6t ‘

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIOXIDANTE DOS FRUTOS MARI-MARI (Cassia leiandra), PAJURÁ

(Couepia bracteosa) E PITOMBA (Talisia esculenta).

MAYANE PEREIRA DE SOUZA.

Orientadora: Profª.Drª. Rita de Cássia Saraiva Nunomura

Co-orientador: Prof. Dr. Afonso Duarte Leão de Souza.

Manaus-AM
Maio de 2016
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

Área de Concentração: Química Orgânica
Nível: Doutorado

*MAYANE PEREIRA DE SOUZA.

Caracterização química e avaliação do potencial antioxidante dos frutos mari-mari

(Cassia leiandra), pajurá (Couepia bracteosa) e pitomba (Talisia esculenta).

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal do Amazonas,

como requisito final para obtenção do

Título de Doutora em Química, Área de

atuação: Química Orgânica.

Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Saraiva Nunomura.

Co-Orientador: Prof. Dr. Afonso Duarte Leão de Souza
*Bolsista CAPES

2
 Ficha Catalográfica
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).

Souza, Mayane Pereira de

S729c Caracterização química e avaliação do potencial antioxidante dos
frutos mari-mari (Cassia leiandra), pajurá (Couepia bracteosa) e
pitomba (Talisia esculenta) / Mayane Pereira de Souza. 2016
126 f.: il. color; 31 cm.

Orientadora: Rita de Cássia Saraiva Nunomura

Coorientador: Afonso Duarte Leão de Souza
Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do
Amazonas.

1. Frutas amazônicas. 2. Potencial antioxidante. 3. Mari-mari

(Cassia leiandra Benth). 4. Pitomba (Talisia esculenta). 5. Pajurá
(Couepia bracteosa). I. Nunomura, Rita de Cássia Saraiva II.
Universidade Federal do Amazonas III. Título
i
ii
 Dedico este trabalho aos meus pais
Valdeci e Paula, minha irmã e
amiga Maryane, meu irmão Valzinho,
minha filha Catarina e meu esposo Aldrey
pelo incentivo, apoio e força, pois devo a vocês
todas as minhas conquistas.

iii
 “Não é o que você faz, mas
quanto amor você dedica no que
faz que realmente importa.”
Madre Tereza de Calcutá

iv
 AGRADECIMENTOS

À Deus que a cada dia nos dá uma nova oportunidade de crescermos e amadurecermos
como humanos.
A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa
concedida.
Ao meu pai que contribuiu diretamente neste trabalho com o conhecimento de frutos
nativas da região e principalmente por me ajudar na coleta dos frutos.
À minha mãe pelo incentivo, compreensão e apoio durante esta jornada.
Meu esposo Aldrey que sempre admirou os meus esforços me apoiando e incentivando
nesta jornada e compartilhando as alegrias de cada conquista.
Aos Professores Rita de Cássia Saraiva Nunomura e Afonso Duarte Leão de Souza pela
orientação, paciência, pela oportunidade de crescimento profissional e pela amizade.
Ao Doutor Sergio Massayoshi Nunomura e aos técnicos Magno Pêrea e Sabrina Kelly
pelas análises de LC-MS/MS no Laboratório Temático de Química de Produtos
Naturais (CA-LTQPN), sem sua ajuda este trabalho não seria possível.
As alunas de I.C. que ajudei a orientar Ingrity Sá e Thais Nobre que contribuíram em
muitos dos trabalhos realizados.
Aos grandes amigos Adriana Silva, Fabiana Greyce, Andréa Medeiros, Rita Cynnara,
Paulo Renan, Priscila Aquino, Aimêe Oliveira, Bruna Caroline Maciel, Orlando
Amazonas, Mauro Galúcio e Felipe Thiago Lima que desde a graduação caminhamos
juntos e nos apoiamos durante o mestrado e doutorado.
Aos colegas Hector, Giovana, Felipe e Richardson na parceria do trabalho envolvendo a
pitomba.
Aos colegas de laboratório da UFAM: Felipe Moura, Richardson, Elzalina, Paulo
Senna, Lídia, Bruna Ribeiro, Liviane, Diego, André e Ingrity.
Á Fiocruz em nome da professora Patrícia Orlandi pelos ensaios antimicrobianos,
antimaláricos e citotóxicos.
Aos professores Marcos Machado e Andersson Barison (UFPR) pelos experimentos em
RMN.
Aos membros que compõem a banca examinadora pelas valiosas contribuições.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

v
RESUMO

Mari-Mari (Cassia leiandra Benth), pajurá (Couepia bracteosa) e pitomba

(Talisia esculenta) são frutas facilmente encontradas nos arredores da cidade e também

na floresta amazônica. A composição química e informações sobre a capacidade

antioxidante do mari-mari é desconhecida e do pajurá e pitomba pouco exploradas.

Neste trabalho, foram produzidos extratos de polpa, cascas e sementes destes frutos

utilizando acetona e metanol, para realização de análises por LC-MS para a

identificação de compostos, especialmente da classe de flavonoides, quantificação do

teor de fenólicos totais, avaliação da capacidade de sequestro de radicais DPPH e

redução de Fe3+. Os resultados de quantificação dos fenólicos totais dos extratos da

parte comestível de mari-mari apresentou teor de fenólicos totais de 0,036 e 40,12 mg

GAEq/100 g de extrato seco nos extratos metanólico e cetônico, respectivamente. O

extrato de polpa pajurá apresentou o maior teor de fenólicos no extrato metanólico. A

atividade antioxidante avaliada pelo método de DPPH para os extratos metanólico e

cetônico de polpa de mari-mari foi CS50 de 620,30 ± 0,01 e 364,94 ± 0,01 µg/mL

respectivamente. Entre os frutos, o destaque foi para o extrato metanólico da amêndoa

de pajurá (63,69 µg/mL ± 0,002). A capacidade de redução de Fe3+ da parte comestível

do fruto foi 629,88 ± 0,01 e 634,46 ± 0,08 µmol FeSO4/g extrato seco. Além disso,

engeletina (1) e astilbina (2) foram isolados e identificados por espectrometria de RMN

e EM e comparação com a literatura. Este é o primeiro relato sobre a caracterização

química e atividade antioxidante do fruto mari-mari e uma contribuição aos estudos de

pajurá e pitomba.

6
ABSTRACT

Mari-mari (Cassia leiandra Benth), pajurá (Couepia bracteosa) and pitomba (Talisia

esculenta) are fruits easily found in Amazon urban neighbouring and also in the

Amazon forest. They are commonly consumed fresh and their chemical composition

and antioxidant capacity have never been studied. Extracts in acetone and methanol

pulp, fruit peel and seed of fruits were obtained and analyzed by LC-MS leading to

identify flavonoid glycosides, dimer flavonoid, phenolic acids and one organic acid

present in the pulp, peel and fruit seed. The scavenger capacity and total phenolic

content were also evaluated. The total phenolic of extracts of the edible part of mari-

mari presented total phenolic content of 0.036 and 40.12 µg GAEq/100 g for methanolic

and ketonic extracts respectively. The antioxidant activity evaluated by DPPH method

revealed values of IC50 of 620.30 ± 0.01 and 364.94 ± 0.01 µg/ to mari-mari extracts

pulp (methanolic and ketonic respectively). The best result was seeds pajurá extracted in

methanol. Iron reduction capacity of the edible part of the fruit was 629.88 ± 0.01 and

634.46 ± 0.08 μmol FeSO4 g− 1 DW. Additionally, engeletin (1) and astilbin (2) were

isolated and identified by RMN and comparison with literature. This is the first report

about the chemical characterization and antioxidant activity from mari-mari and a

contribution to studies from pajurá e pitomba fruits.

7
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Teores de Fenóis totais e atividade antirradical livre (TEAC) de polpas de frutos da

Amazônia segundo Canuto et al, 2010. ................................................................................................... 21

Tabela 2: Teor de fenólicos totais de alguns frutos regionais ............................................................... 22

Tabela 3: Padrões de flavonoides utilizados na solução de mistura de padrões. ................................ 45

Contin.Tabela 3: Padrões de flavonoides utilizados na solução de mistura de padrões. .................... 46

Contin.Tabela 3: Padrões de flavonoides utilizados na solução de mistura de padrões. .................... 47

Tabela 4: Padrões de ácidos fenólicos utilizados na solução de mistura de padrões .......................... 48

Contin. Tabela 4: Padrões de ácidos fenólicos utilizados na solução de mistura de padrões ............ 49

Tabela 5: Rendimentos dos extratos brutos de mari-mari ................................................................... 56

Tabela 6: Rendimentos dos extratos brutos de pitomba ....................................................................... 57

Tabela 7: Rendimentos dos extratos brutos de pajurá .......................................................................... 58

Tabela 8: Tempo de retenção dos padrões de compostos fenólicos eluídos em coluna PFP .............. 62

Tabela 9: Dados de LC-MS das amostras do fruto de mari-mari ........................................................ 71

Tabela 10: Dados de LC-MS das amostras do fruto de pitomba ......................................................... 77

Tabela 11: Dados de LC-MS das amostras do fruto de pajurá ............................................................ 80

Tabela 12: Dados de RMN de 1H da substância 1 e correlações em HSQC e HMBC. ....................... 93

Tabela 13: Dados de RMN de 1H da substância 1 e dados da literatura. ............................................ 94

Tabela 14: Dados de RMN de 1H da substância 2 e dados da literatura. .......................................... 100

Tabela 14: Resultados de fenólicos totais dos extratos do mari-mari,. .............................................. 103

8
Tabela 15: Resultados de fenólicos totais dos extratos de pitomba. ................................................... 104

Tabela 16: Resultados de fenólicos totais dos extratos de pajurá . .................................................... 105

Tabela 17: Resultados de DPPH dos extratos de mari-mari. ............................................................. 107

Tabela 18: Resultados de DPPH dos extratos de pitomba. ................................................................. 108

Tabela 19: Resultados de DPPH dos extratos de pajurá. .................................................................... 109

Tabela 20: Resultados de FRAP dos extratos de mari-mari. .............................................................. 110

Tabela 21: Resultados de FRAP dos extratos de pitomba. ................................................................. 111

Tabela 22: Resultados de FRAP dos extratos de pajurá. .................................................................... 112

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Variedade de frutas amazônicas. ............................................................................................ 19

Figura 2: Alguns frutos amazônicos com reconhecido potencial antioxidante. .................................. 22

Figura 3: Representação de molécula estável e um radical livre.......................................................... 24

Figura 4: Algumas classes de compostos antioxidantes provenientes de dietas .................................. 26

Figura 5: Exemplos de compostos fenólicos ........................................................................................... 27

Figura 6: Estrutura básica dos flavonoides ............................................................................................ 28

Figura 7: Estrutura química dos principais tipos de flavonoides. ....................................................... 28

Figura 8: Exemplos de ácidos fenólicos .................................................................................................. 29

Figura 9: Mari-mari (Cassia leiandra Benth.)........................................................................................ 32

9
Figura 10: a) Mari-marizeiro em mata de várzea; b) mari-mari na árvore ...................................... 32

Figura 11: a) Pajurá (fruto); b) Pajurazeiro; c) flores de pajurá......................................................... 34

Figura 12: Frutos de pitomba (Talisia esculenta) .................................................................................. 35

Figura 13: Fruto em estado de maturação se abrindo espontaneamente e fruto aberto .................... 40

Figura 14: a) Semente de pajurá parte externa da semente e amêndoa (parte interna); b): extrato

bruto da parte interna da semente. ......................................................................................................... 41

Figura 15: Partição do extrato bruto de polpa de pajurá ..................................................................... 42

Figura 16: Precipitação e lavagem do sólido branco proveniente do extrato de casca em acetona. .. 51

Figura 17: CCD dos extratos de polpa de mari-mari (acetona) (1), de casca de (acetona) (2), de

semente (acetona) (3), de polpa (metanol) (4), de casca (metanol) (5), de semente (metanol) (6). ..... 59

Figura 18: CCD das amostras de partição líquido-liquido dos extratos de pitomba revelado em NP-

PEG e observados sob luz UV 365 nm. ................................................................................................... 60

Figura 19: Cromatograma BPC dos padrões de compostos fenólicos ................................................. 63

Figura 20: Comparação dos cromatogramas BPC modo negativo das amostras de polpa a), casca b)

e semente c) de mari-mari extraído em acetona. ................................................................................... 64

Figura 21: Espectro de MS2 com os principais fragmentos do pico 4. ................................................. 66

Figura 22: Proposta de fragmentação para o pico 4 *RDA= Retro Diels Alder ................................. 66

Figura 23: Comparação dos cromatogramas das amostras de polpa de mari-mari extraído a) em

100 % de acetona e b) 100% de metanol. ............................................................................................... 68

10
Figura 24: Comparação dos cromatogramas das amostras de casca de mari-mari extraído em a)

100 % de acetona e b) 100% de metanol. ............................................................................................... 69

Figura 25: Comparação dos cromatogramas das amostras de semente de mari-mari extraído em

100 % de acetona e 100% de metanol. .................................................................................................... 70

Figura 26: Cromatograma BPC do extrato em acetona de polpa de pitomba. ................................... 72

Figura 27: Cromatograma BPC (modo negativo) do extrato de semente extraído em acetona em

comparação com o mix de padrões. Detecção de catequina e epicatequina m/z 289........................... 74

Figura 28: Cromatogramas BPC da mistura de padrões de fenólicos e cromatograma BPC do

extrato de semente de pitomba extraído em acetona com detecção dos íons m/z 271 e 285

correspondente à naringenina e luteolina respectivamente. ................................................................. 75

Figura 29: Comparação entre os cromatogramas BPC dos extratos de casca de pitomba a) extraído

em acetona b) extraído em metanol e detecção de rutina (m/z 609). .................................................... 76

Figura 30: Constituintes identificados nas polpas, cascas e sementes de pitomba.............................. 78

Figura 31: Comparação entre os cromatogramas de polpa de pajurá (a) extraído em acetona; (b)

extraído em metanol. ................................................................................................................................ 79

Figura 32: Flavonoides identificados na polpa de pajurá extraída em metanol ................................. 81

Figura 33: Comparação entre os cromatogramas de semente (amêndoas) de pajurá (a) extraído em

acetona; (b) extraído em metanol. ........................................................................................................... 82

Figura 34: Comparação entre os cromatogramas (a) de semente (parte externa) de pajurá extraído

em acetona; (b) extraído em metanol. ..................................................................................................... 83

Figura 35: Comparação entre os cromatogramas (a) das cascas de pajurá extraído em acetona; (b)

extraído em metanol. ................................................................................................................................ 84

11
Figura 36: Espectro de massas da amostra substância 1 no modo negativo APCI-MS ..................... 86

Figura 37: Espectro de massas da amostra substância 1 no modo positivo APCI-MS ...................... 87

Figura 38: Espectro de RMN de 1H da amostra substância 1 MeOH-d4, 600 MHz) ........................ 87

Figura 39: Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 1...................................................... 88

Figura 40: Ampliação do espectro de 1H da substância 1 com os sinais de H-2 e H-3 ....................... 89

Figura 41: Ampliação de mapas de HMBC dos hidrogênios H-2 e H-3 e correlações. ...................... 90

Figura 42: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, substância 1, em MeOH, a 500.13 MHz, detalhe

das interações espaciais entre os hidrogênios com o hidrogênio irradiado (H-2). .............................. 91

Figura 43: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, substância 1, em MeOH, a 500.13 MHz, detalhe

das interações espaciais entre os hidrogênios com o hidrogênio irradiado (H-3). .............................. 92

Figura 44: Cristais de engeletina ............................................................................................................. 93

Figura 45: Engeletina ............................................................................................................................... 94

Figura 46: Espectro de massas (modo negativo) substância 2 com as propostas de fragmentação. . 95

Figura 47: Espectro de RMN de 1H da amostra substância 2 em DMSO-d6 ...................................... 97

Figura 48: Destaque para o H-2’ no anel B da substância 2. ................................................................ 97

Figura 49: Ampliação da região de hidrogênios ligados a oxigênio (H-O) da substância 2. .............. 98

Figura 50: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, da substância 2, em MeOH, a 500.13 MHz e

detalhe das interações entre o hidrogênio irradiado (H-3) com os hidrogênios vizinhos. .................. 99

Figura 51: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, da substância 2, em MeOH, a 500.13 MHz e

detalhe das interações entre o hidrogênio irradiado (H-2) com os hidrogênios vizinhos. .................. 99

12
Figura 52: Cristais de astilbina ............................................................................................................. 101

Figura 53: Astilbina ............................................................................................................................... 101

Figura 54: Curva de calibração com ácido gálico usado na quantificação de FT............................. 102

ESQUEMAS

Esquema 1: Metodologia geral para o preparo dos extratos de polpa, casca e semente dos frutos. . 39

Esquema 2: Partição líquido-líquido dos extratos dos frutos ............................................................... 42

Esquema 3: Frações da partição do extrato cetônico de casca de pitomba. ........................................ 50

