Extração Pitanga

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DBORA NASCIMENTO E SANTOS

Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio
dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.)

Pirassununga
2012

DBORA NASCIMENTO E SANTOS

Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio
dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.)

Verso Corrigida

Dissertao apresentada Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
Universidade de So Paulo, como parte dos
requisitos para a obteno do Ttulo de
Mestre em Cincias.

rea de Concentrao: Cincias da
Engenharia de Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lopes de
Oliveira.

Pirassununga
2012

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao

Servio de Biblioteca e Informao da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
Universidade de So Paulo

Santos, Dbora Nascimento e
S237e Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo
da composio dos extratos de sementes de pitanga
(Eugenia uniflora L.) / Dbora Nascimento e Santos. -
Pirassununga, 2012.
99 f.
Dissertao (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos Universidade de So Paulo.
Departamento de Engenharia de Alimentos.
rea de Concentrao: Cincias da Engenharia de
Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lopes de
Oliveira.

1. Extrao supercrtica 2. Eugenia uniflora L.
3. GC/MS 4. Atividade antioxidante 5. Leishmaniose.
I. Ttulo.

Com todo o amor do mundo e o peito cheio do agradecimento, dedico esse
trabalho aos meus amados pais, Francisco e Helena, que souberam me fazer a
criana mais feliz do mundo e tanto amor se transformou em asas para que
meu voo aqui chegasse, sempre com o apoio de vocs. s minhas irms, Bruna
e Diana, que mesmo longe no fazem ideia da fora que me transmitem e que
me faz persistir. Ao meu amado Fabrcio, que vem mostrando ter a pacincia
de um monge, eu dedico esse e todos os futuros trabalhos. Obrigada meu
amor, por no desistir de mim. De fato, o mais difcil ficar longe de vocs.

AGRADECIMENTOS

Acho maravilhoso olhar pra trs nesses dois anos e pensar que, se pudesse voltar no tempo
e ter a chance de mudar como tudo aconteceu, s tiraria a dor que causei pela ausncia (e
claro, anteciparia todas as bolsas de estudos de todos os meus amigos e a minha!!), apenas
isso. Foram momentos de alegria, pesar, inquietao, e sobretudo MUITO aprendizado, em
todos os sentidos.
Agradeo a Deus por nunca soltar a minha mo e s colocar pessoas maravilhosas na
minha vida, comeando pela minha querida orientadora Prof Dr. Alessandra Lopes de
Oliveira, qual faltam palavras para agradecer tamanho carinho, orientao, confiana e
ateno dispensadas. Foi uma honra ser a sua primeira orientanda de Ps-Graduao,
espero ter correspondido s suas expectativas e tomara que no futuro eu possa repetir com
muitos tudo o que aprendi com voc.
minha famlia, namorido e amigos (Amanda, Csar Henrique, Davison, Frankeline,
Janana, Lucas, Mariana de Morais, Mariana Sfora, Marina, Robson e tantos outros
queridos) da minha amada terra, que durante esse tempo me encheram de coragem e
persistncia.
todos os professores do Departamento de Engenharia de Alimentos da FZEA, obrigada
pelos ensinamentos e orientaes. Um agradecimento especial a Prof. Dr. Eliana Setsuko,
que na ausncia da minha orientadora, me ajudou bastante no incio desta caminhada. Aos
professores Dr. Carlos Augusto Fernandes de Oliveira e Dr. Edson Roberto da Silva, pelo
uso dos seus laboratrios nas anlises de perfil antimicrobiano e inibio da enzima
arginase, respectivamente.
Aos meus queridos amigos e colegas: Adja, Camila, Diane, Eliane, Graziella, Gisele e
Fausto, Josianne, Jlio, Keliani, Maira, Mariana C. e K., Mirelle, Mirian, Naira, Natali, Noemi,
Paola, Paula, Samira, Sarah, Thaise, e Volnei; obrigada pelos momentos de alegria,
descontrao, apoio e torcida. Sei que tudo foi de corao. Essas palavras so tambm
para a maravilhosa equipe do LTAPPN (minha segunda casa), Nilson e estagirios.
Aos queridos tcnicos Guilherme, Keila, Marcelo, Mrcio e Roice, obrigada pelo apoio
tcnico prestado e palavras de amizade.
querida graduanda Larissa Lima de Sousa, por me acompanhar em todo o projeto e pelas
horas de descontrao que tornaram o trabalho menos cansativo. Sua seriedade no trabalho
te levar para longe, assim espero.
CAPES pela concesso da bolsa de estudos e FAPESP pelo financiamento do projeto.

