Zebrafish

UNIVERSIDADE PAULISTA
ESTUDOS DO MICROPLÁSTICO EM
MODELO EXPERIMENTAL DE ZEBRAFISH:
COMPORTAMENTO E ENCÉFALO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia Ambiental e
Experimental da Universidade Paulista – UNIP,
para a obtenção do título de Mestre em
Patologia Ambiental e Experimental.
ALEX LUCIANO FERNANDES
SÃO PAULO
2022
ESTUDOS DO MICROPLÁSTICO EM MODELO EXPERIMENTAL

DE ZEBRAFISH: COMPORTAMENTO E ENCÉFALO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto

Sensu em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista para a obtenção do título de Mestre em Patologia
Ambiental e Experimental
Orientador: Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten
Instituição: Programa de Pós-Graduação em Patologia

Ambiental e Experimental, Universidade Paulista - Vice-
Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (VRPPG/UNIP)
Mestrado em Patologia Ambiental e Experimental
Área de concentração: Patologia Ambiental e Experimental
SÃO PAULO
DEZEMBRO / 2022
Fernandes, Alex Luciano.
Estudos do microplástico em modelo experimental de
zebrafish: comportamento e encéfalo / Alex Luciano Fernandes. -
2022.
84 f. : il. color. + CD-ROM.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da
Universidade Paulista, São Paulo, 2022.
Área de concentração: Patologia Ambiental e Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten.
1. Danio rerio. 2. Modelo animal. 3. Plástico. 4. Ecotoxicologia.

5. Poluição ambiental. 6. Neuroinflamação. I. Kirsten, Thiago Berti
(orientador). II. Título.
Ficha elaborada pelo Bibliotecário Rodney Eloy CRB8-6450

ESTUDOS DO MICROPLÁSTICO EM MODELO EXPERIMENTAL

DE ZEBRAFISH: COMPORTAMENTO E ENCÉFALO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto

Sensu em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista para a obtenção do título de Mestre em Patologia
Ambiental e Experimental
Aprovado(a) em: ___/___/_____
Banca Examinadora
Prof (a). Dr.(a) _________________________________________________________

Instituição:_________________________________Julgamento__________________
Prof (a). Dr.(a) _________________________________________________________

Prof (a). Dr.(a) _________________________________________________________

O presente trabalho foi realizado com o apoio financeiro da Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES/PROSUP,
processo número 88887.601969/2021-00), Código de Financiamento 001.
"Chegará o tempo em que o homem conhecerá o íntimo de um animal e nesse
dia todo crime contra um animal será um crime contra a humanidade"
Leonardo da Vinci
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten pela oportunidade, sabedoria, dedicação,
afetuosidade e, sobretudo, pela receptividade que demonstrou desde o nosso primeiro
encontro. Tê-lo como orientador foi uma honra para mim. Muito obrigado!
Ao Prof. Dr. Eduardo Fernandes Bondan, do Programa de Pós-Graduação em
Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista pela confecção e análise das
lâminas de imuno-histoquímica do GFAP correspondente ao meu projeto.
À Profa. Dra. Ivana Barbosa Suffredini pela gentil colaboração nas complexas análises
estatísticas relacionadas às avaliações diárias.
Ao mestrando Daniel Lago, que participou das etapas de análise comportamentais
diárias e coletas de órgãos dos animais para avaliações posteriores.
Ao técnico do laboratório de Anatomia Patológica, Paulo Ailton Vedovato pela
contribuição da parte histológica e processamento do material.
À Amanda Tolosana Mendes Fustinoni, Diretora Comercial da Duster Indústria e
Comércio de Espanadores Ltda., pela gentileza em fornecer os microplásticos da empresa
Braskem S. A.
Ao Wilton Pereira, técnico do Laboratório de Experimentação Animal, pela paciência
e disposição nos momentos em que precisei de suas contribuições.
Agradeço aos demais professores do Programa de Pós-Graduação em Ambiental e
Experimental da UNIP pelos ensinamentos e conhecimentos compartilhados.
Agradeço a Universidade Paulista pela infraestrutura oferecida; desde os setores
administrativos, as estruturas do laboratório e demais áreas para a realização dos
experimentos. Em especial a Vice-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa.
Agradeço a CAPES/PROSUP pela bolsa concedida durante toda a realização do
trabalho.
Agradeço aos colegas da Pós-Graduação pela amizade e companheirismo.
Agradeço aos meus pais, Domingos Fernandes (in memoriam) e Maria Aparecida
Luciano Fernandes (in memoriam) pelo amor, dedicação e por priorizar a educação como base
da nossa formação.
Agradeço a minha esposa, Carla Montuori Fernandes, grande incentivadora e
responsável pelo início da minha vida acadêmica, sempre ao meu lado nos momentos difíceis,
demonstrando o amor que existe entre nós.
Aos peixes que cederam sua vida, para que de maneira respeitosa, pudéssemos realizar
um experimento que agregasse valor à ciência.
RESUMO
FERNANDES, A. L. Estudos do microplástico em modelo experimental de zebrafish:

comportamento e encéfalo. Dissertação (Mestrado em Patologia Ambiental e Experimental) -
Universidade Paulista, São Paulo, 2022. 79 f. Orientação: Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten
O acúmulo de lixo plástico em ambientes naturais é um problema global com impactos

negativos na economia, na vida selvagem e na saúde humana. O microplástico vem sendo
fortemente associado a doenças e morte de diversos tipos de animais aquáticos. Porém, pouco
se sabe sobre os mecanismos que o torna tão danoso. O estudo do microplástico em condições
controladas pode contribuir para um melhor entendimento das consequências da sua
exposição em diferentes níveis da cadeia trófica. Assim, os objetivos deste trabalho foram de
estudar os efeitos da exposição ao microplástico em parâmetros comportamentais e
encefálicos de zebrafish, além de propor um modelo experimental e entender aspectos
neurobiológicos relacionados aos prejuízos. Zebrafish adultos foram expostos aos
microplásticos polietileno (PE) e polipropileno (PP, virgens, ≤ 1,2 mm, 0,1, 1,0 e 10,0 mg/L)
e foram diariamente avaliados por até oito dias quanto a aspectos gerais de saúde, distribuição
espaciais dentro dos aquários, parâmetros comportamentais relacionados à atividade motora,
exploratória e de ansiedade, taxa de letalidade, peso corporal e expressão astrocitária (proteína
glial fibrilar ácida, GFAP) no encéfalo. A exposição por 96h aos microplásticos PE e PP
afetou a distribuição espacial dos zebrafish, bem como seus comportamentos. A reação de
alarme em resposta a um estímulo aversivo externo foi prejudicada após a exposição ao PP:
maior permanência na superfície do aquário, de modo a revelar um comportamento
ansiolítico. O estudo da distribuição espacial do tipo basal confirmou a resposta do tipo
ansiolítica ao PP e revelou efeito contrário, isto é, ansiogênico após a exposição ao PE. O
estudo comportamental corroborou o efeito ansiogênico do PE: maior latência para alcançar a
superfície de um novo aquário. Além disso, ambos os microplásticos PE e PP induziram
movimentos erráticos nos zebrafish. O estudo encefálico revelou que houve aumento da
expressão de GFAP em astrócitos no tronco encefálico de zebrafish após oito dias de
exposição ao PP. Concluindo, as exposições aos microplásticos PE e PP modularam o
comportamento tipo-ansiedade dos zebrafish, associado a processo neuroinflamatório. O
presente trabalho propôs um novo modelo experimental para estudar os efeitos da exposição a
diferentes tipos de microplástico em parâmetros comportamentais e encefálicos de zebrafish.
Palavras-chave: Danio rerio; Modelo animal; Plástico; Ecotoxicologia; Poluição ambiental;

Neuroinflamação.
ABSTRACT
FERNANDES, A. L. Microplastic studies in an experimental zebrafish model: behavior and

brain. Master Dissertation (Environmental and Experimental Pathology) - Paulista University, São
Paulo, 2022. 79 p. Advisor: Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten
Accumulation of plastic waste in natural environments is a global issue with negative

impacts on the economy, wildlife and human health. Microplastics have been strongly
associated with disease and death in different aquatic animals. However, little is known about
its mechanisms. The study about microplastics under controlled conditions contributes to a
better understanding of the consequences of its exposure at different levels of the trophic
chain. Therefore, the objectives of this study were to evaluate the effects of microplastics
exposure on behavioral and brain parameters of zebrafish, in addition to proposing an
experimental model, and understanding neurobiological aspects related to the impairments.
Adult zebrafish were exposed to polyethylene (PE) and polypropylene (PP) microplastics
(virgin, ≤ 1.2 mm, 0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and were evaluated daily for up to eight days for
general aspects of health, spatial distribution within the aquariums, behavioral parameters
related to motor, exploratory, and anxiety activity, lethality rate, body weight, and astrocytic
expression (acid glial fibrillar protein, GFAP) in the brain. PE and PP 96h-exposure affected
the spatial distribution of zebrafish, as well as their behavior. The alarm reaction in response
to an external aversive stimulus was impaired after exposure to PP: more time on the surface
of the aquarium, revealing anxiolytic behavior. The study of the basal spatial distribution
confirmed the anxiolytic response to PP and revealed the opposite effect, i.e., anxiogenic
effect after exposure to PE. The behavioral study corroborated the anxiogenic effect of PE:
greater latency to reach the surface of a novel aquarium. Furthermore, both PE and PP
microplastics induced erratic movements in zebrafish. The brain study revealed an increase in
GFAP expression in astrocytes in the brainstem of zebrafish after eight days of exposure to
PP. In conclusion, exposure to PE and PP microplastics modulated zebrafish anxiety-like
behavior associated with a neuroinflammatory process. The present study proposed a novel
experimental model to evaluate the effects of exposure to different types of microplastics on
behavioral and brain parameters of zebrafish.
Keywords: Danio rerio; Animal model; Plastic; Ecotoxicology; Environment pollution;

