20 - Enzimologia Clínica
20 - Enzimologia Clínica
20 - Enzimologia Clínica
ENZIMAS
Grego en= no
Zyme= levedo
• A maioria possui
estrutura 4ª (associação
de subunidades ou
protomeros)
• A alteração da estrutura
acompanha-se de perda
de atividade -
desnaturação (reversível
ou irreversível)
AS ENZIMAS ACELERAM A VELOCIDADE DAS REAÇÕES
TECIDOS
(metabolismo) PULMÕES CO2
ESPECIFICIDADE
E + S ES E + P
ISOENZIMAS
M M M M B B
CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS NO SANGUE
ENZIMAS ESPECÍFICAS DO PLASMA:
Enzimas envolvidas na coagulação: trombina, etc
Enzimas fibrinolíticas ou precursors: plasminogênio,
etc
ENZIMAS SECRETADAS * :
Lipase, -Amilase, Colinesterase, Fosfatase ácida
Prostática.
ENZIMAS CELULARES * :
LD, AST, ALT, Fosfatase Alcalina, CK, outras
Enzima
Substrato Produto
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
TEMPERATURA
pH
TAMPÃO
CONCENTRAÇÃO DA COENZIMA
EFETORES: INIBIDORES (Hg++, F -,CN-)
ATIVADORES (Mg++, Ca++, Cl-)
CURVA DE CONCENTRAÇÃO
DE SUBSTRATO
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO
Exaustão do substrato
1.0 Perda da linearidade
Substrato deixou de ser
0.8 saturante
( perda da cinética de
Absorbância
0. 2
Diluir
0 amostra
0 5 10 15
tempo (minutos)
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO
- +
Acetilcolina
Acetilcolina
+ - + -
Acetilcolinesterase Acetilcolinesterase
EFEITO DA TEMPERATURA
A manutenção da temperatura durante o processo
enzimático é crítica. Variações de 1C podem gerar erros
no resultado final de 10%.
INFLUÊNCIA DA
TEMPERATURA EM
UMA REAÇÃO
ENZIMÁTICA
EFEITO DO pH
INFLUÊNCIA DO pH SOBRE A ATIVIDADE DA ENZIMA
ACETILCOLINESTERASE
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE COFATORES
Tris
Trietanolamina
X Fosfato pH 7,5
EFEITO DA NATUREZA E CONCENTRAÇÃO
DO TAMPÃO
VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA COM
A CONCENTRAÇÃO DO TAMPÃO DIETANOLAMIONA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO EFETORES
COLORIMÉTRICOS
FAL
p-nitrofenilfosfato p-nitrofenol + fosfato
Hidrólise
O substrato ou produto geram cor
Timolfateleína- FAL
monofosfato Timolfateleína + fosfato
Hidrólise
Amilase
AMIDO Glicose + maltose + dextrinas +
Hidrólise
Amido* não hidrolisado
Creatina
Creatina fosfato + ADP Creatina + ATP
quinase
Hexoquinase
ATP + Glicose Glicose –6-P + ADP
G6P-DH
Glicose –6-P + NADP+ Gluconato-6-P + NADPH + H+
SISTEMAS DE MEDIÇÃO
velocidade decresce
↓ [ ] de substrato:
-inativação
parcial da
enzima,
-inibição por
produto e
deslocamento do
equilíbrio
(reversível)
MÉTODOS DE MONITORAMENTO DAS REAÇÕES
velocidade
constante
MÉTODO PONTO FINAL
MÉTODO DE MÚLTIPLOS PONTOS
(MEDIÇÃO CINÉTICA)
EXEMPLIFICAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DA
ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA
UTILIZANDO-SE O MÉTODO DE PONTO FINAL:
Princípio da reação
Protocolo de reação (Técnica)
mL Branco Teste
Substrato-tampão 0,5 0,5
Soro -- 0,05
Banho-maria a 37C por exatos 30 minutos
NaOH 0,02 Mol/L 5,0 5,0
Soro 0,05 --
Misturar bem e ler em 400 ou 405 nm contra o branco
Condições de ensaio:
ATIVIDADE = AT x 9,99
AP
2. UTILIZAÇÃO DA ABSORTIVIDADE MOLAR
ATIVIDADE = AT x 200
ATIVIDADE = 16 U/L
EXEMPLIFICAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DA
ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA
UTILIZANDO-SE O MÉTODO CINÉTICO:
Princípio da reação:
Protocolo de reação (Técnica)
mL Branco Teste
Substrato-tampão 1,0 1,0
Soro -- 0,01
3. A CALIBRAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO É
ESSENCIAL QUANDO SE UTILIZA A ABSORTIVIDADE
MOLAR PARA O CÁLCULO DA ATIVIDADE,
RESUMO
Fosfatase Ácida
Fosfatase Alcalina
AST/TGO
ALT/TGP
-GT
Amilase
Lipase
CK
LDH
FOSFATASE ÁCIDA
• Maiores concentrações: próstata, no fígado,
na medula óssea, nos eritrócitos e plaquetas.
• ↑ fração não-prostática:
crianças em fase de
crescimento e patologicamente aumentada em
condições em que existe um
hipermetabolismo ósseo.
• Utilidade diagnóstica:
diagnóstico e monitoramento
da resposta ao tratamento e
monitoramento de metástases,
no CA de próstata.
FOSFATASE ALCALINA
• Citoplasma e mitocôndrias
• Utilidade
Diagnóstica: hepatites virais agudas,
hepatites alcoólicas, metástases hepáticas e
necrose medicamentosas e isquêmicas, e infarto
agudo do miocárdio.