Somos o que pensamos. Tudo o que somos surge com nossos pensamentos.
Com nossos pensamentos, fazemos o nosso mundo.

Buda

RESUMO

Santos, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio
dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.). 2012. 99 f. Dissertao
(Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So
Paulo, Pirassununga, 2012.

A semente de Pitanga resduo do processamento da polpa e suco da fruta e os poucos
trabalhos existentes sobre sua composio denotam grande valor nutricional. A extrao
com fluido supercrtico, pelos benefcios que apresenta, constitui uma excelente ferramenta
para a obteno e estudo de extratos. Assim, os objetivos deste trabalho foram obter
extratos de sementes de Pitanga utilizando CO
2
supercrtico (SC-CO
2
), caracteriz-los e
avaliar possveis atividades biolgicas in vitro. As sementes lavadas, secas e trituradas
foram caracterizadas e apresentaram umidade de 12,73%, granulometria de 0,48mm e
extrato etreo de 0,52%. As sementes foram colocadas em contato com o SC-CO
2
em
diferentes condies de presso (P) e temperatura (T), conforme um Delineamento
Composto Central Rotacional com P e T como variveis independentes. A condio
operacional de rendimento mais elevado foi repetida com etanol como co-solvente (SC-
EtOH). Para todos os extratos determinou-se o perfil de volteis por cromatografia gasosa
com espectrmetro de massas (CG/EM), a concentrao de compostos fenlicos totais
(CFT), a atividade antioxidante pela inativao dos radicais DPPH e ABTS, e a presena de
terpenos por cromatografia em camada delgada (CCD). Nos extratos, obtidos via SC-CO
2
,
Soxhlet e SC-EtOH, alm de sua frao purificada, foram determinadas a concentrao
inibitria mnima (CIM) com S. aureus, E. coli, B. subtilis e P. aeruginosa, e a inibio da
enzima arginase de Leishmania e de rato. O rendimento dos extratos variou de 0,16 a
0,48%, sendo P a nica varivel que influenciou no processo (p<0,05). Na anlise de
superfcie de resposta constatou-se que os melhores rendimentos foram obtidos a altas
presses, indicando que baixas temperaturas podem ser usadas para no degradar as
substncias termossensveis. CFT variaram de 17,95 a 73,89 ppm em cido glico
equivalente (GAE) nos extratos e P e T, no intervalo estudado, no influenciaram (p<0,05)
na concentrao destes compostos. A presena de terpenos com atividade antioxidante foi
detectada preliminarmente, nas anlises de CCD. O perfil de volteis obtidos por CG/EM
indicou como componentes majoritrios os sesquiterpenos -elemeno (12,54-37,76 ppm
equivalente ao limoneno EqLim) e germacrone (8,44-36,41 ppm EqLim), ambos com
reconhecida atividade biolgica. A concentrao destes sesquiterpenos foi influenciada pela
interao entre P e T. A atividade antibacteriana para os quatro extratos foi elevada
apresentando uma CIM de 125 ppm para todos os micro-organismos testados. A inibio da

enzima arginase foi baixa para o extrato supercrtico, Soxhlet e a frao purificada, porm o
extrato SC-EtOH inibiu em at 48% o que indica forte ao contra o desenvolvimento da
Leishmania. Ainda, a inibio da arginase em mamferos tem funo vasodilatadora. O
extrato SC-EtOH possui compostos diferentes dos demais devido modificao da
polaridade pelo co-solvente (EtOH). Esta hiptese tambm constatada pela atividade
antioxidante, que foi menor para os extratos supercrticos que para aqueles obtidos com SC-
EtOH que apresentou maior concentrao em equivalente de Trolox e inibio do radical
DPPH de 94%. Os resultados mostram extratos de semente de Pitanga altamente
promissores para aplicaes contra enfermidades devido ao antimicrobiana e inibitria
da arginase.