Neuroinflammation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Confecção dos microplásticos. Processo de confecção dos dois tipos de microplásticos
(polietileno e polipropileno). (A e B) Plásticos virgens adquiridos em formato de esfera da fabricante
(BRASKEN, Mais Polimeros do Brasil LTDA, Cajamar, São Paulo, Brasil); (C) microplásticos
confeccionados por trituração mecânica e peneirados em peneira de granulometria, de modo a garantir
tamanho ≤ 1,2 mm; (D) diferentes concentrações de microplásticos, mínima, média e máxima,
estocados para a exposição dos zebrafish nos aquários ........................................................................ 53
Figura 2 – Zebrafish. Zebrafish mantidos no aquário de manutenção de nosso laboratório. O aquário

de manutenção possuía 300 L e lá foram mantidos os 90 zebrafish para aclimatação e em fases prévias
para o aquário de experimentação ......................................................................................................... 54
Figura 3 – Aquários experimentais e comportamentais. Aquários experimentais onde os zebrafish

foram expostos aos microplásticos (polietileno e polipropileno) e avaliados diariamente e também
quanto a parâmetros comportamentais. (A) Aquários experimentais contendo dez zebrafish por grupo
para a exposição aos microplásticos e monitoramento diário da distribuição espacial (superior,
intermediária e inferior), aspectos gerais de saúde e taxa de letalidade; (B) Aquários individuais para
avaliações comportamentais no dia terminal do experimento ............................................................... 57
Figura 4 – Dendrograma de reação de alarme. Efeitos da exposição aos microplásticos polietileno

(PE) e polipropileno (PP), em concentrações mínima, média e máxima na distribuição espacial diária
nos aquários de zebrafish adultos em resposta a reação de alarme. A distribuição espacial contabilizou
a posição superior (S), intermediária (I) e inferior (B) dos zebrafish em cada aquário. Os grupos cujos
nomes terminam em 1 referem às concentrações mínima (0,1 mg/L), grupos cujos nomes terminam em
2 referem às concentrações médias (1,0 mg/L) e grupos cujos nomes terminam em 3 e 4 referem às
concentrações máximas (10,0 mg/L). Os grupos cujos nomes terminam em 1, 2 e 3, bem como o grupo
controle (CON) referem à exposições por 96h e grupos cujos nomes terminam em 4 referem à
exposições por 192h (n = 10 peixes/grupo). Os resultados são expressos segundo a similaridade
baseada nos dados espaciais ao posicionamento dos zebrafish ............... Erro! Indicador não definido.
Figura 5 – Análise de componentes principais da reação de alarme. Efeitos da exposição aos

microplásticos polietileno (PE) e polipropileno (PP), em concentrações mínima, média e máxima na
distribuição espacial diária nos aquários de zebrafish adultos em resposta a reação de alarme. A
distribuição espacial contabilizou a posição superior (S), intermediária (I) e inferior (B) dos zebrafish
em cada aquário. Os grupos cujos nomes terminam em 1 referem às concentrações mínima (0,1 mg/L),
grupos cujos nomes terminam em 2 referem às concentrações médias (1,0 mg/L) e grupos cujos nomes
terminam em 3 e 4 referem às concentrações máximas (10,0 mg/L). Os grupos cujos nomes terminam
em 1, 2 e 3, bem como o grupo controle (CON) referem à exposições por 96h e grupos cujos nomes
terminam em 4 referem à exposições por 192h (n = 10 peixes/grupo). Os resultados são expressos
segundo o gradiente originado dos dados espaciais ao posicionamento dos zebrafishErro! Indicador
não definido.
Figura 6 – Dendrograma de distribuição espacial basal. Efeitos da exposição aos microplásticos

polietileno (PE) e polipropileno (PP), em concentrações mínima, média e máxima na distribuição
espacial diária do tipo basal nos aquários de zebrafish adultos. A distribuição espacial contabilizou a
posição superior (S), intermediária (I) e inferior (B) dos zebrafish em cada aquário. Os grupos cujos
nomes terminam em 1 referem às concentrações mínima (0,1 mg/L), grupos cujos nomes terminam em
2 referem às concentrações médias (1,0 mg/L) e grupos cujos nomes terminam em 3 e 4 referem às
concentrações máximas (10,0 mg/L). Os grupos cujos nomes terminam em 1, 2 e 3, bem como o grupo
controle (CON) referem à exposições por 96h e grupos cujos nomes terminam em 4 referem à
exposições por 192h (n = 10 peixes/grupo). Os resultados são expressos segundo a similaridade
baseada nos dados espaciais ao posicionamento dos zebrafish ............... Erro! Indicador não definido.
Figura 7 – Análise de componentes principais da distribuição espacial basal. Efeitos da exposição

aos microplásticos polietileno (PE) e polipropileno (PP), em concentrações mínima, média e máxima
na distribuição espacial diária do tipo basal nos aquários de zebrafish adultos. A distribuição espacial
contabilizou a posição superior (S), intermediária (I) e inferior (B) dos zebrafish em cada aquário. Os
grupos cujos nomes terminam em 1 referem às concentrações mínima (0,1 mg/L), grupos cujos nomes
terminam em 2 referem às concentrações médias (1,0 mg/L) e grupos cujos nomes terminam em 3 e 4
referem às concentrações máximas (10,0 mg/L). Os grupos cujos nomes terminam em 1, 2 e 3, bem
como o grupo controle (CON) referem à exposições por 96h e grupos cujos nomes terminam em 4
referem à exposições por 192h (n = 10 peixes/grupo). Os resultados são expressos segundo o gradiente
originado dos dados espaciais ao posicionamento dos zebrafish ............ Erro! Indicador não definido.
Figura 8 – Comportamento. Efeitos da exposição aos microplásticos polietileno (PE) e polipropileno

(PP), em concentrações mínima, média e máxima no comportamento de zebrafish adultos. Os grupos
cujos nomes terminam em 1 referem às concentrações mínima (0,1 mg/L), grupos cujos nomes
referem à exposições por 192h. Parâmetros: (A) latência para alcançar os quadrantes superiores do
aquário, (B) atividade exploratória, (C) tempo total de permanência nos quadrantes superiores, (D)
tempo total de permanência nos quadrantes inferiores e (E) tempo total de movimentos erráticos. A
avaliação foi realizada no dia terminal da exposição (n = 10 peixes/grupo). *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 e ****p<0.0001 (ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey ou teste de
Wilcoxon). Os resultados são expressos como box & whiskers, mostrando todos os valores ou
somatórias e mediana .............................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 9 – Peso corporal. Efeitos da exposição aos microplásticos polietileno (PE) e polipropileno
(PP), em concentrações mínima, média e máxima no peso corporal (g) de zebrafish adultos. Os grupos
cujos nomes terminam em 1 referem às concentrações mínima (0,1 mg/L), grupos cujos nomes
referem à exposições por 192h. A avaliação foi realizada no dia terminal da exposição (n = 10
peixes/grupo). *p<0.05 (ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey). Os resultados são
expressos como box & whiskers, mostrando todos os valores ................ Erro! Indicador não definido.
Figura 10 – GFAP. Efeitos da exposição aos microplásticos polietileno (PE) e polipropileno (PP), em
concentrações mínima, média e máxima na expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em
astrócitos no tronco encefálico de zebrafish adultos. Os grupos cujos nomes terminam em 1 referem às
concentrações mínima (0,1 mg/L), grupos cujos nomes terminam em 2 referem às concentrações
médias (1,0 mg/L) e grupos cujos nomes terminam em 3 e 4 referem às concentrações máximas (10,0
mg/L). Os grupos cujos nomes terminam em 1, 2 e 3, bem como o grupo controle (CON) referem à
exposições por 96h e grupos cujos nomes terminam em 4 referem à exposições por 192h. A avaliação
foi realizada no dia terminal da exposição (n = 8 peixes/grupo, 2 fotomicrografias de cada seção
individual do tronco cerebral). Análise morfométrica de seções imunomarcadas com GFAP (objetiva
40X). *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001 (ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey). Os
resultados são expressos como box & whiskers, mostrando todos os valoresErro! Indicador não
definido.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 42
1.1 Microplástico: características e impactos ambientais ..................................................... 42
1.2 Zebrafish: características e uso em pesquisas experimentais ......................................... 45
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 50
2.1 Objetivos específicos ...................................................................................................... 50
3. METODOLOGIA................................................................................................................. 51
3.1 Declaração de ética ......................................................................................................... 51
3.2 Microplástico .................................................................................................................. 51
3.3 Zebrafish ......................................................................................................................... 54
3.4 Exposição, grupos e delineamento experimental ............................................................ 55
3.5 Distribuição espacial diária nos aquários, aspectos gerais de saúde e letalidade ........... 57
3.6 Comportamento .............................................................................................................. 58
3.7 Peso e sexo ...................................................................................................................... 59
3.8 GFAP no encéfalo ........................................................................................................... 59
3.9 Análises estatísticas ........................................................................................................ 60
3.10 Próximos passos ............................................................................................................ 61
4. RESULTADOS .................................................................................................................... 62
4.1 Distribuição espacial diária nos aquários, aspectos gerais de saúde e letalidade ..... Erro!
Indicador não definido.
4.2 Comportamento ............................................................... Erro! Indicador não definido.
4.3 Peso e sexo ....................................................................... Erro! Indicador não definido.
4.4 GFAP no encéfalo ............................................................ Erro! Indicador não definido.
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 63
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 64
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 65
ANEXOS Anexo 1 – Certificado de aprovação do Projeto junto a CEUA/UNIP ................... 74
Anexo 2 – Emenda de aprovação do Projeto junto a CEUA/UNIP ...................................... 75
Anexo 3 – Certificado de qualidade, características e procedência dos plásticos ................ 76
Anexo 4 – Atestado de procedência e saúde dos peixes ....................................................... 80
Anexo 5 – Dados estatísticos suplementares das análises multivariadas realizadas para a
distribuição espacial diária dos peixes .................................................................................. 81
42
1. INTRODUÇÃO
Esta seção aborda assuntos disponíveis na literatura especializada relacionados ao