TGP ou ALT
TGP: Transaminase Glutâmico Pirúvica
ALT: Alanina Amino Transferase
L-alanina + -cetoglutarato ALT Piruvato + L-glutamato
PM kD 55-60 54
Miocárdio 1 22 77
PM (kd) 86 86
Elevação acima do
LMR (horas) 3-6 4-6
VR < 4-5 %
IAM 5-8 %
Simplificado e adapatado de: Manual
Vitros. Química Seca. Johnson &
Johnson. CAT nº MP2-48 p.6/10, 1995
Suspeita de Quantificar
IAM CK-MB seriada
MM CK-MM
M B CK-MB Atividade de B (x 2)
Macro CK Macro CK
tipo 2 tipo 1
IgG + BB
MACRO CK = FORMAS MACROMOLECULARES
Enzima t½ (horas) PM
ALT 50 110 000
mix após IAM 12 ----
AST citoplasmática 14 120 000
mitocondrial 6 100 000
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6a ed. Artmed: Porto Alegre, 2014.
HEMOGLOBINA SE LIGA AO OXIGÊNIO
DE FORMA COOPERATIVA
Hb
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6a ed. Artmed: Porto Alegre, 2014.
PROTEÍNAS
ALOSTÉRICAS
Proteína alostérica:
A interação com um
ligante em um sítio
afeta as propriedades
de ligação de outro
sítio na mesma
proteína.
Captação de água
Enzima conversora
Angitensina II
vasoconstrição
Angiotensinogênio Angiotensina I
Renina
Aldosterona
Perfusão renal
Estimulação do Retenção de Na+,
nervo simpático Excreção de K+
Conc. Na+ no
fluido do túbulo
Retenção
distal de água
Um homem de 46 anos deu entrada na emergência 7
horas depois de consumir grande quantidade de
bebida alcoólica falsificada. Não enxergava
claramente e reclamava de dores no abdome e nas costas.
Os resultados laboratoriais foram os seguintes:
pH 7,28 (7,35-7,45)
HCO3- 9 mmol/L (22-26 mmol/L)
pCO2 20 mmHg (35-45 mmHg)
Osmolaridade 465 mmol/Kg (285-295 mmol/Kg)
Metanol 156 mmol/L
VR < 4-5 %
IAM 5-8 %
Uma mulher de 83 anos foi admitida no centro
médico para investigação de dor no peito de início
agudo, mas o diagnóstico permaneceu incerto após
eletrocardiograma. Os resultados abaixo indicam um
provável Infarto Agudo do Miocárdio (IAM)?
1 dia 2 dia 3 dia VR
Suspeita de Quantificar
IAM CK-MB seriada
Ilhotas de Lagerhans
COLELITÍASE
ALCOOLISMO
DOENÇAS METABÓLICAS : principalmente
hiperparatiroidismo, hiperlipidemia
OBSTRUÇÃO DA PAPILA DE VATER
PARASITAS: Ascaris, Echinococus
HEREDITARIEDADE
IDIOPÁTICAS
Segundo ADOLPH, L. e LORENS, R. Diagnóstico das doenças do coração, fígado e pâncreas. Atheneu:S ão Paulo, 1981, p.110.
PANCREATITE
Patologia inflamatória do pâncreas
CAUSAS MECANISMOS
Autodigestão/ataque proteolítico
do pâncreas
PANCREATITE
CAUSAS MECANISMOS
•RADIOLOGIA
•ULTRASSONOGRAFIA
CAUSA (?) :
Hipertrigliceridemia
- Prejuízo do fluxo
circulatório
- Isquemia da
estrutura acinar
0.7
0.6 A x 1 x VT
0.5 = t .d
VA
0.4
0.3 = 18,7.10-3 L. mol-1.cm-1
d = 1 cm
0.2
VT = 2,1 mL e VA = 0,1 mL
0.1
0.0 A = 0.4 - 0.2 = 0.2
0 2 4 6 8 10
tempo (minutos) t = 5 - 3 2
1. Concentração do Substrato
2. pH
3. Tampão
a) concentração do tampão (força iônica)
b) composição do tampão
4. Temperatura
5. Concentração da Coenzima
6. Ativadores
7. Inibidores
Exaustão
1.0 do
substrato
0.8
Absorbância
0.6 linearidade
Período de
0.4 medição da
atividade
0. 2
Lag fase
0
0 5 10 15
tempo (minutos)
= Unidades Internacionais por Litro
HO P OH +
-
ALP O O
Meio alcalino
Mg++ pH 10,3
+
- N + +
O O - N - N
O O O O
4-Nitrofenilfosfato 4-Nitrofenóxido 4-Nitrofenóxido
(incolor) forma benzóide (incolor) forma quinóide (amarelo)
Condições de ensaio
Tampão 2-amino-2-metil-1- Tampão -
propanol 0,84 mol/L, pH
10,09 a 37ºC Substrato = 2,0 mL
Substrato: 4-Nitrofenilfosfato
215 mmol/L
MgCl2 1,5 mmol/L Soro = 0,1 mL = VA
Temperatura: 37ºC
VT = 2,1 mL
Medição
1. Misture o tampão-substrato com a amostra;
2. Registre o aumento na absorbância em 405 nm
por um período de 2 a 5 minutos
3. Calcule a atividade da porção linear
0.8
0.7
Absorbância (405 nm)
0.6
0.5 Velocidade
0.4
0.3 A = 0.4 - 0.2 = 0.2
t 5-3 = 2
0.2
0.1
0.0
0 2 4 6 8 10
tempo (minutos)
A x 1 x VT
= t .d
VA
A A = 0.4 - 0.2 = 0.2
= velocidade da reação
t t 5-3 2
FATOR =
1 x VT
. d VA
Absorbância
Amostra (A-4) 0,273