HIPÁCIA WERNECK GOMES

INVESTIGAÇÃO DA PLASTICIDADE MORFOLÓGICA E

FENOTÍPICA DE CÉLULAS BASAIS E DE MACRÓFAGOS NO
EPITÉLIO PROSTÁTICO DE RATOS EM DIFERENTES
MICROAMBIENTES HORMONAIS

Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais
Fevereiro/2020
 HIPÁCIA WERNECK GOMES

INVESTIGAÇÃO DA PLASTICIDADE MORFOLÓGICA E

FENOTÍPICA DE CÉLULAS BASAIS E DE MACRÓFAGOS NO
EPITÉLIO PROSTÁTICO DE RATOS EM DIFERENTES
MICROAMBIENTES HORMONAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Celular do Departamento de
Morfologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da
Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre
em Ciências.

Área de concentração: Biologia Celular

Orientador(a): Dr. Cleida Aparecida de Oliveira

Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais
Fevereiro/2020
043 Gomes, Hipácia Werneck.
Investigação da plasticidade morfológica e fenotípica de células basais e de
macrófagos no epitélio prostático de ratos em diferentes microambientes
hormonais [manuscrito] / Hipácia Werneck Gomes. – 2020.
115 f. : il. ; 29,5 cm.

Orientador(a): Dr. Cleida Aparecida de Oliveira.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de
Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular.

1. Neoplasia. 2. Próstata. 3. Macrófagos. I. Oliveira, Cleida Aparecida de. II.

Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III.
Título.

CDU: 576

Ficha catalografica elaborada por Fabiane C. M. Reis – CRB: 6/2680

Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Biologia da Reprodução do Departamento de
Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, sob
a orientação da Profª. Drª. Cleida Aparecida de Oliveira, e contou com o auxílio financeiro da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).
Aos meus pais, a base de tudo, a quem sou grata por todo amor
e dedicação em me fazer feliz.
 AGRADECIMENTOS

Chegar até aqui não foi fácil, mas tenho certeza que o caminho percorrido foi mais leve e
prazeroso graças às maravilhosas pessoas que Deus colocou na minha vida.

Agradeço à minha querida orientadora, Cleida Oliveira, pelo constante incentivo. Sou grata
por ter aberto as portas do laboratório com tanto carinho, e por ter guiado minha trajetória
desde então. Você me ensinou a olhar o mundo microscopicamente, e eu me encantei por ele!
Você me ensinou que um trabalho bem feito exige paciência, dedicação, e sobretudo muito
amor. E essa semente do amor pela ciência, que você plantou em mim durante a nossa
primeira conversa, e regou ao longo desses anos, floresceu, e originou esse trabalho lindo,
feito por NÓS. Muito obrigada!

Agradeço ao Professor Germán A.B. Mahecha, pela disponibilidade em ajudar sempre que
preciso e por compartilhar sua sabedoria.

Agradeço aos queridos amigos do LABRE, pela convivência e paciência ao longo desses
anos. Agradeço ao Gabriel, que não por acaso tem nome de anjo, por ter me apresentado ao
laboratório e ter sido desde então minha dupla de experimentos e ideias. Sua disponibilidade e
paciência foram fundamentais no meu aprendizado. Agradeço à Bruna, minha companheira de
eventos (científicos ou não), pela companhia diária, por estar do meu lado tomando bons
drinks para comemorar as conquistas ou chorar as frustações e dúvidas. Agradeço à Clara,
nossa “severina”, pelo apoio e pela doce ajuda, especialmente nesses últimos meses.
Agradeço a todos que estão e já estiveram no laboratório, e que tive o prazer de conviver:
Elisângela, Jonas, Wiviane, Felipe, Monalise. Esse trabalho tem um pedacinho de cada um de
vocês!

Agradeço à Mônica, por ter me acolhido como filha científica durante seu doutorado. Meus
primeiros passos profissionais foram inspirados em você! Obrigada por me ensinar a ser
pesquisadora e por sempre estar disposta a responder às minhas dúvidas.

Agradeço ao querido professor José Carlos Nogueira, pela contagiante alegria em aprender e
ensinar. Ver sua empolgação em trabalhar e colaborar com a pesquisa é motivador.
Agradeço ao Lucas, meu marido, por acreditar na minha capacidade acima de tudo. Agradeço
todo o carinho e dedicação com que você vem cuidando de nós. Obrigada por ser meu suporte
em todos os momentos em que duvidei de mim mesma, e por toda a ajuda direta e indireta na
realização desse trabalho. E como se não bastasse as dificuldades e desafios enfrentados por
dois mestrandos, você embarcou comigo na aventura de uma vida a dois, que vem sendo
desafiadora e maravilhosa. Obrigada por tanto!

Agradeço aos meus pais pelo amor incondicional. O trabalho que desenvolvi é reflexo da
dedicação que vocês empenharam na minha educação e formação. Vocês me ensinaram a não
desistir diante das dificuldades, sempre me incentivando a ser o melhor que eu pudesse ser.

Agradeço à minha grande família, por sempre permanecer unida. Em especial, agradeço às
minhas avós, por dividirem comigo a sabedoria adquirida ao longo dos anos, sempre com
muito carinho. À minha prima Nathália, agradeço pela amizade que construímos desde a
infância, e por estar presente em todos os momentos. À minha afilhada Alice, por me
apresentar um amor que eu ainda não conhecia, o amor de madrinha, e por alegrar a minha
vida com pequenos gestos. Amo vocês!

Agradeço aos amigos antigos e aqueles que conheci durante o Mestrado, pelas conversas e
momentos de descontração que atenuaram as dificuldades. Em especial, à Maria Alice e à
Karen, por terem me ajudado na elaboração dos vídeos que estão nesse trabalho. À Kiany, por
me socorrer sempre que o Western Blotting não funcionava. À Flávia, pela parceria e
colaboração.

Agradeço aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular por terem

contribuído com a minha formação

Agradeço à UFMG, que foi minha segunda casa durante esses anos e me proporcionou
grandes experiências e aprendizados.

A todos, meu sincero OBRIGADA!

“Não devemos esquecer que, quando o rádio foi descoberto,
ninguém sabia que seria útil em hospitais. Tratava-se de um
trabalho de ciência pura. E isto é uma prova de que o trabalho
não deve ser considerado do ponto de vista da sua utilidade
direta. Deve ser feito por si mesmo, pela beleza da ciência. E
sempre há a possibilidade de que uma descoberta científica se
torne, tal como o rádio, um benefício para a humanidade.”

Trecho do discurso de Marie Curie no Vassar College em 14 de maio de 1921

 RESUMO

O compartimento basal do epitélio prostático é composto por células basais que, além de
estarem associadas à manutenção da homeostase tecidual, podem estar relacionadas à
iniciação e progressão do câncer de próstata. As células basais prostáticas constituem uma
população heterogênea, onde se encontram diversas subpopulações com diferentes
contribuições estruturais e funcionais para a próstata. Porém, pouco se sabe sobre a regulação
do número, da morfologia e da função das diferentes subpopulações de células basais, bem
como a influência dessas células nas modificações que acontecem no epitélio durante o
processo carcinogênico. Complicando ainda mais a compreensão sobre o compartimento basal
do epitélio, esse pode abrigar macrófagos, que por muitos anos foram confundidos com as
células basais. O que vem chamando atenção é a participação dos macrófagos no
desenvolvimento e progressão do câncer de próstata, porém os relatos em relação a presença
dessas células imunes no epitélio no contexto tumoral são escassos e superficiais. Portanto, o
objetivo do presente estudo foi investigar possíveis alterações na morfologia e no fenótipo de
células basais e de macrófagos no epitélio prostático de ratos Wistar em diferentes
microambientes hormonais. Para isso, foram utilizados três modelos experimentais: (1)
envelhecimento, (2) indução de lesões prostáticas através do tratamento prolongado com
testosterona e estradiol e (3) castração. Ensaios de imuno-histoquímica e imunofluorescência
mostraram que as células basais estão amplamente distribuídas na próstata,
independentemente da idade dos animais, e apresentam morfologia variada. A população de
células basais CK5-positivas aumentou no epitélio prostático ao longo do envelhecimento,
enquanto as células basais p63-positivas reduziram. Macrófagos com fenótipo e morfologia
variados foram observados no epitélio prostático após castração cirúrgica e em lesões pré-
malignas e malignas, tanto observadas naturalmente ao longo do envelhecimento quanto após
tratamento com testosterona e estradiol. Além disso, delgadas projeções citoplasmáticas das
células basais foram observadas se estendendo ao redor dos macrófagos intraepiteliais nas
lesões prostáticas, mostrando uma íntima interação entre essas células. Considerando o
conjunto de resultados, conclui-se que os macrófagos e as células basais são células
extremamente plásticas, capazes de adaptar a morfologia e o fenótipo dependendo do
microambiente local, além de desempenharem um papel importante no desenvolvimento e
progressão das lesões prostáticas.
Palavras-chave: Próstata. Células basais. Macrófagos. Câncer.
 ABSTRACT

The basal compartment of the prostatic epithelium is composed of basal cells that, in addition
to being associated with the maintenance of tissue homeostasis, may be related to the
initiation and progression of prostate cancer. Basal cells of the prostate constitute a
heterogeneous population, presenting several subpopulations with different structural and
functional contributions to the prostate. However, little is known about the regulation of the
number, morphology and function of basal cell subpopulations, as well as the influence of
these cells on the changes that occur in the epithelium during the carcinogenic process.
Complicating even more the understanding of the basal compartment of the prostatic
epithelium, it may contain macrophages, which for many years have been confused with basal
cells. The participation of macrophages in the development and progression of prostate cancer
has been drawing attention, but reports regarding the presence of these immune cells in the
epithelium in the tumoral context are scarce and superficial. Therefore, the aim of the present
study was to investigate possible changes in the morphology and phenotype of basal cells and
macrophages in the prostatic epithelium of Wistar rats in different hormonal
microenvironments. For this, three experimental models were used: (1) aging, (2) induction of
prostatic lesions through prolonged treatment with testosterone and estradiol and (3)
castration. Immunohistochemistry and immunofluorescence assays have shown that basal
cells are widely distributed in the prostate, regardless of the age of the animals, and they have
varying morphology. The population of CK5-positive basal cells increased in the prostatic
epithelium during aging, while the p63-positive basal cells decreased. Macrophages with
varied phenotype and morphology were observed in the prostatic epithelium after surgical
castration, as well as in pre-malignant and malignant lesions, either observed naturally during
aging or after treatment with testosterone and estradiol. In addition, thin cytoplasmic
projections of the basal cells have been observed to extend around the intraepithelial
macrophages in prostatic lesions, highlighting an intimate interaction between these cells.
Taken together, our results show that macrophages and basal cells are extremely plastic cells,
capable of adapting their morphology and phenotype depending on the local
microenvironment, playing an important role in the development and progression of prostatic
lesions.
Keywords: Prostate. Basal cells. Macrophages. Cancer.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Comparação entre a estrutura anatômica e histológica da próstata 16

humana e de ratos
Figura 2. Representação esquemática das células de origem do câncer de próstata 20
Figura 3. Representação esquemática das etapas de síntese dos principais 22
hormônios esteroides sexuais que ocorre nas adrenais, nos testículos e
na próstata
Figura 4. Esquema representando a progressão das lesões prostáticas. 28
Figura 5. Representação esquemática exemplificando as diferenças entre 30
macrófagos M1 e M2 em relação aos marcadores, produção de
citocinas e metabolismo celular
Figura 6. Representação das funções pró-tumorigênicas exercidas pelos 32
macrófagos associados ao tumor (TAM)
Figura 7. Representação da interação entre macrófagos e células de Leydig para 35
realização da esteroidogênese
Figura 8. Variação morfológica das células basais CK5-positivas encontradas ao longo 92
do epitélio prostático de ratos Wistar
Figura 9. Variação quantitativa das células basais CK5-positivas encontradas no 93
epitélio prostático de ratos Wistar ao longo do envelhecimento
Figura 10. Variação quantitativa das células basais CK5-positivas presentes no epitélio 93
prostático de ratos Wistar após castração e reposição hormonal.
Figura 11. Variação quantitativa das células basais p63-positivas encontradas no epitélio 94
prostático de ratos Wistar ao longo do envelhecimento.
Figura 12. Variação quantitativa das células basais intensamente coradas para aromatase 95
presentes no epitélio prostático de ratos Wistar após castração e reposição
hormonal.
 LISTA DE ABREVIATURAS

3β-HSD 3β-hidroxiesteroide desidrogenase

ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
ADT Terapia de privação androgênica
AP Próstata anterior
AR Receptor de andrógeno
CaP (ou PCa) Câncer de próstata
CCL2 Proteína quimiotática de monócitos
CD163 Receptor scavenger da hemoglobina
CD206 Receptor de manose
CK Citoqueratina
CKHMW Citoqueratina de alto peso molecular
CYP Citocromo P450
DHEA Dehidroepiandrostrona
DHEA-S Sulfato de dehidroepiandrosterona
DHT Di-hidrotestosterona
DNA Ácido desoxirribonucleico
DP Próstata dorsal
E2 Estradiol
EGF Fator de crescimento epidermal
ERα (ou ESR1) Receptor de estrógeno α
ERβ (ou ESR2) Receptor de estrógeno β
Fizz-1 Fator mitogênico induzido por hipóxia
IFN γ Interferon γ
IL Interleucina
INCA Instituto Nacional de câncer
iNOS Óxido nítrico sintase induzida
LC3 Proteína associada a microtúbulos 1A/1B – cadeia leve 3
LH Hormônio luteinizante
LP Próstata lateral
M1 Macrófagos tipo 1 classicamente ativados
M2 Macrófagos tipo 2 alternativamente ativados
M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos
MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos
MCM7 Proteína de manutenção minicromossômica 7
MMP Metaloproteinases da matriz
MNU N-metil-N-nitrosoureia
NO Óxido nítrico
PCa Câncer de próstata
Ph Potencial hidrogeniônico
PIA Atrofia inflamatória proliferativa
PIN Neoplasia intraepitelial prostática
PSA Antígeno prostático específico
ROS Espécies reativas de oxigênio
RXR Receptor de reteinoide X
TAM Macrófagos associados ao tumor
TGF-β Fator de crescimento transformante β
TNF Fator de necrose tumoral
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VP Próstata ventral
 SUMÁRIO

I. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................. 14

1. A PRÓSTATA .................................................................................. 15
1.1. Características gerais da próstata ............................................... 15
1.1.1. Células basais prostáticas ................................................... 17
1.2. Regulação hormonal da próstata ................................................ 21
1.2.1. Andrógenos ........................................................................ 22
1.2.2. Estrógenos .......................................................................... 24
2. INFLAMAÇÃO ................................................................................ 26
2.1. Inflamação na próstata ................................................................ 26
2.1.1. Associação entre inflamação e câncer ............................... 27
2.2. Macrófagos ................................................................................. 29
2.2.1. Macrófagos associados ao tumor ....................................... 31
2.2.2. Hormônios esteroides sexuais e macrófagos ..................... 34
2.2.3. Macrófagos na próstata ...................................................... 36
II. JUSTIFICATIVA ...................................................................................... 38
III. OBJETIVOS .............................................................................................. 41
IV. RESULTADOS .......................................................................................... 43
CAPÍTULO I – Artigo publicado ........................................................... 45
CAPÍTULO II – Artigo submetido ........................................................ 64
CAPÍTULO III – Resultados adicionais não publicados ....................... 91
V. DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO ................................................. 96
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 99
 14