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABTS – Azinobis-(3-etilbenzotiazolina)-6-ácido sulfônico

AVC – Acidente vascular cerebral
%CS – Porcentagem da capacidade de Sequestro
BPC – Base Peak Chromatogram (Cromatograma de Pico Base)
CA-LTQPN - Central Analítica do Laboratório Temático de Química de Produtos
Naturais
LC-MS – Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massa
CLAE-ESI-EM/EM - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massa com
Ionização por Eletrospray
COTI-INPA – Coordenação de Tecnologia e Inovação-Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia
CS50 – Capacidade de sequestro 50%
CUPRAC – Cupric ion reducing antioxidante capacity assay
Da-Daltons
DAD – Diodo array detector
DPPH – 2,2 -difenil-2-picril-hidrazina
DMSO-d6 – Dimetilsulfoxido deuterado

13
EAG – Equivalente de ácido gálico
EIC – Cromatograma de Íons Extraídos
ESI – Electrospray
FT – Fenólicos totais
FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power
HPLC – High Pressure Liquid Chromatography
HMBC – Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
HSQC – Heteronuclear Single-Quantum Correlation
INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
LEMAH-UFAM – Laboratório de Espectrometria de Massas e HPLC- Universidade Federal do
Amazonas
LC – Liquid chromatography
m/z – razão massa/carga
MeOH – Metanol
MeOH-d4 – Metanol deuterado
MIC – Mínima concentração inibitória
MS – Mass spectrometry
NOE-DIFF – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
ORAC– Oxigen radical absorbance capacity
PFP – Pentafluorofenil
RMN – Ressonância magnética Nuclear
TBARS – Thiobarbituric acid reactive substances
TPTZ - 2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina
tr – Tempo de retenção
UV-Ultravioleta

14
Sumário

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 17

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 18

2.1. Objetivo geral ................................................................................................................................ 18

2.2. Objetivo específico ........................................................................................................................ 18

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................ 19

3.1 Frutos amazônicos com potencial antioxidante ........................................................................... 19

3.2 Processos oxidativos e produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio ........................ 23

3.3 Compostos fenólicos e prevenção de doenças degenerativas ...................................................... 25

3.4 Ensaios químicos de atividade antioxidante ................................................................................ 29

3.5 Mari-mari (Cassia leiandra Benth) ............................................................................................... 30

3.6 Pajurá (Couepia bracteosa) ............................................................................................................ 33

3.7 Pitomba (Talisia esculenta) ............................................................................................................ 35

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................ 38

4.1 Coleta dos Frutos ........................................................................................................................... 38

4.2 Preparo de Extratos (extração de compostos fenólicos).............................................................. 38

4.3 Partição líquido-líquido dos extratos............................................................................................ 41

4.4 Extração em fase sólida (SPE) ...................................................................................................... 43

4.5 Caracterização de compostos por LC-MS ................................................................................... 43

4.6 Isolamento de substâncias ............................................................................................................. 50

4.6.1 Casca de mari-mari ................................................................................................................ 50

4.7 Quantificação de fenólicos totais pelo método Folin-Ciocalteu .................................................. 52

4.8 Determinação da atividade antioxidante ...................................................................................... 53

4.8.1 Capacidade redutora do Ferro (FRAP) ................................................................................ 53

4.8.2. Captura de radicais livres de DPPH .................................................................................... 54

5. RESULTADOS e discussões ................................................................................................................ 55

5.1 Rendimentos de Extratos ............................................................................................................... 55

5.1.1 Mari-mari ................................................................................................................................ 55

15
 5.1.2 Pitomba .................................................................................................................................... 56

5.1.3 Pajurá ...................................................................................................................................... 57

5.2 Comparação dos extratos por CCD .............................................................................................. 59

5.2.1 Mari-mari ................................................................................................................................ 59

5.2.2 Pitomba .................................................................................................................................... 60

5.3 Caracterização de compostos fenólicos por LC-MS.................................................................... 61

5.3.1 Mari-mari ................................................................................................................................ 63

5.3.2 Pitomba .................................................................................................................................... 71

5.3.3 Pajurá ...................................................................................................................................... 78

5.4 Substâncias isoladas ....................................................................................................................... 85

5.4.1 Mari-mari (casca) ................................................................................................................... 85

5.5 Quantificação de fenólicos totais ................................................................................................. 102

5.5.1 Mari-mari .............................................................................................................................. 102

5.5.2 Pitomba .................................................................................................................................. 103

5.5.3 Pajurá .................................................................................................................................... 104

5.6 DPPH (Ensaio de radical Difenil-2-picrihidrazil radical)......................................................... 105

5.6.1 Mari-mari .............................................................................................................................. 106

5.6.2 Pitomba .................................................................................................................................. 107

5.6.3 Pajurá .................................................................................................................................... 108

5.7 FRAP (Ferric reducing antioxidant power) ............................................................................... 109

5.7.1 Mari-mari .............................................................................................................................. 109

5.7.2 Pitomba .................................................................................................................................. 110

5.7.3 Pajurá .................................................................................................................................... 111

6. CONCLUSÃO .................................................................................................................................... 114

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 116

8. ANEXOS ............................................................................................................................................. 124

16
1. INTRODUÇÃO

A Amazônia abriga uma grande variedade de espécies frutíferas que embora o

consumo destes frutos seja alto, ainda existe um grande número de espécies pouco

exploradas. (ALVES et al., 2008). Muitos frutos nativos têm despertado interesse na

comunidade científica por apresentarem quantidades consideráveis de micronutrientes e

macronutrientes, como minerais, fibras, vitaminas e especialmente compostos fenólicos,

os quais são capazes de agir como antioxidantes, aumentando as defesas celulares e

ajudando a proteger componentes da célula de danos oxidativos (VASCO, RUALES, &

KAMAL-ELDIN, 2008; VEER et al., 2000; KÜBOÃ et al., 2006). Inúmeros estudos

mostram a importância desta classe de substâncias para a saúde humana bem como

potencial para a prevenção de muitas doenças. Tais danos têm sido associados ao

desenvolvimento de muitas doenças crônicas e degenerativas, incluindo o câncer,

doenças cardíacas, doenças degenerativas como Alzheimer, bem como está envolvido

no processo de envelhecimento (ROËSLER et al., 2007). Desta forma, este estudo visa

à caracterização por LC-MS/MS de compostos com potencial antioxidante

(especialmente compostos fenólicos) presentes nos frutos mari-mari, pajurá e pitomba

bem como a investigação do potencial antioxidante dos extratos dos frutos através de

ensaios químicos como capacidade de sequestro de radicais DPPH e capacidade de

redução de ferro (FRAP) e quantificação de fenólicos totais.

17
2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Caracterizar os compostos fenólicos presentes nos frutos nativos selecionados

para este estudo e avaliar o potencial antioxidantes dos mesmos.

2.2. Objetivo específico

 Estudar quimicamente os frutos de mari-mari (Cassia leiandra) cuja composição

química não foi reportada na literatura e identificar compostos fenólicos na pitomba

(Talisia esculenta) e no pajurá (Couepia Bracteosa) os quais existem poucos relatos.

 Isolar substâncias dos frutos selecionados por meio de técnicas cromatográficas e

identificá-las por métodos espectroscópicos e espectrométricos. Serão focadas

especialmente as substâncias de classes reconhecidas como antioxidantes.

 Desenvolver métodos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada aos

detectores de arranjo de diodos e espectrômetro de massas (LC-MS) para

caracterização dos compostos fenólicos dos frutos estudados.

 Determinar o teor de fenólicos totais pelo método de Folin-Ciocalteu, e avaliar a

atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical livre DPPH (2,2-

difenilpricilhidrazil) e FRAP (Ferric Reducing Assay Power).

18
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Frutos amazônicos com potencial antioxidante

A Amazônia contém uma grande variedade de frutos (Figura 1), entre os quais

muitos têm despertado interesse devido às suas propriedades nutricionais, apresentando

uma grande variedade de micronutrientes, como minerais, fibras, vitaminas e

especialmente compostos capazes de atuar como antioxidantes, por exemplo, vitamina

C e fitoconstituintes como polifenóis e carotenóides (STEINMETZ & POTTER, 1996;

VASCO, RUALES & KAMAL-ELDIN, 2008; RUFINO et al., 2011; FRACASSETTI,

COSTA, MOULAY & TOMÁS-BARBERÁN, 2013).

Fonte: http://frutasnativasdaamazonia.blogspot.com.br/

Figura 1: Variedade de frutas amazônicas.

19
 O consumo de frutos está associado à diminuição de risco de várias doenças,

incluindo doenças cardiovasculares, câncer e acidente vascular cerebral (AVC)

(WILLETT, 2002) e tais benefícios para a saúde são principalmente atribuídos ao teor

de compostos antioxidantes, particularmente. Segundo Halliwell (2000) “Antioxidante é

qualquer substância que, quando presente em baixa concentração comparada à do

substrato oxidável, regenera o substrato ou previne significativamente a oxidação do

mesmo”.

O potencial antioxidante de diversos frutos da Amazônia é bastante conhecido e

têm sido objeto de estudos científicos anteriores (BATAGLION et al, 2014;

MORALES-SOTO et al., 2014). Entre os vários relatos, destaca-se o estudo realizado

por Canuto e colaboradores em 2010, cujo objetivo foi avaliar o potencial antioxidante

de 15 frutos amazônicos (abiu, acerola, açaí, araçá-boi, bacaba, bacuri, buriti, cajá,

cajarana, caju, cupuaçu, graviola, murici, noni e tamarindo) revelando através do

método de TEAC e quantificação de fenólicos totais pelo método Folin Ciocateau que

algumas polpas apresentaram alta potencialidade antioxidante (Tabela 1), associada com

a atividade anti-radicais livres e os conteúdos dos componentes bioativos como

compostos fenólicos e ácido ascórbico, destacando-se acerola e açaí.

20
 Tabela 1: Teores de Fenóis totais e atividade antirradical livre (TEAC) de polpas de frutos da

Amazônia segundo Canuto et al, 2010.

Amostra FT (mmol.-1de ácido gálico) TEAC (μmol.L-1 de Trolox)

Abiu 0,4 ± 0,0 0,8 ± 0,1

Acerola 3,5 ± 0,2 12,1 ± 0,0

Açaí 2,4 ± 0,2 10,0 ± 0,3

Araçá-boi 0,6 ± 0,0 3,0 ± 0,1

Bacaba 0,3 ± 0,1 3,1 ± 2,1

Bacuri 0,4 ± 0,0 0,6 ± 0,3

Buriti 1,0 ± 0,0 5,4 ± 0,2

Cajá 0,6 ± 0,0 1,8 ± 0,4

Cajarana 0,4 ± 0,1 1,4 ± 0,1

Caju 0,6 ± 0,0 1,5ef ± 0,2

Cupuaçu 0,4 ± 0,0 0,6 ± 0,2

Graviola 0,6 ± 0,0 2,2 ± 0,1

Murici 0,6 ± 0,0 1,5 ± 1,5

Noni 1,2 ± 0,1 3,9 ± 0,1

Tamarindo 0,8 ± 0,1 2,9 ± 0,2

Os frutos representados na Figura 2 são os mais estudados sendo representativos

da região amazônica, os quais foram avaliados o teor de fenólicos totais utilizando o

método de quantificação de fenólicos totais de Folin-Ciocalteu (Tabela2), destacando o

camu-camu como o fruto que contém o maior teor de fenólicos com 1120 a 1420 mg

EAG/100g de fruto seguido pelo açaí, com 421 a 464 mg EAG/100 g de fruto, sendo os

maiores teores encontrados para frutos nativos da região amazônica. Porém sabe-se que

o camu-camu é rico em ácido ascórbico (vitamina C) (ZANATTA & MERCADANTE,

2007; GENOVESE, PINTO, GONÇALVES & LAJOLO, 2008; RUFINO et al, 2010),

que por apresentar uma estrutura bastante conjugada pode atuar como antioxidante.
21
 Tabela 2: Teor de fenólicos totais de alguns frutos regionais

Fenólicos totais
Fruto Referência
(mg EAG/100 g de fruto)
POMPEU, SILVA, ROGEZ.;
Açaí (Euterpe oleráceae) 421 a 464
2009
Camu-camu (Myrciaria dubia) 1120 a 1420 CHIRINOS, et al., 2010

Muruci (Byrsonima crassifolia) 2,90 SOUZA, et al., 2008

Ingá (Inga edulis) 2,40 SOUZA, et al., 2008
Ubaia (Eugenia patrisii) 2,60 SILVA, et al., 2007
Castanha do Brasil (Bertholletia excelsa) 46 a 123 YANG, 2009
Araçá
768 MEDINA, et al., 2011
(Psidium cattleianum Sabine)

Apesar de muitos frutos Amazônicos apresentarem relatos quanto à química e

atividade antioxidante, ainda existem alguns frutos que a população consome cuja

química e potencial biológicos ainda não são conhecidos.

/frutasnativasdamazonia.blogspot.com.br/
Fonte: http:/

Figura 2: Alguns frutos amazônicos com reconhecido potencial antioxidante.

22
3.2 Processos oxidativos e produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio

Processos oxidativos são necessários para as atividades essenciais das células.

Entretanto, o metabolismo do oxigênio nas células vivas também leva à produção de

radicais livres que atuam como oxidantes no organismo (RÖESLER et al., 2007).

Oxidantes são compostos produzidos pelo metabolismo normal do corpo e, se não

controlados, podem provocar danos extensivos como, por exemplo, o desenvolvimento

de muitas doenças crônicas e degenerativas, incluindo o câncer, doenças cardíacas,

doenças degenerativas como Alzheimer, bem como estão envolvidos no processo de

envelhecimento (ANDERSON, 1996; BIANCHI & ANTUNES, 1999).

No esquema (1) a seguir, são ilustrados os passos em que a produção de radicais

ocorre no organismo.

Produção Alvos Danos

de radicais celulares: celulares
livres (proteínas,
Produção de lipídeos,
energia carboidrat
(ATP) os e DNA)
Danos nos
tecidos
Os radicais livres
podem ser gerados
Célula no citoplasma, nas Distúrbios
mitocôndrias ou na e doenças
membrana.

Esquema 1: Etapas da produção de radicais livres no processo metabólico.

23
 Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na

membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA) está

relacionado com o seu sítio de formação (ANDERSON, 1996; YU & ANDERSON,

1997).

Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são moléculas com um ou mais

elétrons desemparelhados e são bastante instáveis (Figura 3). As principais espécies

reativas são divididas em ERO (espécies reativas de oxigênio) e ERN (espécies reativas

de nitrogênio) como, ânion-radical superóxido O2•–, peróxido de hidrogênio H2O2,

radical hidroxila •OH, radicais peroxila (RO2•) alcoxila (RO•), oxigênio singlete 1O2,

óxido nítrico ou monóxido de nitrogênio NO•, dióxido de nitrogênio NO2•, cloreto de

nitrila NO2Cl, peroxinitrito ONOO– (VASCONCELOS et al., 2007). Entre as espécies

reativas de oxigênio o O2- apresenta uma baixa capacidade de oxidação, o HO• mostra

uma pequena capacidade de difusão e é o mais reativo na indução de lesões nas

moléculas celulares. O H2O2 não é considerado um radical livre verdadeiro, mas é capaz

de atravessar a membrana nuclear e induzir danos ao DNA por meio de reações

enzimáticas (ANDERSON, 1996; BIANCHI & ANTUNES, 1999).

https://radicaislivres96.files.wordpress.com/2012/11/bio
bio12
.png

Figura 3: Representação de molécula estável e um radical livre

24
 Antioxidantes dietéticos têm sido associados com a modulação de numerosas

funções bioquímicas e fisiológicas, bem como com a redução de doenças como

aterosclerose e câncer (DECKER & CLARKSON, 2000).

3.3 Compostos fenólicos e prevenção de doenças degenerativas

No organismo, os radicais livres promovem reações com substratos biológicos

ocasionando danos às biomoléculas afetando a saúde humana de diferentes formas.

Diante disso, os antioxidantes atuam de diferentes formas para minimizar os danos

causados pelos radicais livres no organismo (BIANCHI & ANTUNES, 1999). Entre os

principais mecanismos de proteção do organismo, são citados, por exemplo, quando a

cadeia do DNA é quebrada, podendo ser reconectada de forma errada em posição

diferente alterando a ordem de suas bases iniciando um dos processos básicos da

mutação sendo que o acúmulo de bases danificadas pode desencadear a oncogênese.

Desta forma o mecanismo de proteção é o reparo das lesões causadas no DNA pelos

radicais.

Outra situação é quando uma enzima tem seus aminoácidos alterados podendo

perder sua atividade ou, ainda, assumir atividade diferente. Outro dano oxidativo ocorre

na membrana celular, com a peroxidação lipídica, o qual interfere no transporte ativo e

passivo normal através da membrana, ou ocasiona a ruptura desta, levando à morte

celular. Neste caso, o organismo pode atuar na reconstrução da membrana lipídica

danificada. A oxidação de lipídios também pode ocorrer no sangue agredindo as paredes

das artérias e veias, facilitando o acúmulo desses lipídios, ocasionando aterosclerose,

25
podendo levar à trombose, infarto ou acidente vascular cerebral. Neste caso, os

antioxidantes atuam na prevenção reagindo com os radicais livres tornando-os estáveis

(BIANCHI & ANTUNES, 1996; BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006).

