DISCIPLINA: CIÊNCIAS CRIATIVAS

MICROSCOPIA

MICROSCOPIA ÓPTICA DE LUZ

Ao se estudar os seres vivos, ao nível celular, devem-se empregar várias técnicas visando superar três principais
limitações destes estudos: as pequenas dimensões celulares, a grande espessura da maioria dos tecidos e a
transparência (falta de contraste) das células e de suas estruturas. Em conseqüência, o estudo da organização celular
depende do uso de microscópios, aparelhos destinados à observação de detalhes difíceis de serem observados a olho
nu e do emprego de técnicas básicas de preparação do material a ser analisado. Para uma boa observação
microscópica, além de saber preparar adequadamente o material, é necessário conhecer os componentes do
microscópio e as funções de cada um, para tirar deles o máximo proveito.
O microscópio de luz é assim chamado pelo fato de ter como fonte luminosa a luz branca, geralmente proveniente de
uma lâmpada com filamento de tungstênio. Este microscópio é composto basicamente por dois sistemas de lentes
de aumento (oculares e objetivas) que produzem imagens ampliadas do material observado. Além dessas lentes,
o microscópio possui uma parte mecânica (base, braço, revólver, platina, charriot, parafusos macro e
micrométrico e parafuso de regulagem do condensador) e um sistema de iluminação (fonte luminosa, diafragmas,
condensador e filtros). Os componentes básicos do microscópio de luz são mostrados na figura 1.1.

DESCRIÇÃO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO

1.Parte
Mecânica
 Pé ou
Base
 Braço ou Coluna
 Platina
 Charriot
 Parafuso Macrométrico
 Parafuso Micrométrico
 Canhão ou Tubo de Observação
 Revólver

2. Parte Óptica
 Sistemas de Iluminação (abaixo da platina):
- Fonte de luz
- Condensador
- Diafragma
 Objetivas
 Ocular (es)
 Figura 3.1 – Componentes do microscópio de luz.

Formação da Imagem e Aumento

A imagem de um objeto pode ser ampliada quando observada por meio de uma simples lente de vidro.
Combinando um número de lentes de forma correta, pode-se construir um microscópio que permitirá a obtenção de
imagens em grandes aumentos. A primeira lente de um microscópio de luz é a que está mais próxima do objeto
sendo examinado (amostra) e, por esta razão, é chamada de objetiva. Inicialmente, a luz da fonte luminosa do
microscópio, geralmente uma lâmpada embutida no equipamento, passa pelo condensador que forma um cone de
luz bem definido, concentrando a luz em direção à amostra (Figura 1.2). A luz passa por esta e em seguida pela
objetiva que, então, projeta uma imagem real, invertida e aumentada da amostra em um plano fixo dentro do
microscópio, chamado plano intermediário da imagem. Nessa etapa, a imagem parece estar “flutuando” em um
espaço de cerca de 10 mm abaixo do topo do tubo de observação do microscópio.
A lente ocular é o mais distante componente óptico da amostra e serve para aumentar, posteriormente, a
imagem real projetada pela objetiva. Dessa forma, a ocular produz uma imagem secundária aumentada que é captada
pelo olho do observador (Figura 1.2).
O aumento total do objeto observado é calculado multiplicando-se os valores do aumento da ocular e da objetiva.
Por exemplo, ao se usar uma ocular de 10X com uma objetiva de 4X, a imagem final do objeto estará aumentada
40X, onde:

Aumento final do microscópio = aumento da ocular x aumento da objetiva

Figura 3.2 – Trajetória da luz no microscópio.

Especificações das lentes objetivas

As lentes objetivas não diferem entre si apenas quanto ao aumento. Existem diferentes tipos de lentes,
dependendo do material usado na construção, da finalidade da lente e de sua especialização. Algumas
características influenciam na qualidade da imagem, oferecendo maior ou menor grau de correção de aberrações.
As mais sofisticadas têm custo elevado e são, de maneira geral, usadas para fins de pesquisa. As especificações
de cada lente objetiva são fornecidas pelo fabricante e vêm indicadas na própria lente (figura 1.3).
Figura 3.3 – Especificações da lente objetiva.
Tipos de objetivas de acordo com a qualidade óptica
a) Acromáticas: são as mais simples e baratas, presentes em microscópios comuns.
b) Semi-apocromáticas: construídas com fluorita, um material que proporciona alguma correção para
aberrações.
c) Apocromáticas: fornecem correção ampla para as aberrações.
d) Planacromáticas: além de proporcionar correção, são ótimas para fotomicrografias, pois o campo fica todo em
foco.
e) Planapocromáticas: são as melhores e as mais caras, combinando as correções das apocromáticas e
planacromáticas, o que resulta em grande resolução.