I. REVISÃO DE LITERATURA
 15

I. REVISÃO DE LITERATURA

1. A PRÓSTATA

1.1. Características gerais da próstata

A próstata é uma glândula anexa do sistema genital masculino de mamíferos. A

palavra próstata é derivada do grego “prostates”, que significa ''alguém que está diante de
algo ou alguém'' (Marx e Karenberg 2009). Essa denominação refere-se ao fato da próstata
localizar-se na cavidade pélvica, distal ao colo da bexiga, envolvendo a porção inicial da
uretra.
A principal função da próstata é secretar o líquido prostático, que corresponde a
aproximadamente 30% do plasma seminal em humanos, e é caracterizado por uma secreção
homogênea, leitosa, de pH 7,3 (Fair e Cordonnier 1978; Verze et al. 2016). Essa secreção tem
composição diversificada, incluindo cátions metálicos, como zinco, lipídeos, citrato e
proteínas, como albumina, lactoferrina, defensina, fibrinolisina, coagulase, fosfatase ácida e
antígeno prostático específico (PSA) (Kumar e Majumder 1995; Flint et al. 2015; Verze et al.
2016; Sfanos et al. 2018). Tais componentes, juntamente com as secreções produzidas pelas
demais glândulas anexas, são responsáveis por proporcionar condições para a sobrevivência
dos espermatozoides durante sua veiculação pelo sistema genital masculino e feminino,
possibilitando assim a fertilização (Kumar e Majumder 1995; Verze et al. 2016). Nesse
sentido, as enzimas fibrinolisina, coagulase e PSA estão envolvidas no processo de liquefação
do sêmen e do muco cervical, facilitando o trânsito dos espermatozoides (Flint et al. 2015;
Verze et al. 2016). O citrato, por sua vez, atua alcalinizando o pH vaginal, o que é
fundamental para a sobrevivência dos espermatozoides nas vias genitais femininas (Fair e
Cordonnier 1978; Flint et al. 2015).
A eliminação dos produtos secretados pela próstata ocorre através da uretra durante a
ejaculação, momento em que o líquido prostático irá se misturar aos espermatozoides
conduzidos pelos ductos deferentes e aos produtos da vesícula seminal, formando assim, o
sêmen (Kumar e Majumder 1995).
A ejeção da secreção glandular prostática durante a ejaculação é favorecida pela
contração da musculatura lisa presente no estroma prostático (Risbridger e Taylor 2006). O
estroma é de natureza conjuntivo-muscular liso, sendo a proporção e distribuição de seus
componentes variável entre as diferentes espécies. Enquanto na próstata humana a
 16

musculatura lisa é abundante e encontra-se amplamente distribuída por todo o estroma, em

ratos e camundongos o estroma é composto principalmente por tecido conjuntivo frouxo, e as
fibras musculares lisas concentram-se em uma delgada camada de células que circundam os
adenômeros glandulares (Hayward et al. 1996a). Em ambas as espécies, o estroma também
contém vasos sanguíneos e linfáticos, nervos, além de componentes do sistema imune como
mastócitos, macrófagos e linfócitos (Hayward et al. 1996a). O estroma e o epitélio glandular
prostático se influenciam de forma recíproca através de diferentes vias de sinalização,
garantindo um microambiente adequado para a homeostase e o desenvolvimento normal da
próstata (Hayward et al. 1996a; Risbridger e Taylor 2006).
Os adenômeros podem estar dispostos ao redor da uretra de maneira concêntrica,
como ocorre em humanos, ou na forma de lobos, como observado em ratos e camundongos
(Figura 1). Dessa forma, a próstata humana pode ser dividida em três zonas glandulares,
denominadas zona central, zona de transição e zona periférica, e uma região aglandular
constituída apenas por tecido fibromuscular, a zona anterior. Em ratos e camundongos o
complexo prostático é composto por quatro pares de lobos de simetria bilateral, denominados
de acordo com a posição em relação à uretra, sendo estes as próstatas anterior, dorsal, lateral e
ventral (Risbridger e Taylor 2006; Lee et al. 2011).

Figura 1. Comparação entre a estrutura anatômica e histológica da próstata humana e de ratos.

Os adenômeros podem estar dispostos de maneira concêntrica ao redor da uretra prostática, como
ocorre em humanos, ou na forma de lobos, como observado em roedores. Em ambas as espécies, os
adenômeros são revestidos por epitélio composto por células luminais (L, rosa), células
neuroendócrinas (marrom) e células basais (seta; verde). Entretanto, enquanto em humanos as células
basais formam uma camada contínua na base do epitélio, em roedores essas células são mais
esporádicas e estão dispersas entre as células luminais. Estroma (S); lúmen (Lu). Adaptado de
Risbridger e Taylor (2006); El-Alfy et al. (2000).
 17

A constituição histológica dos adenômeros da próstata humana e de outros animais,

incluindo roedores, é muito semelhante (Hayward e Cunha 2000; Risbridger e Taylor 2006),
sendo revestidos por epitélio geralmente prismático, composto por três tipos celulares
morfológica e funcionalmente distintos, sendo eles: células luminais, células neuroendócrinas
e células basais (Figura 1).
As células luminais, denominadas também células secretoras, são as mais abundantes
no epitélio prostático. Apresentam-se colunares e com o núcleo arredondado situado no terço
basal do citoplasma. Estas células altamente diferenciadas são responsáveis pela secreção dos
principais componentes do líquido prostático. Para garantir a composição proteica da
secreção, as células luminais apresentam retículo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi
desenvolvidos, além de numerosos grânulos de secreção apicais (El-Alfy et al. 2000;
Risbridger e Taylor 2006).
As células neuroendócrinas são encontradas esporadicamente no epitélio glandular
prostático. Elas participam da regulação intraepitelial, atuando no crescimento, diferenciação
e processos secretórios da próstata de maneira parácrina, autócrina ou neuroendócrina
(Rodriguez et al. 2003; Risbridger e Taylor 2006; Grigore et al. 2015). Existem dois tipos
morfológicos de células neuroendócrinas descritos, que apresentam importância funcional
distinta: as abertas, que alcançam o lúmen e consequentemente recebem estímulos luminais,
tais como variação química ou de pH, e as fechadas, que não alcançam o lúmen e recebem
estímulos basais, como fatores vindos do estroma (Grigore et al. 2015). Essas células
secretam vários tipos de neuropeptídios, incluindo cromogranina, serotonina, sinaptofisina,
somatostatina e calcitonina, além de fatores de crescimento como VEGF (fator de crescimento
endotelial vascular), que auxiliam na manutenção da homeostase das populações celulares
vizinhas (Rodriguez et al. 2003; Grigore et al. 2015).
Por ser o foco do presente estudo, as características das células basais serão abordadas
com mais detalhes no próximo tópico.

1.1.1. Células basais prostáticas

As células basais prostáticas são classicamente descritas como sendo pequenas,

encontradas no compartimento basal do epitélio, com formato triangular ou achatado, núcleo
pequeno e pouco citoplasma (El-Alfy et al. 2000; Taylor e Risbridger 2008). Em humanos
essas células formam uma camada contínua na base do epitélio, em contato com a lâmina
basal, e logo acima delas encontram-se as células luminais, em uma proporção de 1:1 entre
 18

essas células. Já em roedores as células basais são mais esporádicas e estão dispersas entre as
células luminais, em uma proporção de células basais:luminais de cerca de 1:10 em ratos e 1:4
em camundongos (Figura 1) (El-Alfy et al. 2000).
As células basais podem ser identificadas através da expressão de citoqueratina 5
(CK5), CK14 e p63 (Risbridger e Taylor 2006). A população de células basais é muito
heterogênea, sendo identificados até o momento, na próstata de camundongos adultos, sete
subpopulações que expressam diferentes combinações desses marcadores (Lee et al. 2014).
Tais subpopulações são encontradas em diferentes proporções e estágios de diferenciação no
epitélio prostático (Lee et al. 2014). Nesse sentido, algumas células basais apresentam-se mais
indiferenciadas e são consideradas as células tronco que podem gerar os demais tipos de
células epiteliais prostáticas e contribuir para a manutenção da homeostase tecidual (De
Marzo et al. 1998; Lee et al. 2014; Huang et al. 2015). Outras apresentam fenótipo mais
diferenciado , participando da regulação hormonal do epitélio prostático através da expressão
enzimas esteroidogênicas, tais como 3β-HSD (3β-hidroxiesteroide desidrogenase), 5α-
redutase tipo 2 e aromatase (El-Alfy et al. 2000; Pelletier et al. 2001; Morais-Santos et al.
2018), estando ativamente envolvidas na produção local de andrógenos e estrógenos.
Os avanços das técnicas de imagem na última década resultaram em um progresso
significativo sobre a compreensão da complexa rede de células basais encontrada nos epitélios
pseudoestratificados, especialmente no epidídimo. Inicialmente, foi observado que as células
basais não estavam restritas ao compartimento basal do epitélio, como se pensava
anteriormente, mas que essas podem apresentar projeções citoplasmáticas estreitas, que se
insinuam entre as demais células epiteliais, podendo alcançar o lúmen (Shum et al. 2008).
Posteriormente, reiterando a quebra na concepção de que as células epiteliais são estáticas e
restritas à base do epitélio, Roy e colaboradores (2016) elegantemente mostraram que as
projeções das células basais se entendem e retraem periodicamente em direção ao lúmen,
seguindo um padrão oscilatório. Dessa forma, foi então proposto que essa plasticidade de
movimento das células basais representava um mecanismo único pelo qual essas células
enviam sensores para monitorar o ambiente luminal, modular suas próprias funções e
subsequentemente influenciar o comportamento das células vizinhas (Shum et al. 2008; Roy
et al. 2016; Breton et al. 2019). Esses achados foram explorados no epitélio do epidídimo,
enquanto na próstata a plasticidade estrutural das células basais permanece pouco
caracterizada. O que se sabe é que as células basais prostáticas apresentam múltiplas
projeções, que partem tanto da região basal quanto da região apical da célula, e se
 19

interconectam, formando uma rede na base do epitélio (Soeffing et al. 1995; Hayward et al.
1996b).
No epidídimo, sabe-se que os prolongamentos das células basais criam junções
comunicantes com as células epiteliais adjacentes, estabelecendo uma interação dinâmica e
temporária, preservando a integridade epitelial (Roy et al. 2016). Na próstata, a presença de
junções comunicantes entre as células basais e as secretoras também já foi reportada,
indicando importante papel na comunicação célula-célula (El-Alfy et al. 2000; Habermann et
al. 2001). Assim, as células basais conseguem detectar tanto os estímulos apicais quanto os
basolaterais, evidenciando sua função sensorial e regulatória (El-Alfy et al. 2000; Shum et al.
2008; Roy et al. 2016).
Durante o desenvolvimento prostático, as células basais comportam-se como células-
tronco, multipotentes e auto renováveis, podendo se diferenciar e originar todas as demais
linhagens celulares epiteliais: basais, luminais e neuroendócrinas (Ousset et al. 2012; Lee et
al. 2014; Huang et al. 2015). Na próstata adulta, o tipo celular a qual as células-tronco
epiteliais pertencem é controverso. Embora estudos apontam a existência de células-tronco
dentre as subpopulações de células basais (Verhagen et al. 1992; De Marzo et al. 1998; Lee et
al. 2014), sabe-se que essa propriedade não está restrita ao compartimento basal, uma vez que
as células basais e luminais podem ser mantidas por progenitores celulares independentes
(Kurita et al. 2004; Wang et al. 2009; Choi et al. 2012; Liu e Goldstein 2014; Huang et al.
2015; Crowell et al. 2019). A contribuição de cada progenitor celular na fisiologia e/ou na
patogenia da próstata ainda não está muito bem elucidada, mas sabe-se que as células basais
são necessárias para a regeneração tecidual que ocorre após privação androgênica (McPherson
et al. 2010; Hussaim et al. 2012; Lu et al. 2013), podendo gerar novas células luminais para
manter a homeostase tecidual (Van Leenders et al. 2000; Lee et al. 2014; Toivanen et al.
2016).
Células basais são também alvo de grande interesse no processo de carcinogênese
prostática, desde que esse envolve a perturbação da estrutura do epitélio glandular,
evidenciada pela perda de células com fenótipo basal, o que gera um tumor com fenótipo
luminal (Choi et al. 2012; Wang Z et al. 2014). Apesar dessa característica, não há um
consenso quanto ao tipo celular de origem do câncer de próstata (CaP), mas sabe-se que tanto
as células luminais quanto as células basais podem originar o tumor, influenciando assim nas
suas propriedades biológicas (Goldstein et al. 2010; Choi et al. 2012; Taylor et al. 2012;
Goldstein e Witte 2013; Lu et al. 2013; Wang Z et al. 2014). Devido ao fato de as células
basais sofrerem divisões celulares assimétricas, originando uma célula-filha basal e outra
 20

luminal, as células basais que sofrem transformação maligna produzem tumores com
características luminais (Figura 2) (Lu et al. 2013; Wang J et al. 2014). Essa diferenciação de
células basais em luminais é um processo natural (Wang et al. 2009; Choi et al. 2012), que
pode ser potencializado em condições inflamatórias, como ocorre no CaP (Kwon et al. 2014).
Dessa forma, o acúmulo de células inflamatórias aumenta as chances de as células basais
serem as iniciadoras do câncer (Goldstein e Witte 2013). Os tumores de origem basal
apresentam crescimento mais lento, possivelmente devido ao número inicial de células em
transformação e/ou ao atraso intrínseco na proliferação devido à diferenciação (Wang et al.
2013; Wang J et al. 2014).

Figura 2. Representação esquemática das células de origem do câncer de próstata. Em condições

naturais, células basais tem a capacidade de originar células basais e luminais, através de divisões
assimétricas, ao contrário das células luminais, que expandem sua população através de divisões
simétricas. Após sofrerem mutação, as células basais darão origem a células luminais transformadas,
as quais passarão por vários ciclos de divisões simétricas. Dessa forma, o tumor prostático será
composto principalmente de células luminais, contendo uma pequena população de células basais. Por
outro lado, a transformação maligna de células luminais e a posterior proliferação dessas células
ocorre independentemente das células basais, gerando um tumor composto exclusivamente por células
luminais. Adaptado de Wang J et al. (2014).

Pelo exposto, fica evidente que as células basais do epitélio prostático constituem uma
população heterogênea, onde se encontram diversas subpopulações com diferentes
contribuições estruturais e funcionais para a próstata, tanto no contexto fisiológico quanto
patológico (De Marzo et al. 1998, Goldstein et al. 2010; Taylor et al. 2012; Lee et al. 2014).
 21

1.2. Regulação hormonal da próstata

Em 1941, Huggins e Hodges fizeram uma observação histórica de que a retirada dos
testículos, conhecida como castração cirúrgica, causava regressão do CaP, e demonstraram
pela primeira vez a dependência dos andrógenos circulantes para a sobrevivência e progressão
do câncer (Huggins e Hodges 1941). Por suas descobertas em relação ao tratamento hormonal
do CaP, Charles Huggins foi lauredo com o Prêmio Nobel de Medicina em 1966. Atualmente,
mais de 75 anos após essas descobertas, a privação androgênica permanece sendo o
tratamento de escolha para CaP avançados, porém a maioria dos casos progridem para um
estágio resistente à castração, que invariavelmente é fatal (Risbridger e Taylor 2013). Dessa
forma, as contribuições das possíveis rotas de síntese e fontes de andrógenos permanecem em
debate.
Os hormônios esteroides são derivados do colesterol, e a etapa inicial de sua síntese,
que consiste na clivagem de colesterol em pregnenolona, ocorre em quantidades relevantes
apenas no córtex da adrenal e nas células de Leydig dos testículos em homens, sendo esses os
órgãos-chave no controle hormonal reprodutivo masculino (Sharifi e Auchus 2012).
Entretanto, a próstata dispõe de maquinaria enzimática própria para produção dos esteroides
sexuais, permitindo assim uma regulação autônoma, ajustando o metabolismo dos hormônios
sexuais de acordo com as suas necessidades locais (El-Alfy et al. 1999; Labrie et al. 2000).
Sendo assim, a próstata é influenciada por hormônios esteroides provenientes da circulação
sanguínea e/ou produzidos localmente, utilizando precursores originados dos testículos e do
córtex da glândula adrenal (Figura 3) (Labrie et al. 2000; Pelletier 2008).
 22

Figura 3. Representação esquemática das etapas de síntese dos principais hormônios esteroides
sexuais que ocorre nas adrenais, nos testículos e na próstata. Os hormônios esteroides são
derivados do colesterol, e a etapa inicial de sua síntese ocorre em quantidades relevantes apenas nas
adrenais e nos testículos em homens. A próstata dispõe de maquinaria enzimática própria para
produção dos esteroides sexuais, utilizando para isso precursores e/ou hormônios originados dos
testículos e das glândulas adrenais. CYP19A1: aromatase; DHEA: dehidroepiandrosterona; DHEA-S:
sulfato de dehidroepiandrosterona; DHT: diidrotestosterona. Adaptado de Zang et al. (2017).

