruturas acidó filas (ricas em agrupamentos bá sicos que possuem afinidade
com corantes á cidos) e corantes bá sicos para estruturas basó filas (ricas em
agrupamentos á cidos que possuem afinidade com corantes bá sicos).
5º Procedimento: Montagem: possui como funçã o encerrar o corte entre a
lamina e a lamínula a fim de obter uma preparaçã o permanente e transparente.
Microscópio ótico: composto por uma parte mecâ nica (suporte) e uma parte
ó tica (três sistemas de lentes: condensador, objetiva e ocular). O condensador
possui como finalidade projetar um cone de luz no material examinado, a objetiva
efetua o aumento a imagem e projeta-a na ocular que por sua vez aumenta-a
novamente e leva a imagem a nossa retina.
A capacidade de separar detalhes no microscó pio é chamada de poder de
resoluçã o e por sua vez o poder de resoluçã o é expresso pelo limite de resoluçã o
que é a menor distancia que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam
individualizados.
Concluímos assim que quanto menor o poder de resoluçã o de um M.O. melhor
será sua reproduçã já que menor será a distancia que dois pontos deverã o ter para
que sejam exatamente dois pontos e nã o um só .
O limite de resoluçã o depende exclusivamente da objetiva, da abertura
numérica da mesma e do comprimento de onda da luz utilizada segundo a seguinte
equaçã o:
k .γ
LR=
AN
Onde k é uma constante de valor entre 0,5 e 0,61 e NA é a abertura
numérica da objetiva.
Microscópio de polarização: é parecido com o microscó pio ó tico com a ú nica
diferença de possuir dois prismas polares, um polarizador e um analisador. Sã o
observadas nesse microscó pio apenas as estruturas celulares chamadas
anisotró picas ou birrefringentes que dividem o feixe polarizado em dois, sendo o
primeiro absorvido pelo analisador e o segundo pela ocular. Nas estruturas
isotró picas o ú nico feixe polarizado é diretamente absorvido pelo analisador e nã o
chega à ocular.
Microscópio de Contraste de Fase: possui um sistema ó ptico que transforma
diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade tornando
possível a aná lise de estruturas que nã o seriam visíveis sem o uso do corante. É
empregado principalmente na observaçã o de células vivas sendo de grande
utilidade na observaçã o de células cultivadas, pois permite o acompanhamento do
crescimento sem empregos de corantes que poderiam matar as células.
Microscópio Confocal: neste microscó pio a imagem é formada por um
delgado feixe de raios laser que varre o corte iluminando apenas um determinado
plano da célula resolvendo o problema do microscó pio ó ptico comum que causa
borrõ es nos planos da célula que nã o estã o sendo observados (botã o micrométrico
acionado). A imagem obtida dos diversos planos pode ser salva e depois utilizada
para a criaçã o de uma imagem tridimensional, cá lculos de comprimento, á rea e
volume.
Microscópio Eletrônico: ao invés de feixes de luz ou a laser aqui sã o
utilizados feixes de elétrons retirados de um filamento e tungstênio – o cá todo – e
sã o acelerados devido á diferença de potencial entre o cá todo e o â nodo – placa
perfurada no centro. O feixe de elétrons passa por uma bobina condensadora que o
dirige diretamente para o objeto. Em seguida passam por outra bobina que
corresponderia à objetiva do microscó pio ó tico. Por fim a terceira bobina projeta
os elétrons sobre uma tela fluorescente para a observaçã o.
O trajeto dos elétrons deve ser feito no vá cuo para que nã o haja choque entre
eles e os á tomos do ar. Devido a essa condiçã o todos os materiais observados
devem estar mortos e fixados. A preparaçã o destas lâ minas de fixaçã o é mais
complexa que nos outros microscó pios.
Em primeiro lugar efetuam-se cortes em um micró tomo especial devido á
finura do corte a ser obtido. Em seguida desidrata-se o material e leva-o a uma
coloraçã o com glutaraldeido, passando depois pelo tetró xido de ó smio sendo
possível também um tratamento com outros metais para o aumento do contraste.
A utilizaçã o de metais para o contraste é conhecida como coloraçã o positiva.
A coloraçã o negativa se dá pela utilizaçã o de corantes que desciam elétrons
sendo que a figura aparece clara envolta por uma capa escura eletrodensa que no
caso seria o corante depositado.