microplástico, incluindo suas características e impactos ambientais e aos organismos animais.
Além disso, são apresentados estudos sobre o zebrafish que descrevem suas características e
uso em pesquisas experimentais. Assim, os assuntos a serem estudados experimentalmente
neste trabalho são introduzidos e justificados nesta seção.
1.1 Microplástico: características e impactos ambientais
O acúmulo de lixo plástico em ambientes naturais é um problema global com impactos

negativos na economia, na vida selvagem e na saúde humana (HARTMANN et al., 2019). A
tendência é de piora, uma vez que no Brasil e em todo o mundo ocorre incremento da
produção e uso de plástico (ALI et al., 2021).
Nesse cenário, destaca-se o papel do microplástico, cujas partículas têm dimensão
menores que 5 mm (RICE; HIRAMA; WITHERINGTON, 2021). A poluição por
microplástico representa um potencial danoso à saúde animal, especialmente no ambiente
marinho, mas também na água doce e no ambiente terrestre, incluindo-se aqui moluscos,
crustáceos, peixes, anfíbios, répteis, aves, mamíferos e até mesmo o homem (SMITH et al.,
2018; CAMPANALE et al., 2020; SHARIFINIA et al., 2020; STANTON et al., 2020;
ARAUJO et al., 2021; ZANTIS et al., 2021).
O problema do consumo do microplástico e sua presença no trato digestório não se
refere a princípio a sua toxicidade, mas ao sufocamento e a sensação de saciedade quando do
seu consumo, podendo levar a morte por inanição (BROWNE; GALLOWAY; THOMPSON,
2007; SCHMID; COZZARINI; ZAMBELLO, 2021). Porém, pouco se sabe sobre os
mecanismos de ação que fazem o microplástico ser tão prejudicial.
O microplástico pode ser originário de maneira primária ou secundária. Microplásticos
primários são aqueles produzidos deliberadamente como micropartícula e incorporado aos
produtos, como cosméticos, produtos de higiene pessoal, tintas e produtos de limpeza.
Microplásticos secundários são originados devido ao desgaste, fragmentação ou uso de
produtos plásticos, como pneus, fibras têxteis e plásticos oxidegradáveis (OLIVATTO et al.,
2018). Em outras palavras, o microplástico secundário surge decorrente da exposição
ambiental de resíduos plásticos maiores, os quais vão sofrendo sucessivas fragmentações,
43
gerando detritos de plásticos progressivamente menores. Os principais polímeros relacionados

à formação de microplásticos são polietileno tereftalato (PET), polipropileno (PP),
poliestireno (PS), poliuretano (PU), policloreto de vinila (PVC), polietileno (PE), poliéster
(PES), poliamidas (PA) e náilon (LEI et al., 2018; OLIVATTO et al., 2018; GARCIA et al.,
2021).
Entre os microplásticos mais encontrados em animais aquáticos, tanto no ambiente
marinho como de água doce, em diferentes continentes, destaca-se o PE e o PP
(HENDRICKSON; MINOR; SCHREINER, 2018; KHAN et al., 2020; GARCIA et al., 2021).
O PE, conhecido popularmente como plástico rígido, pode ser encontrado com diferentes
tamanhos, cores e formas (ZHANG et al., 2017). Os PEs mais comuns são os PEAD
(Polietileno de Alta Densidade), o PEMD (Polietileno de Média Densidade), o PEBDL
(Polietileno de Baixa Densidade Linear) e o PEBD (Polietileno de Baixa Densidade). O PE,
usado principalmente em filmes para produção de embalagens, tem sido objeto de
investigação, pois tende a se acumular com o tempo, causando possíveis riscos ambientais
(ROY et al., 2011). O PP é um plástico muito versátil, empregado para diversos fins, como na
indústria têxtil, embalagem para alimentos e componentes para fabricação de automóveis
(HENDRICKSON; MINOR; SCHREINER, 2018).
Além da contaminação ambiental e dos animais pelos diferentes tipos de
microplástico, alguns aditivos químicos adicionados durante o processo de produção dos
plásticos, para conferir características como dureza, durabilidade e resistência, podem conter
substâncias tóxicas. Alguns exemplos são os plastificantes, retardantes de chamas,
estabilizadores, corantes, endurecedores, agentes antiestáticos (aminas) e adjuvantes (ésteres e
amidas), que podem sofrer lixiviação e sua toxicidade se torna prejudicial para os seres
humanos e para a vida selvagem (PRATA et al., 2020).
Os microplásticos também podem absorver outros poluentes ao se ligarem com outros
contaminantes ambientais, como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs),
bifenilospoliclorados (PCBs), diclorodifeniltricloroetanos (DDT) e metais (EERKES-
MEDRANO; THOMPSON; ALDRIDGE, 2015; ROCHMAN et al., 2019) e funcionam como
uma espécie de esponja química, que, quando em contato com fluídos biológicos, são capazes
de causar efeitos tóxicos no ambiente. No ambiente marinho, os plásticos se fragmentam
inclusive sob efeitos combinados da ação das ondas e da abrasão de partículas de sedimento
(THOMPSON et al., 2004). Também podem percorrer longas distâncias e assim funcionam
como vetores para dispersão de toxinas e/ou microrganismos patogênicos (ZETTLER;
MINCER; AMARAL-ZETTLER, 2013).
44
Há um potencial considerável de detritos plásticos microscópicos que se acumulam em

ambientes de água doce e marinha (BROWNE; GALLOWAY; THOMPSON, 2007). Os
plásticos têm uma meia-vida mais longa do que a maioria dos substratos marinhos flutuantes
naturais. Por exemplo, o PP utilizado em embalagens para alimentos (em média com 800 µm
de espessura) tem meia-vida estimada em 87 anos em ambiente marinho. O PE de alta
densidade utilizado em canos para construção civil (em média com 10.000 µm de espessura)
tem meia-vida estimada em 1200 anos em ambiente marinho (CHAMAS et al., 2020). Além
disso, esses plásticos possuem uma superfície hidrofóbica que promove a colonização
microbiana e a formação de biofilme, diferindo de substratos autóctones nas camadas
superiores do oceano. Em função do seu pequeno tamanho, os microplásticos são
considerados biodisponíveis para organismos e por serem tão pequenos são confundidos com
alimentos. Pesquisas apontam que a ingestão e a translocação de partículas microplásticas
trazem impactos para os organismos aquáticos (WRIGHT; THOMPSON; GALLOWAY,
2013), incluindo zooplâncton (COLE et al., 2015), invertebrados (VON MOOS;
BURKHARDT-HOLM; KOHLER, 2012; ROCH; FRIEDRICH; BRINKER, 2020), peixes
(LUSHER; HOLLMAN; MENDOZA-HILL, 2017) e aves (PROVENCHER et al., 2014).
Deve-se destacar que a ingestão de microplásticos pode introduzir toxinas em toda
base da cadeia alimentar, já que são aparentemente transferidos de um nível biológico para
outro (FARRELL; NELSON, 2013). Após serem ingeridos, os microplásticos podem afetar os
organismos aquáticos de muitas maneiras. Pesquisas quantificam o impacto do microplástico
nas espécies marinhas, sendo que mais de 690 já foram descritas como afetadas pelo
componente, como também apontam as implicações físicas e de saúde da ingestão de
microplástico por esses organismos (COLE et al., 2015; ROCHMAN et al., 2015; PEDA et
al., 2016). No trato digestivo, a presença do microplástico tem potencial para inibir a
absorção dos alimentos, bloquear o intestino, interferindo no crescimento, reprodução e
sobrevivência da biota (GALLAGHER et al., 2016).
Além da possível obstrução do trato digestivo, as micropartículas ingeridas podem
funcionar como vetores de microrganismos e contaminantes, responsáveis pela toxicidade dos
organismos aquáticos, com implicações fisiológicas, comportamentais, de crescimento,
reprodutivas e genéticas (CHAE; AN, 2017). Ainda, por se constituírem de minúsculas
partículas, os microplásticos trazem o risco de entrar em teias alimentares aquáticas e
propagar substâncias tóxicas dos mais baixos aos mais elevados níveis tróficos, causando
danos em todo o ecossistema (BESSELING et al., 2013). Em mexilhões, partículas plásticas
de PS e PE são capazes de translocar do trato intestinal para o sistema circulatório, entrar nas
45
células e provocar efeitos negativos na estrutura celular e tecidual (LUSHER; HOLLMAN;