1.2.1. Andrógenos

O principal andrógeno que atua no sistema genital masculino é a testosterona,

produzida principalmente nas células de Leydig dos testículos, mediante estímulo do
hormônio luteinizante (LH), secretado pelas células gonadotróficas da adenohipófise
(Grossman et al. 2001). Ao contrário dos testículos, que produzem diretamente a testosterona,
as adrenais produzem precursores para a formação desse andrógeno em tecidos periféricos,
como na próstata (Figura 3) (Zang et al. 2017). Em relação aos testículos, o córtex da adrenal
secreta de 100 a 500 vezes maiores quantidades de dehidroepiandrostrona (DHEA), um
precursor de testosterona (Rahman et al. 2016). Diferentemente dos testículos, na adrenal essa
produção hormonal é estimulada pelo hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), secretado
pelas células corticotróficas da adenohipófise (Rahman et al. 2016).
 23

Em diversos órgãos a testosterona pode ser convertida, pela enzima 5α-redutase, em

di-hidrotestosterona (DHT). Tanto testosterona quanto DHT exercem seus efeitos através da
ligação e ativação de proteínas específicas, conhecidas como receptores de andrógenos (AR).
DTH se liga com mais afinidade aos receptores de andrógenos e tem uma taxa de dissociação
menor em relação à testosterona, induzindo assim uma atividade transcricional mais
expressiva. Por essa razão DHT é considerado o andrógeno mais potente (Grossmann et al.
2001; Tan et al. 2015). DHT é fundamental para promover o desenvolvimento da próstata
durante o período embrionário (Cunha et al. 1992) e proporcionar a manutenção da estrutura e
da atividade secretora da glândula em animais adultos (Oliveira et al. 2007).
Os andrógenos desempenham função importante no crescimento prostático,
estimulando a proliferação e inibindo a apoptose das células epiteliais (Banerjee et al. 2000;
Kurita et al. 2001). Em condições fisiológicas, as células do estroma prostático produzem
continuamente fatores de sobrevivência, como o fator de crescimento epidermal (EGF), que
estimulam a homeostase epitelial. Com a queda dos níveis de andrógenos, como ocorre após
castração cirúrgica, as células do estroma reduzem a produção de fatores de sobrevivência e
aumentam a produção de sinais de morte celular, induzindo apoptose das células epiteliais
prostáticas (Kurita et al. 2001).
Pelo fato de a próstata ser dependente de um suprimento contínuo de andrógenos para
manter o conteúdo celular adequado e a atividade funcional, a terapia de privação androgênica
(ADT – do inglês androgen deprivation therapy) é o tratamento mais utilizado no CaP, seja
por castração cirúrgica ou química. Porém, apesar de ser inicialmente efetivo por causar a
regressão da massa tumoral via apoptose, o tratamento geralmente falha, resultando na
progressão para um tumor mais agressivo, metastático, refratário a andrógeno e não tratável
pelas estratégias existentes (Risbridger e Taylor 2013).
Ainda não se sabe o mecanismo exato com que a resistência à ADT ocorre, porém,
uma das explicações recai sobre a concentração residual de andrógenos. A ADT é considerada
efetiva quando os níveis séricos de testosterona estão abaixo de 50 ng/dL. Porém, sabe-se que
os níveis séricos de testosterona não se correlacionam com os níveis androgênicos
intratumorais, uma vez que mesmo seis meses após ADT, os níveis de DHT na próstata
permanecem cerca de 25% dos níveis iniciais (Wadosky e Koochekpour 2016). A principal
fonte de andrógeno residual é o sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S), a forma
primária circulante da DHEA, uma precursora de testosterona. Mesmo após ADT, a
concentração de DHEA-S é mantida a níveis suficientes para a conversão em andrógenos
potentes na próstata. Assim, apesar dos níveis androgênicos permanecerem baixos, a
 24

quantidade que persiste é adequada para ativar maquinarias moleculares que direcionam o
crescimento do câncer (Zang et al. 2017; Mostaghel et al. 2019). Nas últimas décadas, as
opções de tratamento para o CaP metastático e resistente a castração vem aumentando com a
introdução terapêutica da abiraterona (inibidor de CYP17A) por exemplo. Apesar dos
avanços, o aumento da sobrevida é de apenas alguns meses, e eventualmente a maioria dos
pacientes vão a óbito (Becker et al. 2019).
Além da explicação relacionada aos hormônios, a recorrência do CaP pode ocorrer
devido à existência de algumas subpopulações de células basais prostáticas que são resistentes
ou se adaptam à privação androgênica (English et al. 1987; Risbridger e Taylor 2013), e que
podem reiniciar o câncer (Taylor et al. 2012; Goldstein e Witte 2013; Lu et al. 2013).

1.2.2. Estrógenos

Além da metabolização em DHT, a testosterona também pode ser convertida de forma

irreversível em estrógenos pela enzima CYP19A1, conhecida como aromatase (Figura 3). A
expressão de aromatase e a consequente síntese de estrógenos ocorre em locais específicos
nos homens, como tecido adiposo, ossos, músculo liso, cérebro, testículo, ductos eferentes e
próstata (Simpson et al. 2002; Carreau et al. 2007; Morais-Santos et al. 2018).
Os estrógenos desempenham papel importante na fisiologia masculina. A ausência
desse hormônio, ocasionada pela deficiência de aromatase, por exemplo, pode gerar
maturação esquelética tardia, redução da massa óssea, fechamento epifisário defeituoso,
comprometimento do metabolismo de lipídeos, hiperinsulinemia e infertilidade (Ellem e
Risbridger 2009; De Ronde e De Jong 2011). Apesar dos efeitos benéficos dos estrógenos em
vários tecidos, seu papel na próstata é ambíguo, sendo sua resposta dependente do tipo de
receptor que será ativado (Ellem e Risbridger 2009).
Embora os níveis de estrógenos durante a vida adulta sejam considerados baixos, os
homens são expostos a altos níveis desse hormônio em dois momentos de sua vida: durante o
desenvolvimento embrionário e durante a senilidade. No último trimestre de gestação ocorre
exposição natural dos machos a estrógenos maternos. Nesse momento, os estrógenos
estimulam diretamente a proliferação das células epiteliais prostáticas e causam metaplasia
escamosa em diversos níveis, que regride imediatamente após o nascimento, quando os níveis
estrogênicos diminuem (Prins e Korach 2008; Ellem e Risbridger 2009). Embora o papel
natural dos estrógenos durante o desenvolvimento da próstata não seja bem compreendido,
sabe-se que a exposição excessiva a estrógenos, durante o desenvolvimento da próstata, pode
 25

contribuir para o desenvolvimento de lesões prostáticas na vida adulta (Prins e Korach 2008;
Prins et al. 2007). O segundo momento em que os níveis hormonais se modificam é durante o
envelhecimento, em que os níveis de testosterona sérica e sintetizada no testículo diminuem,
principalmente devido ao declínio da responsividade das células de Leydig ao estímulo do LH
(Beattie et al. 2015). Em contraste, os níveis de estradiol permanecem constantes ou
aumentam ligeiramente, alterando a razão entre andrógenos e estrógenos, favorecendo a ação
dos estrógenos (Ellem e Risbridger 2010). Essas alterações no microambiente hormonal
relacionadas à idade, aliadas às alterações na expressão dos receptores de esteroides, podem
contribuir para a evolução das lesões prostáticas que acometem os indivíduos idosos (Ellem e
Risbridger 2010; Morais-Santos et al. 2015, 2018).
Diversos estudos têm demonstrado a participação dos estrógenos no desenvolvimento
de lesões prostáticas, que incluem inflamação, proliferação aberrante e metástase (Prins e
Korach 2008; Ellem e Risbridger 2009). Altos níveis de estrógenos prostáticos alteram a
diferenciação e proliferação das células epiteliais e estromais, gerando danos irreversíveis ao
tecido. Nas células epiteliais, ocorre perturbação na diferenciação durante o desenvolvimento,
a qual é evidenciada pela formação de várias camadas de células basais, caracterizando
metaplasia escamosa (Bianco et al. 2002; Ellem et al. 2009). Também ocorre perda da
expressão de proteínas das junções comunicantes, comprometendo a adesividade e a
comunicação celular (Prins et al. 2007). Outras consequências incluem espessamento da
camada de fibroblastos abaixo da membrana basal, aumento relativo dos elementos do
estroma e infiltrado de células inflamatórias (Prins et al. 2001; Bianco et al. 2002; Risbridger
et al. 2007; Ellem et al. 2009).
Os estrógenos geram seus efeitos localmente, a nível celular, através da ligação e
ativação dos receptores de estrógeno, sendo eles ERα (ESR1) e ERβ (ESR2), os quais são
codificados por genes distintos (Matthews e Gustafsson 2003). Os ERα estão relacionados
com papéis proliferativos e inflamatórios na próstata (Prins et al. 2001; Risbridger et al. 2001;
Ellem et al. 2009; Takizawa et al. 2015; Ryl et al. 2015). De forma contrária, os ERβ estão
envolvidos em ações anti-proliferativas, pró-apoptóticas e pró-diferenciação celular (Prins et
al. 2001; Weihua et al. 2001; Risbridger et al. 2001). Diversos relatos apontam que o
silenciamento de ERβ, associado à expressão de ERα, está associado às desordens na
sinalização estrogênica e ao aparecimento de múltiplos e precoces focos de alterações
prostática (Risbridger et al. 2001; Ellem e Risbridger 2010; Takizawa et al. 2015)
Dados recentes do nosso grupo de pesquisa mostraram redução de ERβ e aumento de
ERα em lesões pré-malignas na próstata de ratos idosos (Morais-Santos et al. 2015, 2018).
 26

Paralelamente, nessas mesmas áreas, foi detectado um aumento marcante do número de

células basais intensamente positivas para aromatase, revelando uma fonte local de estrógenos
(Morais-Santos et al. 2018). Esses dados em conjunto reforçam a hipótese de que um possível
desbalanço hormonal, favorável à ação de estrógenos, contribui para o desequilíbrio entre
proliferação e morte celular, levando assim ao desenvolvimento das lesões prostáticas comuns
no envelhecimento (Gonzaga et al. 2017; Morais-santos et al. 2015, 2018).
Interessantemente, a quantidade de células basais intensamente positivas para
aromatase revelou-se proporcional ao número de células inflamatórias presente do estroma
adjacente (Morais-Santos et al. 2018). Esse dado revela uma possível relação entre lesões
prostáticas, estrógenos e inflamação, que serão estudados com mais detalhes no presente
trabalho.

2. INFLAMAÇÃO

2.1. Inflamação na próstata

Apesar da principal função da próstata ser de secretar o líquido prostático contendo

substâncias que proporcionam condições adequadas para a sobrevivência dos
espermatozoides, acredita-se que essa glândula tenha também função na defesa contra agentes
estranhos e/ou patógenos originários da bexiga ou da uretra que invadem o sistema genital
masculino (Quintar e Maldonado 2017; Sfanos et al. 2018). Para isso, além de
imunoglobulinas, a próstata secreta substâncias antimicrobianas como o íon zinco,
lactoferrina e defensinas (Verze et al. 2016; Quintar e Maldonado 2017; Sfanos et al. 2018).
Adicionalmente, a próstata apresenta populações residentes de células imunes, incluindo
linfócitos B e T, macrófagos e mastócitos, situadas principalmente em regiões perivasculares
e periglandulares (Bostwick et al. 2003; Difuccia et al. 2005; Fox et al. 2019). Neutrófilos,
basófilos e eosinófilos são raramente observados na próstata em condições fisiológicas
(Sfanos et al. 2018; Fox et al. 2019).
A inflamação é uma reação do organismo a uma infecção ou lesão dos tecidos, sendo
considerada, portanto, um mecanismo de defesa do corpo. As causas da inflamação na
próstata ainda não são bem compreendidas, mas sabe-se que alguns fatores podem contribuir
para esse processo, como: (1) infecções virais, bacterianas e parasitárias (Quintar et al. 2010;
Sfanos et al. 2018; Peiffer et al. 2019), (2) trauma físico devido à formação de corpos
 27

amiláceos e concreções prostáticas (Sfanos et al. 2009), (3) injúria celular decorrente do
refluxo urinário (Bernoulli et al. 2008) e (4) envelhecimento (Begley et al. 2008).
Naturalmente ao longo do envelhecimento, o número de células imunes que se
infiltram na próstata aumenta (Bostwick et al. 2003; Begley et al. 2008; Bianchi-Frias et al.
2010). Uma das explicações para esse aumento se baseia no efeito dos estrógenos, que além
de serem conhecidos por suas ações pró-inflamatórias (Harris et al. 2000; Cutolo et al. 2005;
Ellem et al. 2009), contribuem para as alterações na morfologia e na composição celular da
próstata ao longo do envelhecimento (Ellem et al. 2009; Bianchi-Frias et al. 2010; Crowell et
al. 2019). Devido a essas alterações durante o envelhecimento, as células do estroma
prostático começam a secretar fatores quimiotáticos associados à inflamação aguda,
produzindo um gradiente quimiotático neutrofílico discreto, mas persistente, para a próstata
(Begley et al. 2008). Os neutrófilos são o principal tipo de leucócito envolvido nas respostas
inflamatórias agudas, que são as respostas iniciais do organismo a estímulos prejudiciais. Na
próstata, os neutrófilos ativados podem liberar quimiocinas e citocinas quimiotáticas para
macrófagos (Begley et al. 2008). Essas células imunes, por sua vez, desencadeiam eventos
bioquímicos, como a secreção de fatores quimiotáticos para linfócitos, responsáveis pela
mudança da resposta inflamatória de aguda para crônica (Begley et al. 2008; Sfanos et al.
2014). A inflamação crônica é caracterizada pela presença de grande quantidade de linfócitos
e macrófagos, e promove principalmente a alteração do estroma prostático normal para um
estroma reativo, responsável por suportar e promover o crescimento tumoral (Begley et al.
2008; Bianchi-Frias et al. 2010; Barron e Rowley 2012).