Desta forma, os radicais livres tendem a ser combatidos através de proteção

enzimática ou por micromoléculas produzidas pelo próprio organismo ou adquiridas

através da dieta. Os antioxidantes produzidos pelo organismo atuam de forma

enzimática como GPx, CAT e SOD2 ou, não enzimática a exemplo de GSH, peptídeos

de histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e

CoQH2 (FINKEL & HOLBROOK, 2000; BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006).

Além dos antioxidantes produzidos pelo corpo, o organismo utiliza aqueles

provenientes da dieta como o a-tocoferol (vitamina-E), β-caroteno (pro-vitamina-A),

ácido ascórbico (vitamina C), cumarinas, taninos e compostos fenólicos onde se

destacam os flavonoides (PIETTA, 2000; HALLIWELL et al., 1995) (Figura 4).

carotenóides
www.extremaduravida.com

Flavonóides

Cumarinas

Tocoferóis
Taninos

Figura 4: Algumas classes de compostos antioxidantes provenientes de dietas

26
 Compostos fenólicos são metabólitos secundários de plantas comumente

associados na defesa do organismo contra a radiação ultravioleta e doenças

degenerativas. Muitos estudos abordando os benefícios à saúde resultantes dos

potenciais de compostos fenólicos de fontes alimentares como antioxidante associando

o consumo em longo prazo de dietas ricas em polifenóis à proteção contra o

desenvolvimento de doenças cardiovasculares, diabetes, osteoporose e doenças

degenerativas (PANDEY & RIZVI, 2009).

Quimicamente, compostos fenólicos (Figura 5), são definidos como substâncias

que possuem anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus

grupos funcionais (CADENAS & PACKER, 2002). Possuem estrutura variável e com

isso, são multifuncionais e são classificados como flavonoides, ácidos fenólicos (Figura

8), cumarinas, taninos, ligninas e tocoferóis (ANGELO & JORGE. 2007).

Figura 5: Exemplos de compostos fenólicos

27
 Flavonoides possuem estrutura marcada pela presença de um esqueleto com 15

átomos de carbono na forma C6-C3-C6 (Figura 6), e são divididos em classes

dependendo do estado de oxidação do anel central de pirano. A Figura 6 apresenta a

estrutura química dos principais tipos de flavonoides (IKAN, 1991).

3'
2' 4'
B
8
7
O 2 1'
5'

A C 6'
6 3
5 4

Figura 6: Estrutura básica dos flavonoides

Antocianidinas Catequinas
+
O Flavonóis
O O

-
O OH OH
O
Flavanonas Flavonas
O Isoflavonas
O O

O O
O

Figura 7: Estrutura química dos principais tipos de flavonoides.

28
 COOH COOH
COOH

OR HO OH

OH OH
OH
R=CH3 (Ácido vinílico) Ácido gálico
Ácido p-hidroxibenzóico
R=H (Ácido protocatéquico)
COOH COOH
COOH

H3CO OCH3

RO OH

OH OH Ácido siríngico
Ácido p-cumárico R=H (Ácido cafeico)
R=CH3 (Ácido Ferúlico)

Figura 8: Exemplos de ácidos fenólicos

3.4 Ensaios químicos de atividade antioxidante

Devido à meia-vida muito curta de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio,

dificilmente estes podem ser mensurados. Estes radicais frequentemente atacam as

moléculas por abstração de hidrogênio e por adição a insaturações. Nos experimentos de

laboratório o HO• pode facilmente ser sequestrado in vitro por inúmeras moléculas,

devido a sua alta reatividade. No entanto, para que os resultados in vitro se reproduzam

in vivo, é necessário ministrar alta concentração do antioxidante para que este alcance o

local onde o radical HO• está presente em concentração suficiente para suprimi-lo.

Existem duas maneiras de controlar a presença do radical HO•, a primeira seria reparar

os danos causados por ele ou inibir sua formação. A formação do radical no organismo

29
ocorre principalmente pela homólise da água por exposição à radiação, desta forma o

ataque intensivo e frequente do radical HO• pode levar ao desenvolvimento de câncer

em seres humanos no período de 15 a 20 anos. Por isso a forma mais eficiente de

controlar este radical é inibir sua formação com a ingestão de antioxidantes

(BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006).

Numerosos métodos têm sido utilizados para determinar a atividade antioxidante

de frutos. Estes métodos são baseados na captura do radical peroxila (ORAC, TRAP),

poder de redução de metal (FRAP; CUPRAC), captura do radical hidroxila (método de

desoxirribose), captura do radical orgânico (ABTS, DPPH), quantificação de produtos

formados durante a peroxidação de lipídios (TBARS) (FRANKEL & MEYER, 2000;

SÁNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003; RUFINO et al, 2007), sendo os mais

utilizados ABTS, FRAP, DPPH e ORAC.

3.5 Mari-mari (Cassia leiandra Benth)

Mari-mari (Cassia leiandra Benth.) é um fruto nativo da Amazônia, bastante

consumido ao natural, conhecida como mari-mari, ingá-mari e seruaia, pertencente à

família Fabaceae, (SILVA, 2011). O fruto é uma vagem com um comprimento entre

40,0 e 50,0 cm de largura e 3,0 cm e 4,0 (Figura 9), quando maduro, a parte comestível

apresenta coloração esverdeada ou amarelada. O número de sementes varia em função

do comprimento: com quarenta a 120 divisões no interior do fruto de forma regular e

simétrica e igual numero de sementes, semelhante a comprimidos, envoltas por pouca

polpa fina de coloração verde-clara, sucosa e agridoce de gosto peculiar, o consumo é in

natura (SILVA, 2010; RABELO, 2012). Além de ser largamente consumido pela
30
população, o mari-mari é a fruta mais consumida por espécies de peixes da região

Amazônica, especialmente durante a época das cheias dos rios (MAIA & CHALCO,

2002).

O habitat natural dessa espécie são matas de igapó e beiras de igarapés, várzeas

inundáveis e lugares úmidos, no entanto pode ser cultivado em terra firme (Figura 10).

Caracteriza-se como uma pequena árvore com 4,0 a 8,0 metros de altura e 20,0 e 30,0

cm de diâmetro, com caule um tanto tortuoso, ramificado desde a base e com copa

ampla. As folhas são compostas de nove a doze pares de folíolos.

Há relatos de estudos de várias espécies do gênero Cassia, cujas partes estudadas

foram, raízes, casca do caule, sementes e folhas. Foram relatadas a presença de

glicosídeos, flavonóides glicosilados, antronas e derivados de antraceno (SINGH,

SINGH & YADAV, 2013). A atividade biológica de extratos de espécies de Cassia

também foi relatada como atividade hepatoprotetora, atividade anti-inflamatória,

antimutagênica, antiúlcera, antibacteriana, antifúngica e antioxidante (SINGH, SINGH

& YADAV, 2013).

Apesar de haver vários relatos da química de espécies do gênero Cassia, os

frutos de C. leiandra não apresenta nenhum estudo abordando sua composição química

nem atividades biológicas.

31
 a) b)

Figura 9: Mari-mari (Cassia leiandra Benth.)

a) b)

Figura 10: a) Mari-marizeiro em mata de várzea; b) mari-mari na árvore

32
3.6 Pajurá (Couepia bracteosa)

O pajurá (Couepia bracteosa) (Figura 11 a) também conhecido como pajurá-da-

mata e pajurá-verdadeiro pertence à família Crysobalanaceae. Apesar de ser um fruto

bastante representativo na Amazônia, seu valor econômico e nutritivo são pouco

conhecidos, bem como os constituintes químicos.

O pajurazeiro (Figura 11 b) é uma árvore de porte médio com altura em torno

de 25 metros. Apresenta caule alongado em florestas fechadas e curto quando cultivadas

em áreas abertas. A copa é ampla e bastante ramificada com densas folhagens. É nativa

da Amazônia com rara ocorrência em floresta reservadas de terra firme principalmente

na Amazônia Central. (RABELO, 2012).

Seus frutos medem cerca de 8 a 12 cm de comprimento e diâmetro e pesando

de 80 a 200 g. A casca apresenta cor marrom com superfície áspera coberta com

pontuações esbranquiçadas. A polpa consiste em 50% do fruto, espessa, carnoso-

farinácea, de coloração amarela, de sabor e aroma adocicado. Os frutos apresentam um

caroço bastante volumoso que contem de uma a duas sementes (SILVA, 2011).

Espécies da família Chrysobalanaceae são largamente utilizadas na medicina

popular tradicional da África e América do Sul (MENDEZ & BILIA, 1996; AGRA et

al., 2007, 2008). Entre os gêneros mais estudados destacam-se os gêneros Licania,

Couepia, Parinarium e Chysobalanus. Há relatos da presença de terpenoides,

flavonoides, taninos e esteroides (CASTILHO, 2001; CARVALHO & COSTA, 2009).

A população tem feito uso de plantas dessa família no tratamento de diarreia, disenteria

e malária e há relatos de atividade antitumoral, antimicrobiana e antioxidante. Estas

atividades têm sido atribuídas aos flavonoides e triterpenoides isolados destas plantas

33
(BADISA et al., 2000; BRACA et al., 2002; MENDEZ et al., 1997; OBERLIES et al.,

2001).

Há relatos na literatura de que o pajurá é fonte natural de carotenóides,

especialmente β-caroteno segundo Marinho & Castro (2003), e recentemente Berto e

colaboradores (2015), relataram sulfato de acacetina e sulfato de apigenina como

principais compostos fenólicos presentes na polpa, casca e semente do fruto, além de

carotenoides como cis-neocromo, trans-neocromo, trans-luteoxantina, trans-luteína,

trans-zeaxantina, α-carotene e β-caroteno. Neste mesmo trabalho foi reportada a

atividade de sequestro de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio da semente do

fruto.

Figura 11: a) Pajurá (fruto); b) Pajurazeiro; c) flores de pajurá

34
3.7 Pitomba (Talisia esculenta)

Pitomba (Talisia esculenta-A.St.-Hil Radlk) pertencente à família

Sapindaceae é nativa da Amazônia ocidental com larga ocorrência em todo bioma

amazônico e regiões Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste do Brasil. Em Manaus, sua

ocorrência é muito comum na região metropolitana, principalmente em quintais de

residências, sítios e jardins botânicos (RABELO, 2012).

O fruto contém de uma a duas sementes, são globosos a ovais, cuja cor da casca

é pardo-amarelada de consistência coriácea (VIEIRA & GUSMÃO, 2008) (Figura 12).

A parte comestível é conhecida como drupa, tem forma arredondada, translúcida com

cerca de 2,5 a 3,0 cm de diâmetro, de sabor agridoce, consumida somente ao natural

não sendo muito utilizada para sucos, sorvetes ou geleias devido à sensibilidade ao

transporte e a deterioração (RABELO, 2012; NETO, SANTANA & SILVA, 2003).

Figura 12: Frutos de pitomba (Talisia esculenta)

35
 Há relato da caracterização físico-química do fruto realizados por Silva e

colaboradores (2008), os quais foram determinados o valor energético (56,35

kcal/100 g), umidade (83,16 g/100g), proteínas (1,15 g/100 g de fruto), lipídeos (0,19

g/100 g de fruto), carboidratos (12, 51 g/100 g de fruto), fibra alimentar (2,40 g/100

g de fruto) e resíduo mineral fixo (0,61 g/100 g de fruto). Neste mesmo estudo

também foram determinadas a composição de minerais da pitomba como o teor de

cálcio (26, 7 mg/100 g de fruto), zinco (0,84 mg/100 g de fruto) e ferro (0,60 mg/100

g de fruto). Um trabalho publicado em 2009 por Marin, Siqueira e Arruda,

apresentou também resultados quanto à composição teor de minerais na pitomba,

como cálcio, zinco e ferro, também determinaram o teor de cobre, fósforo e

magnésio além da composição de taninos (38,3 µg/mL) e ácido fítico (1,5 µg/mL).

Existem também alguns estudos sobre a semente, que relatam a extração de

uma proteína chamada lectina, usada no combate a fungos causadores de doenças de

plantas cultivadas e de pragas como besouros que atacam tanto as plantas (FREIRE,

et al., 2002; MACEDO, et al., 2011; FREIRE, et al., 2012).

Em 2014, foi relatado por Riet-Correa e colaboradores, um trabalho que teve

como objetivo investigar o envenenamento de ovelhas e bovinos por folhas e frutos

de pitomba, após três surtos em fazendas onde havia árvores de T. esculenta. Foi

comprovado que as folhas e sementes de T. esculenta causam intoxicação aguda em

ovinos e gados afetando principalmente o sistema nervoso, porém não o composto

responsável pela toxicidade ainda é desconhecido.

36
 Estudos recentes comprovaram atividades antiproliferativa, antimutagênica e

antioxidante do extrato bruto de pitomba, além da identificação de miricetina e

quercetina no extrato hidrolisado da polpa. (NERI-NUMA et al, 2014) e também existe

relato quanto a composição química do aroma de pitomba identificando a 2,5-dietil-

pirazina como composto majoritário no aroma de pitomba obtido por técnicas de

hidrodestilação (KUBOTA et al, 2009).

37
4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Coleta dos Frutos

A coleta foi realizada levando em consideração a ausência de danos mecânicos

e contaminações aparentes e visuais na epiderme do fruto.

O fruto mari-mari (Cassia leiandra Benth) foi obtido na feira da Manaus

moderna em março de 2012. O pajurá (Couepia bracteosa) foi coletado na feira de

Parintins - Amazonas em 10 de novembro de 2013. A pitomba (Talisia esculenta) foi

coletada no município de Parintins - Amazonas em 10 de fevereiro de 2013.

Após a coleta dos frutos, cada um foi selecionado levando em consideração o

estado de conservação e ausência de possíveis falhas mecânicas, seguido da lavagem,

separação manual da polpa, casca e semente em ausência de luz. As cascas e semente

foram secas em estufa a 40C e posteriormente trituradas em um moinho para aumento

da superfície de contato.

4.2 Preparo de Extratos (extração de compostos fenólicos)

As extrações foram realizadas considerando a capacidade de extrair compostos

fenólicos utilizando solventes que apresentam afinidade com esta classe de compostos

como, por exemplo, álcoois (etanol e metanol) e acetona (CANUTO, XAVIER, NEVES

& BENASSI, 2010; RÖESLER, MALTA, CARRASCO, & PASTORE, 2006). A

metodologia de extração foi adaptada a partir da metodologia utilizada por Canuto e

colaboradores (2010) que consistiu na maceração de aproximadamente 200 g do

material por cerca de 48h primeiramente em 500 mL acetona seguida pela filtração a

vácuo, seguido pela lavagem com aproximadamente 10 mL do respectivo solvente

38
extrator e concentrado à pressão reduzida e temperatura do banho de 40o C. O resíduo

sólido foi submetido à nova extração, desta vez com 500 mL metanol, seguido pela

filtração e concentração como na etapa anterior (Esquema 1). No procedimento foi

utilizada a polpa fresca, enquanto que as cascas e sementes do fruto foram utilizados

após serem secas em estufa de circulação de ar e pulverizadas em moinho de quatro

facas. Uma porção de 10 mg de cada extrato, foi separada para tratamento em extração

de fase sólida para análise posterior em LC-MS.

Fruto

Despolpamento manual

Polpa Polpa Polpa

Maceração em acetona Maceração em acetona Maceração em acetona

Extrato Extrato
cetônico Resíduo Resíduo Extrato
cetônico Resíduo
cetônico
Maceração em metanol
Maceração em metanol
Maceração em metanol

Extrato Resíduo Extrato Resíduo Extrato

metanólico metanólico Resíduo
metanólico
Descarte Descarte
Descarte

Esquema 1: Metodologia geral para o preparo dos extratos de polpa, casca e semente dos frutos.

Durante o preparo da amostra de casca de mari-mari (360 g), o extrato cetônico

apresentou grande quantidade de um precipitado branco (6,75 g). Este, foi lavado com

acetona à frio e filtrado em papel de filtro no funil de Buchner e posteriormente

39
analisado em LC-MS. Alguns dos constituintes majoritários foram isolados e

identificados por técnicas espectroscópicas e espectrométricas.

Durante a separação manual do pajurá (Figura 13) em polpa, casca e semente,

observou-se que a semente continha uma amêndoa (Figura 14). Desta forma trabalhou-

se com a semente considerando as duas partes separadas.

A polpa de pitomba (215, 0 g) foi submetida à maceração em 100% de acetona

por 48 h. Posteriormente o solvente extrator foi filtrado e concentrado sob pressão

reduzida enquanto a torta foi novamente submetida à maceração por 48 h, desta vez em

100% de metanol. Porém após a concentrar o material extraído em 100% de MeOH

observou-se que este apresentou baixíssimo rendimento, desta forma foi considerado

apenas o extrato cetônico de polpa de pitomba.