Há também a técnica de sombreamento onde um metal (geralmente ouro,
cromo ou urâ nio) é pulverizado no material segundo certo â ngulo e o formato do
material aparece em relevo no plano.
 Microscópio eletrônico de varredura: a grande vantagem do microscó pio
eletrô nico de varredura para o de transmissã o é o fato de nã o haver a necessidade
de se efetuar cortes sendo um material de 1 cm perfeitamente analisado se inteiro.
Deve também ser dissecado e fixado devido à presença do feixe de elétrons e
consequentemente do vá cuo. As imagens nã o sã o mais obtidas em filme fotográ fico
ou projeçã o e sim pelo computador. O poder de resoluçã o nã o é tã o grande quanto
o de transmissã o, logo a imagem obtida é pior.

Citoquímica: estuda a localizaçã o intracelular das substancias. Para a fixaçã o

da lâ mina utiliza-se um aparelho chamado histofotô metro ou citofotô metro que
permite determinar a intensidade da cor produzida dosando a quantidade de
matéria utilizada. Para cada substancia que se quer observar há um procedimento
diferente de preparo.
o DNA: reaçã o de Feulgen. A técnica consiste no mergulho da lâ mina em
uma soluçã o aquecida de HCl o que causa a hidró lise da bases pú ricas
mantendo as extremidades de radicais aldeídicos livres para se
combinar com o reativo de Schiff que será tratado o material na
segunda etapa. O reativo de Schiff ao se combinas com as extremidades
do DNA dá uma coloraçã o vermelha ao conjunto.
Como se utiliza a técnica do histofotô metro é possível determinar a
quantidade de DNA presente na célula e com isso percebeu-se que essa
quantidade é está vel de espécie para espécie e se duplica na interfase.
o RNA: para a observaçã o há a necessidade do preparo de duas lâ minas.
A primeira é tratada com a enzima ribonuclease que digere o RNA. Em
seguida as duas lâ minas sã o tratadas com um corante bá sico. O RNA
será a estrutura corada que aparecer apenas na lâ mina que nã o foi
tratada com a ribonuclease sendo os outros compostos comuns á s duas
matérias que nã o interessam ao estudo.
o Catecolaminas: sã o tratadas com formaldeído originando um
composto fluorescente. Pode-se assim observar a localizaçã o das
catecolaminas adrenalina e noradrenalina.
o Proteínas: para a preparaçã o da lamina de proteínas há a complicaçã o
de todas as proteínas serem formadas basicamente pelos mesmos
 aminoá cidos. Para isso deve-se utilizar um processo diferente se
tratando de cada uma das proteínas estudadas.
o Polissacarídeos: o procedimento é parecido com o do RNA. Utilizam-
se duas lâ minas sendo a primeira tratada com a enzima alfa-amilase
digerindo o glicogênio. Em seguidas as duas lâ minas sã o tratadas com o
á cido perió dico que oxida o grupo OH formado grupos aldeídos que
reagem com o reativo de Schiff dando uma coloraçã o vermelha à
amostra. Por fim faz-se uma comparaçã o sendo o local do
polissacarídeo apenas a parte na qual nã o está presente na lâ mina
tratada com a enzima.
o Enzimas: em grande parte das vezes para impedir que o fixador inative
a enzima é necessá rio utilizar cortes nã o fixados obtidos por
congelaçã o. Se analisarmos uma enzima como as desidrogenases que
deslocam o hidrogênio de certos compostos devemos incubar os cortes
em uma substancia de tetrazol que reagirá com o hidrogênio deslocado
na regiã o depositando um composto colorido no local indicando assim
a presença da enzima.
Já para a observaçã o das fosfatases á cidas que hidrolisam ésteres do
á cido fosfó rico deve-se mergulhado em uma soluçã o contendo
glicerofosfato de só dio e nitrato de chumbo com pH 5. A enzima
hidrolisa o glicerofosfato formando um precipitado insolú vel e incolor
de fosfato de chumbo. Em seguida o corte é tratado com sulfeto de
amô nia que transforma o precipitado em sulfeto de chumbo, de cor
negra.

Microscopia de fluorescência: permite a observaçã o de compostos com

cará ter fluorescente se excitados com a vitamina B2, A e as porfinas. Pode ser
utilizada também com compostos que nã o possuem cará ter fluorescente sendo
necessá ria para isso a utilizaçã o de corantes fluorescentes. Sua principal aplicaçã o
é na imunocitoquímica.