2.1.1. Associação entre inflamação e câncer

A associação entre inflamação crônica e a progressão de câncer é bem estabelecida em

vários órgãos, tais como mama, pâncreas, intestino e cérebro (Heusinkveld e van der Burg
2011). Na próstata, a inflamação crônica é considerada crucial para o desenvolvimento do
CaP (De Marzo et al. 2007; Thapa et al. 2015). Tal associação se baseia na existência de uma
lesão pré-maligna, conhecida como atrofia inflamatória proliferativa (PIA), caracterizada por
ser uma atrofia focal proliferativa associada às células inflamatórias (De Marzo et al. 1999).
Essa lesão é mais frequentemente encontrada na zona periférica da próstata humana, região
mais acometida por câncer (Difuccia et al. 2005; De Marzo et al. 2007). Por ser atrófica e
proliferativa, a PIA é considerada uma lesão regenerativa em resposta a um dano celular
causado pelos oxidantes inflamatórios (De Marzo et al. 1999; Nelson et al. 2003). De fato,
 28

células epiteliais da PIA apresentam sinais moleculares de estresse, como altos níveis de
glutationa S-transferase A1, cicloxygenase-2 e BCL-2 (Nelson et al. 2003). A inflamação
associada à PIA pode desencadear efeitos genotóxicos ou citotóxicos, contribuindo para a
progressão dessa lesão para o câncer (De Marzo et al. 1999; Sfanos et al. 2014). Transição
morfológica entre PIA, neoplasia intraepitelial prostática (PIN) e câncer já foi observada
(Figura 4) (Putzi e De Marzo 2000), bem como similaridades genéticas entre essas lesões,
incluindo perda de genes supressores de tumor (Bethel et al. 2006). O fato da PIA ser
precursora das lesões malignas sugere que o microambiente inflamatório pode estar associado
à iniciação da carcinogênese prostática (De Marzo et al. 1999).
As células imunes inicialmente agem para remover os agentes infecciosos e/ou reparar
os tecidos, através da secreção de citocinas ou espécies reativas de oxigênio (ROS),
principalmente pelos neutrófilos. Entretanto, durante a inflamação crônica, ocorre uma
exposição prolongada a esses sinais, que passam a ser danosos. Por exemplo, ROS podem
causar dano oxidativo ao DNA e mutações em oncogenes e genes supressores de tumor
(Mantovani et al. 2004; Khandrika et al. 2009). Esses papéis complexos e dicotômicos da
inflamação também estão presentes no contexto tumoral, em que inicialmente as células
imunes são recrutadas para prevenir o estabelecimento e a proliferação das células epiteliais
malignas e, posteriormente, são recrutadas para sustentar a sobrevivência das células tumorais
e a progressão do câncer, através da manutenção de um estado inflamatório crônico (Thapa et
al. 2015).

Figura 4. Esquema representando a progressão das lesões prostáticas. A infiltração de células

imunes na próstata pode causar danos ao DNA e lesão celular, o que desencadeia o início da
regeneração celular epitelial, manifestada morfologicamente como uma atrofia focal, conhecida como
atrofia inflamatória proliferativa (PIA). A proliferação celular contínua das células geneticamente
instáveis e o acúmulo adicional de alterações genômicas levam à progressão das lesões em direção ao
câncer, passando pela neoplasia intraepitelial prostática (PIN). Adaptado de Nelson et al. (2003).
 29

Durante o processo de transformação maligna as células mutadas começam a produzir

moléculas imunogênicas, conhecidas como antígenos tumorais. As constantes injúrias ao
epitélio prostático também contribuem para a liberação desses antígenos, que são
reconhecidos pelas células do sistema imune, induzindo uma resposta inflamatória para
eliminar as células tumorais antes delas ficarem clinicamente detectáveis (Sfanos et al. 2014).
Porém, a longo prazo, a exposição prolongada a esses antígenos culmina na quebra da
tolerância imunológica da próstata e no desenvolvimento de uma reação autoimune,
contribuindo para a manutenção e a exacerbação da inflamação crônica (De Marzo et al.
2007).
A influência das células imunes na prevenção ou na progressão do câncer é difícil de
discernir, e está relacionada ao tecido em questão, ao estágio do tumor e ao microambiente
tecidual (Sica et al. 2008). Ainda não está bem compreendido quais tipos de células imunes
são capazes de infiltrar no tumor prostático, bem como a maneira com que essas células
interagem com as células epiteliais, porém vários tipos de células imunes já foram
relacionados à progressão do CaP, incluindo macrófagos (Erlandsson et al. 2019; Zarif et al.
2019), mastócitos (Ellem et al. 2014; Pereira et al. 2019), linfócitos (Davidsson et al. 2013;
Erlandsson et al. 2019), dentre outros. No presente trabalho, por serem alvo do estudo, os
macrófagos serão descritos com mais detalhes.

2.2. Macrófagos

Os macrófagos são células imunes extremamente plásticas, capazes de adaptar

rapidamente a sua morfologia, localização, fenótipo e função em resposta aos diferentes sinais
vindos do microambiente (Pollard 2009). De forma simplificada, os macrófagos podem
apresentar dois estágios de polarização, sendo eles os macrófagos tipo 1 classicamente
ativados, ou M1, e os macrófagos tipo 2 alternativamente ativados, ou M2. Esses estágios de
polarização, conhecidos também como fenótipos, não são expressos ao mesmo tempo, mas
regulados de tal maneira que os macrófagos exibem um padrão integrado e equilibrado de
funções (Sica et al. 2008). Macrófagos M1 e M2 diferem em relação às funções exercidas,
expressão de receptores e produção de citocinas e quimiocinas (Figura 5).
 30

Figura 5. Representação esquemática exemplificando as diferenças entre macrófagos M1 e M2

em relação aos marcadores, produção de citocinas e metabolismo celular. Os macrófagos M1,
reconhecidos pela expressão de TNF, iNOS e IFNγ, apresentam um perfil pró-inflamatório, e secretam
moléculas como TNF, IL-1, IL-6, ROS e NO. Por outro lado, os macrófagos M2, reconhecidos pela
expressão de CD206, CD163 e arginase apresentam um perfil anti-inflamatório, e secretam moléculas
como IL-10, TGF-β e MMP-9. Esquema do próprio autor (Hipácia Werneck Gomes).

Os macrófagos M1 são ativados em situações de injúria ou infecção, e são

caracterizados por apresentarem um perfil pró-inflamatório, produzindo citocinas como
Interleucina-1 (IL-1), IL-6 e TNF (fator de necrose tumoral). Eles também produzem
quantidades elevadas de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e óxido nítrico (NO),
moléculas essenciais no combate a agentes infecciosos e células tumorais (Mantovani et al.
2013; Martinez e Gordon 2014). Macrófagos M1 podem expressar TNF, iNOS (óxido nítrico
sintase induzida), IFNγ (interferon γ), dentre outras proteínas (Martinez e Gordon 2014).
Ao contrário dos macrófagos M1, os macrófagos com fenótipo M2 são reconhecidos
por exercerem ações anti-inflamatórias. Eles apresentam alta capacidade fagocítica, estando
envolvidos na fagocitose de células apoptóticas, processo conhecido como eferocitose,
importante na manutenção da homeostase tecidual e para prevenir inflamação aberrante
(Nagata et al. 2010; Myers et al. 2019). Além disso, são capazes de produzir componentes da
matriz extracelular e fatores angiogênicos, participando no reparo e remodelamento tecidual
(Mantovani et al. 2013). Macrófagos M2 também podem desempenhar funções não
imunológicas clássicas, fornecendo suporte trófico para alguns tecidos durante a morfogênese
e participando da sinalização endócrina a partir da produção de hormônios (Pollard 2004;
Röszer 2015). Macrófagos M2 podem expressar CD206 (receptor de manose), CD163
(receptor scavenger da hemoglobina), arginase-1, Fizz-1 (fator mitogênico induzido por
hipóxia), dentre outras proteínas (Martinez e Gordon 2014; Röszer 2015).
 31

Além das diferenças mencionadas, o metabolismo celular é também importante na

determinação do fenótipo dos macrófagos em resposta a estímulos polarizadores distintos no
microambiente tecidual, tanto em condições normais quanto patológicas (Figura 5)
(Mantovani et al. 2013; Mazzone et al. 2018). Por exemplo, o metabolismo da arginina é
diferente entre as duas polarizações de macrófagos, uma vez que tanto iNOS quanto arginase-
1 utilizam a arginina como substrato. Dessa forma, os macrófagos M1 são caracterizados pela
alta expressão de iNOS, produzindo altos níveis de óxido nítrico para eliminar os patógenos,
enquanto os macrófagos M2 apresentam maior quantidade de arginase-1, responsável por
produzir ureia e poliaminas, substâncias importantes no remodelamento tecidual e na
proliferação celular (Mantovani et al. 2013; Röszer 2015; Mazzone et al. 2018). Os
macrófagos também apresentam uma regulação distinta em relação ao substrato energético
principal utilizado. Enquanto os macrófagos M1 utilizam o metabolismo anaeróbico da
glicose, como a glicólise, visando atender às suas rápidas necessidades de energia no combate
a patógenos, os macrófagos M2 requerem um suprimento sustentado de energia para
desempenhar suas funções, utilizando, portanto, a oxidação de ácidos graxos como substrato
energético principal (Vats et al. 2006; Mantovani et al. 2013).

2.2.1. Macrófagos associados ao tumor

Os macrófagos são um dos principais componentes inflamatórios do microambiente

tumoral em vários tipos de câncer, incluindo o CaP, onde participam do crescimento e
progressão tumoral (Figura 6). Acredita-se que o próprio microambiente do tumor seja capaz
de selecionar apenas os macrófagos com propriedades favoráveis ao crescimento tumoral
(Mantovani et al. 2004). Considerando sua localização e suas funções pró-tumorigênicas,
esses macrófagos são denominados macrófagos associados ao tumor (TAM – do inglês
tumor-associated macrophages) e exibem um fenótipo do tipo M2 (Mantovani et al. 2004;
Sica et al. 2008). CD206 é considerado o principal marcador de TAM (Sica et al. 2008; Zarif
et al. 2019), porém esses macrófagos também podem expressar CD163, arginase-1 e iNOS
(Martinez e Gordon 2014; Röszer 2015).
Os TAM são polarizados de acordo com os sinais específicos vindos do
microambiente em que residem. Dessa forma, a integração de sinais distintos pode resultar na
produção de um amplo espectro de fenótipos de TAM, dependendo do tipo de tecido em que
esses macrófagos estão presentes (Mantovani et al. 2013).
 32

Figura 6. Representação das funções pró-tumorigênicas exercidas pelos macrófagos associados

ao tumor (TAM). Os macrófagos são recrutados para as áreas tumorais através de fatores
quimiotáticos secretados pelas próprias células tumorais, e exercem funções que promovem a
progressão do tumor. TAM migram para áreas de hipóxia dentro do tumor, onde estimulam a
angiogênese, induzem eventos mutagênicos e promovem a proliferação celular. TAM produzem
proteases que degradam a membrana basal (MB) e contribuem para o remodelamento do estroma,
promovendo assim a invasão tumoral e a metástase. Esses macrófagos também induzem um
microambiente imunossuprimido, visando impedir respostas inflamatórias contra as células tumorais.
Adaptado de Pollard (2004).

Quimiocinas desempenham um papel central no recrutamento de monócitos para os

tecidos neoplásicos. As células tumorais são capazes de produzir citocinas e quimiocinas,
como VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), M-CSF (fator estimulador de colônias
de macrófagos) e CCL2 (conhecida como MCP-1, proteína quimiotática de monócitos), que
estimulam a migração de monócitos para os tecidos. Além disso, esses mediadores também
direcionam a diferenciação dessas células para macrófagos com fenótipo promotor do tumor
(Mantovani et al. 2004; Linde et al. 2018).
Os macrófagos do tipo TAM modulam a inflamação local, de forma a criar um
microambiente imunossuprimido, visando impedir respostas inflamatórias contra as células
tumorais. Os TAM podem suprimir a resposta imune anti-tumoral interagindo diretamente
com linfócitos T ou secretando fatores imunossupressores, como prostaglandinas, IL-10 e
TGF-β (fator de crescimento transformante β), que inibem a infiltração e a atividade
citotóxica dos linfócitos T (Liu e Cao 2015; Myers et al. 2019). Além disso, uma das
características dos TAM é sua reduzida capacidade de apresentar antígenos, o que suprime o
 33

reconhecimento das células tumorais pelos linfócitos T, permitindo assim o escape

imunológico tumoral (Mantovani et al. 2004).
Os TAM podem também causar efeitos genotóxicos nas células epiteliais, uma vez
que secretam continuamente espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, que reagem com o
DNA, causando instabilidade genética que resulta em eventos mutagênicos nas células
epiteliais e na indução da proliferação celular (Pollard 2004; Fukumura et al. 2006). Além
disso, os macrófagos são capazes de potencializar a proliferação epitelial através da secreção
de citocinas que ativam as vias das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK,
também conhecida como ERK) (Dang e Liou 2018).
Sabe-se que condições de hipóxia limitam a capacidade migratória dos macrófagos.
Assim, ocorre um acúmulo de TAM preferencialmente em regiões tumorais com pouca
vascularização, onde eles agem estimulando a angiogênese (Mantovani et al. 2004). Tal
estímulo ocorre através da secreção de moléculas angiogênicas, como NO e VEGF, que
induzem a proliferação e migração de células endoteliais para regiões específicas do tumor
(Pollard 2004). Além de secretarem fatores angiogênicos, esses macrófagos agem fornecendo
um suporte trófico para guiar a fusão de células endoteliais, facilitando a formação de novos
vasos sanguíneos (Mantovani et al. 2013). A angiogênese induzida por TAM suporta o
crescimento tumoral através de um aporte adequado de oxigênio, e permite o acesso das
células tumorais à vasculatura, etapa essencial para a metástase (Pollard 2004).
Além de estimularem a angiogênese, os TAM ainda contribuem para a metástase
através da produção de proteases e metaloproteinases da matriz (MMP), como MMP-9, que
degradam a membrana basal, permitindo a disseminação das células tumorais para o estroma.
Além disso, eles também secretam fatores de crescimento que estimulam a motilidade tumoral
(Pollard 2004; Mantovani et al. 2013).
Assim como os macrófagos M2, os TAM apresentam alta capacidade fagocítica. Em
condições fisiológicas, a fagocitose de células apoptóticas pelos macrófagos previne a
liberação de sinais inflamatórios pelos corpos apoptóticos, auxiliando na manutenção da
homeostase e na criação de um microambiente imunologicamente silencioso (Heckmann et al.
2017; Werfel e Cook 2018; Myers et al. 2019). Por outro lado, no contexto tumoral, a
eferocitose favorece a progressão do câncer, uma vez que induz a produção de citocinas anti-
inflamatórias e a secreção de fatores que estimulam o crescimento das demais células
cancerígenas (Heckmann et al. 2017; Werfel e Cook 2018; Jones et al. 2019; Myers et al.
2019).
 34