Palavras-chave: extrao supercrtica; Eugenia uniflora L.; GC/MS; atividade antioxidante;
leishmaniose.

ABSTRACT

Santos, D. N. Supercritical extraction with carbon dioxide and study of Pitanga seeds
(Eugenia uniflora L.) extracts composition. 2012. 99 f. M.Sc. Dissertation Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So Paulo, Pirassununga, 2012.

The Pitanga seed is a waste of the fruit pulp and juice processing, and the few existing
studies on its composition denote a high nutritional value. Due to its benefits, the supercritical
fluid extraction is an excellent tool to obtain and study extracts. Therefore, the objectives of
this study were to obtain extracts of Pitanga seeds using supercritical CO
2
(SC-CO
2
),
characterize them and evaluate potential biological activities in vitro. The washed, dried and
crushed seeds were characterized and presented 12.73% moisture, particle size of 0.48 mm
and 0.52% ether extract. The seeds were placed in contact with the SC-CO
2
under different
conditions of pressure (P) and temperature (T), according to a Central Composite Design
with P and T as independent variables. The operational condition of higher yield was
repeated with ethanol as co-solvent (SC-EtOH). For all extracts were determined: the profile
of volatiles by gas chromatography with mass spectrometer (CG/ EM), the concentration of
total phenolics compound (CFT), the inactivation of antioxidant activity by DPPH and ABTS
radicals and the presence of terpenes by layer chromatography (CCD). In the extracts
obtained by SC-CO
2
, Soxhlet and SC-EtOH and its purified fraction, the minimum inhibitory
concentration (CIM) with S. aureus, E. coli, B. subtilis and P. aeruginosa were determined,
as well as the inhibition of the enzyme arginase of Leishmania and rat. The yield of extracts
ranged from 0.16 to 0.48%, being P the only variable that influenced the process (p <0.05).
In response surface analysis it was found that the best yields were obtained at high
pressures, indicating that low temperatures can be used not to degrade the thermo-sensitive
substances. CFT ranged from 17.95 to 73.89 ppm gallic acid equivalent (GAE) in extracts
and P and T, over the range studied, did not influence (p <0.05) the concentration of these
compounds. The presence of terpene with antioxidant activity was detected preliminary, in
the analysis of CCD. The volatile profile obtained by CG/ EM indicated the sesquiterpenes as
major components - -elemeno (12.54 to 37.76 equivalent to ppm limonene - EqLim) and
germacrone (8.44 to 36.41 ppm EqLim), both with recognized biological activity. The
concentration of these sesquiterpenes was influenced by the interaction between P and T.
The antibacterial activity for the four extracts presented a high CIM of 125 ppm for all micro-
organisms tested. The inhibition of the enzyme arginase was low for the supercritical extract,
Soxhlet and purified fraction, but the SC-EtOH extract inhibited up to 48% indicating strong
action against the development of Leishmania. Furthermore, the inhibition of arginase in
mammals has a vasodilator function. The SC-EtOH extract possesses different compounds

due to the modification of their polarity with the co-solvent (EtOH). This hypothesis is also
confirmed by the antioxidant activity, which was lower for the supercritical extracts compared
with the extracts obtained with SC-EtOH, with the highest equivalent concentration of Trolox
and DPPH radical inhibition of 94%. The results show that extracts of Pitanga seeds are
highly promising for applications against diseases, due to antimicrobial activity and inhibition
of arginase.

Keywords: Supercritical extraction; Eugenia uniflora L.; GC/ MS; antioxidant activity;
leishmaniasis.

