Location via proxy:   [ UP ]  
[Report a bug]   [Manage cookies]                

20 - Enzimologia Clínica

Fazer download em pdf ou txt
Fazer download em pdf ou txt
Você está na página 1de 137

ENZIMOLOGIA CLÍNICA

ENZIMAS

Grego en= no
Zyme= levedo

Termo introduzido por Friedrich Wilhelm Külne, 1878

Definição: catalizadores proteicos.


Exceção: pequenas moléculas de RNA
ENZIMAS
• ESTRUTURA das
ENZIMAS

• Todas possuem estrutura


1ª, 2ª, 3ª

• A maioria possui
estrutura 4ª (associação
de subunidades ou
protomeros)

• A alteração da estrutura
acompanha-se de perda
de atividade -
desnaturação (reversível
ou irreversível)
AS ENZIMAS ACELERAM A VELOCIDADE DAS REAÇÕES

TECIDOS
(metabolismo) PULMÕES CO2

CO2 + H2O Anidrase carbônica CO2 + H2O


107 vezes mais rápido

H2CO3 H + + HCO3- H2CO3


VANTAGENS DAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES
 NÃO GERAM SUB-PRODUTOS INDESEJÁVEIS

[S] < ENZIMA > [P]

[S] Catalizador químico  [P1]


 [P2]
 [P3]

 ATUAM EM CONDIÇÕES BRANDAS


pH, Temperatura e Pressão = ambiente biológico

 CONTROLAM AS VIAS METABÓLICAS


(REGULAÇÃO DA HOMEOSTASIA CELULAR)
ENZIMAS ALOSTÉRICAS
RETROINIBIÇÃO (“feedback”)
ATIVADORES e INIBIDORES
SÍNTESE CONTROLADA DA ENZIMA
ENZIMAS

ESPECIFICIDADE

 Apenas um substrato ou vários substratos ao mesmo tempo;

 Se deve ao sítio de ligação do substrato: arranjo


tridimensional especial dos aminoácidos
de uma determinada região da molécula,
geralmente complementar à molécula do
substrato, e ideal espacial e eletricamente
para a ligação do mesmo.
 Um segundo sítio, chamado sítio catalítico ou
sítio ativo, pode estar dentro ou estar
próximo do sítio de ligação, e é neste sítio
ativo que ocorre a reação enzimática.
MECANISMO DE AÇÃO DAS ENZIMAS

E + S ES E + P

Proteínas catalisadoras que aumentam a


velocidade das reações sem serem, elas
próprias, alteradas nesse processo
ENZIMAS: Nomenclatura
O nome da enzima é composto por 3 partes:
- Substrato específico
- Tipo de reação catalisada
- Sufixo “ase”

O código numérico da enzima consiste em 4 números separados


por pontos e precedidos pelas letras EC (Enzyme Comission) – Ex.
EC 2.2.8.11
- O 1º número define a classe da enzima;
- Os 2 números seguintes indicam, respectivamente a
subclasse e a sub-subclasse (diferencia a sub-classe de
enzimas que transferem grupos amina da sub-classe que
transfere grupos fosfatos)
- O 4º número é o numero especifico dado a cada enzima
dentro da sua sub-subclasse
ENZIMAS
CLASSIFICAÇÃO em RELAÇÃO às REAÇÕES
QUÍMICAS CATALISADAS
VARIANTES ENZIMÁTICAS

ISOENZIMAS

• Enzimas com estrutura primária (sequência de


AA) diferente, catalisando a mesma reação
(mesma função), codificadas por genes
estruturais diferentes.
• Formas moleculares múltiplas de uma enzima.

Isoenzimas diferentes podem originar-se de tecidos


diferentes, e sua determinação específica pode
fornecer pistas em relação ao sítio da patologia.

Isoenzimas genéticas e não genéticas (isoformas –


modificação pós-transdução)
VARIANTES ENZIMÁTICAS

ISOENZIMAS = Múltiplas formas moleculares


de uma enzima. Todas as formas catalisam a
mesma reação, e podem ser separadas por
métodos físicos químicos e imunológicos.

Exemplo: Creatinina quinase (CK) M


Dímero composto por subunidades

M M M M B B
CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS NO SANGUE
ENZIMAS ESPECÍFICAS DO PLASMA:
Enzimas envolvidas na coagulação: trombina, etc
Enzimas fibrinolíticas ou precursors: plasminogênio,
etc

ENZIMAS SECRETADAS * :
Lipase, -Amilase, Colinesterase, Fosfatase ácida
Prostática.

ENZIMAS CELULARES * :
LD, AST, ALT, Fosfatase Alcalina, CK, outras

* Normalmente estão em concentração muito baixa e não tem papel funcional no


plasma. Aparecem no sangue incidentalmente e tem valor diagnóstico.

Segundo BURTIS, Carl A. e ASHWOOD, Edward R. (ED.) Tietz textbook of


clinical chemistry. 2 ed. Saunders: Philadelphia, 1994p.782.
ENZIMAS PLASMÁTICAS

Fatores que afetam os níveis enzimáticos no


plasma ou no soro

A lesão dos tecidos de origem ou a proliferação


aumentada das células de onde surgem estas
enzimas levarão a um aumento da atividade
dessas enzimas no plasma.
QUANTIFICAÇÃO DAS ENZIMAS

Determinação da quantidade de enzima


ou
Determinação da atividade catalítica?

•A primeira é uma forma de medida mais


sensível e específica;

• A segunda mede a velocidade de reação


catalisada: que é proporcional à quantidade de
enzima.
QUANTIFICAÇÃO DAS ENZIMAS

AS ENZIMAS SÃO QUANTIFICADAS EM TERMOS DE


ATIVIDADE.