2.2.2. Hormônios esteroides sexuais e macrófagos

Os hormônios esteroides sexuais são moduladores chave da função e do fenótipo das

células imunes em diversos órgãos (Miller e Hunt 1996; Cutolo et al. 2005; Rubinow 2018).
Isso ocorre uma vez que as células imunes, incluindo os macrófagos, são capazes de expressar
receptores de esteroides sexuais, como AR, ERα e ERβ, permitindo a regulação de suas
atividades por esses hormônios (Prins et al. 1991; D’Agostino et al. 1999; Carruba et al.
2003; Capellino et al. 2006). Nesse sentido, andrógenos e estrógenos regulam a proliferação,
apoptose e diferenciação dos macrófagos, bem como a produção de citocinas por essas células
(Miller e Hunt 1996; D’Agostino et al. 1999; Cutolo et al. 2005; Rubinow 2018). Esses
hormônios exercem funções antagônicas na modulação da resposta inflamatória orquestrada
pelos macrófagos, sendo que, enquanto os andrógenos estimulam o fenótipo anti-inflamatório,
os estrógenos, promovem o fenótipo pró-inflamatório (D’Agostino et al. 1999; Carruba et al.
2003; Cutolo et al. 2005).
A relação entre o microambiente hormonal e os macrófagos é ainda mais complexa,
uma vez que essas células imunes não são apenas influenciadas por hormônios esteroides
sexuais, mas também são capazes de produzi-los. Confirmando essa habilidade, sabe-se que
os macrófagos podem expressar enzimas esteroidogênicas, como aromatase, 3β-HSD e 17β-
HSD, contribuindo com a produção local de andrógenos e estrógenos (Mor et al. 1998;
Schmidt et al. 2000; Martins-Santos et al. 2017; Rubinow 2018). Os esteroides sexuais
derivados de células imunes podem desempenhar importantes papéis autócrinos e parácrinos,
com efeitos de sinalização conferidos tanto na célula de origem quanto nas células ao redor
(Rubinow 2018).
Um exemplo clássico da importância dos macrófagos na produção de hormônios
esteroides sexuais é observado nos testículos, onde os macrófagos estão estruturalmente
associados às células de Leydig, fornecendo 25-hidroxicolesterol como substrato direto para a
realização da esteroidogênese nessas células (Nes et al. 2000; Hutson 2006). Sabe-se que a
etapa limitadora da taxa de biossíntese dos hormônios esteroides é a translocação do
colesterol livre citoplasmático para a membrana interna das mitocôndrias, onde se encontra a
enzima CYP11A1, responsável pela hidroxilação do colesterol e a posterior clivagem de sua
cadeia lateral, produzindo pregnenolona (Stocco e Clak 1996). Através da enzima 25-
hidroxilase, os macrófagos testiculares são capazes de produzir 25-hidroxicolesterol, que é
então transportado até as células de Leydig, onde atua como substrato direto para a clivagem
da cadeia lateral, produzindo pregnenolona (Figura 7). Dessa forma, os macrófagos fornecem
 35

uma via alternativa para a esteroidogênese, que elimina a etapa tradicional de limitação da
biossíntese dos hormônios esteroides (Nes et al. 2000). Estudos revelaram que esse
mecanismo não é apenas alternativo, mas fisiologicamente relevante, uma vez que a depleção
experimental de macrófagos testiculares causou redução da quantidade de testosterona
produzida pelas células de Leydig (Bergh et al. 1993; Hutson 2006). Além disso, em
situações que causam danos às células de Leydig, como após exposição crônica ao
desregulador endócrino atrazina, essa função dos macrófagos se torna ainda mais importante,
uma vez que o número dessas células no testículo aumenta na tentativa de reestimular a
esteroidogênese (Martins-Santos et al. 2017).

Figura 7. Representação da interação entre macrófagos e células de Leydig para realização da

esteroidogênese. Nas células de Leydig testiculares, o colesterol livre citoplasmático é translocado
para a membrana mitocondrial interna, onde se encontra a enzima CYP19A1, responsável pela
hidroxilação do colesterol e a posterior clivagem de sua cadeia lateral, produzindo pregnenolona.
Adicionalmente, através da enzima 25-hidroxilase, os macrófagos testiculares produzem 25-
hidroxicolesterol, que é então transportado até as células de Leydig, onde atua como substrato direto
para a clivagem da cadeia lateral, produzindo pregnenolona. Adaptado de Nes et al. (2000).

A produção de hormônios esteroides pelos macrófagos é também relevante no

contexto tumoral. Os TAM encontrados no tecido mamário, por exemplo, podem expressar
aromatase, sendo uma das fontes de estrógenos intratumorais, contribuindo assim para a
progressão do câncer (Mor et al. 1998; Rubinow 2018). Adicionalmente, macrófagos foram
capazes de induzir a proliferação de células de câncer de mama in vitro, um efeito que foi
revertido após tratamento dos macrófagos com um inibidor da aromatase (Mor et al. 1998),
 36

confirmando a importância dos estrógenos produzidos pelos macrófagos na progressão do

câncer.
O recrutamento de macrófagos para os tecidos também pode ser regulado por
hormônios esteroides (Miller e Hunt 1996; Cutolo et al. 2005). Há evidências de aumento da
população de macrófagos na próstata de ratos após tratamento sistêmico com estradiol
(Gilleran et al. 2003), bem como nos testículos de camundongos que superexpressam
aromatase (Li et al. 2006), sugerindo estímulo estrogênico no recrutamento dessas células.

2.2.3. Macrófagos na próstata

Na próstata, os macrófagos fazem parte das populações de células imunes residentes

do tecido, e estão localizados principalmente no estroma (Fox et al. 2019). Alguns estudos
relatam a presença de raros macrófagos no epitélio prostático em condições fisiológicas
(Helminen e Ericsson 1972; Lu et al. 2012; Silva et al. 2018), porém expressiva quantidade
de macrófagos intraepiteliais é observada após castração (Helminen e Ericsson 1972; Evans e
Chandler 1987; Franck-Lissbrant et al. 1998; Desai et al. 2004; Silva et al. 2018). Nessa
situação, macrófagos são recrutados para o compartimento epitelial prostático para fagocitar
células epiteliais que entraram em apoptose após privação androgênica, contribuindo assim
para a homeostase tecidual (Evans e Chandler 1987; Silva; et al. 2018).
Ao longo do envelhecimento, foi observado um aumento na quantidade de macrófagos
na próstata de camundongos, o que levantou a hipótese de que essas células poderiam
contribuir para o desenvolvimento de lesões relacionadas à idade (Bianchi-Frias et al. 2010).
Essa hipótese foi testada posteriormente, realizando a inoculação de células tumorais na
próstata de camundongos jovens e idosos (Bianchi-Frias et al. 2019). Observou-se que, apesar
dos tumores formados serem maiores em camundongos idosos, a quantidade de macrófagos
recrutados para a região tumoral foi semelhante em ambos os grupos. Porém,
interessantemente, a quantidade de macrófagos com fenótipo TAM era maior nos tumores dos
camundongos idosos, chamando a atenção para a influência do envelhecimento na polarização
dos macrófagos para um fenótipo promotor de tumor. Dessa forma, é possível que o
microambiente prostático senil possa favorecer o crescimento de células prostáticas malignas,
destacando principalmente o papel dos macrófagos nesse processo (Begley et al. 2008;
Bianchi-Frias et al. 2010, 2019).
A associação dos macrófagos no circuito inflamatório que promove a progressão do
CaP vem sendo extensivamente estudada. Tal relação fica evidente em um estudo em que
 37

células tumorais prostáticas foram inoculadas no tecido subcutâneo de camundongos, e a

velocidade de crescimento do tumor foi proporcional à quantidade de macrófagos encontradas
no tecido tumoral (Copeland et al. 2019). Adicionalmente, mostrou-se que quando essas
células eram inoculadas no tecido subcutâneo de camundongos junto com macrófagos, a taxa
de crescimento tumoral aumentava (Craig et al. 2008).
Diversos estudos mostram uma correlação positiva entre a quantidade de macrófagos
presentes no tecido prostático e a progressão das lesões. Por exemplo, em ratos tratados com
testosterona em adição ao carcinógeno MNU (N-metil-N-nitrosoureia), observou-se que à
medida que as lesões prostáticas iam se agravando, a densidade de macrófagos presente no
estroma adjacente também aumentava (Narayanan et al. 2009). Além disso, camundongos Hi-
myc, que superexpressam o oncongene MYC, apresentam acúmulo de macrófagos no estroma
prostático desde as lesões pré-malignas (Melis et al. 2017).
Em humanos, a quantidade de macrófagos encontrados em biópsias prostáticas
correlaciona-se positivamente com o estágio do tumor, de modo que os tumores classificados
com maior escore de Gleason1 apresentam mais macrófagos infiltrados que os tumores menos
agressivos (Nanomura et al. 2011; Hu et al. 2015; Fan et al. 2017; Jones et al. 2019). Além
disso, observou-se também aumento progressivo da quantidade de macrófagos M2 desde a
próstata normal até o CaP metastático, sugerindo uma relação entre a infiltração de
macrófagos e o risco de metástase (Hu et al. 2015; Erlandsson et al. 2019; Zarif et al. 2019).
Expressiva quantidade de macrófagos foi observada na próstata de pacientes após
ADT (Gannon et al. 2009; Escamilla et al. 2015; Zarif et al. 2019). Assim como observado
em roedores após castração, esses macrófagos são possivelmente recrutados para fagocitar
células epiteliais que entram em apoptose após privação androgênica, contribuindo assim para
a homeostase tecidual. Entretanto, o próprio processo de fagocitose pode repolarizar os
macrófagos para um fenótipo promotor do tumor, onde atuam na proliferação de células
tumorais, angiogênese e supressão imunológica (Werfel e Cook 2018; Jones et al. 2019;
Myers et al. 2019). Corroborando esses dados, em um modelo experimental que mimetiza a
ADT, foi observado uma redução do crescimento tumoral após depleção dos macrófagos (Lee
et al. 2019). Dessa forma, é possível que os macrófagos também exerçam um papel essencial
na recidiva tumoral.

1
Escore de Gleason se refere à classificação dada a um tecido prostático, baseado em sua
aparência microscópica, que revela a agressividade do tumor. A classificação varia de 6 a 10, em que
10 representa os tumores mais agressivos.
 38

II. JUSTIFICATIVA
 39

II. JUSTIFICATIVA

Além de seu papel na fisiologia reprodutiva, a próstata tem relevância clínica por ser
alvo de desordens benignas e malignas, como a hiperplasia prostática benigna e o câncer, que
afetam a fertilidade e a qualidade de vida dos homens. Entre a população masculina mundial,
o CaP é o segundo câncer mais frequente e a quinta principal causa de morte diretamente
relacionada ao câncer (Bray et al. 2018). Em relação ao Brasil, de acordo com dados do
Instituto Nacional de Câncer (INCA) para o biênio de 2020 e 2021, o CaP é o tipo de câncer
mais incidente entre os homens em todas as regiões do país (INCA 2019).
No contexto do câncer, as células basais prostáticas vêm ganhando destaque uma vez
que elas podem estar envolvidas tanto na iniciação quanto na recidiva do CaP (Choi et al.
2012; Taylor et al. 2012; Wang et al. 2014b). Sabe-se que as células basais do epitélio
prostático constituem uma população heterogênea, onde se encontram diversas subpopulações
com diferentes contribuições estruturais e funcionais para a próstata, tanto no contexto
fisiológico quanto patológico (Goldstein et al. 2010; Taylor et al. 2012; Lee et al. 2014).
Porém, pouco se sabe sobre a regulação do número, da morfologia e da função das diferentes
subpopulações de células basais do epitélio prostático, bem como a influência dessas células
nas modificações que acontecem no epitélio durante o processo carcinogênico.
Complicando ainda mais a compreensão sobre o compartimento basal do epitélio
pseudoestratificado, esse pode abrigar macrófagos (Shum et al. 2014; Silva et al. 2018).
Similaridades morfológicas e ultraestruturais entre células basais e macrófagos, assim como
sua íntima relação espacial, já foram observadas, por exemplo no epitélio epididimário
(Yeung et al. 1994; Seiller et al. 1999; Holschbach e Cooper 2002). Essa íntima relação levou
alguns estudos mais antigos a descreveram marcadores e funções clássicas de macrófagos,
como por exemplo habilidade fagocítica, em células basais do epidídimo (Yeung et al. 1994;
Seiller et al. 1999). Mais recentemente demonstrou-se que as células basais são morfológica e
fenotipicamente diferentes dos macrófagos, e apesar de coexistirem em alguns tecidos,
desempenham funções distintas (Shum et al. 2014).
O que vem chamando atenção é a participação dos macrófagos no desenvolvimento e
progressão do CaP. Diversos estudos mostram que à medida que as lesões prostáticas
progridem, a quantidade de macrófagos encontrados no tecido aumenta (Hu et al. 2015; Fan
et al. 2017; Bianchi-Frias 2019; Zarif et al. 2019). Esses macrófagos são encontrados no
estroma próximo às lesões, principalmente em regiões perivasculares (Klotz et al. 1998;
Narayanan et al. 2009; Bianchi-Frias et al. 2010; Copeland et al. 2019). Entretanto, as células
 40

imunes parecem interagir com células epiteliais de maneira complexa, uma vez que os
macrófagos em contato com as células tumorais desencadeiam efeitos parácrinos mais
pronunciados que os macrófagos situados mais distante, como por exemplo induzindo a
proliferação celular das células ao redor (Lissbrant et al. 2000). Na próstata, os relatos em
relação a presença dessas células imunes no epitélio no contexto tumoral são escassos e
superficiais. Por exemplo, apesar de alguns estudos não mencionarem a localização dos
macrófagos, é possível observar a presença dessas células imunes no epitélio prostático de
camundongos após a deleção do gene NKX3.1 (um gene supressor de tumor cuja perda ou
redução representa um evento chave na iniciação do CaP) (Le Magnen et al. 2018), ou após
tratamento com diferentes carcinógenos (Nakai et al. 2007; Prins et al. 2017). Por outro lado,
quando a localização dos macrófagos no epitélio é reportada, nenhuma referência é feita em
relação à função desempenhada por eles ou à sua interação com as células epiteliais (Bianchi-
Frias et al. 2010; Lu et al. 2012; Zarif et al. 2019).
Pelo exposto, fica evidente a necessidade de estudos que contribuam para a
compreensão acerca da presença e das funções dos macrófagos epiteliais, bem como da
contribuição das subpopulações de células basais e interação dessas células no compartimento
basal do epitélio prostático, em diferentes microambientes, especialmente no contexto das
patologias associadas à próstata.
 41

III. OBJETIVOS
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III. OBJETIVOS

O presente estudo tem como objetivo geral investigar possíveis alterações na

morfologia e no fenótipo de células basais e de macrófagos no epitélio prostático de ratos em
diferentes microambientes hormonais. Serão utilizados três diferentes modelos experimentais:
(1) envelhecimento, (2) indução de lesões prostáticas através do tratamento prolongado com
testosterona e estradiol e (3) castração e reposição hormonal.

Os objetivos específicos incluem:

• Investigar se os diferentes microambientes hormonais podem modular as

subpopulações de células basais prostáticas;
• Investigar o possível recrutamento de macrófagos para o compartimento basal do
epitélio prostático em diferentes microambientes hormonais;
• Avaliar a morfologia e o fenótipo dos macrófagos encontrados no epitélio,
• Investigar a possível interação entre macrófagos e células basais prostáticas.
 43

IV. RESULTADOS
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IV. RESULTADOS

Os resultados desta dissertação estão divididos em três capítulos, apresentados da

seguinte maneira:

CAPÍTULO I – Artigo publicado

Com o objetivo de aumentar a incidência de lesões pré-malignas e malignas na próstata, ratos

Wistar machos foram submetidos ao tratamento prolongado com testosterona e estradiol. A
caracterização desse modelo experimental foi publicada, com primeira autoria compartilhada,
no artigo:

Targeting Wistar rat as a model for studying benign, premalignant and malignant
lesions of the prostate
Life Sciences, 2020
DOI: 10.1016/j.lfs.2019.117149

CAPÍTULO II – Artigo submetido ao periódico Andrology

Tumor-Associated Macrophages (TAM) are recruited to the aging prostate epithelial

lesions and become intermingled with basal cells

CAPÍTULO III – Resultados adicionais não publicados

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CAPÍTULO I
Targeting Wistar rat as a model for studying benign, premalignant and malignant lesions of
the prostate
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CAPÍTULO II
Tumor-Associated Macrophages (TAM) are recruited to the aging prostate epithelial lesions
and become intermingled with basal cells
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Tumor-Associated Macrophages (TAM) are recruited to the aging prostate epithelial

lesions and become intermingled with basal cells

Hipácia Werneck-Gomes1; Gabriel H. Campolina-Silva1; Bruna T. Maria1; Germán A.