Figura 13: Fruto em estado de maturação se abrindo espontaneamente e fruto aberto

40
 a) b)
Figura 14: a) Semente de pajurá parte externa da semente e amêndoa (parte interna); b): extrato

bruto da parte interna da semente.

4.3 Partição líquido-líquido dos extratos

Foram pesados cerca de 10 mg de cada extrato das amostras de pajurá (polpa,

casca, casca da semente e amêndoas), de pitomba (polpa, casca e semente) e mari-mari

(polpa, casca e semente), solubilizados em metanol (100%) ou uma mistura de metanol

e água (9:1) os quais foram submetidas à partição líquido-líquido com hexano e a

mistura de Hex/AcOEt (9:1), para remoção dos compostos de baixa polaridade. Na

sequência foram extraídos com 100% de clorofórmio e posteriormente 100% de acetato

de etila para extração de compostos de média polaridade (Esquema 2). Em destaque, é

mostrada na Figura 15, a emulsão formada durante a partição liquido-líquido do extrato

de polpa de pajurá. Os extratos em hexano, acetato de etila, clorofórmio e

hidroalcoólicos foram concentrados e comparados por CCD fase normal e reversa para

constatação da eficiência da partição.

41
 Extrato
10 mg
1- Solubilizado em MeOH/H2O 9:1
2- Partição em Hex/AcoEt 9:1

Fração Hex/AcoEt Fração

9:1 Hidroalcóolica

Partição em Clorofórmio

Fração clorofórmio Fração

Hidroalcóolica

Partição em Acetato de Etila

Fração Fração
Acetato de etila Hidroalcóolica

Esquema 2: Partição líquido-líquido dos extratos dos frutos

Figura 15: Partição do extrato bruto de polpa de pajurá

42
4.4 Extração em fase sólida (SPE)

Antes de realizar as análises por LC-MS para caracterização de compostos

fenólicos, as amostras foram tratadas por extração em fase sólida utilizando cartuchos

com fase estacionaria C-18 eluídas em três proporções diferentes da mistura ACN/H2O

(1:9 1:1 9:1). As amostras eluídas em ACN/H2O 1:1 foram concentradas e pesadas para

as análises.

4.5 Caracterização de compostos por LC-MS

As análises por LC-MS foram realizadas na Central Analítica do Laboratório

Temático de Química de Produtos Naturais (CA-LTQPN) do Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia (INPA). O sistema LC-MS é constituído por um cromatógrafo

modelo Prominence UFLC (Shimadzu), equipado com bomba binária LC-20AT,

detector de arranjo de diodos (DAD) SPDM-20A e injetor automático SIL-20ª e

acoplado a espectrômetro de massas (Brucker Daltonics, modelo Micro TOF-QII)

através de uma fonte eletrospray e ajustado para os seguintes parâmetros de operação:

Tipo de fonte: ESI; voltagem do capilar: 2600 volts; Scan: 50-1200 m/ z; Set nebulizer:

4,0 bar; Set dry heater: 200 ºC; Set dry gas: 9,0 L/ min. As análises foram realizadas nos

modo positivo e negativo, usando a coluna: PFP (Kinetex, 2,6 μm, 100A, 150x200

mm). Foram utilizados metanol, acetonitrila, isopropanol e ácido fórmico grau LC-MS,

adquiridos da Sigma-Aldrich. A água utilizada foi previamente tratada no sistema

Millipore Simplicity.

43
 Utilizaram-se vinte e oito padrões comerciais (Tabela 3 e 4) adquiridos da

Sigma-Aldrich e da Fluka.

Os padrões foram preparados previamente como soluções estoques na

concentração de 1,0 mg/ mL usando metanol grau LC-MS. Alíquotas de 100 μL de cada

uma das 28 soluções foram reunidas em um vial com o volume final de 2,8 mL

posteriormente filtrada com filtro 0,2 μm da Millipore e dividida em dois vials

previamente identificados.

A caracterização foi feita considerando o tempo de retenção (tr) de cada padrão

com suas respectivas razões m/z.

Os padrões de flavonóides e ácidos fenólicos utilizados encontram-se listados

na Tabela 3 e 4 a seguir:

44
 Tabela 3: Padrões de flavonoides utilizados na solução de mistura de padrões.

Padrão Fórmula [M+H]+ [M-H]- Fórmula estrutural

molecular/M.M.
(+)- Catequina C15H14O6 291,0868 289,0712
290,0790

(-)-Epicatequina C15H14O6 291,0868 289,0712

290,0790

(-)-Epigalocatequina C15H14O7 307,0710 305,0667

306,0740

(-)-Epigalocatequina C22H18O11 459,0917 457,0961

galato 458,0849

(-)-Gallocatequina C22H18O11 459,0917 457,0965

galato 458,0849

45
 Contin.Tabela 3: Padrões de flavonoides utilizados na solução de mistura de padrões.

Padrão Fórmula [M+H]+ [M-H]- Fórmula estrutural

molecular/M.M.
Isorramnetina C16H12O7 317,0661 315,0505
316,0583

Rutina C27H30O16 611,1610 609,1463

610,1534

(±)-Narigenina C15H12O5 273,0758 271,0612

272,0684

Quercetina C15H10O7 303,0280 301,0410

302,0426

Apigenina C15H10O5 271,0600 269,0455

270,0528

Apigenina-7-glicosídeo C21H20O10 433, 1068 431,0978

432,1093

46
 Contin.Tabela 3: Padrões de flavonoides utilizados na solução de mistura de padrões.

Padrão Fórmula [M+H]+ [M-H]- Fórmula estrutural

molecular/M.M.
Miricetina C15H10O8 319,0449 317,0303

318,0376

Quercitrina C21H20O11 449,1252 447,0999

448,1006

Kaempferol C15H10O6 287,0550 285,0329

286,0471

Luteolina C15H10O6 287,0550 285,0404

286,0477

Resveratrol C14H12O3 229,0713 227,8559

228,04

47
 Tabela 4: Padrões de ácidos fenólicos utilizados na solução de mistura de padrões

Padrão Fórmula [M+H]+ [M-H]- Fórmula estrutural

molecular/M.M.
Ácido gálico C7H6O5 171,0101 169,0137
170,0215

Ácido caféico C9H7O4 171,0212 179.0363

180,1600

Ácido clorogênico C16H18O9 355,1029 353,0866

354,0951

Ácido siríngico C9H10O5 199,0500 197,0450

198,0528

Ácido ferúlico C10H10O4 195,0569 193,0506

194,0579

Ácido trans-cinâmico C9H8O2 149,0489 147,0498

148,0524

48
 Contin. Tabela 4: Padrões de ácidos fenólicos utilizados na solução de mistura de padrões

Padrão Fórmula [M+H]+ [M-H]- Fórmula estrutural

molecular/M.M.
Ácido sináptico C11H12O5 225,0762 223,0607 OH3C O
224,0685
OH
HO
OH3C

Ácido p-coumárico C9H8O3 165, 0391 163,0395 O

164,0473
OH
HO

OH
Ácido C18H22O4 303,1591 301,1445 H3C
Nordihidroguaiarético 302,1518
OH
CH3
HO
HO

Ácido C7H6O4 155,0267 153,0257 HO

3,4-dihidroxibenzóico 154,0266 OH

OH

Após a otimização das condições de análise, foram injetadas a solução de

mistura de padrões e as soluções das amostras. Os padrões com massas moleculares

idênticas foram injetados individualmente mediante as condições determinadas podendo

assim retirar as informações pertinentes à identificação destes quando em mistura.

49
4.6 Isolamento de substâncias

4.6.1 Casca de mari-mari

A casca e a semente de C.leiandra (mari-mari) foram submetidas à maceração

em acetona 100% durante 48h e posteriormente em metanol 100% durante 48h. Ambos

os solventes foram concentrados sob pressão reduzida e os respectivos extratos secos

foram devidamente pesados. Durante a etapa de retirada do solvente em evaporador

rotativo, o extrato da casca extraído em 100% de acetona apresentou grande quantidade

de um precipitado nas paredes do balão de fundo redondo. O precipitado foi testado

quanto à solubilidade em hexano, acetato de etila, acetona, metanol e água. Foi

observado que este precipitado é insolúvel em acetato de etila e solúvel em metanol.

Procede-se com a lavagem a frio com acetato de etila e filtração em funil de Büchner

(Figura 16). Após este procedimento o sobrenadante, precipitado e o extrato de casca

foram analisados por CCD e espectrometria de massas e purificação em HPLC semi-

preparativo.

Extrato de casca
(acetona)
1. Evaporação sob pressão reduzida
2. Precipitação de um sólico branco
3. Lavagem em funil de Buchnner com acetato de etila à frio

Sobrenadante em Precipitado branco

acetona m = 255,8 mg

4. Purificação em HPLC semi-preparativo

Substância 1 Substância 2
m = 13,8 mg m = 60,7 mg

Esquema 3: Frações da partição do extrato cetônico de casca de pitomba.

50
 Figura 16: Precipitação e lavagem do sólido branco proveniente do extrato de casca em acetona.

O precipitado (m = 255,8 mg) foi submetido à purificação em HPLC semi-

preparativo nas seguintes condições: Fase móvel (55% de solvente A- água) (45% de

solvente B- metanol grau HPLC), fluxo de 6 mg/mL, coluna Luna C-18 preparativa.

Foram coletadas sete frações os quais forneceram duas amostras puras substância 2

(13,8 mg) e substância 1 (60,7 mg).

As amostras puras foram encaminhadas para análises por espectrometria de

massas e espectroscopia de RMN de 1H 1D e 2D para determinação estrutural.

51
4.7 Quantificação de fenólicos totais pelo método Folin-Ciocalteu

A quantificação de fenólicos presentes nas amostras de fruto estudadas foi

realizada utilizando a metodologia descrita por Velioglu et al. (1998). Este método

consiste na utilização do reagente Folin-Ciocalteu, que se trata de uma mistura de

molibdato, tungstato e ácido fosfórico. A presença de substâncias fenólicas na amostra é

observada pela mudança de coloração da amostra amarela do meio reacional para a

coloração azul (analisada em comprimento de onda =725 nm). Para este ensaio, foram

preparadas soluções das amostras em MeOH na concentração de 1 mg/ mL. Foram

transferidos para um frasco âmbar 200 μL da solução e adicionados 1,5 mL de solução

Folin-Ciocalteu 10%. Após 5 minutos, adicionou-se ao meio 1,5 mL de solução

NaHCO3 6%. Aguardou-se 90 minutos para a leitura do meio no comprimento de onda

de 725 nm em espectrofotômetro UV/Visível Femto 800XI.

A determinação foi realizada através da interpolação da curva de ácido gálico, utilizado

como padrão. A curva foi construída utilizando soluções padrões nas concentrações de

250, 125, 62,5 e 31,25 μg/mL. Todas as análises foram realizadas em triplicatas

utilizando solventes com grau HPLC. Os resultados obtidos para o teor de Fenólicos nas

amostras foram expressos em gramas de ácido gálico por grama de extrato seco (g AG/

extrato seco).

52
4.8 Determinação da atividade antioxidante

4.8.1 Capacidade redutora do Ferro (FRAP)

O ensaio FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power), consiste na medida da

capacidade da amostra em reduzir Fe3+ para Fe2+, via avaliação da redução do complexo

[Fe3+(TPTZ)2]3+ (ferritripiridiltriazina) a ferroso-tripiridiltriazina [(Fe2+- (TPTZ)2]2+. Se

a amostra apresentar capacidade antioxidante frente a este ensaio haverá a mudança da

coloração do meio reacional para azul. Seguindo o procedimento descrito por Luximon-

Ramma et al.(2002), foram preparadas soluções metanólicas de 1 mg/mL das amostras a

serem analisadas, as quais foram reservadas. Preparou-se então o reagente FRAP, que

resulta da reunião das soluções previamente preparadas de FeCl3.6H2O 20 mM, solução

de TPTZ [2,4,6-tri(2-pridil)-1,3,5-triazina] 10 mM e da solução tampão de HOAc/-OAc

0,3 M e pH 3,6, na proporção de 1:1:10. Em um vidro âmbar foram transferidos 100 μL

da solução de 1 mg/mL da amostra a ser analisada, ao qual foram acrescentados 300 μL

de água Milli-Q. Em seguida foram adicionados 3 mL do reagente FRAP e após o

período de repouso, sobre abrigo de luz por 4 minutos, foi feita a leitura da absorbância

em espectrofotômetro UV/Visível Femto 800XI no comprimento de onda de 593 nm.

Os resultados foram expressos em μmol de Fe (II) / mg de extrato seco e calculados por

meio da equação de regressão linear, obtida a partir da construção de uma curva

analítica de sulfato ferroso nas concentrações de 62,5, 125, 250, 500, 1000 e 2000 μM.

53
4.8.2. Captura de radicais livres de DPPH

O método consiste na captura de radicais livres de DPPH (2,2-difenil-picril-

hidraxina) descrito por Choi et al. (2002) que apresentam coloração roxa quando em

solução. A caracterização da atividade antioxidante frente a este método é observada

pela captura dos radicais livres de DPPH, o que é evidenciado pela mudança da

coloração do meio. A capacidade antioxidante medida por esse ensaio é expressa pela a

massa de amostra por mL (concentração da amostra) capaz de sequestrar 50% dos

radicais livres de DPPH (CS50). Este cálculo é realizado a partir de gráficos plotados

com o percentual da capacidade de sequestro de radicais para cada diluição segundo a

fórmula abaixo, onde A= absorbância e concentração da amostra ensaiada.

AA % = 100 – ((Aamostra – Abranco) x 100) /Acontrole)

O método consiste no preparo de soluções de 1 mg/mL de amostra em MeOH

grau HPLC. Em seguida são realizadas 2 diluições para concentrações finais de 0,1 e

0,01 mg/mL. Foi preparada então a solução DPPH 0,2 mg/mL em MeOH grau HPLC.

A leitura da absorbância do meio é então realizada após a adição de 1 mL de solução

DPPH 0,2 mg/mL a 2,5 mL de amostra, passados os 30 minutos de reação sob o abrigo

de luz, em espectrofotômetro a 518 nm. Após essa fase inicial foram determinadas as

diluições que serviram para a construção da curva analítica para o cálculo do CS50.

Utilizou-se a quercetina como padrão positivo para atividade antioxidante nas

concentrações 20, 10, 5,0, 2,5 e 1,25 μg/ mL por diluições sucessivas.

54
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Rendimentos de Extratos

5.1.1 Mari-mari

Nesta etapa foram avaliados os rendimentos de cada extrato de mari-mari

enfatizando principalmente a capacidade de extrair compostos fenólicos (Tabela 5).

Entre os vários métodos de extração de compostos fenólicos os quais envolvem agitação

via ultrassom, maceração e extração por Soxlet utilizando diversos sistemas de solvente

com variações na proporção. Optou-se por utilizar o método de maceração, pois foi

realizada com grande quantidade de material in natura e a escolha dos solventes

extratores foi considerando a afinidade dos compostos de interesse com os solventes

selecionados. Desta forma, procedeu-se com a extração de aproximadamente 200 g de

material de cada fruto em 500 mL de solvente (100% de acetona) para extrair

principalmente compostos da classe de fenólicos e realizar uma segunda extração

utilizando o mesmo volume (100% de metanol) para extrair especialmente compostos

fenólicos glicosilados.

Foi observado que para a polpa de mari-mari, o extrato em acetona apresentou

maior variedade de compostos pertencentes à classe de fenólicos, indicadas por CCD

(pag. 51), quantificação de fenólicos totais e LC-MS (pag. 59). A extração em metanol

apresentou maior seletividade extraindo principalmente os dois flavonoides

glicosidados os quais foram isolados e identificados neste trabalho. Quanto ao

rendimento, observa-se claramente que a extração em metanol extraiu maior quantidade

55
de massa de compostos, visto que este solvente pode extrair além de compostos

fenólicos uma grande quantidade de açúcares presentes no fruto. Em termos de

seletividade de constituintes de interesse, a acetona extraiu maior variedade de

compostos pertencentes à classe de polifenóis e alguns ácidos orgânicos, os quais foram

identificados por técnicas espectrométricas.