Imunocitoquímica: permite o estudo da localizaçã o intracelular exata de
proteínas específicas. Sã o de dois tipos:
 Imunocitoquímica direta: obtêm uma proteína X de rato e injeta-se essa
proteína em um coelho, por exemplo. O coelho produzirá anticorpos para a
proteína exó gena. Os anticorpos sã o coletados e marcados (ou com substâ ncias
fluorescentes ou com peroxidase) e em seguida introduzidos novamente no ó rgã o
de onde se conseguiu a proteína X. Os anticorpos marcados atacarã o a proteína e
poderã o ser observados no microscó pio (eletrô nico ou ó ptico, depende do tipo de
marcaçã o) informando assim a localizaçã o da proteína na célula.
Imunocitoquímica indireta: é mais utilizada, pois possui uma sensibilidade
maior demonstrando pequenas quantidades de antígeno. Nessa técnica ao invés de
utilizarmos o anticorpo marcado utilizaremos um anti-anticorpo. Efetua-se o
mesmo processo adquirindo uma proteína X do rato, injetando-a no coelho,
obtendo um anticorpo do coelho à proteína X. Em seguida pega-se o anticorpo do
coelho e injeta-se em uma cabra obtendo assim o anti-anticorpo do coelho. Esse
anti-anticorpo é marcado e introduzido no sistema antígeno-anticorpo formando
assim o sistema antígeno-anticorpo-antianticorpo+marcaçã o. Observa-se assim a
localizaçã o da proteína na célula.
Cromatografia em coluna: técnica de separaçã o de proteínas e á cidos
nucléicos. Baseia-se no fato de que quando se faz uma mistura de proteínas (ou
á cidos nucléicos) dissolvidas em á gua passar por uma matriz só lida e porosa a
velocidade de migraçã o das diferentes proteínas (ou á cidos nucléicos) varia
conforme a interaçã o de cada uma delas com a matriz. Coleta-se cada proteína por
vez.
Antes de iniciar o procedimento, deve-se analisar a afinidade da matriz com a
molécula e utilizar um solvente que interrompa a afinidade que houver. Essa
afinidade pode ser também muito ú til na separaçã o de um composto. Os tipos sã o:
o Interação de troca iônica: a matriz é constituída por partículas
positivas e partículas negativas e a separaçã o das proteínas depende da
carga elétrica na superfície de suas moléculas.
o Interação hidrofobia: as partículas da matriz possuem cará ter
hidrofó bico retardando a passagem das proteínas que também tem
cará ter hidrofó bico.
o Filtração em gel: a matriz atua como peneira na qual as proteínas
menores passam com maior rapidez e as maiores sã o retardadas.
 o Interação por afinidade: se pegarmos uma matriz com características
antígenas as proteínas anticorpos da misturas serã o retardadas e
podem ser obtidas depois das outras para o estudo.

Eletroforese em gel de poliacrilamida: essa técnica é utilizada para a

observaçã o do tamanho das moléculas de proteína. Primeiro elas sã o tratadas com
uma soluçã o extremamente negativa para que se tornem negativas também. Em
seguida suas ligaçõ es S-S sã o rompidas tornando-as com uma forma alonga. Entã o
sã o colocadas no centro de uma substancia em gel com uma extremidade positiva e
outra negativa. A velocidade com que migram para a extremidade positiva (devido
ao seu cará ter negativo) dependerá exclusivamente do seu tamanho sendo as
menores mais rá pidas e as maiores mais lentas.
Uma variá vel do método é a eletroforese bidimensional na qual ocorre em
primeiro lugar a separaçã o das partículas por carga e em seguida uma nova
deposiçã o no gel para que haja a separaçã o por tamanho evitando assim o
aglomerado de mais de uma partícula.
Radioautografia: é utilizada para localizar isó topos radioativos
intencionalmente introduzidos nas células para estudo (como por exemplo a
utilizaçã o do H³ em uma cadeia de DNA, as células marcadas com esse isó topo
estavam em divisã o durante o intervalo de tempo analisado). A técnica mais
utilizada em biologia celular é a técnica da emulsã o líquida. Para sua utilizaçã o
deve-se seguir as seguintes etapas:
o Mergulha-se a lâ mina contendo as células radioativas em uma emulsã o
fundida a 45°;
o Remove-se com papel absorvente a emulsã o do verso da lamina e
deixa-se secar à temperatura ambiente;
o Colocam-se os preparados em caixas à prova de luz, para o período de
exposiçã o, durante o qual a radiaçã o irá atual sobre a emulsã o;
o Apó s a exposiçã o, revela-se a emulsã o fotográ fica;
o Em seguida as células sã o coradas e observadas ao microscó pio.