MENDOZA-HILL, 2017).
Diante do potencial dos detritos plásticos se acumularem nos organismos, o consumo
por inteiro de determinadas espécies aquáticas, sem a remoção do trato digestório completo,
representa uma forma de exposição para os humanos (ROCHMAN et al., 2015; SMITH et al.,
2018). Estudos recentes também indicam que a exposição de humanos a microplásticos ocorre
por meio do consumo diários de outros alimentos, uma vez que pequenas partículas plásticas
foram detectadas em diferentes frutos do mar, artigos de alimentos processados e em bebidas,
como a cerveja. Deve-se considerar também a exposição por inalação e contato dérmico,
devido à presença do microplástico no ar (SMITH et al., 2018). Por exemplo, já foi
demonstrada a presença de microplástico no pulmão de pessoas que vivem em cidades
poluídas como São Paulo provenientes da inalação do microplástico disperso no ar (AMATO-
LOURENCO et al., 2021). Aliás, os microplásticos mais encontrados neste estudo de 2021
foram o PE e o PP.
Nos diferentes sistemas biológicos, a exposição ao microplástico pode causar
toxicidade celular, ocasionando estresse oxidativo e lesões inflamatórias. Diante da
incapacidade do sistema imunológico de remover partículas sintéticas, também pode
ocasionar inflamações crônicas e aumentar o risco de neoplasias. Os microplásticos também
podem liberar seus constituintes, contaminantes adsorvidos e organismos patogênicos
(PRATA et al., 2020).
Assim, a presença de microplásticos no ecossistema representa uma preocupação
ambiental global diante do risco potencial associados à exposição de longo prazo para animais
e humanos (LUSHER; HOLLMAN; MENDOZA-HILL, 2017). No entanto, como o
conhecimento da toxicidade do microplástico ainda é reduzido, a ampliação do número de
pesquisas sobre o tema se torna necessária (PRATA et al., 2020).
A avaliação da presença do microplástico no ambiente, em particular no ambiente
aquático, em condições controladas, pode contribuir para um melhor entendimento das
consequências da sua exposição em diferentes níveis da cadeia trófica chegando até o homem.
1.2 Zebrafish: características e uso em pesquisas experimentais
O zebrafish (Danio rerio) é um pequeno peixe teleósteo tropical de água doce, que
pertence à família Cyprinidae. É originário do rio Ganges, no leste da Índia, além do
46
Bangladesh, Nepal e norte de Mianmar (SPENCE et al., 2006). Trata-se de uma espécie que,
na fase adulta, apresenta medida em torno de 4-5 cm e traz como característica corpo
cilíndrico e padrão, com 7 a 9 listras horizontais claras e escuras, que percorrem todo o corpo
e se alternam em tons de azul escuro sobre prata, com coloração verde ou amarela na região
dorsal (GERLAI et al., 2000; PAULL et al., 2010).
Eles exibem dimorfismo na maturidade sexual, com diferenças na coloração que
surgem após seis semanas de vida. Na fase reprodutiva, os machos apresentam coloração
amarelo dourado na parte ventral, são mais afilados e leves que as fêmeas, que apresentam cor
prateada e arredondadas, principalmente na região ventral, características que se tornam mais
evidentes próximo do período da desova (GERLAI et al., 2000; PAULL et al., 2010).
A capacidade de desova de uma fêmea se estabelece em torno de 200 a 300 ovos
fertilizados por semana e completa sua embriogênese em 72 horas, passando por estágios bem
definidos; a saber: a fase de zigoto, clivagem, blástula, gástrula, segmentação, faringula e fase
filotípica, em que o tubo neural está formado com as vesículas cefálicas e estruturas
sensoriais, assim como a musculatura segmentar e as extremidades; as nadadeiras estão
presentes, o coração na região ventral do corpo e os arcos branqueais na região bucal. Ao final
do processo da embriogênese, forma-se uma larva com morfogênese praticamente completa,
livre-natante e que exibe visíveis movimentos oculares, da mandíbula e nadadeiras
(PARICHY et al., 2009). Os embriões do zebrafish medem em torno de 0,7 mm de diâmetro,
são opticamente transparentes e podem atingir a maturidade sexual dentro de dois a três meses
(GERLAI et al., 2000; SPENCE et al., 2008).
O zebrafish tem se constituído como um modelo muito procurado para experimentos
científicos, já que compartilham aproximadamente 70% de semelhança genética com os
humanos, com aspectos morfológicos e fisiológicos semelhantes, tais como sistema nervoso
central, sistema esquelético complexo, células hematopoiéticas múltiplas (eritrócitos, células
mieloides, linfócitos B e T etc.) e sistema cardiovascular (LIESCHKE; CURRIE, 2007;
KALUEFF; STEWART; GERLAI, 2014). Assim, quando genes causadores de doenças em
humanos são injetados nos embriões de zebrafish, os peixes em crescimento acabam por
adquirir grande parte dessas enfermidades. Deve-se destacar que o corpo translúcido do do
embrião do zebrafish permite melhor visualização de órgãos e processos biológicos in vivo,
sem a necessidade de procedimentos invasivos. Além disso, essa espécie é favorável a
abordagens genéticas avançadas e seu genoma totalmente sequenciado está disponível desde
2013. As vantagens de incorporá-los como modelo de experimento se relacionam ao fato de
ter um baixo custo de manutenção em cativeiro, possuírem alta fecundidade e
47
desenvolvimento rápido (LIESCHKE; CURRIE, 2007; KALUEFF; STEWART; GERLAI,

2014).
A ascensão do zebrafish como modelo experimental também guarda relação com a boa
tolerância a condições ambientais em cativeiro, ainda que a qualidade da água e da
alimentação exerça importância significativa para sua sobrevivência e reprodução (WATTS et
al., 2016). No que tange a questão alimentar, são onívoros e possuem como componentes de
dieta na natureza zooplâncton e insetos. Pesquisas também indicam a presença de
fitoplâncton, algas filamentosas e plantas vasculares, ovos e pequenos crustáceos no sistema
digestório do zebrafish (SPENCE et al., 2008).
Um dos sistemas que guarda notável semelhança dos zebrafish com os humanos é o
sistema nervoso, tornando-se importante objeto de pesquisa em distintas áreas como no
campo da neurociência, biologia do desenvolvimento, oncologia, toxicologia, análises
comportamentais e estudos genéticos. Aliás, identifica-se um aumento dos estudos utilizando
adultos e larvas de zebrafish, em função da semelhança com a genética humana e da
facilidade de manipulação do sistema nervoso central (GERLAI, 2003). Diversas células e
estruturas neurais dos zebrafish são semelhantes as nossas, como a micróglia, os astrócitos e
neurônios motores, inclusive no que diz respeito à produção de neurotransmissores como
serotonina, ácido gama-aminobutírico (GABA), dopamina, histamina etc. (IJAZ; HOFFMAN,
2016). Por falar em astrócitos, têm se avaliado a expressão da proteína glial fibrilar ácida
(GFAP) no encéfalo de zebrafish como marcador de neuroinflamação e danos
ecotoxicológicos (LEME et al., 2018). Ademais, tornou-se modelo para o estudo de fármacos
para enfermidades ligadas ao transtorno do espectro autista (MAASWINKEL; ZHU; WENG,
2013) e análise de mecanismos genéticos associados a doenças neurodegenerativas, como
Parkinson e Alzheimer (LEE; FREEMAN, 2014).
Pesquisas apontam que o zebrafish tem sido útil para detectar a presença de algumas
toxinas ambientais, com compostos que vão desde metais e metaloides de ocorrência natural,
até componentes sintéticos de produtos de consumo, pesticidas e subprodutos de
processamento industrial e incineração de resíduos (BAMBINO; CHU, 2017). Efeitos tóxicos
do fungicida piraclostrobina e do poluente ambiental ftalato de benzila butil (BBP) constam
como estudos recentes sobre o impacto desses produtos na saúde do animal (ZHANG et al.,
2017).
Na linha de pesquisa comportamental, o zebrafish tem sido um modelo experimental
para abordagens cognitivas e sociais, com utilidade para mensurar a utilização de drogas
terapêuticas para distúrbios depressivos graves (FONSEKA et al., 2016). A contaminação por
48
produtos farmacêuticos em ecossistemas aquáticos, em especial as psicoativas (diazepam ou