ATIVIDADE = SUBSTRATO DESDOBRADO POR TEMPO


UNIDADES DE MEDIDA DA ATIVIDADE

A. UNIDADE INTERNACIONAL (U.I.)


Quantidade de enzima que catalisa a transformação de
1mol de substrato por minuto em condições de ensaio
padronizadas. É usual expressar o resultado nos ensaios de
laboratório no volume de 1 Litro de amostra biológica (soro ou
plasma) produzindo a Unidade Internacional por Litro ou
simplesmente U/L

1 U/L = 1mol [S] x min-1 x L-1


UNIDADES DE MEDIDA DA ATIVIDADE

B. UNIDADE CATALÍTICA (KATAL): utilizada no sistema S.I.

1 katal = 1 Mol [S] x s-1 x L-1

Para os ensaios em clínica o submúltiplo mais utilizado


é o nanokatal.

1 U/L = 16,66 nKat


ou
1 nKat = 0,06 U/L
MEDIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Enzima

Substrato Produto

VELOCIDADE DE REAÇÃO = Consumo de [S] / tempo


= Formação de [P] / tempo

VELOCIDADE DE REAÇÃO  QUANTIDADE DE ENZIMA


FATORES QUE ALTERAM A VELOCIDADE DE
UMA REAÇÃO CATALISADA POR ENZIMA

 CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
 TEMPERATURA
 pH
 TAMPÃO
 CONCENTRAÇÃO DA COENZIMA
 EFETORES: INIBIDORES (Hg++, F -,CN-)
ATIVADORES (Mg++, Ca++, Cl-)

Estes fatores não podem variar durante o processo de


medição da atividade
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

CURVA DE CONCENTRAÇÃO
DE SUBSTRATO
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

Velocidade da reação enzimaticamente catalisada


dependente da concentração enzimática quando há
saturação do substrato
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

Exaustão do substrato
1.0 Perda da linearidade
Substrato deixou de ser
0.8 saturante
( perda da cinética de
Absorbância

0.6 linearidade ordem zero)

0.4 Medida de Atividade

0. 2
Diluir
0 amostra
0 5 10 15
tempo (minutos)
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

INIBIÇÃO POR EXCESSO DE SUBSTRATO

- +
Acetilcolina

Acetilcolina
+ - + -

Acetilcolinesterase Acetilcolinesterase
EFEITO DA TEMPERATURA
A manutenção da temperatura durante o processo
enzimático é crítica. Variações de 1C podem gerar erros
no resultado final de 10%.

INFLUÊNCIA DA
TEMPERATURA EM
UMA REAÇÃO
ENZIMÁTICA
EFEITO DO pH
INFLUÊNCIA DO pH SOBRE A ATIVIDADE DA ENZIMA
ACETILCOLINESTERASE
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE COFATORES

VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA GLUTAMATO DESIDROGENASE COM


CONCENTRAÇÃO DE NADH
EFEITO DA NATUREZA E CONCENTRAÇÃO
DO TAMPÃO

VARIAÇÃO DE ATIVIDADE DA LEUCINA-ARILAMIDASE EM


RELAÇÃO A CONCENTRAÇÃO DE TAMPÃO

 Tris

 Trietanolamina

X Fosfato pH 7,5
EFEITO DA NATUREZA E CONCENTRAÇÃO
DO TAMPÃO
VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA COM
A CONCENTRAÇÃO DO TAMPÃO DIETANOLAMIONA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO EFETORES

ATIVADORES Amilase Cl-


Enzimas que convertem ATP Mg++

INIBIDORES Produto da reação


Drogas
Detergentes
Agentes desnaturantes
VARIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ATPase
COM A CONCENTRAÇÃO DE [ATP-4] E [Mg++]
PROCESSOS DE VISUALIZAÇÃO DE
REAÇÕES ENZIMÁTICAS

COLORIMÉTRICOS

 O substrato ou produto geram cor


 Reação de cor com o substrato ou produto
 Reações acopladas (uso de outras enzimas para produção
de cor)
 O substrato ou produto geram cor
1. Produto formado na reação já é um composto corado
(Ex: Fosfatase alcalina pelo método do paranitrofenol)

FAL
p-nitrofenilfosfato p-nitrofenol + fosfato
Hidrólise
 O substrato ou produto geram cor

2. Produto formado tem que ser transformado em um


composto corado (Ex: Fosfatase alcalina pelo método
de Roy)

Timolfateleína- FAL
monofosfato Timolfateleína + fosfato
Hidrólise

Timolfateleína + Tampão Coloração azul


alcalino
Reação de cor com o substrato ou produto
Determinam a quantidade de substrato não consumido
através de uma reação específica.
Exemplo: Dosagem da Amilase pelo método de
Caraway

Amilase
AMIDO Glicose + maltose + dextrinas +
Hidrólise
Amido* não hidrolisado

Amido * + iodo Complexo azul (dosado fotometricamente)


REAÇÕES NO ULTRA-VIOLETA (UV)
ENSAIOS ENZIMÁTICO ENVOLVENDO
NADH OU NADPH
1. Ensaios utilizando diretamente NADH ou NADPH como
indicador:

Lactato + NAD+ LDH Piruvato + NADH + H+

Exemplo: Dosagem da LDH pelo Método do U.V


+ LDH
Ácido lático + NAD Ácido pirúvico + NADH + H+
↑ da absorção no UV qdo NAD+ é reduzido a NADH
ou

Ácido pirúvico + NADH + H+ LDH Ácido lático + NAD+


↓ da absorção no UV qdo NADH é oxidado a NAD+
ENSAIOS ENZIMÁTICO ENVOLVENDO
NADH OU NADPH

2. Ensaios com reações indicadoras:

Aspartato + -cetoglutarato AST Glutamato + Oxalacatato

Oxalacatato + NADH + H+ Malato Malato + NAD+


desidrogenase
3. Ensaios com reação auxiliar e indicadora dependente de
NADH ou NADPH como indicador:

Creatina
Creatina fosfato + ADP Creatina + ATP
quinase

Hexoquinase
ATP + Glicose Glicose –6-P + ADP

G6P-DH
Glicose –6-P + NADP+ Gluconato-6-P + NADPH + H+
SISTEMAS DE MEDIÇÃO

MÉTODOS DE MONITORAMENTO DAS REAÇÕES

velocidade decresce

↓ [ ] de substrato:
-inativação
parcial da
enzima,
-inibição por
produto e
deslocamento do
equilíbrio
(reversível)
MÉTODOS DE MONITORAMENTO DAS REAÇÕES

velocidade
constante
MÉTODO PONTO FINAL
MÉTODO DE MÚLTIPLOS PONTOS
(MEDIÇÃO CINÉTICA)
EXEMPLIFICAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DA
ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA
UTILIZANDO-SE O MÉTODO DE PONTO FINAL:

Princípio da reação
Protocolo de reação (Técnica)
mL Branco Teste
Substrato-tampão 0,5 0,5
Soro -- 0,05
Banho-maria a 37C por exatos 30 minutos
NaOH 0,02 Mol/L 5,0 5,0
Soro 0,05 --
Misturar bem e ler em 400 ou 405 nm contra o branco
Condições de ensaio:

Substrato: 4-nitrofenilfosfato 5,5 mMol/L


Tampão: glicina/NaOH 50 mMol/L, pH 10,5
Ativador: MgCl2 0,5 mMol/L
Temperatura: 37C
Tempo de incubação: 30 minutos
Monitoração da reação: ponto final
1. UTILIZAÇÃO DO PRODUTO COLORIDO COMO PADRÃO

AS ENZIMAS NÃO TEM PADRÃO, A


CALIBRAÇÃO É REALIZADA COMO O
CROMÓGENO “INDICADOR” DA REAÇÃO

Proposta A: Padrão único

Adicionar a 5,5 mL de NaOH a 0,02 Mol/L um volume


de 0,05 mL de uma solução de 4-nitrofenol a 1 mMol/L.

Concentração de padrão no tubo: C1.V1 = C2.V2

1 mMol/L x 0,05 mL = C2 x 5,55 mL

C2 = 0,0090 ou 9 x 10-3 mMol/L


CÁLCULO:

ATIVIDADE (U/L) = AT x Conc. Padrão x 1 x VT x 1000


AP t VA

Onde: AT = Absorbância do teste


AP = Absorbância do padrão
Conc. Padrão = Concentração do padrão em mMol/L
t = Tempo da reação em minutos
VT = Volume total da mistura de reação em mL
VA = Volume da amostra em mL
1000 = Fator de conversão de mMol/L para Mol/L
No exemplo nós teríamos:

ATIVIDADE = AT x 0,0090 mMol/L x 1 x 5,55 x 1000


AP 30 0,05

Numa hipótese da amostra apresentar Absorbância = 0,080 e


o padrão de 0,169, a atividade desta amostra seria:

ATIVIDADE = 0,08 x 0,0090 mMol/L x 1 x 5,55 x 1000


0,169 30 0,05

ATIVIDADE = 0,08 x 33,3


0,169

ATIVIDADE = 15,7 U/L


1. UTILIZAÇÃO DO PRODUTO COLORIDO COMO PADRÃO

Proposta B: Curva de calibração

Preparar um padrão de 4-nitrofenol na concentração de


0,027 mMol/L e a partir desta solução efetuar as diluições
abaixo:

Tubos Volume de Volume de Volume Atividade Absorbância


padrão NaOH 0,02 Mol/L de padrão
1 1 9 0,0027 10
2 2 8 0,0057 20
3 3 7 0,0081 30
4 6 4 0,0162 600
5 10 0 0,0270 100
Construir o gráfico

ATIVIDADE (U/L) = AT x Conc. Padrão x 1 x VT x 1000


AP t VA

ATIVIDADE = AT x 0,0027 mMol/L x 1 x 5,55 x 1000


AP 30 0,05

ATIVIDADE = AT x 9,99
AP
2. UTILIZAÇÃO DA ABSORTIVIDADE MOLAR

Absortividade molar mais usadas nos ensaios de rotina:

Substância Comprimento de  (l.mMol-1.cm-1)


onda (nm)
NADH ou NAPH 334 6,18
340 6,22 ou 6,3
365 3,42
4-nitrofenol 400 18,8
405 18,7
4-nitroanila 405 9,9
CÁLCULO:

ATIVIDADE (U/L) = AT x 1 x 1 x VT x 1000


X1 t VA

ATIVIDADE = AT x 1 x 1 x 5,55 x 1000


18,7 X 1 30 0,05

ATIVIDADE = AT x 200

ATIVIDADE = 16 U/L
EXEMPLIFICAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DA
ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA
UTILIZANDO-SE O MÉTODO CINÉTICO:

Princípio da reação:
Protocolo de reação (Técnica)
mL Branco Teste
Substrato-tampão 1,0 1,0

Soro -- 0,01

Misturar bem e ler em 405 nm por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10


minutos.
CÁLCULO:

ATIVIDADE (U/L) = A x 1 x VT x 1000


t X1 VA

Onde:  A = Variação na absorbância


 t = Variação no tempo correspondents às
variações de absorbância
 = Absortividade milimolar do 4-nitrofenol em 405
nm (18,7 L.mMol-1.cm-1)
VT = Volume total da mistura de reação em mL
VA = Volume da amostra em mL
1000 = Fator de conversão de mMol/L para Mol/L
Suponha que durante o período de medição foram
encontrados os parâmetros abaixo:
Tempo A (405 nm)  A/ t
0 0,091 -
1 0,174 0,083
2 0,256 0,082
3 0,339 0,083
4 0,422 0,083
5 0,504 0,082
6 0,583 0,079
7 0,653 0,070
8 0,715 0,062
9 0,761 0,046
10 0,802 0,041
ATIVIDADE (U/L) =  A x 1 x VT x 1000
t x1 VA

ATIVIDADE (U/L) = 0,083 x 1 x 1,01 x 1000


18,7 x 1 0,01

ATIVIDADE (U/L) = 448 U/L


RESUMO

1. AS DETERMINAÇÕES ENZIMÁTICAS NÃO POSSUEM


PADRÃO DA ENZIMA EM ENSAIO,

2. VÁRIOS FATORES ALTERAM A MEDIDA DA ATIVIDADE


ENZIMÁTICA
CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO,
TEMPERATURA,
pH,

3. A CALIBRAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO É
ESSENCIAL QUANDO SE UTILIZA A ABSORTIVIDADE
MOLAR PARA O CÁLCULO DA ATIVIDADE,
RESUMO