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 - Pitangueira. ......................................................................................................... 27
Figura 2 - Biossntese de compostos terpnicos a partir de isopentil difosfato em tecidos
vegetais. ............................................................................................................................ 31
Figura 3 - Semente de Pitanga seca inteira (A) e triturada (B). ............................................ 41
Figura 4 - Extrao da semente de Pitanga utilizando Soxhlet (A). Detalhe do arraste de
lipdios pelo solvente lquido (B). ........................................................................................ 42
Figura 5 - Sistema de extrao com CO
2
supercrtico do LTAPPN, FZEA/USP (A). Extrato
supercrtico de semente de Pitanga (B). ............................................................................ 44
Figura 6 Curva padro de Limoneno para o clculo da concentrao de sesquiterpenos
expresso em Equivalente de Limoneno (EqLim) dos extratos de semente de Pitanga. ...... 49
Figura 7 - Curva padro de cido glico para determinao quantitativa de compostos
fenlicos totais. .................................................................................................................. 50
Figura 8 - Curva padro que relaciona a concentrao de Trolox com a resposta da inibio
do ABTS+ com leitura feita a 734 nm. .............................................................................. 51
Figura 9 Rendimento das extraes de semente de Pitanga em funo da densidade do
CO
2
supercrtico. ................................................................................................................ 58
Figura 10 - Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas no rendimento de extratos
supercrticos de semente de Pitanga. ................................................................................ 59
Figura 11 - Superfcie de resposta gerada pelo modelo de segunda ordem que mostra os
efeitos das variveis independentes no rendimento da extrao. ...................................... 61
Figura 12 Massa acumulada de extrao em funo do tempo de extrao. ................... 62
Figura 13 Massa acumulada de extrao em funo do volume acumulado de CO
2
. ....... 63
Figura 14 ndice de refrao dos extratos SFE de sementes de Pitanga a 20 e 40C. ..... 64
Figura 15 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel
60 F254 com fase mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo para
a deteco de terpenos. .................................................................................................... 65
Figura 16 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga em Cromatografia de
Camada Delgada, em placa de Slica Gel 60 F
254
com fase mvel tolueno e acetato de etila
(93:7 v:v) e revelador uma soluo 0,05% do radical DPPH. ............................................. 67
Figura 17 - Cromatograma de ons total (total ion chromatography, TIC) dos extratos de
semente de Pitanga (ensaio 1 ao 8, de baixo pra cima), coluna capilar Rtx-5MS; fase
mvel metanol. Detalhe na seo ampliada, em que so evidenciados os principais picos.
.......................................................................................................................................... 69

Figura 18 - Cromatograma de ons total (total ion chromatography, TIC) da frao Soxhlet e
dos extratos supercrticos (ensaios 9, 10 e 11 de baixo para cima) de semente de Pitanga;
coluna capilar Rtx-5MS; fase mvel metanol. Os picos em destaques esto igualmente
mostrados na Figura 17. .................................................................................................... 70
Figura 19 Espectros de massa (EM) dos compostos majoritrios dos extratos de semente
de Pitanga. A: EM do gama-elemeno dos extratos. B: EM do gama-elemeno da biblioteca
NIST. C: EM do furanodieno dos extratos. D: EM do curzereno da biblioteca NIST. E: EM
do germacrone dos extratos. F: EM do germacrone da biblioteca NIST. ............................ 72
Figura 20 - Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na obteno de
germacrone (A) e -elemeno (B) nos extratos supercrticos de semente de Pitanga. ......... 74
efeitos das variveis independentes na concentrao de germacrone (21.A) e -elemeno
(21.B) nos extratos............................................................................................................. 76
Figura 22 - Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na quantidade de
compostos fenlicos dos extratos de semente de Pitanga. ................................................ 77
Figura 23 - Diluio seriada do extrato supercrtico de semente de Pitanga para
determinao da concentrao inibitria mnima. .............................................................. 82