Códigos de cores das lentes objetivas

Ao usar o microscópio, observe que cada lente objetiva (figura 1.3) tem Aumento Código de Cor
uma marcação (anel) com determinada cor que ajuda na identificação rápida 2X ou 2,5X Marrom
do aumento a ser utilizado. A presença desses códigos é bastante útil quando 4X ou 5X Vermelho
se utiliza um equipamento contendo muitas objetivas. As objetivas de 10X Amarelo
imersão têm código adicional de cor que indica o meio de imersão que 16X ou 20X Verde
deve ser usado. 40X ou 50X Azul claro
60X Azul cobalto
100X – óleo Preto
Extensão do tubo
100X – glicerina Laranja
Esta especificação vem gravada na objetiva (Fig. 1.3) e corresponde ao comprimento do tubo do microscópio,
situado entre as objetivas e as oculares. Essa medida pode ser fixa (geralmente 160 mm) ou corrigida ao infinito
(nos microscópios mais modernos). No primeiro caso, a obtenção de imagens de qualidade só é possível quando
a objetiva é construída a uma determinada distância das oculares. No segundo caso, o tubo é equipado com
acessórios ópticos que permitem a obtenção de uma imagem precisa, sem necessidade de se estabelecer um
comprimento fixo para o mesmo (símbolo ∞).

Distância de trabalho

É a distância em mm entre a lente objetiva e a superfície da lâmina, quando a amostra está em foco. Encontra-se
indicada na lente (Fig. 1.3). De maneira geral, a distância de trabalho da objetiva diminui à medida que a
ampliação aumenta.

Poder de resolução e limite de resolução

Quando se observa qualquer estrutura ao microscópio, o observador não está vendo diretamente a estrutura e
sim a imagem desta. A imagem é uma representação da estrutura e, obviamente, ela deve reproduzir de forma
acurada o material analisado. Portanto, um bom microscópio não é aquele que dá maior aumento e sim aquele que
reproduz os detalhes do material observado. Não importa quantas vezes uma lente amplia, se ela não é capaz de
fornecer uma imagem nítida do objeto observado. Dessa forma, um bom microscópio é sempre considerado em
termos do seu poder de resolução.
Poder de resolução é um termo usado em microscopia para se referir à fineza de detalhes que pode ser obtida em
um microscópio. Conforme mencionado, a capacidade de aumento de um microscópio só tem valor quando
acompanhada de um aumento paralelo do poder de resolução.

Poder de resolução: fineza de detalhes fornecida pelo microscópio

O poder de resolução de um microscópio é estimado pelo seu limite de resolução, definido como a menor
distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados.

Quanto menor o limite de resolução, maior o poder de resolução

O limite de resolução é calculado pela equação do matemático e físico alemão Ernest Abbe:
 LR= 0,612 x γ / AN
0,612 = constante
AN = abertura numérica da lente objetiva
γ = comprimento de onda da fonte luminosa utilizada

Abertura numérica

A abertura numérica (AN), ou número de abertura, indica a resolução de uma lente objetiva, ou seja, sua capacidade
de captar a luz e fornecer detalhes da amostra a uma determinada distância desta. Esse número é pré-
determinado na construção das lentes objetivas e já vem grafado na própria lente (Fig. 1.3), podendo variar entre
0,1 (para aumentos muito pequenos) até 1,4 (para grandes aumentos obtidos com objetivas de imersão).
A AN é calculada a partir da seguinte equação:

AN = n x senα
N = índice de refração do meio situado entre a amostra e a lente objetiva
α = metade do ângulo de abertura da lente objetiva

Índice de refração (n): para objetivas secas = 1 (ar)

para objetivas de imersão = 1,51 (óleo)
= 1,45 (glicerina)

Medidas das células

As células só podem ser observadas ao microscópio porque têm dimensões abaixo do limite de resolução do
olho humano (Figura 1.4). As dimensões de uma célula, vista ao microscópio de luz, são expressas em
micrômetros (μm), unidade que representa a milésima parte do milímetro (mm). Para estruturas intracelulares
observadas ao microscópio eletrônico, a medida utilizada é o nanômetro (nm) que significa um milésimo do
micrômetro.