4. A ACURÁCIA NA MEDIDA DE VOLUMES, EM ESPECIAL A


TOMADA DA AMOSTRA É FUNDAMENTAL PARA
RESULTADOS EXATOS E REPRODUTÍVEIS, e

5. A LIMPEZA DA VIDRARIA É CRÍTICA.


ENZIMAS de DIAGNÓSTICO

Para que o diagnóstico do envolvimento de um órgão


seja feito através de enzimas, deve-se:

•Conhecer a proporção entre as enzimas, que difere de


tecido para tecido;

•Conhecer a cinética do aparecimento e


desaparecimento da enzima no plasma. Enzimas que não
são específicas do plasma são depuradas do plasma em
velocidades variáveis (estabilidade da enzima e captação
pelo sistema retículo-endotelial).
ENZIMAS DE DIAGNÓSTICO
Principais enzimas utilizadas no diagnóstico de doenças são:

Fosfatase Ácida
Fosfatase Alcalina
AST/TGO
ALT/TGP
-GT
Amilase
Lipase
CK
LDH
FOSFATASE ÁCIDA
• Maiores concentrações: próstata, no fígado,
na medula óssea, nos eritrócitos e plaquetas.
• ↑ fração não-prostática:
crianças em fase de
crescimento e patologicamente aumentada em
condições em que existe um
hipermetabolismo ósseo.
• Utilidade diagnóstica:
diagnóstico e monitoramento
da resposta ao tratamento e
monitoramento de metástases,
no CA de próstata.
FOSFATASE ALCALINA

• Maiores concentrações: presente em


praticamente todos os tecidos do organismo,
especialmente nas membranas das células dos
túbulos renais, ossos (superfície dos
osteoblastos), placenta, trato intestinal e fígado.

• Função: transporte de lipídios no intestino e nos


processos de calcificação óssea.
FOSFATASE ALCALINA
• Utilidade Diagnóstica: doenças ósseas que
cursam com aumento da atividade osteoblástica e
na investigação de doenças hepatobiliares.
A resposta hepática a
qualquer tipo de
agressão da árvore biliar
é sintetizar fosfatase
alcalina principalmente
nos canalículos biliares.
•Recém-nascidos, crianças, e especialmente
adolescentes, apresentam valores
significativamente mais elevados do que os
adultos, devido ao crescimento ósseo.
TGO ou AST
TGO: Transaminase Glutâmico Oxalacética
AST: Aspartato Amino Transferase

L-Aspartato + -cetoglutarato AST Glutamato + Oxalacetato

• Maiores concentrações: encontrada em


diversos órgãos e tecidos, incluindo coração,
fígado, músculo esquelético e eritrócitos.

• Citoplasma e mitocôndrias
• Utilidade
Diagnóstica: hepatites virais agudas,
hepatites alcoólicas, metástases hepáticas e
necrose medicamentosas e isquêmicas, e infarto
agudo do miocárdio.
TGP ou ALT
TGP: Transaminase Glutâmico Pirúvica
ALT: Alanina Amino Transferase
L-alanina + -cetoglutarato ALT Piruvato + L-glutamato

• Maiores concentrações: fígado, rim e em pequenas


quantidades no coração e musculatura esquelética.
•Sua origem é predominantemente citoplasmática,
fazendo com que se eleve rapidamente após a lesão
hepática (marcador sensível da função hepática).
• Utilidade Diagnóstica: patologias que levam a necrose
do hepatócito (hepatites virais, mononucleose,
citomegalovirus e hepatites medicamentosas).
AMILASE
• Maiores concentrações: pâncreas e
glândulas salivares.
• Função: catalisar a hidrólise da
amilopectina, da amilose e do glicogênio.
• Utilidade Diagnóstica: doenças do
pâncreas e investigação da função
pancreática.
•A amilase é uma das poucas enzimas
pequena o bastante para ser filtrada e
eliminada pelos rins.
AMILASE
Na pancreatite aguda,
cerca de 20% dos
casos podem cursar
com valores normais
de amilase (dosagem
concomitante dos
níveis de lipase). Aumento da amilase
(causas não-
pancreáticas) :
lesões inflamatórias
das glândulas
salivares (parotidite),
trauma pancreático
LIPASE
• Maiores concentrações: pâncreas.
•Função: hidrólise das longas cadeias de
triglicerídeos no intestino delgado.

• Utilidade Diagnóstica: sua avaliação é essencial


no diagnóstico das patologias pancreáticas. Seus
níveis estão aumentados em pacientes com
pancreatite aguda e recorrente, abscesso ou
pseudocisto pancreático, trauma, carcinoma de
pâncreas, obstrução dos ductos pancreáticos.
CAUSAS DE ELEVAÇÃO DA AMILASE E LIPASE
AMILASE ELEVADA LIPASE ELEVADA
- Patologias pancreáticas - Pancreatite
• pancreatite - IR
• traumas - Drogas (opiáceos)
• carcinomas
- Patologias não pancreáticas
• IR NÍVEIS NÃO ELEVADOS
• Lesão das glândulas salivares - Úlcera gástrica ou duodenal
(parotidite) - Obstrução intestinal
• Macroamilasemia - Lesão das glândulas salivares
• Patologias biliares 
• Patologias intra-abdominais Elevações de lipase mais
(úlcera duodenal, obstrução específicas para patologi-
intestinal,peritonite,apendicite) as pancreáticas que eleva-
• Queimaduras ções de amilase
• Cetoacidose diabética
• Drogas(opiáceos)
CAUSAS EXTRAPANCREÁTICAS DE
AUMENTO DA AMILASE E LIPASE

VALORES ELEVADOS NO SORO


CAUSAS
AMILASE LIPASE
Acidose diabética + -
Gravidez extra-uterina + -
Insuficiência renal + +
Macroamilasemia + -
Opiáceos + +
Parotidite + -
AMILASE x LIPASE
O uso combinado da avaliação sérica da lipase e
de amilase permite um melhor diagnóstico.