Tabela 5: Rendimentos dos extratos brutos de mari-mari

Extratos Solventes extratores m inicial (g) m extrato (g) Rendimento (%)

Polpa Acetona 100% 200,14 7,82 3,8

Casca Acetona 100% 360,02 6,75 3,3

Semente Acetona 100% 220,12 8,46 4,1

Polpa MeOH 100% 120,18 3,51 2,9

Casca MeOH 100% 130,25 3,43 2,6

Semente MeOH 100% 110,66 3,01 2,5

5.1.2 Pitomba

Foram obtidos cinco extratos brutos de pitomba provenientes da polpa, casca e

semente. A polpa foi extraída por maceração em 100% de acetona durante 48h. Após

este período a torta filtrada foi extraída em 100% de MeOH (Tabela 6). Porém o extrato

metanólico resultante de extração sucessiva não apresentou rendimento suficiente e foi

necessário fazer um novo extrato em metanol da polpa íntegra de pitomba para que

fosse possível fazer análises comparativas. Os extratos foram plotados em placa de

CCD de modo normal e reverso com a finalidade de comparar os constituintes presentes

56
em cada parte de fruto e se os extratos de diferentes solventes apresentavam algumas

diferenças nas extrações. Posteriormente cada extrato bruto foi submetido à partição

líquido-líquido inicialmente com 100% de hexano para retirar os compostos de baixa

polaridade e na sequência a partição com 100% de acetato de etila para obtenção de um

extrato que contenha compostos de média polaridade especialmente alguns compostos

fenólicos e alguns flavonoides.

Os extratos obtidos da polpa, casca e semente foram denominados como mostra

a tabela abaixo com suas respectivas massas.

Tabela 6: Rendimentos dos extratos brutos de pitomba

Parte do fruto Cód. Solvente extrator minicial (g) mextrato (g) Rendimento (%)

Talisia esculenta (polpa) Tep1 Acetona 100% 155,00 15,3707 13%

Talisia esculenta (polpa) Tep2 Metanol 100% 189,00 23,1234 17%

Talisia esculenta (casca) Tec1 Acetona 100% 200,00 2,1163 1,06%

Talisia esculenta (casca) Tec2 Metanol 100% 197,8837 3,0027 1,52%

Talisia esculenta (semente) Tes1 Acetona 100% 162,00 2,4088 1,48%

Talisia esculenta (semente) Tes2 Metanol 100% 159,5912 4,7465 2,98%

5.1.3 Pajurá

Foram obtidos oito extratos brutos de pajurá provenientes da polpa, casca,

semente (parte interna e parte externa) (Tabela 7). Foi observado que a extração em

57
100% de MeOH apresentou um rendimento bastante elevado comparado a outros

extratos (39,72 g). Trata-se de um material bastante viscoso e com odor doce bastante

pronunciado. Esta observação é bastante coerente com o fato de o pajurá ser um fruto de

sabor bastante doce e a extração em 100% de metanol retirou grande parte dos açúcares

presentes na polpa. O extrato de polpa obtido através da maceração em 100% de

acetona apresentou rendimento bastante inferior (0,8990 g) não chegando a 1, 0 g de

amostra. Também foi observado que as demais amostras de pajurá extraídas em 100%

de acetona por maceração apresentaram rendimentos mais baixos do que as amostras

extraídas em 100% de metanol. Ambos os extratos foram analisados por LC-MS e

submetidos a ensaios de investigação de capacidade antioxidante, bem como as demais

amostras de casca e semente deste fruto.

Tabela 7: Rendimentos dos extratos brutos de pajurá

Parte do fruto Cód. Solvente minicial (g) m extrato(g) Rendimento (%)

extrator
Couepia bracteosa (polpa) Cbp1 Acetona 100% 220,1358 0,8990 0,41 %

Couepia bracteosa (polpa) Cbp2 Metanol 100% 229,2368 39,7216 18,11 %

Couepia bracteosa (casca) Cbc1 Acetona 100% 80,2634 0,5689 0,70 %

Couepia bracteosa (casca) Cbc2 Metanol 100% 79,6945 4,7199 5,92 %

Couepia bracteosa (amêndoas) Cbsd1 Acetona 100% 86,2639 0,1836 0,21 %

Couepia bracteosa (amêndoas) Cbsd2 Metanol 100% 83,2737 2,9902 3,47 %

Couepia bracteosa (semente) Cbsf1 Acetona 100% 66,25991 0,2460 0,37 %

Couepia bracteosa (semente) Cbsf2 Metanol 100% 66,3531 2,6255 3,96 %

58
5.2 Comparação dos extratos por CCD

5.2.1 Mari-mari

A comparação por cromatografia de fase reversa foi utilizada para obter um

perfil com preliminar e para detectar a presença de substâncias fenólicas, visto que foi

utilizado revelador FeCl3 10% para compostos fenólicos. Foram testados vários

sistemas de eluentes, sendo MeOH/água (6:4) o melhor eluente para ultrassom-casca

(2), maceração-casca(5), ultrassom-casca(10), como pode ser visto na Figura 17 que

apresentou uma boa separação apenas para os extratos de extrato de casca (acetona) (2)

e extrato de casca (metanol) (5),onde foi possível observar a presença de fenólicos uma

vez que foi utilizado revelador FeCl3 10%, enquanto os demais extratos: extrato de

polpa (acetona) (1), extrato de semente (acetona) (3), extrato de polpa (metanol) (4),

extrato de semente (metanol) (6), que além de ficaram retidos na base, não apresentou

manchas intensas características de flavonoides.

Figura 17: CCD dos extratos de polpa de mari-mari (acetona) (1), de casca de (acetona) (2), de

semente (acetona) (3), de polpa (metanol) (4), de casca (metanol) (5), de semente (metanol) (6).

59
5.2.2 Pitomba

Após a partição as amostras de pitomba extraídas em acetato de etila e as

hidroalcoólicas foram comparadas por CCD em fase reversa sendo observado que os

dois extratos de casca da pitomba, particionados com acetato de etila, apresentaram

grande semelhança (Figura 18). O extrato hidroalcóolico da casca apresentou uma

coloração mais intensa em relação às demais da mesma amostra ao ser revelada na luz

UV (365 nm) e com o revelador NP-PEG indicando a presença de flavonoides nos

respectivos extratos.

Figura 18: CCD das amostras de partição líquido-liquido dos extratos de pitomba revelado em NP-

PEG e observados sob luz UV 365 nm.

60
5.3 Caracterização de compostos fenólicos por LC-MS

Muitas metodologias analíticas foram desenvolvidas para detectar e quantificar

os flavonoides, principalmente usando técnicas hifenadas para rápida caracterização

destes compostos como a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de

espectro de UV-VIS acoplado a espectrômetro de massas (GATES & LOPES 2012).

Uma variedade de bancos de dados comerciais foram desenvolvidos para

auxiliar na identificação de compostos, como o Scifinder, MASSBANK e CrossFire

Commander (NIKOLIC et al., 2012). Porém na ausência de informações para os

compostos investigados, a criação de um banco de dados próprio para o trabalho é

bastante útil usando padrões disponíveis analisados nas mesmas condições e

aparelhagem.

Após tratamento em extração em fase sólida (SPE), os extratos obtidos foram

submetidos à cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de

massas de alta resolução (LC-MS). A caracterização dos compostos fenólicos dos

extratos de polpa, casca e semente dos frutos estudados foi realizada baseada na

comparação com o tempo de retenção e razão m/z dos padrões no modo positivo e modo

negativo de flavonoides e ácidos fenólicos. Neste trabalho as amostras apresentaram

melhor detecção no modo negativo, desta forma este dado foi utilizado para a

caracterização dos compostos identificados nos extratos dos frutos.

Na tabela 8 são apresentados os dados correspondentes aos padrões de

compostos fenólicos e em seguida o cromatograma no modo negativo (Figura 19)

utilizados neste trabalho para auxiliar na caracterização de compostos dos frutos

estudados.

61
Tabela 8: Tempo de retenção dos padrões de compostos fenólicos eluídos em coluna PFP

Pico nº tr (min) [M-1]- Padrão

BPC (-) Erro (ppm)
1 4,0 169,0194 (1,7) Ácido Gálico

2 6,7 153,0243 (1,3) Ácido 3,4-dihidroxibenzóico

3 10,4 305,0785 (-3,9) (-)- Epigalocatequina

4 10,9 289,0827 (-3,8) (+)- Catequina

5 11,3 353,0866 (-1,7) Ácido Clorogênico

6 12,4 179,0417 (0,1) Ácido Caféico

7 13,5 289,0834 (-4,1) (-)-Epicatequina

8 14,8 457,0961 (7,2) (-)-Epigalocatequina galato

9 15,9 457,0965 (-5,9) (-)-Galocatequina galato

10 15,5 163,0460 (1,2) Ácido p-cumárico

11 17,1 609,1710 (-4,2) Rutina

12 17,5 193,0506 (-6,2) Ácido Ferúlico

13 17,5 223,0696 (-4,0) Ácido Sinápico

14 19,7 447,1131 (-21) Quercitrina

15 23 431,0969 (-7,4) Apigenina-7-glucosídeo

16 23,2 227,0811 (-4,4) Resveratrol

17 24,4 317,0303 (0,1) Miricetina

18 28,6 271,0743 (-7,0) (±)-Narigenina

20 29 301,1587 (-8,0) Quercetina

21 29,6 285,0537 (17) Kaempferol

22 29,6 285,0404 (-7,3) Luteolina

23 29,9 315,0654 (-6,6) Isorramnetina

24 31,6 269,0455 (0,2) Apigenina

25 36,1 301,1445 (-7,0) Ácido Nordiidroguaiarético

62
 Figura 19: Cromatograma BPC dos padrões de compostos fenólicos

5.3.1 Mari-mari

Foram identificados na polpa, casca e semente no extrato cetônico, dois

flavonoides glicosilados previamente isolados das cascas do fruto e alguns compostos

são sugestões de identificação utilizando LC-MS (Figura 20). Cada pico foi identificado

através do espectro de massas no modo negativo e suas respectivas fragmentações

comparando os dados fornecidos com os padrões disponíveis e dados da literatura.

Todos os compostos apresentaram baixo erro (<3,7 ppm) indicando a precisão de massa

exata e fórmula molecular obtida. Na Tabela 9 são listados os compostos identificados

incluindo os tempos de retenção, massa molecular experimental e calculado, fórmula

molecular, erro (desvio entre a massa medida e massa teórica), os principais fragmentos

(MS/MS) e a proposta de composto.

63
 a)

b)

c)

Figura 20: Comparação dos cromatogramas BPC modo negativo das amostras de polpa a), casca b)

e semente c) de mari-mari extraído em acetona.

No LC-MS da polpa o pico 1 em 1,5 min apresentou íon molecular em m/z

387,1275 com principais fragmentos em m/z 341, 179, 135 e 89. Os fragmentos

sugerem que o composto seja um derivado de ácido cafeico hexosídeo cujo fragmento

principal em m/z 341 corresponde à perda de CO2 seguida pela perda de hexosídeo [M-

1-44-146]- representado pelo íon em m/z 179 coerente com o ácido cafeico e os

fragmentos característicos em m/z 135 e m/z 89. Estes dados comparados com a

literatura sugerem que a substância seja um derivado do cafeoil-hexosideo (CHEN,

INBARAJ & CHEN, 2012). O pico 2 em tr 1,8 min, apresentou m/z 191,0271 coerente

com o ácido cítrico confirmado pelos fragmentos em m/z 173 correspondente a perda de

[M-H-H2O]− e m/z 111 resultante da perda de [M-H-CO2-2H2O]− (ISWALDI et al.,

2013; DUNN et al., 2005; GÓMEZ-ROMERO et al., 2010).

64
 O pico 3 com tr de 3,1 minutos, íon precursor em m/z 191,0203, apresentou

fragmento em m/z 114. Porém a identificação deste não foi possível, pois não foram

encontradas sugestões de compostos que apresentem uma fórmula molecular coerente

com esta fragmentação.

No tr 16,3 min, o pico 4 com íon precursor em m/z 561,1907, foi identificado

como um composto pertencente à classe de proantocianidinas. Os principais relatos de

proantocianidinas são referentes a compostos cujas unidades monoméricas são ligadas

diretamente a carbonos (C-3 e C-4) nos anéis. (HEMINGWAY, 1989; PORTER, 1994).

Neste caso, os fragmentos característicos observados por espectrometria de massas para

esta classe seria a perda de [M-H-152]- (Figura 21). Nesta amostra, foi observado que

este dímero apresenta as unidades monoméricas ligadas por um grupo éter (C4-O-C3),

apresentando como principais fragmentos a perda de [M-1-272]- em m/z 289,

fragmentos correspondentes à perda de H2O e CO2, m/z 543 e m/z 517, respectivamente.

Fragmentos resultantes da clivagem do anel A foram confirmados pelo íon em m/z 227.

Os fragmentos com m/z 425 e m/z 135 foram atribuídos à clivagem Retro Diels-Alder.

O íon em m/z 435 corresponde à perda de 1,2,3-benzenotriol [M-H-126]- (Figura 22).

Estes dados em conjuntos com a precisão da massa molecular sugerem esse composto

como epioritina-(4β→3)-epioritina-4β-ol, pertencente a classe rara de conhecidas

proantocianidinas éter-ligadas, os quais foram reportadas previamente em espécies de

Acacia caffra pertencentes à família Leguminoseae, descrita por Bennie, Malan,

Coetzee & Ferreira (2000).

65
 Figura 21: Espectro de MS2 com os principais fragmentos do pico 4.

Figura 22: Proposta de fragmentação para o pico 4 *RDA= Retro Diels Alder

66
 O pico 5 (tr 17,6 min) com íon precursor em m/z 449,1258 apresentou íons

filhos em m/z 303, correspondente a perda de [M–H–rhamnosil]-, 303, 215, 145, 89. A

perda seguinte em [M–H–18]- correspondente à perda de água é confirmada pela

presença do íon em m/z 285 foi identificada como astilbina. A análise do pico 6

apresentou a molécula desprotonada em m/z 433 [M-H]- e íons filhos em m/z 287 [M-H-

146]- caracterizando a perda de glicosídeo e em m/z 269 [M-H-18]- correspondente a

perda de água. Este pico corresponde a engeletina respectivamente, cujo isolamento e

identificação destes compostos são relatados neste trabalho. Para os picos 3 e 7 em m/z

191,0203 [M-H]- e m/z 605,2768 [M-H]- não foi possível a tentativa de identificação.

Observando os cromatogramas BPC dos extratos de polpa em acetona e em

metanol (Figura 23), observa-se que ambos apresentam a maioria dos identificados por

LC-MS, com exceção do ácido cítrico, o derivado de cafeoil-hexosil e a

proantocianidina que foram detectados apenas no extrato em acetona o qual extraiu

parte considerável de compostos fenólicos.

A comparação dos extratos de cascas em acetona e em metanol (Figura 24)

mostra um perfil bastante semelhante ao que foi observado para os extratos de polpa de

mari-mari. Vale ressaltar a abundância dos flavonoides astibina (m/z 449) e engeletina

(m/z 433) em ambos os extratos.

Nos extratos de semente extraídos em acetona e em metanol, os cromatogramas

BPC (Figura 25) apresentaram foram identificados os flavonoides (astilbina, engeletina

e epioritina-(4β→3)-epioritin-4β-ol) encontrados na polpa e nas cascas do fruto.

67
Figura 23: Comparação dos cromatogramas das amostras de polpa de mari-mari extraído a) em

100 % de acetona e b) 100% de metanol.

68
Figura 24: Comparação dos cromatogramas das amostras de casca de mari-mari extraído em a)

100 % de acetona e b) 100% de metanol.

69
Figura 25: Comparação dos cromatogramas das amostras de semente de mari-mari extraído em

100 % de acetona e 100% de metanol.

70
 Tabela 9: Dados de LC-MS das amostras do fruto de mari-mari

Composto tr (min) Experimental Teórico MS/MS Possível Polpa Casca Semen

te
m/z m/z (erro Fragmentos substância
em ppm) A M A M A M

1 1,5 341,1080 341,0878 179, 135, Derivado de X

(58) 89 Cafeoil-
hexosideo
2 1,8 191,0198 191,0197 173, 111, Ácido cítrico X
(0,2)
3 3,1 191,0203 - 114 Desconhecido X

4 16.3 561,1415 561,1402 289, Epioritina- X X X X X X

(2,2) (4β→3)-
epioritina-4β-
ol
5 17,6 449,0773 449,1089 303, 254, Astilbina X X X X X X
(3,7) 215,145,89
6 19,8 433,1100 433,1140 287,269 Engeletina X X X X X X
(-9,4)
7 23,6 605,2768 315, 289 Desconhecido X X

*A= extraído em acetona; M= extraído em metanol.

5.3.2 Pitomba

Foram identificados no cromatograma BPC do extrato em metanol de polpa de

pitomba (Figura 26) compostos fenólicos e flavonoides utilizando como técnica

identificação LC-MS. Cada pico foi identificado através do espectro de massas e suas

respectivas fragmentações comparando os dados fornecidos com os padrões disponíveis

e dados da literatura. Todos os compostos apresentaram erro abaixo de 22 ppm

indicando a precisão de massa exata e fórmula molecular obtida. Na Tabela 10 são

listados os compostos identificados incluindo os tempos de retenção, massa molecular

71
experimental e calculado, fórmula molecular, erro (desvio entre a massa medida e massa

teórica), os principais fragmentos (MS/MS) e a tentativa de identificação do composto.

6
5

7
8

Figura 26: Cromatograma BPC do extrato em acetona de polpa de pitomba.