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Comparao de algumas propriedades fsicas do gs, lquido e fluido
supercrtico. ....................................................................................................................... 19
Tabela 2- Propriedades crticas de solventes que podem ser usados na extrao
supercrtica. ....................................................................................................................... 20
Tabela 3- Nveis dos dois fatores, presso e temperatura, no DCCR. ................................. 44
Tabela 4 - Matriz do DCCR de dois fatores incluindo trs pontos centrais para o estudo do
efeito da presso e temperatura nos extratos da semente de Pitanga. .............................. 45
Tabela 5 Diluio e contedo dos tubos de ensaio para determinao da Concentrao
Inibitria Mnima. ............................................................................................................... 53
Tabela 6 - Umidade e extrato etreo da semente de Pitanga seca e triturada. .................... 55
Tabela 7 - Densidade aparente da amostra de semente de Pitanga seca e triturada. ......... 55
Tabela 8 Massa de sementes de Pitanga secas e trituradas retidas nas peneiras usadas
na determinao do dimetro mdio das partculas. .......................................................... 56
Tabela 9 - Matriz do Delineamento Composto Central Rotacional de dois fatores (P e T) com
trs pontos centrais para o estudo do efeito da presso e temperatura no rendimento (R),
concentraes de compostos fenlicos totais (CFT) e volteis dos extratos de semente de
Pitanga. ............................................................................................................................. 57
Tabela 10 - Coeficientes de regresso significativos para modelos linear e quadrtico que
simulam o rendimento dos extratos de semente de Pitanga obtidos com CO
2
supercrtico.
.......................................................................................................................................... 60
Tabela 11 - ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR para o
rendimento (%) dos extratos. ............................................................................................. 60
Tabela 12 ndice de reteno dos compostos revelados pela Cromatografia em Camada
Delgada dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel 60 F
254
com fase
mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo. .................................. 66
Tabela 13 - Composio da frao voltil dos extratos supercrticos da semente de Pitanga
(Eugenia uniflora) obtidos por anlise em GC/MS em coluna Rtx-5MS. .......................... 70
Tabela 14 - Coeficientes de regresso para modelos linear e quadrtico que simulam a
concentrao dos sesquiterpenos (Germacrone e -elemeno) nos extratos de semente de
Pitanga obtidos com CO
2
supercrtico. ............................................................................... 74
Tabela 15 - ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR com dois
fatores para a concentrao de germacrone (ppm EqLim) dos extratos. ........................... 75
fatores para a concentrao de -elemeno (ppm EqLim) dos extratos. .............................. 75

Tabela 17 Atividade antioxidante dos extratos de semente de Pitanga pelo percentual de
inibio do radical DPPH em trs concentraes e pelo mtodo de varredura do radical
ABTS. ................................................................................................................................ 79
Tabela 18 - Concentrao inibitria mnima (ppm) dos diferentes extratos de semente de
Pitanga. ............................................................................................................................. 83
Tabela 19 - Porcentagem (%) da atividade de inibio da arginase isolada de fgado de rato
e da Leishmania ................................................................................................................ 84

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABTS
Acetil-CoA
AI
ASR
CCD
CFT
CG/ EM
CIM
CLAE
CO
2

DCCR
DPPH
EFS
EM
EqLim
ER
ESA
EtOH
FRAP
GAE
GRAS
HMG-CoA
IPP
KI
MeOH
ORAC
P
SC-CO
2
SC-EtOH
SLCC
T
TIC
UFC
Radical 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)
acetil-co-enzima-A
ndice de Van der Dool e Kratz
Anlise de superfcie de resposta
Cromatografia em camada delgada
Compostos fenlicos totais
Cromatografia gasosa com espectrmetro de massas acoplado
Concentrao inibitria mnima
Cromatografia lquida de alta eficincia
Dixido de carbono
Delineamento Composto Central Rotacional
Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
Extrao com fluido supercrtico
Espectro de massa
Equivamente de Limoneno
Equivalente de retinol
Extrao por solvente avanado
Etanol
Capacidade de reduo de ons ferro em plasma
Equivalente de cido glico
Geralmente Reconhecidos como Seguros
3-hidroxi-3-metilglutaril-Co-A
Isopentenil difosfato
ndice de Kovatz
Metanol
Capacidade de absoro de radicais de oxignio
Presso
Dixido de carbono supercrtico
Extrao supercrtica com etanol como co-solvente
Sucos de Laranja Concentrado e Congelado
Temperatura
Total ion chromatography
Unidade formadora de colnias