• Cerca de 20% dos casos de pancreatite


aguda cursam com níveis de amilase normais
e com a lipase isoladamente elevada.

• Nas parotidites agudas, em que a amilase


pode se apresentar elevada, os níveis séricos
de lípase não se alteram, auxiliando no
diagnóstico diferencial.
Lípase é marcador mais específico de doença
pancreática aguda que amilase.
ENZIMAS PANCREÁTICAS

CARACTERÍSTICAS AMILASE LIPASE

PM kD 55-60 54

Função Hidrólise do amido Hidrólise de


e glicogênio triglicerídeos

Elevação acima do 2-12 4-8


LRM (horas)

Pico (horas) 12-72 24

Retorno ao normal 3-4 8-14


(dias)

Elevação (LMTX) 4-6 2-50


CPK ou CK
Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase

• Maiores concentrações: vasta distribuição tissular, está


principalmente na musculatura estriada, no tecido
cardíaco e no cérebro.

• São encontradas no citosol ou associadas com


estruturas miofibrilares, e são liberadas no sangue após
dano ao tecido.

• Utilidade Diagnóstica: lesões da musculatura


esquelética e infarto agudo do miocárdio.

3 isoformas = CK-1 (CK-BB)


CK-2 (CK-MB)
CK-3 (CK-MM)
CPK ou CK
Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase
TECIDO CK-BB/CK-1 CK-MB/CK-2 CK-MM/CK-3
% % %
Músculo esquelético 0 1 99

Miocárdio 1 22 77

Cérebro 97-98 2a3 0

Estômago, íleo e cólon 96 0 4


Distrofia muscular
AVC, Infarto, de Duchenne,
tumor miosites, traumas
miocardite musculares,
no injeções
cérebro intramusculares
recentes
CPK ou CK
Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase

• Seus níveis séricos podem estar diminuídos em


situações nas quais ocorra perda de massa
muscular.

•O valor de referência para a CK total é bastante


ampla, variando com idade, estatura, atividade
física e volume da massa muscular.
CPK ou CK
CK e CK-MB
CARACTERÍSTICA CK CKMB

PM (kd) 86 86

Elevação acima do
LMR (horas) 3-6 4-6

Pico (horas) 24-36 24

Retorno ao normal (dias) 3-4 2-3

Elevação ( x LMR) 7-12 10-20


Atividade enzimática
(quantas vezes de aumento em relação limite normal)

Dias após dor no peito


PERFIL DE ELEVAÇÃO DAS ENZIMAS CARDÍACAS
PERFIL DE ELEVAÇÃO DOS MARCADORES
CARDÍACOS
PERFIL DE ELEVAÇÃO DOS MARCADORES
CARDÍACOS
PERFIL DE ELEVAÇÃO DOS MARCADORES
CARDÍACOS ANTES E APÓS REPERFUSÃO
MB
(Medição Enzimática = U/L)

Associar à CK-total CK-MB (U/L)


= X 100
(Calcular relação com CK-MB) CK-total (U/L)

VR < 4-5 %
IAM 5-8 %
Simplificado e adapatado de: Manual
Vitros. Química Seca. Johnson &
Johnson. CAT nº MP2-48 p.6/10, 1995

Suspeita de Quantificar
IAM CK-MB seriada

CK-MB não Negativo p/ IAM


 limite superior
sim
% CK-MB
CK total Sugestivo de
> 4% e < 25% > 25% macro CK ou
Perfil de elevação e queda CK-BB
Possível IAM
Anticorpo anti-M

MM CK-MM

M B CK-MB Atividade de B (x 2)

CK-BB B B ASSUMIR QUE NÃO ESTÁ


PRESENTE NO SORO
PERFIL ELETROFORÉTICO DAS
- ISOENZIMAS DA CK
+

CK-Mt CKMM CKMB CKBB

Macro CK Macro CK
tipo 2 tipo 1
IgG + BB
MACRO CK = FORMAS MACROMOLECULARES

Ocorrem em 6% dos pacientes hospitalizados

MACRO CK TIPO 1 MACRO CK TIPO 2


- Complexo de CKBB+ IgG - Polímero de CK-Mt
- Ocorre em mulheres, >50a - Ocorre em adultos e crianças
- Associada a patologias GI, ade- - Associada a patologias malignas ou
noma ou carcinoma, patologias hepáticas, e patologias do miocárdio
vasculares e do miocárdio
- Associada a elevada mortalidade
- Pode causar diagnóstico falso- - Pode interferir nos métodos de
positivo de IAM: mobilidade ele- imunoinibição
troforética próxima à CKMB; re-
sultados falsamente elevados pa-
ra CKMB nos métodos de imuno-
inibição
LDH ou DHL
Lactato Desidrogenase ou Desidrogenase lática
• Maiores concentrações: vasta distribuição tissular,
concentrando-se no miocárdio, rim, fígado, hemácias e
músculo.
• Utilidade Diagnóstica: seus valores encontram-se
elevados em todas as situações em que ocorre grande
destruição celular.
(Anemia hemolítica,
infarto agudo do
5 isoformas = HHHH (LDH1), miocárdio, infarto
HHHM (LDH2), pulmonar, doenças
HHMM (LDH3), musculares, lesões
HMMM (LDH4), hepáticas, neoplasias
primárias ou secundárias
MMMM (LDH5). (metastásicas), hepatites)
LDH ou DHL

Isoenzimas da lactato desidrogenase


2 cadeias O conteúdo da isoenzima LDH varia por
polipeptídicas tecido. A figura mostra as formas específicas
diferentes de LDH em tecidos adultos de rato.
H: heart / M: muscle
• Predomínio • Predomínio
subunidade H subunidade M
•  LDH1 e LDH2 •  LDH5
• Inversão H2 e H1
BURTIS, Carl A e ASHWOOD, Edward R. Tietz Textbook of
Clinical Chemistry. 3 ed. Saunders: Philadelphia, 1999, p.641.