B. Mahecha1; Rex A. Hess2; Cleida A. Oliveira1*

1 Department of Morphology, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas

Gerais, Brazil, 31270-901

2 Department of Comparative Biosciences, University of Illinois, Urbana, Illinois, USA,

61802-6199

Short title: Intraepithelial macrophage in prostate lesion

Keywords: prostate; macrophage; epithelium; autophagy; aging

* Corresponding author:

Cleida Aparecida Oliveira

Av. Antônio Carlos, 6627

CEP 31270-901, Belo Horizonte, MG - Brasil.

Phone: +55.31.3409-2795

E.mail: cleida@icb.ufmg.br
 67

Abstract

Background: Prostate cancer remains one of the most common cancers in men. Macrophages
are thought to be important regulators in cancers and their potential involvement in prostate
cancer should not be overlooked. Therefore, the association between macrophages and the
pre-tumorous changes in prostate epithelium during aging deserves further investigation.
Objectives: We sought to investigate whether macrophages would be recruited into the
prostate epithelium that display pathological lesions commonly found during aging.
Materials and methods: Prostates of aging rats, with and without treatment with a
combination of testosterone and estradiol, were examined for premalignant and malignant
epithelial lesions. For comparison, prostates of castrated rats were also investigated. Induced
and naturally formed lesions were observed. Results: Intraepithelial macrophages were found
restricted to areas of premalignant and malignant lesions. An unprecedented interaction
between macrophages and basal cells was observed in the aging pathological lesions. The
intraepithelial macrophages were associated with autophagy, in contrast to those found after
castration. In prostate lesions, the intraepithelial macrophages had TAM phenotype
(CD68+/iNOS+/ CD206+/ARG+), denoting a possible involvement in cancer progression.
However, M2 macrophages (CD68+/CD163+) were recruited into the epithelium after
castration, possibly to phagocytize cells undergoing apoptosis. Discussion and Conclusion:
In conclusion, macrophages were recruited into the prostate epithelium and presented diverse
phenotypes and morphology, consistent with changes reflected in the hormonal environment.
Macrophages with the TAM phenotype were found restricted to areas of premalignant and
malignant lesions in aging prostates, denoting a possible involvement in cancer progression.
In contrast, M2 macrophages were found in the regressed epithelium after castration.
 68

Introduction
The prostate has clinical relevance as a prominent target for benign and malign
disorders that affect the quality of men’s life. In particular, prostate cancer (PCa) is the most
frequently diagnosed cancer among men worldwide, with an estimated 1,276,000 cases and
359,000 deaths annually (Bray et al. 2018). The risk of PCa in men remains high in the aging
population (Wang et al. 2018). Therefore, understanding the numerous cellular interactions
associated with the onset of tumorigenesis is a major goal of prostate research. The reciprocal
interaction between the epithelium and surrounding stroma is essential for normal prostate
function, and disruption of this interface appears to induce uncontrolled growth and
development of a malignant transformation (Taylor & Risbridger 2008; Goldstein & Witte
2013). Immune cells are one of the key components of the prostate stroma, having
pronounced paracrine effects on epithelial cells (Lissbrant et al. 2000; Huang et al. 2018).
Among the inflammatory cells of the prostate, macrophages have gained attention, due to the
intrinsic association between stromal macrophage density and progression of prostatic lesions,
including cancer (Lissbrant et al. 2000; Narayanan et al. 2009; Lindholm et al 2010;
Nonomura et al. 2011; Hu et al. 2015; Bergstrom et al. 2016; Fan et al. 2017; Melis et al.
2017; Jones et al. 2019; Erlandsson et al. 2019). Macrophages associated with pro-
tumorigenic lesions, also called tumor-associated macrophages (TAM), have been recognized
as a polarized M2 population (Mantovani et al. 2004; Sica et al. 2008). TAM participate in
the promotion of angiogenesis, remodeling of the extracellular matrix, and in the release of
growth factors that contribute to cell proliferation, thus playing a role in the support of tumor
growth and metastasis (Sica et al. 2008; Hu et al. 2015; Dang & Liou 2018).
Macrophages have also been shown to interact with epithelial cells in a rather complex
manner (Lissbrant et al. 2000), secreting factors that promote mutagenic events, cellular
proliferation and motility (Mantovani et al. 2004; Sica et al. 2008; Dang & Liou 2018). In the
prostate, aside from the presence of stromal and perivascular macrophages, these cells have
long been reported within the epithelium after androgen withdraw induced by castration
(Evans & Chandler 1987; Franck-Lissbrant et al. 1998; Desai et al. 2004; Silva et al. 2018;
Barbosa et al. 2019). These intraepithelial macrophages appear to phagocytize apoptotic
epithelial cells (efferocytosis) and contribute to the remodeling of the regressing prostate
(Evans & Chandler 1987; Silva et al. 2018). Nevertheless, the presence of macrophages
within the prostate epithelium has often been overlooked with regards to the pathological
 69

context. Therefore, we asked whether macrophages would be recruited to the epithelium in

premalignant and malignant lesions, commonly found in the aging prostate.
To answer this question and better evaluate the presence of intraepithelial
macrophages in a broad spectrum of histopathological alterations arising in the prostate, we
sought to investigate two experimental models that have been well characterized by the
occurrence of prostate lesions: (1) aging Wistar rats, which present naturally occurring
prostate lesions that mimic most of the histopathological changes affecting the human prostate
(Morais-Santos et al. 2015; Campolina-Silva et al. 2019); and (2) Wistar rats chronically
exposed to a combination of testosterone and estradiol (T+E2), which is a well-known
treatment that increases the incidence of prostate premalignant and malignant lesions
(Bosland et al. 1995; Campolina-Silva et al. 2019; Ozten et al. 2019). Prostates of rats
submitted to castration or castration followed by androgen replacement were also
investigated, for comparison.

Materials and methods

Experimental approach
Prostates of adult male Wistar rats were obtained from multiple litters that were
housed in the animal facilities at the Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). All the
experimental procedures were approved by the Ethical Committee for Animal
Experimentation of the UFMG (CEUA, process 30/2016 and 344/2018).
For investigations on aging prostates, male Wistar rats at 3, 6, 12, 18 and 24 months of
age (n = 8) were used. To drive prostatic malignant lesions (Bosland et al. 1995), 12-month
old male Wistar rats (n = 8) were treated surgically by subcutaneous implantation into the
flank region with hormone-containing Silastic tubes (#508-009; 1.98 mm i.d. X 3.18 mm o.d;
Dow-Corning Corporation, Midland, USA). Under anesthesia, the animals received two 2.0
cm Silastic capsules filled with testosterone propionate (#T-1875, Sigma, St. Louis, USA) and
one 1.0 cm Silastic capsule filled with 17-β-estradiol-3-benzoate (#E-8515, Sigma, St. Louis,
USA). The rats were hormonally treated for 24 weeks. Freshly prepared tubes with the same
dimensions were replaced after 12 weeks, to ensure consistent steroid levels over time.
Control animals received empty Silastic tubes (n = 5).
For the castration experiment, 90-days-old male Wistar rats underwent bilateral
castration (n = 4), performed by the scrotal incision under anesthesia. Sham-operations were
performed as surgery controls. Starting on the same day of the bilateral castration, the rats
 70

were subjected to hormone replacement for six days, with a daily subcutaneous injection of 5
mg of 5α-dihydrotestosterone (DHT) (#A-8380, Sigma, St. Louis, USA), dissolved in 0.1 mL
of corn oil as vehicle. The replacement control group received only vehicle. The treatment
period and dosage used were chosen based on previous studies (Oliveira et al. 2007).
After reaching the ages of interest and after the treatments, the rats were anesthetized
and the ventral (VP) and lateral (LP) prostates were dissected and embedded in paraffin
(Histosec Pastilles, Merck, Darmstadt, Germany). Tissue sections (4.0 m) were stained with
hematoxylin and eosin (HE) and periodic acid-Schiff (PAS) for histopathological analysis.
Alternatively, the freshly dissected lobes were immediately frozen in liquid nitrogen and
stored at -80 ºC. VP and LP were chosen, respectively, for being the most involuted after
castration (Evans & Chandler 1987; Banerjee et al. 2000; Desai et al. 2004) and the most
affected by prostatitis (Prins et al. 2017; Morais-Santos et al. 2018; Campolina-Silva et al.
2018, 2019).

Immunohistochemistry and immunofluorescence

In order to investigate the occurrence of intraepithelial macrophages in the rat
prostates, tissues sectioned at 4.0 µm were submitted to immunohistochemistry for CD68, a
pan-macrophage marker (Silva et al. 2017). Additionally, to characterize the epithelial cells in
close proximity to macrophages, immunostaining to detect cellular proliferation (MCM7) and
apoptosis (cleaved caspase-3) was also performed. To detect the expression of retinoid X
receptors (RXR), a transcription factor involved in M2 macrophages polarization (Myers at
al. 2019), immunohistochemistry was performed combined with the PAS (Corbellini et al.
2001), in which macrophages could be visualized in pink and RXR-positive nuclei in brown.
Negative controls were performed by omitting primary antibodies.
Oversimplifying the macrophage phenotypes, two distinct polarization states may be
recognized: the classically activated type 1 macrophages (M1), and the alternative activated
type 2 macrophages (M2). Aiming to distinguish these cell populations, immunofluorescence
was performed, as described previously (Campolina-Silva et al. 2018), to colocalize CD68
with basal cell marker (CK5), M1 macrophage marker (iNOS), M2 macrophage markers
(CD206, CD163, and arginase-1) or autophagy marker (LC3β). The fluorescence was
examined using a Zeiss ApoTome microscope (Carl Zeiss, Göttingen, Germany) equipped
with specific filters suitable for the detection of the signals. Additionally, the association
between intraepithelial macrophages and basal cells was investigated by immunofluorescence,
 71

using 16.0µm-thick prostate sections. Multiple optical sections taken along the Z axis were
acquired using a motorized Nikon Eclipse Ti microscope with NIS-Elements (Nikon
Instruments, Tokyo, Japan) to produce 3D reconstructions.
All antibodies used herein were tested with appropriate negative (muscle) and positive
(spleen and skin) control tissues. Serial dilutions were also performed to determine the
optimal concentration before being used in the described assays. Antibodies used are specified
in Table 1.

Transmission electron microscopy

Tissue fragments (1 mm3) from prostates were fixed in 2,5% glutaraldehyde in 0.1M
phosphate buffer, pH 7.4, at 4ºc for 24h. Samples were post-fixed in 2% osmium tetroxide,
contrasted en bloc with 2% uranyl acetate, infiltrated and embedded in EPON resin. Ultrathin
sections obtained were then examined with a Tecnai- G2-Spirit FEI/Quanta electron
microscope (120 kV Philips) and digital images were acquired.

Western blotting
Western blotting assays were performed, as previously described (Campolina-Silva et
al. 2018), in LP of control and T+E2-treated animals to detect possible changes in the LC3
protein levels through assessment of the nonlipidated cytosolic LC3-I and the lipidated
membrane-bound LC3-II levels (Klionsky et al. 2016). The assay was performed in duplicate
to confirm the results.

Quantitative and statistical analysis

Quantification of the number of stromal and epithelial CD68 positive cells and
caspase-3 positive epithelial cells was performed using the ImageJ software (National
Institutes of Health, Bethesda, USA). For each tissue section, ten 40x magnification images
were randomly taken from selected areas as close to the periphery of the gland as possible. In
addition, 40x magnification images were taken from normal epithelium, as well as from
prostate lesions areas (selected following the criteria described by Shappell et al. (2004)).
Positive and negative cells were counted, and the results were expressed as the percentage.
The quantitative data were statistically analyzed by using GraphPad Prism 7 software
(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Initially, the D’Agostino-Pearson test was used to
check the normality of the datasets. When normality was confirmed, the data were analyzed
by Student t-test or ANOVA plus Tukey post-hoc test to compare means between two or
 72

more groups, respectively. Otherwise, nonparametric data were analyzed using the Mann-
Whitney test or Kruskal-Wallis plus Dunn’s post-hoc test, to compare two or more groups,
respectively. Correlations were also calculated using Spearman’s correlation coefficient. As a
categorical data, the incidence of prostatic lesions containing intraepithelial macrophages was
presented as frequency and analyzed by Fisher’s exact test. The results were expressed
graphically as the mean + standard error of the mean and the significance level used for all
tests was p < 0.05.

Results

Intraepithelial macrophages in age-related and hormone-induced prostate lesions

To investigate the possibility of macrophage recruitment to the prostate epithelial
lesions we used the aging rat model. Epithelial CD68+ cells were not observed in the normal
prostate epithelium, at any age analyzed. On the other hand, intraepithelial macrophages were
observed in prostate epithelial lesions of rats at 18 and 24 months of age, such as in areas
showing atrophy, PIA, HGPIN and cancer (Fig. 1A and Table 2). Macrophages were also
observed in the stroma of both prostate lobes. The number of stromal CD68+ cells remained
similar in the VP of Wistar rats at all ages analyzed, whereas in the LP the proportion of
macrophages in the stroma was reduced at older ages (18 and 24 months) (Fig. 1A).
To test the hypothesis that intraepithelial macrophages are recruited into the prostatic
lesions, premalignant and malignant lesions were induced by treating aged rats to chronic
exposures to T+E2 (Bosland et al. 1995; Campolina-Silva et al. 2019; Ozten et al. 2019). In
control rats, CD68+ cells were restricted to the stromal areas (Fig. 1B). T+E2 treatment
increased the number of CD68+ macrophages in both stromal (from 6% and 14% to 15% and
31%) and epithelial (from undetectable to 1% and 5%) compartments of the VP and LP,
respectively (Fig. 1B). T+E2 treatment also increased the incidence of prostatic lesions
containing intraepithelial macrophages (Table 2). The number of intraepithelial CD68+
macrophages recruited after T+E2 treatment increased according to the severity of the prostate
lesions, from normal to atrophy and LGPIN in the VP, as well as from normal to PIA to
LGPIN to HGPIN to cancer in the LP (Fig. 1B). These lesions were identified through serial
tissue sections stained by HE, CD68 and MCM7 (Fig. 1B). Proliferating MCM7 positive
epithelial cells were found significantly associated with intraepithelial macrophages (r =
0.9608; p < 0.0001).
 73

Basal cells projections were observed intermingled with the intraepithelial TAM
phenotype macrophages
The intraepithelial CD68+ macrophages present in naturally occurring or hormone-
induced prostatic lesions were typically round or globular in shape, but with considerable
variation in size, sometimes forming large clusters of cells (Fig. 2A). The nuclei were
vesicular and generally peripheral in location. The cytoplasm was characterized by intense
PAS-positive and eosinophilic staining. Serial sections of the same area stained with HE and
CD68 marker indicated that these eosinophilic cells were CD68+ macrophages. The presence
of macrophages within the epithelium was further confirmed by their presence above the
basement membrane, as seen with PAS staining (Fig. 2A).
Electron microscopy also confirmed the intraepithelial position of macrophages in
prostate lesions, including a common observation of these cells located above basal cells (Fig.
2B and 3). Often, multiple macrophages were juxtaposed, forming large clusters and
resembling multinucleated cells, but in fact these were individual cells, recognized by their
nuclei and delimiting plasma membranes (Fig. 2B). Extensive cytoplasmic interdigitations
were observed between macrophages in the base of the epithelium, as well as above the basal
cells. No junctional structures were detected between the intraepithelial macrophages nor
between macrophages and the surrounding epithelial cells.
To characterize the intraepithelial macrophages, immunofluorescence was used to
distinguish M1 (iNOS) and M2 (CD163, CD206 and arginase) populations. Colocalization
revealed that intraepithelial CD68+ macrophages, recruited after T+E2 treatment, expressed
iNOS, CD206 and arginase (Fig. 2C), but they did not express CD163 (data not shown).
These macrophages also expressed nuclear RXR (Fig. 2C).
Colocalization of CD68 and CK5 further confirmed that macrophages were localized
within the basal epithelium, highlighting an intricate relationship between CD68+ cells and
basal cells (Fig. 3). Using 3D confocal microscopy, it was possible to observe a dense and
sometimes continuous network of basal cells located at the base of the epithelial lesions
(Movie S1). Besides emitting cytoplasmic projections towards the lumen, some basal cells
also extended projections that partially or completely intermingled with the intraepithelial
macrophages (Fig. 3B and Movie S1). Basal cells were also seen interacting with other basal
cells, in order to involve the intraepithelial macrophages or even their clusters (Fig. 3B).
 74

Intraepithelial macrophages show autophagic activity in the prostate epithelial lesions

Ultrastructurally, the intraepithelial macrophages observed in prostatic lesions were
characterized by an abundance of lysosomes of different sizes and associated with autophagic
vacuoles (Fig. 4). The autophagic-related structures varied in stage of formation, from initial
phagophores or elongating membranes engulfing cytoplasmic components, to double-
membraned autophagosomes and autophagic vacuoles containing debris in various stages of
digestion (Fig. 4A). The vacuoles varied in size and occupied most of the macrophage
cytoplasm (Fig. 4B). The association of initial autophagic structures with mitochondria and
endoplasmic reticulum was commonly found (Fig. 4A). The nucleus, with clumps of
heterochromatin under the nuclear envelope, was often located near the periphery.
Confirming the macrophage autophagic activity, serial sections stained for CD68,
iNOS, and LC3 (an autophagy marker) revealed that the intraepithelial macrophages express
LC3 (Fig. 4B). In control and T+E2 treated animals, Western blotting assays specifically
detected two main reactive bands of approximately 16 kDa and 14 kDa, corresponding to the
nonlipidated LC3-I and lipidated LC3-II forms, respectively (Klionsky et al. 2016). An
increase in LC3-II band intensity and a decrease in LC3-I expression was observed in the LP
prostate of T+E2 treated animals, indicative of lipidation and consequently, increased
autophagy (Fig. 4B).