SUMRIO

1 INTRODUO .................................................................................................................. 16
2 REVISO DA LITERATURA ............................................................................................. 18
2.1 EXTRAO COM FLUIDOS SUPERCRTICOS ...................................................................................... 18
2.1.1 O uso de co-solvente ............................................................................................................ 22
2.1.2 O estudo da cintica de extrao ......................................................................................... 24
2.2 PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.) .................................................................................................... 26
2.3 COMPOSTOS TERPNICOS .............................................................................................................. 29
2.4 ENSAIOS PARA DETECO DE BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE MATRIZES VEGETAIS ......................... 33
2.4.1 Atividade antioxidante ........................................................................................................... 33
2.4.2 Atividade antimicrobiana ....................................................................................................... 35
2.4.3 Inibio da enzima arginase ................................................................................................. 38
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 40
4 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................ 41
4.1 OBTENO E PREPARAO DA SEMENTE DE PITANGA ..................................................................... 41
4.2 CARACTERIZAO DA AMOSTRA ..................................................................................................... 41
4.2.1 Umidade................................................................................................................................ 41
4.2.2 Extrato etreo ....................................................................................................................... 42
4.2.3 Granulometria ....................................................................................................................... 42
4.2.4 Densidade aparente ............................................................................................................. 43
4.3 OBTENO DOS EXTRATOS COM CO
2
SUPERCRTICO ...................................................................... 43
4.3.1 Processo de extrao ........................................................................................................... 43
4.3.2 Delineamento Composto Central Rotacional ....................................................................... 44
4.3.3 Extrao supercrtica com co-solvente (SC-EtOH) .............................................................. 45
4.3.4 Purificao do extrato supercrtico obtido com co-solvente ................................................. 45
4.4.5 Cintica de extrao ............................................................................................................. 46
4.4 CARACTERIZAO DOS EXTRATOS .................................................................................................. 46
4.4.1 ndice de refrao ................................................................................................................. 46
4.4.2 Caracterizao dos extratos em cromatografia em camada delgada (CCD) ....................... 46
4.4.3 Anlise do perfil de volteis por cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de
massas (CG/EM) ........................................................................................................................... 47
4.4.4 Anlise de compostos fenlicos totais (CFT) ....................................................................... 49
4.4.5 Atividade antioxidante pelo mtodo DPPH........................................................................... 50
4.4.6 Atividade antioxidante pelo mtodo ABTS ........................................................................... 51
4.4.7 Determinao da atividade antimicrobiana - concentrao inibitria mnima ...................... 52
4.4.9 Inibio da enzima arginase ................................................................................................. 53
4.5 ANLISE ESTATSTICA..................................................................................................................... 54
5 RESULTADOS E DISCUSSES ...................................................................................... 55

5.1 CARACTERIZAO DA SEMENTE DE PITANGA ................................................................................... 55
5.2 DETERMINAO DE RENDIMENTO GLOBAL ....................................................................................... 56
5.3 DETERMINAO DE CINTICA DE EXTRAO .................................................................................... 61
5.4 CARACTERIZAO DOS EXTRATOS .................................................................................................. 63
5.4.1 ndice de refrao e cromatografia em camada delgada ..................................................... 64
5.4.2 Composio voltil dos extratos ........................................................................................... 67
5.5 ANLISE DA BIOATIVIDADE DO EXTRATO SUPERCRTICO DE SEMENTE DE PITANGA ............................ 77
5.5.1 Quantificao dos compostos fenlicos totais...................................................................... 77
5.5.2 Quantificao da atividade antioxidante ............................................................................... 78
5.5.3 Determinao da atividade antimicrobiana .......................................................................... 81
5.5.4 Determinao da inibio da enzima arginase .................................................................... 83
6 CONCLUSES ................................................................................................................. 85
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................. 86
SANTOS, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.)