Enzima t½ (horas) PM
ALT 50 110 000
mix após IAM 12 ----
AST citoplasmática 14 120 000
mitocondrial 6 100 000

LD-1 (cardíaca) 107 135 000


LD
LD-5 (hepática) 10 135 000
RESUMO - DISTRIBUIÇÃO DAS ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA
DIAGNÓSTICA
ENZIMA FONTES PRINCIPAIS PRINCIPAIS APLICAÇÕES CLÍNICAS
ALT/TGP Fígado, músculo Doença hepática parenquimatosa
esquelético, coração
AST/TGO Fígado, músculo Infarto do miocárdio, doença hepática
esquelético, coração, parenquimatosa, doença muscular
rim, hemácias
Fosfatase alcalina Fígado, osso, mucosa Doenças ósseas, doenças
intestinal, placenta, rim hepatobiliares
GGT Fígado, rins Doenças hepatobiliares; alcoolismo

Amilase Glândulas salivares, Doenças pancreáticas


pâncreas, ovários
Lipase Pâncreas; mucosas gástrica, Doenças Pancreáticas
pulmonar e intestinal;
glândulas da língua
CPK (Creatinofosfo Músculo esquelético, Infarto do miocárdio, doenças
quinase) cérebro, coração, musculares
músculo liso
LDH (Lactato Coração,fígado,músculo Infarto do miocárdio, hemólise,
desidrogenase) esquelético, hemácias, doenças do parênquima hepático
plaquetas, linfonodos
RESUMO - DISTRIBUIÇÃO DAS ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA
DIAGNÓSTICA
ENZIMA FONTES PRINCIPAIS PRINCIPAIS APLICAÇÕES CLÍNICAS
Glutamato Fígado Doenças do parênquima hepático
desidrogenase
5’-NT Trato hepatobiliar Doenças hepatobiliares
(5’-
Nucleotidase)
PSA (Prostatic- Próstata Carcinoma de Próstata
specific
antigen)
Fosfatase ácida Próstata, hemácias Carcinoma da próstata

Colinesterase Fígado Envenenamento por inseticida


organofosforado, doenças
hepáticas parenquimatosa
Aldolase Músculo esqulético, Doenças musculares
coração
SDH (Sorbitol Fígado Doenças do parênquima hepático
Desidrogenase)
No início do século passado, James Herrick, médico
de Chicago, relatou a história clínica (Herrick, 1910)
de um paciente negro de 22 anos de idade, que se
apresentava fraco, com tosse, febre e dor de cabeça. Sentia
palpitações e lhe faltava a respiração. Há 3 anos havia
diminuído sua atividade física. Ao exame físico,
apresentava inúmeras cicatrizes na pele, uma cor
amarelada (icterícia) na esclerótica e as membranas
mucosas estavam pálidas. O exame de sangue revelou que
apresentava anemia:

Contagem de glóbulos vermelhos 2,6x106/mL (4,6-6,2x106/mL)


Conteúdo de hemoglobina 8 g/dL (14-18 g/dL )
Contagem de glóbulos brancos 15.250/mL (4.000-10.000/mL)
Presença de reticulócitos
Eritrócitos em forma de foice
ELETROFORESE DAS HEMOGLOBINAS
CONFORMAÇÕES DA HEMOGLOBINA

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6a ed. Artmed: Porto Alegre, 2014.
HEMOGLOBINA SE LIGA AO OXIGÊNIO
DE FORMA COOPERATIVA

Hb

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6a ed. Artmed: Porto Alegre, 2014.
PROTEÍNAS
ALOSTÉRICAS

Proteína alostérica:
A interação com um
ligante em um sítio
afeta as propriedades
de ligação de outro
sítio na mesma
proteína.

NELSON, D. L.; COX, M. M.


Princípios de Bioquímica de Lehninger.
6a ed. Artmed: Porto Alegre, 2014.
ANEMIA FALCIFORME
Entupimento dos vasos:
Micro-infartos

Induzem deformação dos


NELSON, D. L.; COX, M. M.
eritrócitos
Princípios de Bioquímica de Lehninger.
6a ed. Artmed: Porto Alegre, 2014.
Uma mulher de 56 anos de idade foi admitida em
uma unidade de tratamento intensivo. A paciente
apresentava febre baixa por uma semana, leve dor
no peito e dificuldade para respirar há 24 h oras.
Nenhuma anormalidade foi encontrada na radiografia de
tórax ou eletrocardiograma. Os exames laboratoriais
realizados foram:

Contagem de leucócitos 12.100/mm3 (4.000-9.000/mm3)


Contagem de eritrócitos 240x104/mm3 (380-500x104/mm3)
Hemoglobina 8,6 g/dL (11,8-16,0 g/dL )
LDH 1.400 U/L (200-400 U/L)
AST 37 U/L (<40 U/L)
ALT 28 U/L (<56 U/L)
Fosfatase alcalina 57 U/L (<126 U/L)
-GT 24 U/L (<50 U/L)
CASOS QUE ELEVAM A LDH
- Infarto do miocárdio - AVC
- Anemia - Anemia perniciosa
- Hipotensão - Pancreatite
- Mononucleose infecciosa - Infarto pulmonar
- Doença hepática - Derrame cerebral
- Lesão muscular - Hipotireoidismo
- Distrofia muscular - Colagenoses
- Linfomas e outros tipos de - Síndrome nefrótica
câncer
- Isquemia intestinal
(deficiência sanguínea) e
infarto (morte tissular)
ISOENZIMAS DA LDH ou DHL
ISOENZIMAS DA LDH ou DHL
DIAGNÓSTICO: LINFOMA

A LDH é usada para monitorar o tratamento


do câncer, já que a resposta à terapia está
frequentemente refletida no declínio do seu
nível sérico.
Um homem de 50 anos foi internado referindo fadiga
generalizada, rigidez de ombro e dor de cabeça. A
paciente media 1,80 m e pesava 84 Kg. Sua pressão
sanguínea era de 196/98 mmHg. Foi diagnosticado
hipertenso. O paciente foi medicado com captopril, um
inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA).
Depois de 5 dias sua pressão retornou aos níveis normais.
Sede ADH