M2 macrophages recruited to prostate epithelium after androgen withdrawn are

involved in efferocytosis
For comparison, macrophage phenotypes were investigated in the prostate of castrated
animals, which is a well-known model of the recruitment of intraepithelial macrophages. In
control rats, macrophages were not detected in the epithelium of the adult VP and LP;
whereas, a small number of CD68+ cells were observed in the stroma (Fig. 5A). Conversely,
under androgen deprivation through surgical castration, there was an induction of CD68+
macrophage recruitment into the basal portion of the prostate epithelium (Fig. 5A and B).
After castration, the intraepithelial CD68+ macrophages were increased 10-fold greater in the
VP than in the LP. Treatment with DHT returned macrophages to levels comparable to sham-
treatment, in both lobes (Fig. 5A).
Intraepithelial CD68+ macrophages present in the base of the epithelium after
castration showed considerable variation in morphology (Fig. 5B). Some macrophages had
cytoplasmic processes that were parallel to the basement membrane or interposed transversely
between epithelial cells. The location and morphology of these macrophages made it easy to
 75

confuse with basal cells of the prostate epithelium (Fig. 5A). Therefore, immunofluorescence
for dual staining of CD68 and CK5 (basal cell marker) was performed, confirming that,
although morphologically similar, macrophages and basal cells were distinct cells populating
the basal epithelial compartment (Fig. 5B).
Intraepithelial CD68+ macrophages were commonly observed engulfing apoptotic
cells (Fig. 5C). This finding was confirmed by staining of cells with the apoptosis marker
cleaved caspase-3. A strong positive correlation between the number of intraepithelial CD68+
macrophages and cleaved caspase-3 positive epithelial cells was observed (r = 0.8155; p <
0.0001). Ultrastructurally, it was possible to identify long and slender macrophage
projections, sometimes parallel to the basement membrane and also extending apically
between luminal cells. Some pseudopodia-like projections were also seen. Confirming the
light microscopy findings, macrophages were shown to be engulfing apoptotic cells (Fig. 5C).
To further characterize intraepithelial macrophage phenotypes, immunofluorescence
was performed to distinguish M1 (iNOS) and M2 (CD163, CD206 and arginase) populations.
Colocalization revealed that intraepithelial CD68+ macrophages recruited after castration
expressed CD163, but did not express iNOS, CD206 and arginase (Fig. 5D). Macrophages
found in the epithelium after castration were also immunopositive for the retinoid receptor
RXR (data not shown).

Discussion
This study revealed significant recruitment of CD68+ macrophages into the prostatic
epithelium, but only into areas restricted to the premalignant and malignant lesions, either
found naturally during aging or induced by T+E2. The intraepithelial macrophages associated
with premalignant and malignant changes were morphologically and phenotypically distinct
from those found in the epithelium of prostates undergoing regression after castration.
Macrophages in the epithelial lesions were heavily involved in autophagy, while those found
in the regressed epithelium were observed engulfing apoptotic cells. The study also revealed
an unprecedented interaction between macrophages and basal cells in the aging pathological
lesions, suggesting a potential crosstalk between the cells.
Intraepithelial macrophages were not detected in the normal prostate under
physiological conditions, whereas the infiltration of macrophages into the epithelium was
observed after castration and in the epithelial lesions. It was noteworthy that the number of
intraepithelial macrophages varied according to the severity of the lesion, as cancer and
HGPIN, a well-recognized pre-cancerous lesion, presented greater numbers of macrophages
 76

than LGPIN and atrophy. Although other studies have also associated macrophage density to
prostatic lesion severity (Lissbrant et al. 2000; Narayanan et al. 2009; Lindholm et al 2010;
Hu et al. 2015; Bergstrom et al. 2016; Fan et al. 2017; Melis et al. 2017; Jones et al. 2019),
this association was not specifically characterized for intraepithelial macrophages. It is likely
that macrophages with the closest contact with epithelial cells will have more pronounced
paracrine effects on the epithelium than macrophages situated in the stroma (Lissbrant et al.
2000). Such paracrine interactions may play a role in increasing the proliferation of prostatic
epithelial cells, thereby accelerating tumor progression (Lissbrant et al. 2000; Dang & Liou
2018; Jones et al. 2019). In support of this hypothesis, proliferating MCM7-positive epithelial
cells showed a significant positive correlation with the presence of intraepithelial
macrophages.
It is noteworthy that an intricate relationship was observed between CD68+
macrophages and the basal cells located in prostatic lesions. Long, thin arms of basal cell
cytoplasm were seen extended around the intraepithelial macrophages. To our knowledge, this
is the first report to show such intimate interaction between basal cells and macrophages
within the prostate epithelium. Similar intricate association between basal cells and
mononuclear phagocytes was previously found in the epididymis under physiological
conditions (Da Silva et al. 2011; Shum et al. 2014). Herein the coexistence of macrophages
and basal cells was restricted to altered areas in the prostate epithelium, and the cell-cell
associations appeared even more intimate, as basal cells were seen surrounding the
macrophages. It has been shown that prostate basal cells may function as a barrier to protect
the luminal cells from insults, such as cytokines secreted by immune cells (Choi et al. 2012;
Goldstein & Witte 2013). Therefore, it is possible that this reorganization of the basal cells
may protect the luminal epithelial cells from potential harmful actions of immune cells, by
isolating the macrophages.
Of particular interest was the differences observed in intraepithelial macrophage
phenotypes, depending on the hormonal microenvironment. In the prostate from castrated
rats, intraepithelial macrophages were CD68+/iNOS-/ CD163+/CD206-/ARGINASE-,
whereas those in the prostatic lesions of aging males were CD68+/iNOS+/ CD163-
/CD206+/ARGINASE+. These features are consistent with the M2 and TAM phenotypes,
respectively. Corroborating our findings, CD68+/iNOS- macrophages were also found in the
rat VP on day 5 after castration, although without being positive for CD163 (Silva et al. 2018;
Barbosa et al. 2019). The M2 phenotype observed in the present study is compatible with the
morphology showing frequent engulfment of apoptotic cells by intraepithelial macrophages,
 77

which would indicate an active scavenging function involved in the clearance of apoptotic
cells, an essential role for preventing the buildup of dangerous inflammation signals (Nagata
et al. 2010). Indeed, data presented here show a strong positive correlation between the
number of intraepithelial CD68+ macrophages and cleaved caspase-3 positive epithelial cells.
It is known that M2 macrophages have greater capacity for clearance of apoptotic cells, a
process also known as efferocytosis, which is important for the maintenance of tissue
homeostasis (Werfel & Cook 2018; Jones et al. 2019; Myers et al. 2019).
Macrophages positive for CD206, a biomarker for the M2/TAM macrophage
phenotype (Fan et al. 2017; Zarif et al. 2019), were observed in rat prostates showing early
proliferative lesions, even before malignancy was established. Similar findings have been
reported previously in breast tissue (Linde et al. 2018) and the prostate (Fan et al. 2017). In
human PCa, a positive correlation has been reported between CD206+ cell density and the
tumor grade, metastasis and castration resistance (Fan et al. 2017; Zarif et al. 2019).
However, the determination of a functional role for macrophages having the
CD68+/iNOS+/CD163-/CD206+/ARGINASE+ phenotype is more complicated. Although
M2/TAM are considered poor nitric oxide (NO) producers (Mantovani et al. 2004),
macrophages may score positive for iNOS in PCa (Klotz et al. 1998; Narayanan et al. 2009),
as found in prostatic lesions of the present study. It has been proposed that contrasting with
the high levels of NO produced by M1 macrophages, which is the mediator in tumor-cell
killing, attenuated iNOS but increased arginase in M2 cells leads to low concentrations of NO
associated with arginase-derived polyamines, thus contributing to vascularization and tumor
cell proliferation and survival (Mantovani et al. 2004; Fukumura et al. 2006). The
simultaneous expression of iNOS and arginase, considered M1 and M2 markers respectively,
in the intraepithelial macrophages found in prostatic lesions further corroborate that the
macrophage heterogeneity may not always fit well in the oversimplified dichotomy of the
macrophage functional states of M1 and M2 (Jablonski et al. 2015; Lin et al. 2016).
Macrophages with diverse morphological features were recruited to the epithelium
under different conditions, reinforcing the plasticity of these immune cells, depending on the
hormonal environment. As such, frequent cytoplasmic projections from the intraepithelial
macrophages were seen associated with apoptotic cells after androgen deprivation. In contrast,
intraepithelial macrophages located in prostatic lesions were mostly enlarged, rounded cells,
containing numerous and large autophagic vacuoles. It has been shown that engulfment of
multiple targets induces molecular and morphological changes in macrophages, making them
rounder in shape with less membrane extension, thus reducing their capacity to engulf new
 78

targets (Zent & Elliott 2017). Such macrophage features corroborate our present findings. One
possible mechanism for enhancing the degradation of excess cytoplasmic cargo by
macrophages is the involvement of autophagic pathways, which would lead to the LC3-
associated phagocytosis (Zent & Elliott 2017). Consistent with these events, the engorged
macrophages were usually found in clusters within the prostate lesions and were proven
positive for the autophagic-specific marker LC3. Autophagic activity in these cells was also
confirmed by transmission electron microscopy, a well-recognized approach to study
autophagy (Klionsky et al. 2016).
It should be pointed out that the clearance of apoptotic cells by macrophages, as
observed in the regressed prostate after androgen withdrawn, may have physiological
significance in the maintenance of homeostasis and an immune-silent environment (Silva et
al. 2018; Werfel & Cook 2018; Myers et al. 2019). In the context of prostatic lesions,
characterized by dysregulation in cell proliferation and death (Gonzaga et al. 2017), the
immunosuppression created by efferocytosis may have deleterious consequences, favoring
cancer progression (Werfel & Cook 2018; Jones et al. 2019; Myers et al. 2019). The
degradation of cellular debris by macrophages induces the production of cholesterol-
derivatives responsible for activating the nuclear receptor family of transcriptional factors,
specifically retinoid X receptors (RXR), liver X receptor (LXR) and peroxisome proliferator-
activated receptor (PPAR) (Werfel & Cook 2018; Myers et al. 2019). These nuclear receptors
have been shown to be associated with the transcription of genes related to M2 polarization,
as well as the activation of genes encoding anti-inflammatory cytokines and proteins involved
in efferocytosis (Werfel & Cook 2018; Jones et al. 2019; Myers et al. 2019). In the present
study, macrophages found in the epithelium after castration, as well as in the prostatic lesions,
expressed RXR, thus corroborating the M2 phenotype observed and their possible functional
role in efferocytosis.
In conclusion, morphologically and phenotypically distinct macrophages were found in aging
prostatic epithelial lesions and in the castration-induced regressed epithelium. This highlights the
plasticity of these inflammatory cells depending on the microenvironment. Intraepithelial
macrophages with the TAM phenotype were found restricted to areas of premalignant and malignant
lesions, in both the naturally formed lesions observed during aging and those induced by T+E2
treatment. These data support the hypothesis that TAMs may be part of the inflammatory pathway
involved in prostate cancer progression (Nonomura et al. 2011).
 79

Acknowledgements
We are grateful to Dra. Vanessa Pinho for the donation of the anti-iNOS and anti-arginase
antibodies. We are grateful to Dr. Gustavo Menezes and Maria Alice Lopes for the donation
of the anti-CD206 antibody and for providing the equipment and technical support to produce
3D reconstructions. The authors would like to acknowledge the Center of Microscopy at the
Universidade Federal de Minas Gerais for providing the equipment and technical support for
experiments involving electron microscopy and fluorescence. Fluorescent pictures shown in
this work were also obtained using the microscopes and equipment in the Centro de Aquisição
e Processamento de Imagens (CAPI- ICB/UFMG).

Financial support
This study was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico - CNPq/Brazil (Grant and research fellowship to C.A.O., fellowship to H.W.G.);
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES/Brazil (fellowships
to G.H.C.S. and B.T.M.); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais -
FAPEMIG/Brazil (Grant to C.A.O.) and Pró-Reitoria de Pesquisa – Universidade Federal de
Minas Gerais (PRPq/UFMG).

Author contributions statement

Study design: HWG GHCS CAO. Execution of experiments: HWG GHCS BTM. Data
analysis and interpretation: HWG GHCS BTM CAO. Writing of the manuscript HWG RAH
CAO. Technical and Intellectual support: HWG GABM RAH CAO.

The authors have nothing to disclose.