Grâ nulos negros de prata metá lica indicarã o a radioatividade.
 Centrifugação: para a separaçã o de organelas através desse método faz-se a
imersã o das células em uma soluçã o de sacarose e em seguida faz-se a ruptura da
membrana plasmá tica para a obtençã o de um homogeneizado. Durante o processo
a maioria das organelas se mantém intacta sendo rompido apenas o Retículo
endoplasmá tico. O isolamento de uma organela através da centrifugaçã o depende
do seu coeficiente de sedimentaçã o, ou seja, do seu tamanho, forma e densidade,
sendo levada em conta também a densidade e viscosidade do líquido que se
encontra.
A técnica mais utilizada é a centrifugaçã o diferencial na qual a velocidade de
centrifugaçã o é gradativamente aumentada. As organelas mais densas sedimentam
primeiro e o sobrenadante de cada centrifugaçã o passa novamente pelo processo
em uma velocidade maior, sendo desse modo as organelas sendo sucessivamente
separadas.
Se a cada centrifugaçã o forem obtidos sedimentados mais de um componente
deve-se solubilizar novamente o precipitado e submetê-lo novamente à
centrifugaçã o. O sobrenadante que permanece apó s a ultima centrifugaçã o é
chamado de porçã o solú vel.
Outro tipo de centrifugaçã o é a centrifugaçã o contragradiente onde o
homogeneizado é colocado sobre um tubo contendo uma substancia com gradiente
de concentraçã o crescente de cima para baixo. A amostra é levada à centrifugaçã o
e cada organela desce até o ponto onde há equilíbrio entre a força centrífuga da
partícula e a concentraçã o do gradiente formando assim faixas diferentes que
depois podem ser separadas.
Estudo de células: para a efetuaçã o do estudo de uma célula viva deve-se
colocá -la em um meio isotô nico para que nã o haja modificaçã o em seu volume e
utilizar um microscó pio de contraste de fase para evitar o uso de corantes ou
utilizar corantes vitais que nã o causam a morte da célula.
Se o interesse é em um estudo mais prolongado costuma-se colocar a célula
em um meio de cultivo que possibilita o estudo dos movimentos celulares, da
mitose, as açã o de diversas substancias sobre as células e da secreçã o pela célula
de produtos que irã o acumular-se no meio de cultura.
Esse cultivo permite o estudo dos movimento celulares, proliferaçã o celular,
digestã o celular, açã o de drogas sobre as células, açã o de produtos de secreçã o
acumulados no meio, carió tipo, obtençã o de vírus, microcirurgia, fertilizaçã o in
vitro, transferência de embriõ es e câ ncer.
O cultivo em frasco deve conter aminoá cidos, glicídios, sais minerais,
vitaminas e fatores de crescimento que sã o proteínas que estimulam a proliferaçã o
e diferenciaçã o das células. As culturas primá rias sã o constituídas pelas células
iniciais dos animais que morrem apó s certo nú mero de mitoses.
Porém algumas células podem sofrer mutaçõ es e se tornar imortais
constituindo as culturas secundá rias. Essas células imortais possuem as mesmas
características das células cancerígenas podendo crescer sem se aderir à parede do
frasco e se reproduzir de forma mais rá pida que as células normais.
Com o avanço no domínio do método de cultivo de células pode-se observar
que certos vírus possuem a capacidade de fazer duas células se fundirem
tornando-se bi ou multinucleadas que no caso de serem de espécies diferentes sã o
conhecidas como heterocá rios. Essas células ao se dividiram tornam-se
mononucleadas novamente, mas com a diferença de conterem os dois tipos de
cromossomos no seu no seu nú cleo.
Protoplastos: células veg8etais sem a parede celular.
Células totipotentes: células com capacidade de voltar ao está gio
embrioná rio e dar origem a qualquer outro tipo de célula. Foram observadas que
as células vegetais sã o totipotentes por estar em cultura e depois de certo nú mero
de divisõ es darem origem a pequenos agregados de células indiferenciadas.