fluoxetina) e os efeitos do estresse agudo na ansiedade, memória, interação social e
agressividade em zebrafish, também aparece entre as recentes pesquisas que abordam como a
presença dessas drogas causa alterações comportamentais significativas nos peixes
(KALUEFF; STEWART; GERLAI, 2014; GIACOMINI et al., 2016).
Outras abordagens usando zebrafish incluem doenças cardiovasculares de origem
congênitas, trombose, desenvolvimento de vasos colaterais, inflamação, cardiomiopatia e
arritmias (CHICO; INGHAM; CROSSMAN, 2008; ASNANI; PETERSON, 2014), bem
como recentes estudos ligados a medicina regenerativa (GERHARD, 2007; GOESSLING;
NORTH, 2014). A alta capacidade regenerativa e comodidade à manipulação genética tornam
o peixe um modelo terapêutico para avaliar a capacidade de regeneração de distintos órgãos
como: nadadeiras, sistema nervoso central, coração, pâncreas, fígado e rim (ARJMAND et al.,
2020).
O zebrafish também se tornou modelo para estudos de doenças endócrinas e
metabólicas, objetivando encontrar novas terapias para obesidade, diabetes mellitus tipo 2,
esteatohepatite não alcoólica, distúrbios da tireóide e insuficiência das glândulas adrenais
(ARJMAND et al., 2020).
Por fim, deve-se destacar que a utilização de peixes como o zebrafish enfrentam
menos obstáculos éticos e minimizam as dificuldades técnicas e de alto custo quando
comparada ao uso de mamíferos em investigações científicas.
Assim, o zebrafish foi proposto como modelo experimental pelo fato deste peixe ser
usado como um modelo animal para toxicologia do desenvolvimento (TERAOKA; DONG;
HIRAGA, 2003; HILL et al., 2005; BAILEY; OLIVERI; LEVIN, 2013), em testes de
neurotoxicidade e compreensão de distúrbios encefálicos (DE ESCH et al., 2012; KALUEFF;
STEWART; GERLAI, 2014). Além disso, o estudo comportamental do zebrafish vem sendo
usado como biomarcador de toxicidade (EISSA et al., 2010), bem como para a neurociência
translacional, por exemplo, para compreender as vias neurais, biomarcadores fisiológicos e
fundamentos genéticos da função cerebral normal e patológica (KALUEFF et al., 2013;
KALUEFF; STEWART; GERLAI, 2014).
Desse modo, o objetivo do presente projeto foi de estudar os efeitos de diferentes tipos
de microplástico em parâmetros comportamentais e encefálicos de zebrafish, para, em
condições controladas, propor um modelo experimental para o estudo do microplástico.
49
Também foi objetivo entender aspectos neurobiológicos relacionados aos prejuízos induzidos
pelo microplástico, para contribuir com o entendimento dos mecanismos neurobiológicos.
50
2. OBJETIVOS
São três objetivos principais: estudar os efeitos da exposição a diferentes tipos de

microplástico em parâmetros comportamentais e encefálicos de zebrafish; propor um modelo
experimental para o estudo do microplástico; e entender aspectos neurobiológicos
relacionados aos prejuízos induzidos pelo microplástico.
2.1 Objetivos específicos
 Expor zebrafish adultos a dois tipos de microplásticos, PE e PP, em diferentes

concentrações;
 Avaliar diariamente os efeitos da exposição ao PE e PP quanto a aspectos gerais da
saúde do zebrafish;
 Avaliar diariamente os efeitos da exposição ao PE e PP quanto à distribuição
espaciais dentro dos aquários em dois contextos: resposta de alarme e distribuição
espacial do tipo basal dos zebrafish;
 Avaliar os efeitos da exposição ao PE e PP quanto a parâmetros comportamentais
relacionados à atividade motora, exploratória, intoxicação, deficiências do sistema
respiratório e expressão de ansiedade dos zebrafish;
 Avaliar os efeitos da exposição ao PE e PP quanto à eventual taxa de letalidade e peso
corporal dos zebrafish;
 Avaliar os efeitos da exposição ao PE e PP quanto à expressão astrocitária de GFAP
no encéfalo dos zebrafish.
 Propor modelo experimental de estudo do microplástico em zebrafish.
51
3. METODOLOGIA
Nesta seção, são apresentados os procedimentos éticos e legais, informações relativas

aos microplásticos e zebrafish utilizados, os protocolos de exposições, os grupos
experimentais, as avaliações realizadas, que incluem a distribuição espacial diária dos
zebrafish nos aquários, seus comportamentos e análises encefálicas, bem como as análises
estatísticas realizadas.
3.1 Declaração de ética
Este projeto foi submetido para a Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-
UNIP) e só foi iniciado experimentalmente após sua aprovação, sob número 4386210222
(Anexo 1). Os procedimentos estão de acordo com as normas e procedimentos éticos relativos
ao uso de animais de laboratório. Essas diretrizes são baseadas nas normas do National
Institutes of Health (Bethesda, MD). Os experimentos foram realizados de acordo com os
protocolos de boas práticas de laboratório com métodos de garantia de qualidade. Todos os
esforços possíveis foram realizados para minimizar o sofrimento dos animais.
3.2 Microplástico
Foram estudados dois tipos de microplástico, o PE e o PP, devido ao fato deles serem
comumente encontrados no sistema digestório de peixes de água doce e marinha de diferentes
regiões do mundo, como na Colômbia (GARCIA et al., 2021), no Rio Nilo (KHAN et al.,
2020) e nos EUA e Canadá (HENDRICKSON; MINOR; SCHREINER, 2018). Inclusive,
existem estudos com protocolos experimentais de exposição em zebrafish (LEI et al., 2018).
Os dois tipos de plásticos foram adquiridos na forma virgem, pura, de um fabricante
fornecedor certificado (BRASKEN, Mais Polimeros do Brasil LTDA, Cajamar, São Paulo,
Brasil). Os certificados de qualidade, as características físicas e atestados de pureza e
procedência dos plásticos PE e PP estão disponíveis no Anexo 2.
O dois microplásticos foram confeccionados por processo de trituração mecânica, com
constatação de partículas de no máximo 1,2 mm por meio de peneira (inox) de granulometria.
Foram confeccionadas soluções para cada um desses microplásticos em três diferentes
52
concentrações. As concentrações mínima, média e máxima de cada microplástico foram 0,1,

1,0 e 10,0 mg/L, respectivamente, de acordo com estudos de exposição de zebrafish adultos a
diferentes tipos de microplástico (LEI et al., 2018; UMAMAHESWARI et al., 2021). A
Figura 1 ilustra os plásticos virgens adquiridos em formato de esfera (Figuras 1A e B), os
microplásticos já triturados e peneirados, de modo a garantir tamanho ≤ 1,2 mm (Figura 1C)
e as diferentes concentrações de microplásticos, mínima, média e máxima, estocados para a
exposição dos zebrafish nos aquários (Figura 1D).
53
Figura 1 – Confecção dos microplásticos

microplásticos.. Processo de confecção dos dois tipos de microplásticos
(polietileno e polipropileno). (A e B) Plásticos virgens adquiridos em formato de esfera da fabricante
(BRASKEN, Mais Polimeros do Brasil LTDA, Cajamar, São Paulo, Brasil); ((C) microplásticos
confeccionados por trituração mecânica e peneirados em peneira de granulometria, de modo a garantir
tamanho ≤ 1,2 mm; (D) diferentes concentrações de microplásticos, mínima, média e máxima,
estocados para a exposição dos zebrafish nos aquários
Fonte: dos autores