A análise dos dados conduziu à identificação do pico 1 como ácido quínico (tr

1,1 min) com íon precursor em m/z 191,0575 apresentando íons produtos em m/z 173

m/z 127, m/z 111, m/z 93 e m/z 85 compatíveis com dados da literatura (BASTOS et al,

2007). O pico 2 foi identificado como ácido gálico (tr 1.5 min) apresentando íon

precursor em m/z 169,0142 com perda característica de CO2 [M-H- 44]- (QUIFER-

RADA et al, 2015). O composto 3 foi identificado ácido p-coumárico (m/z 163,0423).

Os experimentos de MS2 apresentaram perdas de características de CO2 [M-H- 44]-

(VALLVERDÚ-QUERALT, DE ALVARENGA, ESTRUCH, & LAMUELA-

RAVENTOS, 2013).

72
 No extrato metanólico de polpa e cetônico de cascas foram identificadas a

epicatequina (4) e catequina (5) apresentam íon precursor em m/z 289,0730 e 289,0732

com fragmentos característicos em m/z 245, m/z 205, m/z 203, m/z 179, m/z 125, m/z

109 (Figura 27) (KOOLEN et al, 2013).

A rutina (6) de razão m/z 609,1461 Da foi identificada no (tr) 18,8 min

apresentando como principal fragmento m/z 301 correspondente a perda de uma porção

de rutinose desidratada [M-H-308]- (HOSSAIN et al, 2010).

Nos cromatogramas de extrato de polpa em metanol e extrato de semente em

acetona de pitomba, os picos 7 e 8 foram identificados os flavonoides naringenina em

(tr) 29,1 minutos com m/z 271,0703 [M-H]-1 e luteolina em (tr) 29,6 minutos com m/z

285,0501 [M-H]-1 (Figura 28). Em ambos os extratos de casca, foram identificados no

cromatogramas BPC à presença do íon m/z 609 [M-H]-1 correspondente à rutina (Figura

29).

73
 289.0830
12.1
4

Figura 27: Cromatograma BPC (modo negativo) do extrato de semente extraído em acetona em

comparação com o mix de padrões. Detecção de catequina e epicatequina m/z 289.

74
 m/z 285.0501
17

Figura 28: Cromatogramas BPC da mistura de padrões de fenólicos e cromatograma BPC do

extrato de semente de pitomba extraído em acetona com detecção dos íons m/z 271 e 285

correspondente à naringenina e luteolina respectivamente.

75
 a)

b)

Figura 29: Comparação entre os cromatogramas BPC dos extratos de casca de pitomba a) extraído

em acetona b) extraído em metanol e detecção de rutina (m/z 609).

76
 Tabela 10: Dados de LC-MS das amostras do fruto de pitomba

Composto tr (min) Experimental Teórico m/z MS/MS Tentativa de Polpa Casca Semen
te
m/z (erro em Fragment identificação
ppm) os A M A M A M
1 1,1 191,0575 191,0561 173, 127, Ácido quínico X
(7) 111, 93,
85

2 1,5 169,0146 169,0142 125 Ácido gálico X

(2,36)

3 15,5 163,0423 163,0401 119 Ácido p- X

(13) coumarico

4 17,4 289,0732 289,0718 245, 205, Catequina X X X X X

(5) 203, 179,
125, 109

5 17,9 289,0730 289,0718 245, 205, Epicatequina X X X

(4) 203, 179,
125, 109

6 18,8 609,1490 609,1461 301 Rutina

(5)

7 29,1 271,0703 271,0612 253 Naringenina - - X X X X

(6)
8 29,6 285,0501 285,0404 267, 215 Luteolina - - - - X X
(22)
*A= extraído em acetona; M= extraído em metanol.

77
 4

5 6

Figura 30: Constituintes identificados nas polpas, cascas e sementes de pitomba.

5.3.3 Pajurá

A comparação dos cromatogramas referentes aos extratos de polpa do pajurá

extraídos em acetona e em metanol (Figura 31) mostrou grande diferença de

constituintes. Na Tabela 11 são listados os dados de alguns constituintes cuja tentativa

de identificação foi sugerida.

78
 (a)

(b)

Figura 31: Comparação entre os cromatogramas de polpa de pajurá (a) extraído em acetona; (b)

extraído em metanol.

No extrato de polpa em metanol observou-se a predominância dos picos 4 e 5

correspondentes aos íons m/z 363,0221 e m/z 377,0381 os quais não coincidem com

nenhum dos padrões disponíveis. Relatos recentes mostraram que estes íons

correspondem a sulfato de acacetina, sulfato de apigenina e oleuropeína aglicona

(Figura 32) (BERTO et al, 2015). Os mesmos foram observados no extrato em acetona

de polpa de pajurá, porém em pequena quantidade.

Os íons observados no extrato em acetona de pajurá foram comparados com íons

de ácidos orgânicos e principalmente açúcares. O pico 1 presente em ambos os extrato

de polpa apresentou o íon em m/z 179,0562 (tr 1,4 min) com fragmentos em m/z 161 e

m/z 89 foi sugerido como ácido cafeico confirmado pela comparação com o padrão e

com os fragmentos característicos.

79
 Os picos 2 e 3 do extrato em acetona (Figura 31) cujos íons em m/z 173,0817 (tr

19,8 min) e 173,0816 (tr 21,0 min), porém como o erro relativo considerado alto para a

sugestão de identificação deste composto, a sua identificação não foi possível.

Tabela 11: Dados de LC-MS das amostras do fruto de pajurá

Composto tr (min) Experimental Teórico MS/MS Sugestão de Polpa Casca Semen- Amen-
m/z m/z (erro identificação te doas
em ppm) Fragmentos
A M A M A M A M

1 14,0 179,0562 - 161, 89 Ácido cafeico X X X X X X X X

2 19,8 173,0817 - - Desconhecido X X - - - X - -

3 21,0 173,0816 - - Desconhecido X X - - - - - -

4 30,0 363,0221 363, 0201 - Sulfato de X X X X X X X X

(-5,5) acacetina

5 35,0 377,0381 377,0361 - Oleuropeína X X - - X X X X

(-5,3) aglicona

6 32,0 271,0699 271,0612 Naringenina - - - - - - X X

(32)

7 25,0 349,0044 349,0024 - Sulfato de - - X - X X X X

(5,7) apigenina

*A= extração em acetona; M= extração em metanol.

80
 Figura 32: Flavonoides identificados na polpa de pajurá extraída em metanol

No extrato cetônico de amêndoas de semente foram identificados sulfato de

acacetina (m/z 363), sulfato de apigenina (m/z 349) e naringenina. No extrato

metanólico foram detectados apenas os sulfatos de acacetina e apigenina em

abundância. O perfil dos extratos (Figura 32) mostrou que o extrato metanólico

apresenta maior variedade de constituintes que talvez não sejam pertencentes à classe de

compostos fenólicos. A extração em acetona mostrou que além dos sulfatos de

flavonoides, extraiu naringenina, talvez seja um indicativo de que a acetona seja um

solvente extrator mais apropriado para este material do que o metanol, que apesar de

extrair mais compostos, é menos seletivo, pois além de extrair compostos de interesse

pode extrair açúcares, que são predominantes nesta matriz.

81
 a)
Sulfato de apigenina
0

Sulfato de acacetina

Naringenina

b)

Sulfato de acacetina

Sulfato de apigenina

Figura 33: Comparação entre os cromatogramas de semente (amêndoas) de pajurá (a) extraído em

acetona; (b) extraído em metanol.

82
 a) Sulfato de apigenina

0
Sulfato de acacetina

b)

0
Sulfato de acacetina

Sulfato de apigenina

Figura 34: Comparação entre os cromatogramas (a) de semente (parte externa) de pajurá extraído

em acetona; (b) extraído em metanol.

O perfil dos extratos da parte externa das sementes (Figura 34) mostra certa

diferença em comparação com as amêndoas, justificando a escolha de se estudar estas

partes separadas. Ainda sim os sulfatos de acacetina e apigenina foram detectados em

ambas as extrações. Observa-se na extração em acetona, o sinal abundante

correspondente ao sulfato de apigenina, enquanto que no extrato metanólico o sinal é

muito inferior ao pico que corresponde ao sulfato de acacetina.

83
 Também foram detectados nos cromatograms (BPC) de casca do fruto (Figura

35) do extrato cetônico os íons m/z 349 e m/z 363 correspondentes ao sulfato de

apigenina e sulfato de acacetina respectivamente. No extrato metanólico de casca de

pajurá os íons m/z 363 e m/z 377 correspondentes ao sulfato de acacetina e oleuropeína

aglicona, sendo este segundo, o mais abundante na amostra.

Sulfato de acacetina

Sulfato de apigenina

Oleuropeína aglicona

Sulfato de acacetina

Figura 35: Comparação entre os cromatogramas (a) das cascas de pajurá extraído em acetona; (b)

extraído em metanol.

84
5.4 Substâncias isoladas

Em função do baixo rendimento dos extratos de polpa do mari-mari, optou-se

por fracionar e purificar os extratos de cascas e sementes do fruto, pois as análises

prévias em LC-MS apontaram alguns compostos presentes em ambos os extratos

auxiliando na caracterização de compostos presentes na polpa do fruto.

5.4.1 Mari-mari (casca)

O precipitado branco purificado por HPLC preparativo (Seção 4.6.1), forneceu

as amostras puras substância 1 e substância 2 identificadas por espectroscopia de RMN

de 1H 1D e 2D e espectrometria de massas.

Substância 1 (Engeletina)

A análise deste composto por espectrometria de massas (Figura 36 e 37)

apresentou a molécula desprotonada em mz 433 [M-H]- e suas respectivas perdas em

mz 287 [M-H-146]- e em mz 269 [M-H-18]-. No modo positivo a molécula protonada

apresentou mz 435 [M+ H]+ como um íon pouco intenso cujos fragmentos são em mz

289 [M+H-146]- e em mz 271 [M+H-18]- evidenciando que a massa do composto seja

de 434 Da com a perda inicial equivalente a uma perda de glicosídeo seguida pela perda

de uma molécula de água coerente com a presença de hidroxila.

O espectro de RMN de 1H da amostra substância 1 realizado em MeOH-d4 600

MHz, apresentou sinais na região de hidrogênios aromáticos, hidrogênios metínicos

entre eles hidrogênios carbinólicos e um sinal de hidrogênios metílicos (Figura 38).

Foram registrados dois dubletos em  6,84 e 7,35 ppm cuja a constante de acoplamento

85
 igual a 8,6 Hz sugerem que estes estão acoplando em orto, típicos de anel “B” p-di-

substituído. Cada sinal integrado indica que existem dois hidrogênios em  6,84 ppm

que correspondem aos hidrogênios H-2’ e H-6’ e outros dois hidrogênios em  7,35

ppm correspondentes aos hidrogênios H-3’ e H-5’ justificados pela simetria do anel

aromático confirmando a estrutura do anel “B” do flavonoide (Figura 39) . Sinais em 

5,89 e  5,90 ppm cuja multiplicidade observada revelou dois dubletos com constante

de acoplamento igual a 2,1 Hz, típico de acoplamento meta no anel aromático. As

correlações observadas nos mapas de HMBC confirmam a caracterização do anel “A”

da estrutura proposta.

C.l.c_1ppt #193-202 RT: 3,56-3,70 AV: 5 NL: 2,60E7

F: - c APCI Q1MS [100,000-1000,000]
433,29
100

90

80

70
Relative Abundance

60

50

40

30
269,20
20
287,16
10
143,04 259,16 307,19 419,28 449,25 547,30 579,36 703,46 744,72 867,53 940,65 972,52
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z

Figura 36: Espectro de massas da amostra substância 1 no modo negativo APCI-MS

86
 C.l.c_1ppt #194-202 RT: 3,58-3,69 AV: 4 NL: 1,87E8
F: + c APCI Q1MS [100,000-1000,000]
289,15
100

90

80

70
Relative Abundance

60

50

40

30

20
271,12 435,25
10
107,14 417,21
185,08 243,10 331,14 466,28 541,34 581,30 703,33 778,63 873,04 960,34
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z

Figura 37: Espectro de massas da amostra substância 1 no modo positivo APCI-MS

MI_6_MAYANE_600.001.ESP TMS

0.55

0.50 Methanol

0.45
METHANOL-d4
0.40
Normalized Intensity

0.35

0.30

0.25
M06(d)
0.20
1.1820
1.1715

M04(dd) Methanol TMS

M02(d)
0.15 M01(d) M03(d)
6.8428
6.8285
7.3399
7.3543

M05(dd)
5.8943
5.9167

4.6183
4.6005

0.0000
5.8908
5.9202

4.0161
4.0137
5.1273
5.1452

3.4991

0.10
3.5019

3.4938
3.6333
3.6389
3.6494
3.6551

3.2754
4.2359
4.2415

0.05

0
2.00 1.87 1.54 0.96 1.05 0.00 0.31 1.01 1.00 1.01 1.00 0.22 3.06

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Chemical Shift (ppm)

Figura 38: Espectro de RMN de 1H da amostra substância 1 MeOH-d4, 600 MHz)

87
 MI_6_MAYANE_600.001.ESP
0.11

0.10

0.09

6.8428
6.8285
7.3399
0.08
7.3543

5.8943
5.9167
0.07
Normalized Intensity

H-5'
0.06
OH

5.8908
5.9202
H-5' H-6'
0.05
H-6'
OH
0.04 H-3'

0.03
H-3' H-2'
H-2'
0.02
Anel “A”
0.01 Anel “B”
0
2.00 1.87 1.54

7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 6.0 5.9 5.8
Chemical Shift (ppm)

Figura 39: Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 1

Sinais em  5,14 (d 10,7 Hz) 1H e  4,61 (d 10,7 Hz) 1H mostraram conexão

com carbonos de deslocamento químico de  84,1 e 78,8 ppm no mapa de HSQC, os

quais não são considerados deslocamentos químicos característicos de carbonos

aromáticos mas provavelmente de carbonos secundários ligados a heteroátomo. O

acoplamento observado também sugere que ambos os hidrogênios estão em posição

axial no anel “C” do flavonoide (Figura 40). Através das correlações por HMBC

(Figura 41), observou-se que o hidrogênio H-2 em  5,14, correlaciona com C-3, C-2’,

C-1’ e C-4 sendo C-1’ e C-2’ carbonos que compõem o anel B do flavonoide. O

hidrogênio H-3 ( 4,61 (d J=10,7 Hz) apresentou correlação com C-2 e C-1 além dos

carbonos C-4 e C-4β do anel C, desta forma, foi possível determinar esta parte desta

molécula.

88
 MI_6_mayane_600.001.esp Methanol

METHANOL-d4
H-5'
H-6'
OH
H-8'
0.20
HO O H-2 H-3'
H-2'
Normalized Intensity

H-6'
0.15
H-3 O
OH O
M02(d)
0.10 M01(d)

4.6183
4.6005
5.1273
5.1452

0.05

0.96 1.050.00

5.20 5.15 5.10 5.05 5.00 4.95 4.90 4.85 4.80 4.75 4.70 4.65 4.60 4.55
Chemical Shift (ppm)

Figura 40: Ampliação do espectro de 1H da substância 1 com os sinais de H-2 e H-3

89
 4,61 (d 10,7 Hz) 1H
C-2' OH C-2

F1 Chemical Shift (ppm)

C-1’ 100
HO O H-2
C-1' C-4β

150
C-4
C-3 O
C-4
OH O 200

4.75 4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40

5,14 (d 10,7 Hz) 1H F2 Chemical Shift (ppm)

50
OH

F1 Chemical Shift (ppm)

C-3
C-1'
100 HO O
C-2’ C-2
150
C-1’ C-4
C-4B H-3 O
C-4 200

OH O
5.30 5.25 5.20 5.15 5.10 5.05 5.00 4.95
F2 Chemical Shift (ppm)

Figura 41: Ampliação de mapas de HMBC dos hidrogênios H-2 e H-3 e correlações.

Os deslocamentos químicos dos hidrogênios do ramnosídeo foram comparados

com os dados da literatura, porém alguns dados não coincidem, como pode ser

observado na tabela 5, desta forma estes foram determinados através das correlações por

HMBC (Tabela 12).

No espectro NOE-DIFF 1D (Figura 42) é possível observar a proximidade

espacial dos hidrogênios do anel C com alguns hidrogênios vizinhos para determinação

da configuração relativa da substância. O H-2 (5,14 ppm) foi irradiado e observou-se

que além da interação com o hidrogênio H-3, corroborando o dado de constante de

acoplamento calculado para estes hidrogênio provando que estes encontram-se do

90
mesmo da molécula. Na figura 43 é mostrada que além da interação com o hidrogênio

H-3, o hidrogênio irradiado (H-2) também apresenta sinal de interação com os

hidrogênios H-2’ e H-6’ que fazem parte do anel B do flavonoide. Ao irradiar o H-3

(4,61 ppm), observa-se que este hidrogênio tem além da interação com H-2, tem

interação com os hidrogênios H-2’ e H-6’ do anel B e o hidrogênio H-1” do

rhamnosídeo. Desta forma, a configuração relativa atribuída para o composto pode ser

R/S ou S/R evidenciado pelo espectro NOE-DIFF de que os hidrogênios estão do

mesmo lado da molécula.