Supplementary information
Movie S1. 3D reconstructions from a z-series of confocal images, evidencing basal cells
projections (green) involving intraepithelial macrophages (orange).
 80

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 84

Fig. 1. Identification of macrophages in the rat prostate during aging and after T+E2
treatment. (A) HE staining shows intraepithelial macrophages (arrow) at PIA lesion,
highlighting isolated (a) and clustered (b) macrophages. Graphical representation of the
variation in stromal CD68+ macrophages at aging ventral and lateral lobes. Mean values with
different letters represent statistically significant differences (p < 0.05). (B) Graphical
representation of the variation in stromal and intraepithelial CD68+ macrophages in ventral
and lateral lobes after T+E2 treatment. Mean values with different letters or * represent
statistically significant differences (p < 0.05). HE, CD68 and MCM7 staining reveal stromal
(arrowhead) and intraepithelial (arrow) macrophages in areas of normal epithelium, atrophy,
HGPIN and cancer. Ne: normal epithelium. Lu: lumen. S: stroma. bv: blood vessel. sc:
sloughed cells into the lumen. #: thickening of the periacinar stroma. Scale bars = 50 µm.
 85

Fig. 2. Characterization of intraepithelial macrophages in the rat prostate found during

aging and after T+E2 treatment. (A) Identification of macrophages by HE, PAS and CD68
staining. Arrow: PAS-positive basement membrane. (B) Illustrative electron micrograph of a
cluster of intraepithelial macrophages localized alongside basal cells (green) and basement
membrane (*). The cluster area delimited by rectangle 1 was amplified depicting three
juxtaposed macrophages (M1, M2 and M3). Amplified rectangle 2 area shows cytoplasmic
interdigitations (#) between different macrophages of the cluster located above basal cell
(green). BC: basal cell. M: macrophage. Nu: macrophage nuclei. *: basement membrane. bv:
blood vessel. (C) Immunofluorescence showing the expression of iNOS, CD206 and arginase
by the intraepithelial CD68+ macrophages. Dual staining revealed that PAS-positive
macrophage (pink) also express RXR (brown). Lu: lumen. S: stroma. Scale bars = 50 µm.
 86

Fig. 3. Interaction between intraepithelial macrophages and basal cells in prostate

lesions found after T+E2 treatment. (A) Electron micrograph confirming the location of
macrophages (M) above the epithelial basal cell (green). BC: basal cell. Arrowhead:
hemidesmosome in basal cell. *: basement membrane. #: cytoplasmic interdigitations between
different macrophages. (B) Colocalization of CD68 and the basal cell marker CK5 evidencing
basal cells projections involving isolated or clusters of intraepithelial macrophages. Lu:
lumen. S: stroma. Scale bars = 50 µm.
 87

Fig. 4. Ultrastructural characterization and autophagic activity in intraepithelial

macrophages found in prostate lesions after T+E2 treatment. (A) Electron micrograph
showing autophagy related structures in different stage of formation, from phagophore initial
to autophagosome and autophagic vacuoles (numbered 1 to 5). Mi: mitochondria. (B) The
autophagic vacuoles (blue) varied in size, occupying most of the macrophage cytoplasm
(pink). Colocalization of iNOS and CD68 or LC3 markers by using serial sections confirm
autophagic activity in the intraepithelial macrophages. Representative bands from the Western
blotting of LC3 revealed two main bands corresponding to LC3-I (16 kDa) and LC3-II (14
kDa). Ep: epithelial cells. Nu: macrophage nuclei. S: stroma. Scale bars = 50 µm.
 88

Fig. 5. Characterization of macrophages in the rat prostate after castration and

androgen replacement. (A) Graphical representation of variation in the stromal and
intraepithelial CD68+ macrophages in the ventral and lateral prostates. Mean values with
different letters represent statistically significant differences (p < 0.05). (B) CD68
immunostaining showing stromal and intraepithelial macrophages with varied morphology.
Colocalization of CD68 and the basal cell marker CK5 confirmed that macrophages and basal
cells are distinct cells. bv = blood vessel. (C) CD68 immunostaining showing intraepithelial
macrophage (between arrows) apparently engulfing an apoptotic cell (Ap). There was strong
positive correlation between the number of intraepithelial CD68+ macrophages and epithelial
caspase-3 positive cells (r = 0.8155; p < 0.0001). Electron micrograph of castrated ventral
prostate showing macrophage (pink) engulfing apoptotic cell (blue). (D) Colocalization of
CD68 and CD163 or iNOS. Ep: epithelial cell. LB: lipid body. Lu: lumen. Nu: macrophage
nuclei. S: stroma. Figures are representative of castrated rats. Scale bars in IHC = 20 µm, IF =
50 µm.
 89

Table 1. Primary antibodies used in this study

Manufacturer, Catalogue
Antibody Type Dilution RRID
number
Santa Cruz Biotechnology, 1:600 (IHC)
CD68 Mouse monoclonal AB_1120614
sc-59103 1:100 (IF)
Thermo Scientific, MS-
MCM7 Mouse monoclonal 1:800 (IHC) AB_145298
862-P0
cleaved Cell Signaling
Rabbit polyclonal 1:400 (IHC) AB_2341188
caspase-3 Technology, 9661
Santa Cruz Biotechnology,
RXR Mouse monoclonal 1:300 (IHC) AB_2184877
sc-46659

CK5 Rabbit polyclonal BioLegend, 905501 1:4000 (IF) AB_2565050

Santa Cruz Biotechnology,

iNOS Rabbit polyclonal 1:100 (IF) AB_2298577
sc-651
CD206 Mouse monoclonal BD Biosciences, 564062 1:50 (IF) AB_2738570
Santa Cruz Biotechnology,
CD163 Rabbit polyclonal 1:50 (IF) AB_2074556
sc-33560
Santa Cruz Biotechnology,
arginase-1 Rabbit polyclonal 1:100 (IF) AB_2058955
sc-20150
Santa Cruz Biotechnology, 1:100 (IF)
LC3β Mouse monoclonal AB_11150489
sc-376404 1:1000 (WB)

Abbreviations: IF, immunofluorescence; IHC, immunohistochemistry; RRID, research

resource identifier; WB, Western blotting.

 90

Table 2. Incidence of prostatic lesions containing intraepithelial macrophages.

Ventral prostate Lateral prostate

Atrophy LGPIN PIA LGPIN HGPIN Cancer

Natural lesions at
12,5% 0 12,5% 0 18,7% 12,5%
aging (18 and 24 M)

Induced lesions
85,7% 85% 100% 57,1% 100% 71,4%
(T+E2 treatment)

p-value 0.0017 0.0001 0.0001 0.0040 0.0005 0.0107

M = months; PIA = proliferative inflammatory atrophy; LGPIN = low or high grade prostatic

intraepithelial neoplasia; HGPIN = high grade prostatic intraepithelial neoplasia.

 91

CAPÍTULO III
Resultados adicionais não publicados
 92

Modulação das células basais de acordo com o microambiente hormonal prostático

Os ensaios de imuno-histoquímica e imunofluorescência para CK5 mostraram que as

células basais estão amplamente distribuídas na próstata ventral de ratos Wistar,
independentemente da idade dos animais, e apresentam morfologia variada (Figura 8).
Algumas células são pequenas, arredondadas ou triangulares, e aparentemente restritas à base
do epitélio, (Figura 8 a, b). Outras apresentam projeções citoplasmáticas paralelas à
membrana basal, que se entendem na base do epitélio (Figura 8 c, i), ou projeções
citoplasmáticas apicais, delgadas, de tamanhos variados, que se estendem em direção ao
lúmen prostático, chegando às vezes a alcançá-lo (Figura 8 d, g, h, j). Adicionalmente,
algumas células basais emitem projeções citoplasmáticas apicais que se curvam em direção à
célula epitelial vizinha (Figura 8 e, f, g, k Vídeo 1).

Figura 8. Variação morfológica das células basais CK5-positivas encontradas ao longo do

epitélio prostático de ratos Wistar. As células basais são pequenas, arredondadas ou triangulares,
situadas normalmente na base do epitélio, podendo apresentar projeções basais ou apicais. Células
basais CK5-positivas marcadas em marrom na imuno-histoquímica e em verde na imunofluorescência.
Imagem g é representativa do Vídeo 1.

Ao longo do envelhecimento, considerando áreas de epitélio normal, foi detectado um

discreto aumento do número de células basais CK5-positivas, que representaram cerca de
10% das células epiteliais prostáticas em ratos adultos jovens (3 e 6 meses) e 17% em ratos
idosos (18 e 24 meses) (Figura 9). Por outro lado, o número de células basais que emitem
projeções citoplasmáticas apicais (definida como a célula cuja projeção citoplasmática estava
localizada acima dos núcleos das células epiteliais adjacentes, de acordo com critério
estabelecido por Shum et al. (2008)) reduziu ao longo do envelhecimento (Figura 9).
 93

Enquanto essas células representaram cerca de 40% das células basais encontradas no epitélio
de ratos Wistar aos 3 meses de idade, elas representaram 20% aos 18 meses e 14% aos 24
meses, uma redução de mais de 50%.

Figura 9. Variação quantitativa das células basais CK5-positivas encontradas no epitélio

prostático de ratos Wistar ao longo do envelhecimento. Setas: células basais emitindo projeções
citoplasmáticas apicais. Letras (a, b) indicam diferença estatística entre os grupos (p < 0,05; n = 5).

Em seguida, visando compreender a modulação das células basais prostáticas de

acordo com o microambiente hormonal, ratos Wistar machos de 3 meses de idade foram
submetidos à castração cirúrgica bilateral, seguida de reposição hormonal com estradiol (E2)
ou DHT, durante 7 dias. Os ensaios de imuno-histoquímicas para CK5 mostraram que nos
animais controle (sham), as células basais corresponderam a cerca de 9% das células epiteliais
prostáticas. A castração bilateral aumentou o número de células basais do epitélio para
aproximadamente 14%, proporção que se manteve após reposição com E2. O tratamento com
DHT reduziu a quantidade de células basais para níveis comparáveis ao controle (Figura 10).

Figura 10. Variação quantitativa das células basais CK5-positivas presentes no epitélio
prostático de ratos Wistar após castração e reposição hormonal. Letras (a, b) indicam diferença
estatística entre os grupos (p < 0,05; n = 5).
 94

Sabendo que as células basais constituem uma população heterogênea, decidimos

investigar a possibilidade de modulação tanto de uma subpopulação indiferenciada quanto de
uma mais diferenciada, conforme proposto por Wang et al. (2001). Para isso, investigamos a
subpopulação p63+, importante por conter as células tronco basais prostáticas (Lee et al.
2014), e as células basais que expressam aromatase mais intensamente, considerada uma
subpopulação com fenótipo mais diferenciado (Morais-Santos et al. 2018).
Ao longo do envelhecimento, considerando áreas de epitélio normal, foi detectada
uma redução do número de células basais p63-positivas, que representaram cerca de 5% das
células epiteliais prostáticas em ratos adultos jovens (3 e 6 meses) e 2% em ratos idosos (18 e
24 meses) (Figura 11).

6
a

a
a
% c é lu la s p 6 3 +

b
2

0
3M 6M 12M 18M 24M

Figura 11. Variação quantitativa das células basais p63-positivas encontradas no epitélio
prostático de ratos Wistar ao longo do envelhecimento. Letras (a, b) indicam diferença estatística
entre os grupos (p < 0,05; n = 5).

Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa mostraram a presença de células

intensamente coradas para aromatase no epitélio prostático, e que essas células pertenciam à
população de células basais (Morais-Santos et al. 2018). Essas células foram denominadas
células basais Arom+. Foi previamente mostrado que a quantidade de células basais Arom+
no epitélio prostático normal não variou ao longo do envelhecimento (Morais-Santos et al.
2018). Em ratos de 3 meses de idade, as células basais Arom+ representaram cerca de 2% do
total de células do epitélio prostático, ou seja, 20% das células basais (Figura 12). A
castração bilateral aumentou o número de células basais Arom+ do epitélio para cerca de 6%
do total de células epiteliais e 45% das células basais. Após castração + reposição com E2, o
aumento foi ainda maior, alcançando 14% do total de células epiteliais e 99% das células
basais. O tratamento com DHT reduziu o número de células basais Arom+ para níveis
comparáveis ao controle.
 95

Figura 12. Variação quantitativa das células basais intensamente coradas para aromatase
presentes no epitélio prostático de ratos Wistar após castração e reposição hormonal. Letras (a,
b, c) indicam diferença estatística entre os grupos (p < 0,05; n = 5).
 96

V. DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO

 97

V. DISCUSSÃO GERAL E CONSLUSÃO

Nossos resultados fornecem evidências de que ratos Wistar podem ser um modelo pré-
clínico adequado para os estudos referentes às desordens prostáticas relacionadas ao
envelhecimento, como o CaP. Tal conclusão é baseada na observação do surgimento de lesões
benignas, pré-malignas e malignas em ratos idosos, além de uma incidência de CaP de 36%
que aumentou para 100% após a exposição à testosterona e estradiol. Dessa forma, assim
como observado em humanos, o desenvolvimento de CaP em ratos Wistar parece resultar de
um processo lento e de várias etapas envolvendo o desenvolvimento e a progressão de lesões
pré-malignas.
O tratamento de ratos Wistar com testosterona e estradiol causou um maciço infiltrado
de células imunes mononucleares para a próstata. Essas células foram observadas no estroma
circundando os ácinos, no lúmen e até mesmo no epitélio, onde estavam intimamente
associadas às lesões pré-malignas como PIA e PIN. Considerando que a identificação dos
tipos de leucócitos envolvidos na progressão das lesões pode ser valiosa para entender melhor
a relação entre inflamação e câncer, observamos que macrófagos estão presentes no epitélio
prostático em áreas restritas às lesões pré-malignas e malignas, tanto observadas naturalmente
ao longo do envelhecimento quanto após tratamento com testosterona e estradiol. Esses
macrófagos apresentaram fenótipo TAM e foram encontrados associados às células epiteliais
em proliferação, corroborando a hipótese de que as TAM podem fazer parte da via
inflamatória envolvida na progressão do CaP (Nonomura et al. 2011).
De forma pioneira, mostramos uma íntima interação entre os macrófagos e as células
basais em lesões prostáticas, onde delgadas projeções citoplasmáticas das células basais foram
observadas se estendendo ao redor dos macrófagos intraepiteliais. Considerando que as
células basais da próstata podem funcionar como uma barreira para proteger as células
luminais de insultos vindos do estroma adjacente (Choi et al. 2012; Goldstein e Witte 2013), é
possível que essa reorganização das células basais, de forma a isolar os macrófagos
intraepiteliais, possa proteger as demais células epiteliais das possíveis ações nocivas dessas
células imunes.
Assim como descrito no epidídimo (Shum et al. 2008; Roy et al. 2016), observamos
também que algumas células basais prostáticas apresentaram projeções citoplasmáticas
apicais que por vezes atingiam o lúmen prostático. Sabe-se que as projeções citoplasmáticas
apicais encontradas nas células basais se entendem e retraem periodicamente em direção ao
lúmen, podendo até ultrapassá-lo para monitorar o ambiente luminal, modulando sua função
 98

em resposta à demanda fisiológica (Roy et al. 2016). No presente trabalho, ampliamos a

concepção do monitoramento exercido pelas células basais, uma vez que observamos que elas
emitem projeções citoplasmáticas apicais que se estendem não apenas em direção ao lúmen,
mas também se curvam em direção às células epiteliais vizinhas. Dessa forma, é possível que
as projeções emitidas pelas células basais sejam capazes de monitorar também as células
epiteliais ao seu redor, demonstrando assim uma forma alternativa de interação entre essas
células. Mais estudos são necessários para compreender as funções exercidas pelos
prolongamentos emitidos pelas células basais, bem como os mecanismos que regulam essa
plasticidade de movimento.
Foi previamente mostrado que a quantidade de células basais intensamente coradas
para aromatase não variou ao longo do envelhecimento (Morais-Santos et al. 2018). No
presente trabalho, observamos um aumento da quantidade de células basais CK5-positivas no
epitélio prostático ao longo do envelhecimento, enquanto as células basais p63-positivas
reduziram. Esses resultados mostram que de fato, as células basais constituem uma população
heterogênea, cujas subpopulações são moduladas de maneira diferente de acordo com o
microambiente. Mais estudos são necessários para compreender a função desempenhada por
cada uma dessas subpopulações tanto no contexto fisiológico quanto no patológico.
Considerando o conjunto de resultados obtidos, podemos concluir que os macrófagos e
as células basais são células extremamente plásticas, capazes de adaptar a morfologia e o
fenótipo dependendo do microambiente local. Além disso, mostramos a importância desses
dois tipos celulares, bem como a interação entre elas, no desenvolvimento e progressão das
lesões prostáticas.
 99

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 100

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