Unidade de medida Símbolo Valor

Micrômetro μm 0,001 mm
Nanômetro nm 0,000001 mm ou 10-3 μm

Figura
3.4 – Escala de limite de resolução.

Como usar o Microscópio

1. Antes de ligar o microscópio, verifique se ele está ligado a corrente elétrica, em seguida verifique o controle
de intensidade da iluminação e certifique-se de que a objetiva de menor aumento (4 ou 5X) está posicionada.

2. Ligue o microscópio e gire o parafuso macrométrico até abaixar toda a platina. Coloque a lâmina na platina,
sempre com a lamínula voltada para cima, prendendo-a convenientemente. Em seguida ajuste o foco do
espécime observado utilizando o parafuso macro e micrométrico. Ajuste a intensidade da iluminação mais
adequada. Certifique-se de estar observando a estrutura em foco simultaneamente com os dois olhos. Se não
estiver, acerte a distância interpupilar aproximando ou afastando as duas oculares. Verifique também se as duas
oculares estão em foco. Se não estiverem, focalize bem o material olhando em apenas uma delas, e gire depois a outra
ocular até acertar o foco. Quem é míope ou tem hipermetropia não precisa usar óculos para observar ao microscópio,
somente quem possui astigmatismo. Atenção: não tocar os dedos nas lentes!

3. Utilizando os parafusos do Charriot, examine a lâmina e selecione a área que deverá ser observada com maior
aumento. A área selecionada deverá estar no centro do campo e em foco, antes de se passar ao aumento
seguinte (10X). Posicione a objetiva e, desse momento em diante, ajuste o foco utilizando-se apenas do parafuso
micrométrico. Ajuste sempre a iluminação mais adequada para cada aumento, utilizando-se também do diafragma do
condensador.

4. Para passar ao aumento seguinte (40X) proceda exatamente como no item anterior.

5. Para focalizar com a objetiva de 100X é necessária a utilização de óleo de imersão. A lâmina deverá estar
perfeitamente focalizada na objetiva de 40X, e a área a ser observada colocada no centro do campo. Desloque a
objetiva de 40X girando o revolver, porém sem encaixar a objetiva de 100X, parando a meio caminho. Coloque
uma pequena gota de óleo sobre a área iluminada da lâmina e posicione a objetiva de imersão. Note que a
extremidade inferior da lâmina ficará imersa na gota de óleo. Utilizando-se apenas do parafuso micrométrico
encontre o foco que deverá estar bem próximo.

Caso não consiga, volte para a objetiva de menor aumento, reiniciando todos os passos. Importante: não tente
focalizar o material nas objetivas de 10, 40 e 100X com o parafuso macrométrico, pois, com grande
chance, você quebrará a lâmina.

6. Para retirar a objetiva da imersão, gire o revólver posicionando a objetiva de menor aumento (4X). Retire a
lâmina, limpe-a bem, fazendo o mesmo com a objetiva de imersão com lenço de papel embebido levemente em
álcool-éter. Cuidado ao manusear estas substâncias que, além de serem solventes de plástico, são inflamáveis e
seus vapores são tóxicos.

7. Verifique se as objetivas estão encaixadas, caso contrário você verá o campo completamente escuro ou
parcialmente iluminado.

8. Ao terminar a sua prática, abaixe toda a platina, gire o revolver de modo a posicionar a objetiva de menor
aumento. Desligue o microscópio e limpe-o utilizando lenço de papel. Verifique se a lâmina foi retirada e guardada no
seu respectivo lugar, e se o controle de iluminação está no mínimo. Por fim, cubra o microscópio e deixe-o sempre
como gostaria de encontrá-lo!

ATENÇÃO: Não use as capas do microscópio para limpar bancada ou outro!! Não jogue sujeira (papel, aparas
de lápis, etc) no chão ou gavetas!! Nunca arrastar o microscópio pela bancada!!

IMPORTANTE:
Para limpeza das lentes do microscópio, inclusive a objetiva de imersão, nunca use
soluções corrosivas ou xilol, as quais podem danificar o sistema óptico. A limpeza deverá
ser feita periodicamente com solução apropriada (álcool e éter absolutos, na proporção
de 3:7) e pela pessoa responsável pelo equipamento. Rotineiramente, usa-se para
limpeza das lentes, apenas um lenço de papel macio e seco. O microscópio deve ser
mantido protegido da poeira e livre da umidade. Esta pode provocar o aparecimento de
fungos que danificam as lentes.