4.6074
ENGELENTINA.400.ESP
7.3642

-0.1

-0.2

-0.3
Normalized Intensity

H O H
H-6'
-0.4
H H
-0.5 H H-2'
H H-2 H
O H
O
-0.6 O H H H
H H O
-0.7 O
H H
H
-0.8 O O O O
H H H
-0.9 H
H
H
-1.0
5.1303

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0
Chemical Shift (ppm)

Figura 42: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, substância 1, em MeOH, a 500.13 MHz, detalhe

das interações espaciais entre os hidrogênios com o hidrogênio irradiado (H-2).

91
 5.1535

4.0088
ENGELENTINA.401.esp

7.3472
0

-0.1

-0.2
H-6' H
O H
-0.3 H
H-2
H H
Normalized Intensity

H
H O
-0.4 O H H-2'
H
H-1" O
H H-3
-0.5 H H
H O H
O
-0.6 O O H
H H
O
-0.7
O
H H
H H
-0.8 H

-0.9

-1.0
4.6300

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Chemical Shift (ppm)

Figura 43: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, substância 1, em MeOH, a 500.13 MHz, detalhe

das interações espaciais entre os hidrogênios com o hidrogênio irradiado (H-3).

A partir dos dados de RMN de 1H, espectros de massas comparados aos dados da

literatura (Tabela 13), a substância 1, um sólido cristalina (Figura 44) foi caracterizada

como engeletina (dihidrokaempferol 3-rhamnosídeo) (Figura 45), um flavonoide

glicosilado reportado em outros gêneros da família Fabaceae por Silva e colaboradores

em 2006 e em uvas e vinhos por Trousdale e Singleton em 1982.

92
 Tabela 12: Dados de RMN de 1H da substância 1 e correlações em HSQC e HMBC.

H HSQC HMBC

1 7,35 d 2H J 8,6 orto 130,5 83,6- 116,5 – 130,3- 159,5

2 6,84 d 2H J 8,6 116,6 116,5 – 130,5 – 159,5

3 5,90 d 1H J 2,1 meta 97,6 96,1 – 102,6 – 165,6 – 168,8

5,89 d 1H J 2,1 96,5 97,5 – 102,6 – 164,4 – 168,8

4 5,14 d 1 H J 10,7 84,1 78,3 – 128,9- 130,4 – 164,2- 196,1

4,61 d 1H J 10,7 78,8 83,6 – 102,1- 128,9 – 196,3 fort

6 4,24 m 1H 70,4 17,6 – 72,0 – 74,1

7 4,01 d 1H J 1,5 102,4 70,4 – 72,0 – 79,1 – 102,4

3,30 m 1H 74,2 17,6 – 70,4 – 72,0

8 3,64 ddd 1H J 9,7 e 6,4 72,4 74,2 – 72,4 – 74,1

9 3,50 ddd 1H J 3,2 e 1,7 72,0 72,4 – 74,2

10 1,18 d 3H J 6,3 17,6 17,6 – 70,4 – 74,2

Figura 44: Cristais de engeletina

93
 Tabela 13: Dados de RMN de 1H da substância 1 e dados da literatura.

Dados de RMN de 1H (200 MHz,

DMSO-D6) (Trousdale, E. K. & Substância 1 RMN de 1H (600 MHz,
Singleton, V.L. 1982) MeOH d-4)

H-2 5,28 (d 10,5 Hz) 1H 5,14 (d 10,7 Hz) 1H

H-3 4,76 (d 10,6 Hz) 1H 4,61 (d 10,7 Hz) 1H

H-6 5,90 (s) 1H 5,89 (d 2,1 Hz) 1H

H-8 5,91 (s) 1H 5,90 (d 2,1) 1H

H-2’e H-6’ 7,33 (d 8,5 Hz) 2H 7,35 (d 8,6 Hz) 2H

H-3’e H-5’ 6,78 (d 8,4 Hz) 2H 6,84 (d 8,6 Hz) 2H

H-1” 3,95(s, 1H) 4,01 (d 1,5 Hz) 1H

H-2” - 3,50 m 1H

H-3” - 3,64 m 1H

H-4” - 3,30 m 1H

H-5” - 4,24 m 1H

H-6” 1,05 (d 6,1 Hz) 3H. 1,18 (d 6,3 Hz) 3H

H-5'
H-6' OH
H-2
H-8 H
HO O H-3'
H-2'
H-6
O HO
H OH
OH O H-3 OH
O
CH3
Figura 45: Engeletina

94
  Substância 2 (Astilbina)

A identificação da astilbina foi realizada inicialmente pela comparação com o

espectro de massas da engeletina e o fato de que ambas foram identificadas em espécies

da mesma família além de dados complementares da literatura para confirmação da

estrutura.

O espectro de massas no modo negativo da substância 2 (Figura 46) apresentou

o íon molecular em m/z 449, com perda inicial em m/z 303 e m/z 285, correspondentes à

perda de rhamnosídeo [M-146]- e consecutiva perda de água [M-146-18]-. Outros

fragmentos característicos da molécula são consequência da fragmentação que leva à

um rearranjo segundo Retro Diels-Alder (RDA) (DEMARQUE et al, 2016). O primeiro

em m/z 151 correspondente à perda do anel B, parte do anel c ligado ao rhamnosídeo

[M-298]-. O segundo corresponde ao rearranjo ao contrário onde se perde [M-152]-

dando origem ao fragmento em m/z 297.

-298Da
RDA

-18Da -146 Da
Perda de
água Perda de
rhamnosideo

-152Da
RDA

Figura 46: Espectro de massas (modo negativo) substância 2 com as propostas de fragmentação.
95
 Desta forma foi realizada apenas a análise por RMN de 1H comparando com os

dados previamente reportados por Trousdale & Singleton, (1982) e Silva e

colaboradores, (2006) (Tabela 14). Apesar da única diferença entre os dois compostos

ser uma hidroxila no C-3’, alguns sinais de deslocamento químicos dos dois compostos

são diferentes devido a influencia que esta hidroxila apresenta sobre a blindagem dos

átomos de carbono e hidrogênio. Esta diferença fora observada por espectrometria de

massas e confirmada por espectrometria de RMN de 1H.

No espectro de RMN de 1H (Figura 47) realizado em DMSO-d6 foram

observados sinais com deslocamento químico (δ) com valores de deslocamento químico

próximos aos valores da engeletina. A diferença principal está nos valores de

deslocamento químico no anel B, onde a hidroxila na posição C-3’ está localizada. O H-

2’ apresenta δ= 6,72 ppm e aparece como um simpleto (Figura 48) Outra diferença foi

o uso de DMSO-d6 como solvente para análise que possibilitou o registro sinais de

hidrogênios de hidroxila dos anéis aromáticos (Figura 49) , os quais não aparecem em

MeOH-d4. Desta forma os dados da substância 2 obtida como um sólido cristalino

(Figura 52) são coerentes com a estrutura da astilbina (dihidroquercetina 3-ramnosídeo)

com fórmula molecular C21H22O11 e massa molecular 450 (Figura 53).

96
 RITA_MAYANE_ASTILBINA.011.ESP Water

1.0

6.7310
0.9

1.0531
1.0320
0.8

5.8784
DMSO

0.7
DMSO-d6
Normalized Intensity

5.8946
0.6

5.9020
0.5

6.8830

4.6661
5.2164

4.0183
4.6332
0.4

5.2499
11.8058

0.3

4.7337
4.5382
4.5264
7.3124

4.7684

3.1174
3.9507

3.8743
3.8843
3.9054
5.2667
0.2

5.3014

3.0863
9.0925

0.1

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Chemical Shift (ppm)
1
Figura 47: Espectro de RMN de H da amostra substância 2 em DMSO-d6

1.0 RITA_MAYANE_ASTILBINA.011.ESP
6.7310

0.9

0.8

0.7
Normalized Intensity

0.6

0.5
6.8830

0.4
Anel B
0.3
6.7682
7.3124

0.2

0.1

7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 6.0
Chemical Shift (ppm)
Figura 48: Destaque para o H-2’ no anel B da substância 2.

97
 1.0 RITA_MAYANE_ASTILBINA.011.ESP

6.7310
0.9

0.8

5.8784
0.7

5.8946
Normalized Intensity

0.6

5.9020
0.5

6.8830
0.4
11.8058

0.3

7.3124
0.2 9.0925

0.1

12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0
Chemical Shift (ppm)

Figura 49: Ampliação da região de hidrogênios ligados a oxigênio (H-O) da substância 2.

Da mesma forma que a substância 1 (engeletina), foi realizado para esta amostra

o experimento de NOE-DIFF com a finalidade de determinar a configuração relativa

deste composto. O H-2 (5,23 ppm) foi irradiado e apresentou interação com H-3 (4,63

ppm) (Figura 50). Além da interação com o hidrogênio H-2, o hidrogênio H-3 também

apresentou interação com os hidrogênios H-2’e H-1” (Figura 51). Da mesma forma que

a engeletina, o espectro de NOE-DIFF da astilbina revelou que a configuração relativa

do composto é R/S ou S/R confirmado pela análise do espectro NOE-DIFF.

98
 0 ASTILBINA.405.esp

5.2474

4.0387
-0.1

-0.2

H-6' H
-0.3
O H
H
Normalized Intensity

H-2
H H
-0.4 O H H-2'
H
H-1" O
H H-3
H H H
-0.5 O O
O H
H
O
-0.6 O
H H
H H
-0.7 H
4.6580
4.6379

6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5

Chemical Shift (ppm)

Figura 50: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, da substância 2, em MeOH, a 500.13 MHz e

detalhe das interações entre o hidrogênio irradiado (H-3) com os hidrogênios vizinhos.
4.6372

ASTILBINA.404.esp

0
6.8852
6.7369

-0.1

H O H
-0.2 H-6'
H OH
Normalized Intensity

-0.3 H H-2'
H H-2 H
O H
O
-0.4 O H H H
H H O
O
-0.5
H H
H
O O O O
-0.6 H H H
H H
-0.7 H
5.2493

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0
Chemical Shift (ppm)

Figura 51: Espectro de RMN de 1D, NOE-DIFF, da substância 2, em MeOH, a 500.13 MHz e

detalhe das interações entre o hidrogênio irradiado (H-2) com os hidrogênios vizinhos.

99
 Tabela 14: Dados de RMN de 1H da substância 2 e dados da literatura.

Dados de RMN de 1H (200 MHz, Substância 2 RMN de 1H (300 MHz,

DMSO-d6) (Trousdale, E. K. & DMSO-d6)
Singleton, V.L. 1982).

H-2 5,23 (d 9,9 Hz) 1H 5,23 (d 9,9 Hz) 1H

H-3 4,65 (d 9,9 Hz) 1H 4,64 (d 9,9 Hz) 1H

H-6 5,88 (s) 1H 5,89 (d 2,1 Hz) 1H

H-8 5,90 (s) 1H 5,90 (d 2,1) 1H

H-2’ 6,88 (s) 1H 6,87 (s) 1H

H-5’ 6,73 (s) 1H 6,72 (d 8,6 Hz) 1H

H-6’ 6,73 (s) 1H 6,79 (d 8,4 Hz) 1H

H-1” 4,02 (s) 1H 4,01 (d 1,2 Hz) 1H

H-2” - 3,93 m 1H

H-3” - 3,14 m 1H

H-4” - 3,08 m 1H

H-5” - 2,49 m 1H

H-6” 1,05 (d 6,2 Hz) 3H. 1,04 (d 6,0 Hz) 3H

OH-3’ 9,08 (s) 1H 9,00 (s) 1H

OH-4’ 9,11 (s) 1H 9,10 (s) 1H

OH-5 11,81 (s) 1H 11,82 (s) 1H

OH-7 10,75 (s) 1H 11,79 (s) 1H

100
 Figura 52: Cristais de astilbina

H-5'
H-6' OH
H-2
H-8 H
HO O
H-2'
OH
H-6
O HO
H OH
OH O H-3 OH
O
CH3

Figura 53: Astilbina

101
5.5 Quantificação de fenólicos totais

A partir dos dados de absorbância em função da concentração de ácido gálico

(µg/mL) foi construída uma curva de calibração nas seguintes concentrações (500; 125;

63; 31 µg/mL). (Figura 54). O coeficiente de correlação linear (R2) da equação obtida a

partir da curva apresentou um valor 0,9998 indicando uma boa correlação linear. O teor

de fenólicos totais foi estimado por interpolação de dados de absorbância dos extratos e

frações na reta de regressão.

1,400
1,200 y = 5,4296x - 0,0267
1,000 R² = 0,9998
0,800
Série1
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300

Figura 54: Curva de calibração com ácido gálico usado na quantificação de FT

5.5.1 Mari-mari

Na Tabela 14 estão listados os resultados de teor de fenólicos totais dos

extratos de polpa, casca e semente de mari-mari. As amostras de polpa, casca e semente

extraídas em acetona e em metanol dos frutos foram avaliadas quanto ao teor de

fenólicos totais e apresentaram compostos fenólicos na sua composição. As

concentrações variaram de 0,036 ± 0,008 a 0,169 ± 0,003 mg EAG- 1

por 100 g de

102
extrato seco sendo que o valor mais elevado foi obtido para o precipitado de casca de

mari-mari extraído em acetona. Os teores de fenólicos totais do precipitado e

sobrenadante de casca foram 0,169 mg EAG/g e 0,166 mg EAG/g, respectivamente,

onde pode ser observado que o precipitado apresentou o teor de fenólicos um pouco

mais elevado do que o sobrenadante. Este resultado é bastante coerente, com os dados

de LC-MS onde foi observada a presença abundante de dois flavonoides no precipitado,

os quais foram isolados e identificados engeletina (1) e astilbina (2).

Estes dados reforçam os relatos de Ayala-Zavala e colaboradores (2011) de que

o teor de compostos funcionais em diferentes tecidos de frutos exóticos tropicais está

localizado preferencialmente na casca e das sementes e em menor medida na polpa.

Tabela 14: Resultados de fenólicos totais dos extratos do mari-mari,.

Amostras Fenólicos totais

(mg EAG/100g extrato seco)

Mari-mari/Polpa (metanol) 0,036 ± 0,008

Mari-mari/Casca (metanol) 0,146 ± 0,121
Mari-mari/Sementes (metanol) 0,036 ± 0,032
Mari-mari/Polpa (acetona) 0,065 ± 0,040
Mari-mari/Casca (acetona) 0,129 ± 0,020
Mari-mari/Sementes (acetona) 0,060 ± 0,005
Mari-mari/Sobrenadante (casca) 0,166 ± 0,008
Mari-mari/Precipitado (casca) 0,169 ±0,010

5.5.2 Pitomba

Entre os extratos de pitomba apenas o extrato metanólico das cascas com 0,363 ±

0,04 EAG apresentou maior teor de fenólicos em comparação com os extratos de polpa
103
e semente (Tabela 15). Os extratos cetônico e metanólico de polpa apresentaram baixo

teor de compostos fenólicos (0,028 ± 0,001 e 0,038 ± 0,05 EAG) respectivamente.

Apesar de análises dos dados de LC-MS apontarem a presença de flavonoides e ácidos

fenólicos, estes podem se encontrar em baixa quantidade nos extratos justificando assim

os valores de teor de fenólicos encontrados.

Tabela 15: Resultados de fenólicos totais dos extratos de pitomba.

Amostras Fenólicos totais

(mg EAG/100g extrato seco)

Pitomba/polpa (acetona) 0,028 ± 0,001

Pitomba/polpa (metanol) 0,038 ± 0,05
Pitomba/casca (acetona) 0,015 ± 0,07
Pitomba/casca (metanol) 0,363 ± 0,04
Pitomba/semente (acetona) 0,091 ± 0,001
Pitomba/semente (metanol) 0,057 ± 0,03

5.5.3 Pajurá

Na Tabela 16 estão listados os resultados de teor de fenólicos totais dos extratos

de pajurá. As amostras de polpa, casca, semente e amêndoa extraída em acetona e em

metanol dos frutos foram avaliadas quanto ao teor de fenólicos totais e apresentaram

compostos fenólicos na sua composição. As concentrações variaram de 0,031 ± 0,032 a

0,169 ± 0,003 mg EAG- 1 por 100 g de extrato seco sendo que o valor mais elevado foi

obtido para a polpa de pajurá extraído em metanol. O extrato de polpa em acetona

apresentou um teor de fenólicos ligeiramente menor (0,129 ± 0,01 mg EAG- 1 por 100 g

de extrato seco), mas ainda sim foi um dos valores mais altos determinados para o fruto.

104
 Entre os extratos de casca, o extraído em acetona apresentou melhor resultado

com 0,121 ± 0,003 mg EAG- 1

por 100 g de extrato seco, sendo que o extraído em

metanol apresentou apenas 0,036 ± 0,005 mg EAG- 1.