Captação de água

Enzima conversora
Angitensina II

vasoconstrição
Angiotensinogênio Angiotensina I

Renina
Aldosterona
 Perfusão renal
Estimulação do Retenção de Na+,
nervo simpático Excreção de K+
 Conc. Na+ no
fluido do túbulo
Retenção
distal de água
Um homem de 46 anos deu entrada na emergência 7
horas depois de consumir grande quantidade de
bebida alcoólica falsificada. Não enxergava
claramente e reclamava de dores no abdome e nas costas.
Os resultados laboratoriais foram os seguintes:
pH 7,28 (7,35-7,45)
HCO3- 9 mmol/L (22-26 mmol/L)
pCO2 20 mmHg (35-45 mmHg)
Osmolaridade 465 mmol/Kg (285-295 mmol/Kg)
Metanol 156 mmol/L

Com tratamento intensivo, incluindo infusão venosa de


etanol e bicarbonato, além de hemodiálise, sobreviveu e
recuperou a visão.
Homem de 57 anos foi admitido na unidade
coronariana após 6 horas de dor no centro do peito,
o eletrocardiograma na admissão indicava um
infarto do miocárdio. As determinações enzimáticas
obtidas na admissão e dias subsequentes estão abaixo:

1 dia 2 dia 3 dia 4 dia VR

CK (U/L) 284 3179 937 256 < 190

CK-MB (U/L) 16 197 48 8 < 15

CK-MB % 5,2 6,2 5,1 3,1 < 4-5


ENZIMA INÍCIO PICO ESPECIFICIDADE
ALERAÇÃO IAM

CK total 4-8 hs 20-24 hs Não

CK-MB 4-8 hs 24 hs Parcialmente


MB
(Medição Enzimática = U/L)

Associar à CK-total CK-MB (U/L)


= X 100
(Calcular relação com CK-MB) CK-total (U/L)

VR < 4-5 %
IAM 5-8 %
Uma mulher de 83 anos foi admitida no centro
médico para investigação de dor no peito de início
agudo, mas o diagnóstico permaneceu incerto após
eletrocardiograma. Os resultados abaixo indicam um
provável Infarto Agudo do Miocárdio (IAM)?
1 dia 2 dia 3 dia VR

CK (U/L) 469 479 400 < 190

CK-MB (U/L) 355 348 328 < 15

CK-MB % 76 73 82 < 4-5

LDH (U/L) 173 173 147 < 200


Atividade enzimática
(quantas vezes de aumento em relação limite normal)

Dias após dor no peito


PERFIL DE ELEVAÇÃO DAS ENZIMAS CARDÍACAS
1 dia 2 dia 3 dia VR

CK (U/L) 469 479 400 < 190

CK-MB (U/L) 355 348 328 < 15

CK-MB % 76 73 82 < 4-5

LDH (U/L) 173 173 147 < 200


Simplificado e adapatado de: Manual
Vitros. Química Seca. Johnson &
Johnson. CAT nº MP2-48 p.6/10, 1995

Suspeita de Quantificar
IAM CK-MB seriada

CK-MB não Negativo p/ IAM


 limite superior
sim
% CK-MB
CK total Sugestivo de
> 4% e < 25% > 25% macro CK ou
Perfil de elevação e queda CK-BB
Possível IAM
Uma mulher de 41 anos foi internada com dor
abdominal central aguda, a qual foi precedida de várias
crises de cólica do tipo biliar.

Plasma/dias (1) (2) (3) VR


AMS (U/L) 1360 300 65 < 70
LPS (U/L) 530 1290 310 < 190
tCálcio (mg/dL) 7,64 8,28 8,48 8,3 a 10,2
Albumina (g/dL) 4,4 -- 4,2 3,5 - 5,0

1) qual diagnóstico pode ser presumido dos dados


laboratoriais?
Duodeno Glândulas exócrinas Veia Pancreática

Ilhotas de Lagerhans

Atualidades Diagnósticas - Boehringer Mannheim , 1983


Veia Porta - Fígado
B. CAUSAS DE PANCREATITE RECORRENTE
(AGUDA OU CRÔNICA)

 COLELITÍASE
 ALCOOLISMO
 DOENÇAS METABÓLICAS : principalmente
hiperparatiroidismo, hiperlipidemia
 OBSTRUÇÃO DA PAPILA DE VATER
 PARASITAS: Ascaris, Echinococus
 HEREDITARIEDADE
 IDIOPÁTICAS

Segundo ADOLPH, L. e LORENS, R. Diagnóstico das doenças do coração, fígado e pâncreas. Atheneu:S ão Paulo, 1981, p.110.
PANCREATITE
Patologia inflamatória do pâncreas

Sintomas: Dor abdominal severa, náuseas, vômitos e febre

CAUSAS MECANISMOS

Obstrução do ducto pancreático, Retenção de secreções pancreáticas


ducto biliar, ampola de Vater
por cálculos ou carcinoma
Conversão de pro-enzimas à
enzimas ativas

Autodigestão/ataque proteolítico
do pâncreas
PANCREATITE

CAUSAS MECANISMOS

• Ingestão excessiva de álcool • Álcool aumenta a secreção


pancreática

• Hiperlipidemia • Ácidos graxos livres são


tóxicos à membrana das
células acinares

• Drogas (tetraciclina, diuréticos


tiazídicos, ácido valpróico)
• Cirurgias abdominais • Obstrução parcial do ducto
• Traumas pancreático
• Infecções
• Idiopática
DIAGNÓSTICO DA PANCREATITE

•HISTÓRIA CLÍNICA + EXAME FÍSICO

•RADIOLOGIA

•ULTRASSONOGRAFIA

•EXAMES LABORATORIAIS: AMILASE


LIPASE
HIPOCALCEMIA NA PANCREATITE
AGUDA

OCORRÊNCIA :  50% dos casos , raramente com mani-


festações clínicas

CAUSA (?) :