54
3.3 Zebrafish
Um total de 90 zebrafish adultos de 4–5 cm e 3–4 meses de idade foram obtidos de um

criador comercial certificado. O Anexo 3 dispõe informações que atestam a procedência dos
zebrafish bem como sua saúde.
O transporte do zebrafish, sua aclimatação na água e condições de manutenção e
alimentação foram condições padrão, as mesmas descritas anteriormente em estudo realizado
em nosso laboratório (LEME et al., 2018). A manutenção dos zebrafish utilizou água
desclorada da Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo (SABESP, São
Paulo, Brasil) mantida a uma temperatura de 27±2°C por termostato, pH 7,5±0,2, amônia total
zero, nitrito zero e nitrato até 200 mg/L. A sala possuía iluminação artificial (ciclo claro de 14
horas/escuro de 10 horas, luzes acesas às 8h00 da manhã). No aquário de manutenção (300
L), as trocas parciais de água (20% do volume) ocorreram quinzenalmente e o material
filtrante do filtro tipo canister era substituído mensalmente. Todos os parâmetros físicos e
químicos de manutenção foram empregados de acordo com o Manual de Criação em Biotério
para Zebrafish (DAMMSKI et al., 2011). Os zebrafish foram mantidos por um período
mínimo de dez dias nas condições de nossos laboratórios antes do início dos experimentos
para aclimatação. A Figura 2 ilustra os zebrafish mantidos no aquário de manutenção de
nosso laboratório.
Figura 2 – Zebrafish. Zebrafish mantidos no aquário de manutenção de nosso laboratório. O aquário

de manutenção possuía 300 L e lá foram mantidos os 90 zebrafish para aclimatação e em fases prévias
para o aquário de experimentação
Fonte: dos autores

55
3.4 Exposição, grupos e delineamento experimental
Um total de nove grupos foi avaliado neste estudo. Cada grupo foi composto por dez
zebrafish. Durante os procedimentos experimentais, cada grupo ficou em um aquário de vidro
(20 × 20 × 20 cm, aerado usando compressores de ar e com controle de temperatura por
termostato). A água utilizada nestes aquários experimentais foi proveniente do aquário de
manutenção. Os zebrafish de cada um dos nove grupos foram expostos as seguintes
condições:
(1) Grupo controle (CON): água controle;
(2) Grupo PE1: solução contendo concentração mínima de PE, com exposição por quatro
dias (96h);
(3) Grupo PE2: solução contendo concentração média de PE, com exposição por quatro
dias (96h);
(4) Grupo PE3: solução contendo concentração máxima de PE, com exposição por quatro
dias (96h);
(5) Grupo PE4: solução contendo concentração máxima de PE, com exposição por oito
dias (192h);
(6) Grupo PP1: solução contendo concentração mínima de PP, com exposição por quatro
dias (96h);
(7) Grupo PP2: solução contendo concentração média de PP, com exposição por quatro
dias (96h);
(8) Grupo PP3: solução contendo concentração máxima de PP, com exposição por quatro
dias (96h);
(9) Grupo PP4: solução contendo concentração máxima de PP, com exposição por oito
dias (192h).
Os microplásticos nas diferentes concentrações foram sempre adicionados em cada

aquário experimental somente após constatação de que a temperatura da água do aquário
estava estável e igual aquela do aquário de manutenção, bem como somente 10 minutos após
o acondicionamento dos 10 zebrafish gentilmente dentro do aquário (dia 0), de modo a
garantir sua habituação.
Todos os nove grupos foram avaliados diariamente (a cada 24h) com relação as suas
distribuições espaciais dentro dos aquários (superior, intermediária e inferior), avaliando-se
56
também aspectos gerais da saúde animal e eventual taxa de letalidade. A distribuição espacial
dentro dos aquários foi avaliada em dois contextos: resposta de alarme e distribuição do tipo
basal, explicadas no próximo item.
A cada 24h a água do aquário era gentilmente agitada com auxílio de bastão de vidro a
fim de ressuspender eventual microplástico depositado no fundo e então os zebrafish eram
alimentados.
No dia terminal (T), os zebrafish foram avaliados individualmente quanto a
parâmetros comportamentais. Imediatamente depois, os zebrafish foram submetidos à
eutanásia, pesados, sexados e foram coletados seus encéfalos. O encéfalo foi processado para
técnica de imuno-histoquímica de quantificação da expressão de GFAP (marcador de
astrócitos).
O início das exposições aos microplásticos, as avaliações diárias e comportamentais,
bem como a eutanásia foram sempre realizados entre 9h00 e 11h00 AM para minimizar
variações induzidas por alterações no ritmo circadiano dos zebrafish.
A Figura 3A ilustra os aquários experimentais onde cada um dos nove grupos foi
exposto ou não aos diferentes tipos de microplásticos em diferentes protocolos de
concentrações e dias de exposição.
57
Figura 3 – Aquários experimentais e comportamentais

comportamentais.. Aquários experimentais onde os zebrafish
foram expostos aos microplásticos (polietileno e polipropileno) e avaliados diariamente e também
quanto a parâmetros comportamentais. (A) Aquários experimentais contendo dez zebrafish por grupo
para a exposição aos microplásticos e monitoramento diário da distribuição espacial (superior,
intermediária e inferior),, aspectos gerais de saúde e taxa de letalidade;; (B) Aquários individuais para
avaliações comportamentais no dia terminal do experimento
Fonte: dos autores
3.5 Distribuição espacial diária nos aquários

aquários, aspectos gerais de saúde e letalidade
Os zebrafish dos nove grupos experimentais foram avaliados diariamente, a cada 24h,
quanto sua distribuição espacial dentro de cada aquário experimental (Figura
( 3A) em duas
situações diferentes. Primeiro, os zebrafish foram expostos a uma situação aversiva de
58
abertura de porta sanfonada disposta imediatamente à frente dos aquários, com 1 metro de
distância entre o aquário e a porta, de modo que cada peixe era exposto a um distúrbio visual
e auditivo. Essa resposta ambiental aversiva foi chamada de reação de alarme. O segundo
contexto avaliado na distribuição espacial diária dos peixes foi após 120 segundos da situação
aversiva, considerado como uma distribuição espacial basal. Para os dois parâmetros (reação
de alarme e distribuição basal) foi anotado a quantidade de peixes de cada aquário dispostos
nos extratos: superior, intermediário e inferior. Os zebrafish respondem a comportamentos
aversivos e que causam ansiedade procurando extratos mais inferiores do aquário (KALUEFF
et al., 2013).
Ao término das avaliações diárias de reação de alarme e distribuição espacial basal, os
peixes eram individualmente inspecionados quanto a aspectos gerais de saúde e eventuais
padrões comportamentais anômalos, incluindo mudança de postura e coloração, segundo
catálogo de comportamento do zebrafish (KALUEFF et al., 2013).
Além disso, diariamente foi monitorado eventual letalidade dos zebrafish, para
fornecer a taxa de letalidade.
3.6 Comportamento
No dia terminal das avaliações diárias (após 96h ou 192h, a depender do grupo
experimental), cada um dos dez zebrafish de cada um dos nove grupos foi individualmente
alocado em aquários de vidro pequenos (21 × 10 × 21,5 cm de largura) contendo água do
aquário de manutenção. A parede frontal de cada aquário era dividida em nove retângulos
iguais (7 × 5 cm, Figura 3B). A análise comportamental era iniciada imediatamente após a
inserção suave do zebrafish no meio do aquário. A sessão de análise de 10 minutos era sempre
filmada em uma sala pequena e silenciosa, sem a presença do experimentador em seu interior.
Os aquários eram isolados visualmente entre si por meio de papel pardo disposto na parte
exterior de cada aquário, de modo a impedir a comunicação visual entre zebrafish durante a
gravação da análise comportamental simultânea dos dez zebrafish de cada grupo. As
condições da sala de análise comportamental e da filmagem foram as mesmas daquelas
descritas anteriormente (LEME et al., 2018). Os parâmetros analisados incluíram: latência
(em segundos) para alcançar os quadrantes superiores do aquário pela primeira vez;
frequência de atividade exploratória (número total de quadrantes percorridos, contabilizando
somente quando o corpo inteiro do zebrafish entrou em cada quadrante); tempo total (em
59
segundos) de permanência nos quadrantes superiores do aquário; tempo total (em segundos)
de permanência nos quadrantes inferiores do aquário; e tempo total (em segundos) de
movimentos erráticos (episódios de mudanças bruscas na direção e/ou velocidade e/ou
disparos rápidos [dartings], movimentos em ziguezague, saltos, movimentos circulares e
reação de alarme). Esses parâmetros representam diferentes padrões de comportamento
relacionados a mudanças motoras, exploratórias, intoxicação, deficiências do sistema
respiratório e expressão de ansiedade e foram baseados em um catálogo de comportamento do
zebrafish (KALUEFF et al., 2013).
3.7 Peso e sexo
Imediatamente depois da avaliação comportamental, os zebrafish foram submetidos à

eutanásia por método padrão autorizado pela CEUA-UNIP, no caso, a submersão completa
por no mínimo 30 segundos em óleo de cravo/eugenol 3000 mg/L, seguido por incisões com
bisturi (LUCENA et al., 2013). Então, os peixes foram lavados em água corrente e secados
em papel toalha para serem pesados (peso corporal, g) e sexados (discriminando os machos e
fêmeas). Machos e fêmeas adultos de zebrafish podem ser identificados com base em vários
fenótipos sexualmente dimórficos. Os três dimorfismos externos utilizados presentemente
para identificar o sexo dos zebrafish foram: (1) abdômen maior nas fêmeas, devido ao fato
dos ovários serem significativamente maiores que os testículos); (2) cor dimórfica da
barbatana anal e do abdômen, no caso, as células pigmentares xantáforos, que resultam na
faixa amarela no corpo, são mais pigmentadas nos machos; (3) diferenças na aparência do
poro genital, localizado na linha média ventral do abdômen logo anterior à barbatana anal e
posterior ao ânus (MENKE et al., 2011; KOSSACK; DRAPER, 2019).
3.8 GFAP no encéfalo
Os mesmos zebrafish submetidos à eutanásia descritos para a avaliação do peso e sexo

foram utilizado para a coleta de seus encéfalos, que seguiram procedimentos padronizados em
nossos laboratórios (LEME et al., 2018). Resumidamente, seções sagitais de cada encéfalo
foram feitas para atingir o tronco cerebral. A imuno-histoquímica para GFAP foi realizada
usando o método de coloração conjugada com polímero de cadeia (sistema Dako EnVision,
60
Glostrup, Dinamarca), usando a imunoglobulina policlonal de coelho anti-GFAP (1:50;