Os extratos de semente do pajurá também foram avaliados e o teor de fenólicos

totais para o extrato metanólico foi 0,036 ± 0,010 mg EAG- 1

e para o extrato em

acetona 0,060 ± 0,005 mg EAG- 1.

Tabela 16: Resultados de fenólicos totais dos extratos de pajurá .

Amostras Fenólicos totais

(mg EAG/100g extrato seco)

Pajurá/polpa (acetona) 0,129 ± 0,02

Pajurá/polpa (metanol) 0,169 ± 0,03
Pajurá/casca (acetona) 0,121 ± 0,001
Pajurá/casca (metanol) 0,036 ± 0,08
Pajurá/semente/amendoa (acetona) 0,036 ± 0,05
Pajurá/semente/amendoa (metanol) 0,031 ± 0,12
Pajurá/semente (acetona) 0,118 ± 0,03
Pajurá/semente (metanol) 0,060 ± 0,091

5.6 DPPH (Ensaio de radical Difenil-2-picrihidrazil radical)

Existe uma variedade de ensaios antioxidante in vitro que servem como base

para o estudo da capacidade antioxidante de frutos. Neste estudo, os ensaios realizados

foram o FRAP (Ferry Reduction Assay Power) e sequestro de radicais DPPH, que

atuam por mecanismos diferentes (AKTER, OH, EUN & AHMED, 2011; CAO &

PRIOR, 1998).

105
 A partir da equação da reta dos gráficos da porcentagem de capacidade de

sequestro do radical livre DPPH· (%CS) em função da concentração (das series de

diluições dos extratos, frações e do controle positivo) foi estimado o parâmetro c em

μg/mL que expressa a concentração de substrato que causa 50 % de perda da atividade

(cor) do radical DPPH·). O controle positivo utilizado foi a quercetina com IC50 = 6,0

µg/mL.

5.6.1 Mari-mari

Os resultados de capacidade de sequestro de radicais livres, determinado pelo

ensaio de DPPH (Tabela 17), mostraram que a casca de mari-mari apresentou maior

atividade comparada à polpa e à semente do fruto. O valor de IC50 obtido para polpa

extraída em acetona foi de 364.94 ± 0.01 µg/mL e para o extrato metanólico de polpa

foi IC50 = 620.30 ± 0.01µg/mL. Entretanto os valores obtidos para os extratos cetônico e

metanólico de casca com valores de IC50 = 199.44 ± 0.01 µg/mL e IC50 = 619.14 ± 0.01

µg/mL respectivamente, revelando que os extratos cetônicos apresentam melhor

capacidade de sequestro de radicais DDPH em relação aos extratos metanólicos. O

mesmo ensaio foi realizado para com os três flavonoides isolados das cascas foram

ensaiados e pode ser observado que a engeletina, composto mais abundante nas

amostras, não apresenta o potencial antioxidante (IC50 = 3710 ± 0.005 µg/mL), enquanto

que a astilbina apresenta atividade antioxidante moderada (IC50 = 316 ± 0,06 µg/mL).

106
 Tabela 17: Resultados de DPPH dos extratos de mari-mari.

Amostras DPPH IC50 (µg/mL m/v)

Mari-mari/Polpa (metanol) 620,30 ± 0,01

Mari-mari/Casca (metanol) 619,14 ± 0,04
Mari-mari/Sementes (metanol) 673,73 ± 0,01
Mari-mari/Polpa (acetona) 364,40 ± 0,001
Mari-mari/Casca (acetona) 199,44 ± 0,01
Mari-mari/Sementes (acetona) 456,43 ± 0,02
Engeletina 3710,09 ± 0,005
Astilbina 316,66 ± 0,06
Quercetina 6,0 ± 0,005

5.6.2 Pitomba

As amostras ensaiadas do fruto de pitomba (Tabela 18) apresentaram a menor

capacidade de sequestro, sendo que para o extrato de polpa em acetona, não foi possível

calcular o IC50%, pois na triagem, a maior concentração utilizada (1,0 mg/mL),

apresentou 50% da capacidade de sequestro. O extrato de polpa em metanol apresentou

818,58 µg/mL ± 0,07, concentração mínima necessária para sequestrar os radicais

DPPH. O extrato com maior capacidade de sequestro de radicais DPPH entre os extrato

de pitomba é o de semente extraído em acetona com 183,73 µg/mL ± 0,01, o qual

contém luteolina, quercetina e naringenina que podem justificar esta atividade para este

extrato.

107
 Tabela 18: Resultados de DPPH dos extratos de pitomba.

Amostras DPPH IC50 (µg/mL m/v)

Pitomba/polpa (acetona) n.c

Pitomba/polpa (metanol) 818,58 ± 0,07
Pitomba/casca (acetona) n.c
Pitomba/casca (metanol) n.c
Pitomba/semente (acetona) 183,73 ± 0,01
Pitomba/semente (metanol) n.c
Quercetina (controle positivo) 6,0 ± 0,005

5.6.3 Pajurá

Entre os extratos de pajurá, observa-se claramente que as amêndoas da semente

apresentam grande capacidade de sequestro de radicais DPPH (Tabela 19), os quais são

necessários apenas 63,69 µg/mL de extrato para sequestrar 50% dos radicais. Este foi o

melhor resultado entre todos os extratos ensaiados do fruto pajurá e entre dos três frutos

estudados. Esta atividade pode estar diretamente associada aos flavonoides abundantes

nas amêndoas, identificadas por LC-MS como sulfato de acetina, sulfato de apigenina e

olerupeína. A polpa de pajurá como parte comestível, sendo a parte de maior interesse

no fruto, necessita de pelo menos 282, 83 µg/mL de extrato (metanólico) para sequestrar

50% dos radicais livres, ou seja, tem uma atividade não muito alta, porém é possível

atribuir aos fenólicos encontrados no fruto uma parcela da atividade antioxidante, pois

esta atividade é bem reconhecida devido aos carotenoides do fruto.

108
 Tabela 19: Resultados de DPPH dos extratos de pajurá.

Amostras DPPH IC50 (µg/mL m/v)

Pajurá/polpa (acetona) n.c

Pajurá/polpa (metanol) n.c
Pajurá/casca (acetona) n.c
Pajurá/casca (metanol) 1297,78 ± 0,002
Pajurá/semente/amêndoa (acetona) 282,83 ± 0,01
Pajurá/semente/amêndoa (metanol) 63,69 ± 0,002
Pajurá/semente (acetona) n.c
Pajurá/semente (metanol) n.c
Quercetina (controle positivo) 6,0 ± 0,005

5.7 FRAP (Ferric reducing antioxidant power)

Os valores de absorbância para cada extrato/fração foram interpolados na curva

de calibração com Fe2(SO4).7H2O e os resultados da capacidade redutora de Fe (III)

foram expressos como µg/ml de Fe(II)/g de extrato e fração.

5.7.1 Mari-mari

A partir dos resultados obtidos pelo método FRAP (Tabela 20), foi possível

observar um teor significativo de Fe2+, indicando que os compostos fenólicos presentes

nas cascas de mari-mari apresentam grande potencial de redução de Fe3+, tanto para o

extrato cetônico (1624,46 ± 0,05 µmol/g) quanto para o extrato metanólico (1240,70 ±

0,06 µmol/g DW). Os extratos de polpa apresentaram metade do teor de Fe2+ encontrado

nas cascas, (634,46 ± 0.06 e 629,88 ± 0.06 µmol/g) nos extratos cetônico e metanólico

respectivamente. Por ouro lado, os extratos de semente apresentaram baixa

concentração de Fe2+ comparados aos extratos de polpa e semente de mari-mari. As

109
substâncias isoladas também foram ensaiadas para avaliação da capacidade de redução

de Fe3+ onde a astilbina apresentou grande potencial de redução de ferro representada

pela concentração de Fe2+ (1905,71 ± µmol/g). A engeletina converteu uma pequena

parcela de íons Fe3+ em Fe2+ representada pela concentração final de equivalente de

sulfato ferroso 190,13 ± µmol/g.

Tabela 20: Resultados de FRAP dos extratos de mari-mari.

Amostras FRAP (μmol FeSO4 g− 1 DW)

Mari-mari/Polpa (metanol) 629,88 ± 0,02
Mari-mari/Casca (metanol) 1240,71 ± 0,06
Mari-mari/Sementes (metanol) 406,96 ± 0,09
Mari-mari/Polpa (acetona) 634,46 ± 0,03
Mari-mari/Casca (acetona) 1624,46 ± 0,09
Mari-mari/Sementes (acetona) 466,12 ± 0,02
Engeletina 190,13 ± 0,002
Astilbina 1905,71 ± 0,07

5.7.2 Pitomba

Entre os extratos de pitomba (Tabela 21), destacou-se o extrato em acetona de

semente de pitomba com 123,36 ± µmol/g, muito superior ao extrato em metanol de

semente (70,40 ± µmol/g). a capacidade de redução de Fe3+ avaliada nos extratos de

polpa e casca de pitomba foram consideradas baixas com 75,61 ± 0,05 µmol/g (polpa

extraída em acetona), 70,44 ± 0,02 µmol/g (polpa extraída em metanol), 63,90 ± 0,07

µmol/g (casca extraída em acetona) e 61,02 ± 0,06 µmol/g (casca extraída em metanol).

110
 Ainda assim estes resultados são bastante significativos, pois os compostos

fenólicos presentes na polpa mesmo que em menor quantidade comparados à casca,

ainda sim podem contribuir em efeitos benéficos na alimentação atuando na conversão

de Fe3+ em Fe2+ que tem papel fundamental no organismo.

Tabela 21: Resultados de FRAP dos extratos de pitomba.

Amostras FRAP (μmol FeSO4 g− 1 DW)

Pitomba/polpa (acetona) 75,61 ± 0,05
Pitomba/polpa (metanol) 70,43 ± 0,02
Pitomba/casca (acetona) 63,90 ± 0,07
Pitomba/casca (metanol) 61,07 ± 0,06
Pitomba/semente (acetona) 123,36 ± 0,05
Pitomba/semente (metanol) 70,40 ± 0,06

5.7.3 Pajurá

Entre os extratos do pajurá (Figura 22), destacou-se com o maior teor de Fe2+ o

extrato de amêndoas da semente extraído em metanol com 156,44 ± µmol/g. Este

resultado é coerente com os resultados prévios de Berto e colaboradores (2015), o qual

atribui a alta capacidade de sequestro de radicais livres do extrato da semente do pajurá

aos compostos identificados como sulfato de acacetina, sulftato de apigenina e

oleuropeína. Ambos os extratos de polpa do pajurá em acetona e metanol apresentaram

teor de Fe2+ (71,02 ± 0,11 e 77,61 ± 0,11) µmol/g bastante inferiores ao teor

determinado para as amêndoas da semente.

111
 Tabela 22: Resultados de FRAP dos extratos de pajurá.

Amostras FRAP (μmol FeSO4 g− 1 DW)

Pajurá/polpa (acetona) 71,02 ± 0,11

Pajurá/polpa (metanol) 77,61 ± 0,11
Pajurá/casca (acetona) 70,82 ± 0,03
Pajurá/casca (metanol) 116,57 ± 0,56
Pajurá/semente/amendoa (acetona) 65,09 ± 0,09
Pajurá/semente/amendoa (metanol) 156,44 ± 0,04
Pajurá/semente (acetona) 56,94 ± 0,01
Pajurá/semente (metanol) 89,44 ± 0,43

Analisando os resultados de dois diferentes mecanismos de avaliação de

potencial antioxidante, os dados podem ser correlacionados, observando-se que apesar

dos extratos de cascas do fruto apresentarem altos teores de fenólicos, a capacidade de

sequestro de radicais ainda é considerada baixa em relação aos frutos como o açaí (421

a 464 mg/100g de frutos) (POMPEU, SILVA & ROGEZ, 2009), o camu-camu (1120 a

1420 mg/100g de frutos) (CHIRINOS, et al., 2010), o muruci (2,90 mg/g de matéria

seca) o ingá (2,40 mg/g de matéria seca) (SOUZA, et al., 2008), a ubaia com (2,60 mg/g

de fruto) (SILVA, et al., 2007), especialmente na parte comestível do fruto. Em

contrapartida, os resultados conseguidos através do FRAP apontam para a capacidade

de redução de ferro dos compostos fenólicos encontrados na polpa do mari-mari.

Segundo Rice-Evans, Miller & Paganga (1997), a atividade de sequestro de flavonoides

está diretamente ligada ao seu potencial de oxidação e dos radicais a serem

sequestrados. Outro fator que tem grande influência sobre a capacidade de sequestro de

112
radicais livres de flavonoides é o numero de hidroxilas, pois quanto mais hidroxilas,

maior a atividade como agente doador de H e de elétrons (CAO, SOFIC & PRIOR,

1997), desta forma, a baixa capacidade de sequestro na flavanona engeletina é

justificada comparada à astilbina.

113
6. CONCLUSÃO

Analisando os resultados de dois diferentes mecanismos de avaliação de

potencial antioxidante (DPPH e FRAP), é possível correlacioná-lo com os valores

determinados nos ensaios de fenólicos totais. Observou-se que a maior concentração de

compostos fenólicos foi encontrada nos extratos de casca do fruto para o mari-mari e

nos extratos de sementes de pitomba e pajurá. Estes extratos também apresentaram

capacidade de sequestro de radicais DPPH assim como capacidade de redução de ferro.

Os extratos de casca do mari-mari apresentaram melhores resultados nos ensaios

antioxidantes do que os extratos de polpa e de semente. As cascas contêm grande

quantidade de engeletina de forma que eleva o teor de fenólicos totais. Porém o alto teor

de engeletina nas amostras resultou na diminuição do potencial antioxidante, pois a

engeletina apresentou baixa capacidade de sequestro de radicais DPPH quando ensaiada

isoladamente.

Entre os extratos de pitomba, o extrato cetônico das sementes apresentou maior

teor de fenólicos totais, maior capacidade de sequestro de radicais DPPH e maior

potencial de redução de ferro. Foram identificados neste extrato os flavonoides

naringenina, luteolina e rutina os quais podem estar relacionados às atividades

antioxidantes ensaiadas. Nos extratos de polpa de pitomba foram identificados

compostos fenólicos como ácido gálico, ácido quínico, ácido p-coumárico, rutina,

catequina, epicatequina, observados em baixa quantidade nos extratos justificando o

baixo teor de fenólicos totais e atividades antioxidantes.

114
 Nos extratos de pajurá os picos apresentados não coincidiram com os padrões, os

quais foram relatados em um estudo prévio como sulfatos de flavonoides identificados

como sulfato de acacetina, sulfato de apigenina e oleurupeína aglicona. Estes compostos

são abundantes nas amêndoas de semente de pajurá justificando o alto teor de

compostos fenólicos e atividade antioxidante comprovada pelos ensaios de DPPH e

FRAP.

Nas amostras do fruto mari-mari foram identificados engeletina, astilbina,

epioritina-(4β→3)-epioritina-4β-ol, um derivado de cafeoil-hexosídeo e ácido cítrico).

A engeletina e astilbina isoladas das cascas do mari-mari foram identificadas

tanto nos extratos de polpa como os extratos de sementes do fruto, porém estes são mais

abundantes nos extratos de cascas.

Em suma, este trabalho corrobora a importância de estudos como este de frutos

nativos da região Amazônica mostrando sua diversidade química e sua capacidade de

fornecer compostos bioativos com potenciais efeitos benéficos à saúde humana.

115
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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123
8. ANEXOS

50

F1 Chemical Shift (ppm)

100

150

200

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
F2 Chemical Shift (ppm)

Mapa de HSQC da substância 1 (engelentina) a 300, 2 MHz e 75,5 MHz..

50

100 F1 Chemical Shift (ppm)

150

200

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
F2 Chemical Shift (ppm)

Mapa de HMBC da substância 1 (engelentina) a 300, 2 MHz e 75,5 MHz..

124
 RITA_MAYANE_ASTILBINA.021.esp

0.15
Normalized Intensity

0.10

18.66
146.80

127.85
167.96
163.09

0.05
146.05

82.43
119.83

72.52
100.94

71.29
116.08
158.76

76.50
130.00

96.95
195.72

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Chemical Shift (ppm)

Espectro de 13C da substância 2 (astilbina) a 75.5 MHz.

0
F1 Chemical Shift (ppm)

10

15

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2
F2 Chemical Shift (ppm)

Mapa de correlação COSY da substância 2 (astilbina) a 300, 2 MHz e 75,5 MHz..

125
 0

F1 Chemical Shift (ppm)

50

100

150

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
F2 Chemical Shift (ppm)

Mapa de correlação HSQC da substância 2 (astilbina) a 300, 2 MHz e 75,5 MHz..

F1 Chemical Shift (ppm)

50

100

150

200

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2
F2 Chemical Shift (ppm)

Mapa de correlação HMBC da substância 2 (astilbina) a 300, 2 MHz e 75,5 MHz.

126