A) Formação de sais de B) Membranas celulares


cálcio com ácidos gra- lesadas permitem maior
xos livres influxo de cálcio nas
células
Perfil enzimático e história clínica
compatíveis com pancreatite aguda
Características:
1) a elevação da amilase quando > 10 xLM sugere muito
fortemente o diagnóstico. Neste paciente a amilase
apresenta sua cinética clássica: elevação máxima em 12
a 24 h e retorno ao normal em 72 h.
2) A lipase é mais específica que a amilase para doença
pancreática e permanece elevada por mais tempo.
3) A hipocalcemia é observada em ~50% dos casos de
pancreatite aguda, raramente com manifestações
clínicas e persiste por aprox. 1-5 dias (até 10 dias).
Principais causas: cálculos biliares (este paciente
apresenta cálculo no ducto biliar comum) ou álcool.
Uma mulher de 28 anos apresentou-se com dor
abdominal aguda. Ela já havia apresentado
quadro clínico similar várias vezes após os 16 anos. O
laboratório observou um soro muito lipêmico e realizou
as dosagens abaixo:

Amilase 1.085 U/L (< 70)


Colesterol 1.143 mg/dL (< 200)
Triglicérides 9.200 mg/dL (<200)

Qual a possível causa de elevação da amilase ?


Pancreatite: causas

Hipertrigliceridemia

1,3 - 11,0% TRI>1000 mg/dL

Associação da pancreatite com hipertrigliceridemia


12 – 39%
Patogênese da pancreatite induzida por
hipertrigliceridemia
Patogênese da pancreatite induzida por
hipertrigliceridemia

Ácidos graxos livres


pró-inflamatórios

Obstrução capilar: Lipases pancreáticas

- Prejuízo do fluxo
circulatório
- Isquemia da
estrutura acinar

Exposição dos Q às Células acinares


lipases pancreáticas
Calcule a atividade da Fosfatase alcalina com
base nos dados abaixo:
Tampão - Substrato = 2,0 mL Amostra = 0,1 mL
0.8
Absorbância (405 nm)

0.7
0.6 A x 1 x VT
0.5 = t .d
VA
0.4
0.3 = 18,7.10-3 L.  mol-1.cm-1
d = 1 cm
0.2
VT = 2,1 mL e VA = 0,1 mL
0.1
0.0 A = 0.4 - 0.2 = 0.2
0 2 4 6 8 10
tempo (minutos) t = 5 - 3 2
1. Concentração do Substrato
2. pH
3. Tampão
a) concentração do tampão (força iônica)
b) composição do tampão
4. Temperatura
5. Concentração da Coenzima
6. Ativadores
7. Inibidores
Exaustão
1.0 do
substrato
0.8
Absorbância

0.6 linearidade
Período de
0.4 medição da
atividade
0. 2
Lag fase
0
0 5 10 15
tempo (minutos)
= Unidades Internacionais por Litro

1 U/L = quantidade de enzima que transforma 1 mol


de Substrato por minuto em condições de
ensaio padronizadas (Temperatura; pH;
Tampão; Conc. [S]; força iônica ativadores, etc)

1 U/L = 1 mol[S] . min-1. L-1


Reação -
O
-
O P O
-
O O

HO P OH +
-
ALP O O
Meio alcalino
Mg++ pH 10,3
+
- N + +
O O - N - N
O O O O
4-Nitrofenilfosfato 4-Nitrofenóxido 4-Nitrofenóxido
(incolor) forma benzóide (incolor) forma quinóide (amarelo)
Condições de ensaio
Tampão 2-amino-2-metil-1- Tampão -
propanol 0,84 mol/L, pH
10,09 a 37ºC Substrato = 2,0 mL
Substrato: 4-Nitrofenilfosfato
215 mmol/L
MgCl2 1,5 mmol/L Soro = 0,1 mL = VA
Temperatura: 37ºC
VT = 2,1 mL
Medição
1. Misture o tampão-substrato com a amostra;
2. Registre o aumento na absorbância em 405 nm
por um período de 2 a 5 minutos
3. Calcule a atividade da porção linear
0.8
0.7
Absorbância (405 nm)

0.6
0.5 Velocidade
0.4
0.3 A = 0.4 - 0.2 = 0.2
t 5-3 = 2
0.2
0.1
0.0
0 2 4 6 8 10
tempo (minutos)
A x 1 x VT
= t .d
VA
A A = 0.4 - 0.2 = 0.2
= velocidade da reação
t t 5-3 2

FATOR =
1 x VT
 . d VA

 = absortividade molar (mol/L) =


18,7.10-3 L.  mol-1.cm-1
d = caminho ótico (cm)= 1 cm
VT = 2,1 mL e VA = 0,1 mL
A x 1 x VT
= t .d
VA
FATOR = 1 x 2,1 = 1123
18,7.10-3 . 1 0,1
A = 0,2 X 1123
= 112 U/L
t= 2
Portanto esta amostra contem uma quantidade da
enzima Fosfatase Alcalina, a qual nas condições de
ensaio (Temperatura, pH, Tampão, conc [S], conc
ativador) desdobra 112 moles de 4-nitrofenilfosfato
por minuto por Litro de soro
U/L = A x
1 VT x 1000
x
t  . d VA
ENZIMAS - 1
d = 1,0 cm; T = 37ºC
Calcule a atividade as  = 6,3 L.mmol-1.cm-1
amostras abaixo e
Tampão - substrato: 2,5 mL
discuta os resultados
Amostra = 0,1 mL
Substrato + NADH - E--- Produto + NAD+ + H+
Tempo (min.) A-1 A-2 A-3 CTRL (240 – 290)
0 1,320 0,800 0,630 1,200
1 1,300 0,650 0,685 1,100
2 1,250 0,550 0,740 1,035
3 1,201 0,520 0,795 0,972
4 1,150 0,502 0,850 0,907
5 1,100 0,492 0,905 0,843
concP 1
U/L = AT x x x VT x 1000
ENZIMAS –2 AP t VA
(método de ponto final)
Calcule a atividade Tempo = 10 min
enzimática e discuta os Tampão-substrato = 1,5 mL
resultados Amostra = 0,1 mL
T = 37ºC
Substrato-cromógeno < ---E-- > Produto + cor

Absorbância
Amostra (A-4) 0,273

CTRL (550 – 650 U/L) 0,675

Padrão (0,5 mmol/L) 1,233

Você também pode gostar