Z033401, Dako, Glostrup, Dinamarca) como o anticorpo primário, seguido pelo kit
EnVision+ (HRP, Rabbit, DAB +, K4011, Dako, Glostrup, Dinamarca). Duas
fotomicrografias de cada seção individual do tronco cerebral foram feitas usando uma
objetiva de 40×. A área das células semelhantes à astrócitos GFAP+ e seus processos,
marcados em marrom foram calculados automaticamente, em pixels, usando o software
Image-ProPlus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA) calibrado com filtros de cores
digitais que incluíram apenas células positivas e a coloração de fundo foi excluída. A análise
morfométrica dos cortes marcados por imuno-histoquímica foi realizada utilizando o index
per area do software que representa a proporção da área marcada em relação à área total da
imagem, sendo zero a completa ausência de marcação e 1 a marcação total da área. O GFAP
está presente no citoplasma e nos processos dos astrócitos e por meio de técnicas de imuno-
histoquímica é possível verificar a astrogliose como um biomarcador de neuroinflamação
(SOFRONIEW; VINTERS, 2010).
3.9 Análises estatísticas
As avaliações diárias relativas à distribuição espacial dos zebrafish de cada grupo

experimental dentro de cada aquário foram analisadas estatisticamente por análises
multivariadas, considerando três possibilidades de distribuição espacial no aquário – superior,
intermediária e inferior, os nove grupos experimentais (com diferentes concentrações de
diferentes microplásticos PE e PP) e as avaliações diárias nos quatro últimos dias de
exposição (denominadas de T para o último dia de avaliação, ou dia terminal e os três dias
anteriores: T-1, T-2 e T-3). Assim, foram usadas quatro variáveis de tempo e 27 casos (isto é,
os nove tratamentos e as três variáveis espaciais no aquário). A unidade experimental
considerada foi cada aquário com dez zebrafish. Foram realizadas duas análises: o
dendrograma, ou análise hierárquica de cluster (AC) pelo método de UPGMA e distância
Euclidiana, e a análise de componentes principais (ACP, ou do inglês PCA, de principal
componente analysis).
Foram verificadas a homocedasticidade (teste de Bartlett) e a normalidade dos dados
(testes Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov, a depender do tamanho amostral). Os dados
foram obtidos de forma independente. Foi utilizada a análise de variância (ANOVA) de uma
via, seguida do pós-teste de comparações múltiplas de Tukey para comparar dados
61
paramétricos de peso, comportamento e órgãos entre os nove grupos. Nestes casos, cada
zebrafish foi considerado a unidade experimental.
Parâmetros não paramétricos relativos ao tempo de movimentos erráticos foram
analisados pelo teste de Wilcoxon de classificação sinalizada, considerando-se o valor
hipotético igual a zero, que é relativo aos movimentos observados para o grupo controle. Para
esta análise, a unidade experimental foi cada aquário com dez zebrafish, de modo a realizar a
somatória dos valores de cada grupo.
O nível de significância de 5% (p< 0,05) foi considerado suficiente para mostrar
diferenças significativas em todos os dados analisados. Os dados são expressos como média e
respectivos erros-padrão, medianas, ou como box & whiskers, mostrando todos os valores.
3.10 Próximos passos
Os mesmos zebrafish utilizados para a coleta encéfalo também foram aproveitados

para a coleta de suas brânquias e sistema digestório. As brânquias e o sistema digestório serão
processados utilizando técnicas padronizadas para confecção de lâminas de Hematoxilina-
Eosina (HE) para estudos histológicos qualitativos e quantitativos. Também está previsto o
estudo da expressão de GFAP em outra área encefálica.
62
4. RESULTADOS
Nesta seção, são apresentados os resultados relativos aos estudos: da distribuição

espacial diária nos aquários, de aspectos gerais de saúde, letalidade, comportamento, peso
corporal, sexo e GFAP no encéfalo de zebrafish expostos aos diferentes microplásticos (PE e
PP), em diferentes concentrações e em diferentes intervalos de exposição.
A exposição por 96h aos microplásticos PE e PP afetou a distribuição espacial dos
zebrafish, bem como seus comportamentos. A reação de alarme em resposta a um estímulo
aversivo externo foi prejudicada após a exposição ao PP: maior permanência na superfície do
aquário, de modo a revelar um comportamento ansiolítico. O estudo da distribuição espacial
do tipo basal confirmou a resposta do tipo ansiolítica ao PP e revelou efeito contrário, isto é,
ansiogênico após a exposição ao PE. O estudo comportamental corroborou o efeito
ansiogênico do PE: maior latência para alcançar a superfície de um novo aquário. Além disso,
ambos os microplásticos PE e PP induziram movimentos erráticos nos zebrafish. O estudo
encefálico revelou que houve aumento da expressão de GFAP em astrócitos no tronco
encefálico de zebrafish após oito dias de exposição ao PP.
Este volume de Dissertação de Mestrado apresenta somente o resumo dos principais
resultados obtidos com este estudo. Para maiores detalhes, consultar a publicação em artigo
científico, ou contatar o orientador deste estudo via e-mail: Prof. Dr. Thiago B. Kirsten,
thiago.kirsten@docente.unip.br ou thik@outlook.com
63
5. DISCUSSÃO
Este volume de Dissertação de Mestrado apresenta somente as conclusões do trabalho,

sem sua discussão. Para maiores detalhes, consultar a publicação em artigo científico, ou
contatar o orientador deste estudo via e-mail: Prof. Dr. Thiago B. Kirsten,
thiago.kirsten@docente.unip.br ou thik@outlook.com
64
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A exposição por 96h aos microplásticos PE e PP afetou a distribuição espacial diária

dos zebrafish nos aquários, bem como seus comportamentos. Especificamente, a reação de
alarme em resposta a um estímulo aversivo externo foi prejudicada após a exposição ao PP,
observado pela maior permanência na superfície do aquário, de modo a revelar um
comportamento ansiolítico. O estudo da distribuição espacial do tipo basal confirmou a
resposta do tipo ansiolítica nos zebrafish expostos ao PP e revelou efeito contrário, isto é,
ansiogênico após a exposição ao PE. O estudo comportamental corroborou o efeito
ansiogênico do PE, demonstrado pela maior latência para alcançar pela primeira vez a
superfície do novo aquário. Além disso, ambos os microplásticos PE e PP induziram
movimentos erráticos nos zebrafish, também vinculados a modulações na ansiedade. O estudo
encefálico revelou que houve aumento da expressão de GFAP em astrócitos no tronco
encefálico de zebrafish após oito dias de exposição ao PP. Concluindo, as exposições aos
microplásticos PE e PP modularam o comportamento tipo-ansiedade dos zebrafish, associado
a processo neuroinflamatório. O presente estudo propõe um novo modelo experimental para
estudar os efeitos da exposição a diferentes tipos de microplástico em parâmetros
comportamentais e encefálicos de zebrafish.
65
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74
ANEXOS
Anexo 1 – Certificado de aprovação do Projeto junto a CEUA/UNIP
75
Anexo 2 – Emenda de aprovação do Projeto junto a CEUA/UNIP

76
Anexo 3 – Certificado de qualidade, características e procedência dos plásticos

77
78
79
80
Anexo 4 – Atestado de procedência e saúde dos peixes

81
Anexo 5 – Dados estatísticos suplementares das análises multivariadas realizadas para a

distribuição espacial diária dos peixes
Cálculo feito com o pacote estatístico MVSP
Dados da reação de alarme
CLUSTER ANALYSIS
Imported data
Analysis begun: sexta-feira, 11 de novembro de 2022 19:01:52
Analysing 4 variables x 27 cases
UPGMA
Euclidean
Objects
Node Group 1 Group 2 Dissimil. in group
1 PP3.AR.I (2) CON.AR.B (3) 0 2
2 Node 1 PE1.AR.B (3) 0 3
3 Node 2 PE2.AR.B (3) 0 4
4 Node 3 PE3.AR.B (3) 0 5
5 Node 4 PE4.AR.B (3) 0 6
6 Node 5 PP1.AR.B (3) 0 7
7 Node 6 PP2.AR.B (3) 0 8
8 Node 7 PP3.AR.B (3) 0 9
9 Node 8 PP4.AR.B (3) 0 10
10 CON.AR.S (1) PE1.AR.S (1) 1 2
11 PP2.AR.S (1) PP3.AR.S (1) 1 2
12 CON.AR.I (2) PE1.AR.I (2) 1 2
13 PP2.AR.I (2) Node 9 1 11
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25 Node 22 PE3.AR.I (2) 10.026 9
26 Node 25 Node 24 16.736 27
82
PRINCIPAL COMPONENTS ANALYSIS

Imported data
Analysisbegun: sexta-feira, 11 de novembro de 2022 19:01:22
Tolerance of eigenanalysis set at 1E-007
Eigenvalues
Axis 1 Axis 2
Eigenvalues 59.142 14.462
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Cum. Percentage 76.654 95.399
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Groups Axis 1 Axis 2
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PP3.AR.B 3 -1.262 0.328
PP4.AR.B 3 -1.262 0.328
83
Dados da distribuição do tipo basal
CLUSTER ANALYSIS
Imported data
Analysis begun: sexta-feira, 11 de novembro de 2022 19:11:39
UPGMA
Euclidean
Objects
Node Group 1 Group 2 Dissimil. in group
1 CON.BB.B (3) PP1.BB.B (3) 0 2
2 Node 1 PP3.BB.B (3) 0 3
3 PE4.BB.B (3) PP2.BB.B (3) 0 2
4 Node 2 PP4.BB.B (3) 1 4
5 CON.BB.S (1) PE1.BB.S (1) 2 2
6 PP2.BB.I (2) PP4.BB.I (2) 2 2
7 PE1.BB.B (3) PE3.BB.B (3) 2 2
8 Node 4 Node 3 2.059 6
9 PE2.BB.S (1) PE4.BB.S (1) 2.828 2
10 Node 5 Node 9 2.96 4
11 PE2.BB.I (2) PE4.BB.I (2) 3 2
12 PP1.BB.I (2) PE2.BB.B (3) 3 2
13 PP1.BB.S (1) PP2.BB.S (1) 3.162 2
14 PE1.BB.I (2) Node 6 3.384 3
15 Node 13 PP4.BB.S (1) 3.461 3
16 Node 14 PP3.BB.I (2) 4.241 4
17 Node 12 Node 7 4.407 4
18 Node 15 PE3.BB.I (2) 5.02 4
19 Node 16 Node 11 5.112 6
20 Node 10 Node 18 5.596 8
21 PE3.BB.S (1) Node 19 6.089 7
22 Node 17 Node 8 6.369 10
23 Node 20 Node 21 6.501 15
24 PP3.BB.S (1) CON.BB.I (2) 6.708 2
25 Node 23 Node 24 8.638 17
26 Node 25 Node 22 9.643 27
84
PRINCIPAL COMPONENTS ANALYSIS

Imported data
Analysisbegun: sexta-feira, 11 de novembro de 2022 19:10:15
Tolerance of eigenanalysis set at 1E-007
Eigenvalues
Axis 1 Axis 2
Eigenvalues 22.753 9.346
Percentage 64.866 26.644
Cum. Percentage 64.866 91.509
PCA variableloadings
Axis 1 Axis 2
T-3 0.224 -0.974
T-2 0.55 0.089
T-1 0.546 0.141
T 0.592 0.156
PCA case scores

Groups Axis 1 Axis 2
CON.BB.S 1 0.521 0.793
PE1.BB.S 1 0.753 0.854
PE2.BB.S 1 0.619 0.818
PE3.BB.S 1 -0.123 0.648
PE4.BB.S 1 0.939 0.497
PP1.BB.S 1 1.51 0.007
PP2.BB.S 1 0.912 0.064
PP3.BB.S 1 1.81 -0.713
PP4.BB.S 1 1.043 -0.499
CON.BB.I 2 0.728 -1.178
PE1.BB.I 2 0.101 0.48
PE2.BB.I 2 0.196 -0.303
PE3.BB.I 2 1.065 0.304
PE4.BB.I 2 0.222 -0.5
PP1.BB.I 2 -0.261 -0.391
PP2.BB.I 2 0.249 -0.067
PP3.BB.I 2 -0.561 0.329
PP4.BB.I 2 0.09 0.083
CON.BB.B 3 -1.249 0.385
PE1.BB.B 3 -0.854 -1.334
PE2.BB.B 3 -0.816 -0.515
PE3.BB.B 3 -0.942 -0.952
PE4.BB.B 3 -1.161 0.003
PP1.BB.B 3 -1.249 0.385
PP2.BB.B 3 -1.161 0.003
PP3.BB.B 3 -1.249 0.385
PP4.BB.B 3 -1.133 0.415

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UNIVERSIDADE PAULISTA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

ALEX LUCIANO FERNANDES

ESTUDOS DO MICROPLÁSTICO EM MODELO EXPERIMENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto

Orientador: Prof. Dr. Thiago Berti Kirsten

Instituição: Programa de Pós-Graduação em Patologia

Mestrado em Patologia Ambiental e Experimental

Área de concentração: Patologia Ambiental e Experimental

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

1. Danio rerio. 2. Modelo animal. 3. Plástico. 4. Ecotoxicologia.

Ficha elaborada pelo Bibliotecário Rodney Eloy CRB8-6450

ESTUDOS DO MICROPLÁSTICO EM MODELO EXPERIMENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto

Aprovado(a) em: ___/___/_____

Prof (a). Dr.(a) _________________________________________________________

Prof (a). Dr.(a) _________________________________________________________

Prof (a). Dr.(a) _________________________________________________________

FERNANDES, A. L. Estudos do microplástico em modelo experimental de zebrafish:

O acúmulo de lixo plástico em ambientes naturais é um problema global com impactos

Palavras-chave: Danio rerio; Modelo animal; Plástico; Ecotoxicologia; Poluição ambiental;

FERNANDES, A. L. Microplastic studies in an experimental zebrafish model: behavior and

Accumulation of plastic waste in natural environments is a global issue with negative

Keywords: Danio rerio; Animal model; Plastic; Ecotoxicology; Environment pollution;

Figura 2 – Zebrafish. Zebrafish mantidos no aquário de manutenção de nosso laboratório. O aquário

Figura 3 – Aquários experimentais e comportamentais. Aquários experimentais onde os zebrafish

Figura 4 – Dendrograma de reação de alarme. Efeitos da exposição aos microplásticos polietileno

Figura 5 – Análise de componentes principais da reação de alarme. Efeitos da exposição aos

Figura 6 – Dendrograma de distribuição espacial basal. Efeitos da exposição aos microplásticos

Figura 7 – Análise de componentes principais da distribuição espacial basal. Efeitos da exposição

Figura 8 – Comportamento. Efeitos da exposição aos microplásticos polietileno (PE) e polipropileno

Esta seção aborda assuntos disponíveis na literatura especializada relacionados ao

1.1 Microplástico: características e impactos ambientais

O acúmulo de lixo plástico em ambientes naturais é um problema global com impactos

gerando detritos de plásticos progressivamente menores. Os principais polímeros relacionados

Há um potencial considerável de detritos plásticos microscópicos que se acumulam em

células e provocar efeitos negativos na estrutura celular e tecidual (LUSHER; HOLLMAN;

1.2 Zebrafish: características e uso em pesquisas experimentais

desenvolvimento rápido (LIESCHKE; CURRIE, 2007; KALUEFF; STEWART; GERLAI,

produtos farmacêuticos em ecossistemas aquáticos, em especial as psicoativas (diazepam ou

São três objetivos principais: estudar os efeitos da exposição a diferentes tipos de

2.1 Objetivos específicos

 Expor zebrafish adultos a dois tipos de microplásticos, PE e PP, em diferentes

Nesta seção, são apresentados os procedimentos éticos e legais, informações relativas

3.1 Declaração de ética

concentrações. As concentrações mínima, média e máxima de cada microplástico foram 0,1,

Figura 1 – Confecção dos microplásticos

Fonte: dos autores

Um total de 90 zebrafish adultos de 4–5 cm e 3–4 meses de idade foram obtidos de um

Figura 2 – Zebrafish. Zebrafish mantidos no aquário de manutenção de nosso laboratório. O aquário

Fonte: dos autores

3.4 Exposição, grupos e delineamento experimental

Os microplásticos nas diferentes concentrações foram sempre adicionados em cada

Figura 3 – Aquários experimentais e comportamentais

Fonte: dos autores

3.5 Distribuição espacial diária nos aquários

3.7 Peso e sexo

Imediatamente depois da avaliação comportamental, os zebrafish foram submetidos à

3.8 GFAP no encéfalo

Os mesmos zebrafish submetidos à eutanásia descritos para a avaliação do peso e sexo

Aprovado(a) em: _/_/_____