16

1 INTRODUO

A Pitanga, uma fruta de crescente importncia no cenrio brasileiro, composta de
polpa e semente, a qual responsvel por 31% do peso total da fruta. A fruta e a polpa so
detentoras de substncias com inmeras propriedades funcionais, visto a sua elevada
concentrao em carotenides. Sendo resduo do processamento da polpa em suco ou
polpa congelada, as sementes atualmente no apresentam nenhuma aplicao industrial. O
estudo da composio dos extratos das sementes e suas atividades biolgicas vo de
encontro s perspectivas da indstria de alimentos, que prezam pelo total aproveitamento
das matrias-primas (SANTOS et al., 2011).
O Brasil tem lugar de destaque na produo de leos essenciais, ao lado da ndia,
China e Indonsia, que so considerados os quatro grandes produtores mundiais. A posio
do Brasil deve-se aos leos essenciais de ctricos, que so subprodutos da indstria de suco
de laranja concentrado e congelado (SLCC). No passado, o pas teve destaque como
exportador de leo essencial de pau-rosa, sassafrs e menta. Nos dois ltimos casos,
passou condio de importador (BIZZO; HOVELL; REZENDE, 2009).
Na obteno de leos essenciais, alm do enfoque dado s matrizes vegetais, como a
semente de Pitanga, por exemplo, a escolha do mtodo de extrao fundamental para a
preservao das suas caractersticas. Dentre os novos mtodos de extrao existentes, o
que utiliza fluido supercrtico tm se tornado foco de estudos, j que este possui vrias
vantagens em relao aos demais mtodos, pelas condies brandas de operao,
ausncia de resduos aps a extrao, dentre outras (SANTOS et al., 2011). Inmeros
trabalhos mostram que a qualidade dos extratos obtidos pela extrao supercrtica so
superiores aos obtidos pelos mtodos convencionais. Porm, quando se remete a
tecnologia supercrtica, sabe-se que o investimento inicial de uma planta industrial possui
custo mais elevado tendo em vista as particularidades de um sistema que opera a alta
presso. Para se chegar a condies otimizadas de operao e baratear o produto final,
crucial o estudo das variveis que interferem no processo, para que se possam obter os
rendimentos mximos, o que se consegue atravs de um planejamento experimental e
anlise de superfcie de resposta das variveis estudadas na operao.
A busca por produtos naturais com propriedades biolgicas e que no ofeream riscos
aos consumidores crescente e tem sido tema de trabalhos de inmeros grupos de
pesquisa. As diversas metodologias existentes para a avaliao e comprovao de
atividades bioativas (antimicrobiano, antioxidante, antineoplsica, antimutagnica, dentre
outras) auxiliam na pesquisa de aplicaes de tais produtos e justificam etapas posteriores,

17

quando necessrias, como a purificao destes produtos naturais ou mesmo a aplicao em
testes in vivo, os quais so bem mais complexos.
Neste trabalho foram obtidos extratos supercrticos de semente de Pitanga, sob
condies pr-estabelecidas de presso e temperatura. Foi realizado o estudo destes
extratos avaliando sua composio voltil, quantidade de compostos fenlicos totais, alm
de ensaios de bioatividade, tais como a antimicrobiana, antioxidante e de inibio da enzima
arginase.


18

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Extrao com Fluidos Supercrticos

Desde os primrdios histricos praticou-se a extrao de substncias a partir de
matrizes vegetais, com fins alimentcios, aromticos e medicamentosos. A finalidade sempre
foi obter um produto mais especfico, puro e padronizado (MAUL; WASICKY; BACCHI,
1986). O fracionamento de misturas naturais complexas para a obteno de compostos
puros ou concentrados de interesse tem sido objeto de pesquisas. Os mtodos tradicionais
de obteno de extratos so destilao a vapor (com ou sem vcuo), extrao por solvente
lquido, cromatografia preparativa, adsoro e processos seletivos por membranas. O uso
da extrao com fluido supercrtico e, em particular com o dixido de carbono supercrtico,
uma alternativa interessante devido s vrias vantagens que apresenta (GAN;
BRIGNOLE, 2011).
Nos ltimos anos, tem havido um interesse crescente na recuperao de compostos
bioativos de fontes naturais para o desenvolvimento de alimentos funcionais. A extrao
com fluido supercrtico (EFS) tem sido reconhecida como um procedimento promissor para
aplicaes em alimentos, na rea farmacutica e cosmtica, pois proporciona maior
seletividade, menores tempos de extrao e no utiliza solventes orgnicos txicos (SERRA
et al., 2010).
O potencial do fluido supercrtico como solvente foi inicialmente estudado na dcada
de 60, por uma equipe de pesquisadores russos em Kniipp, e nos Estados Unidos pelo
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, na Califrnia. Os equipamentos em
pequena e grande escala surgiram no mercado na dcada de 70 e as primeiras plantas em
escala industrial surgiram na dcada de 80 na Alemanha, para a descafeinao de caf e
para a extrao de lpulo. Esta operao, embora ainda no tenha uma aplicao industrial
mundialmente disseminada, tem despertado grande interesse de pesquisas devido s suas
vantagens que refletem na qualidade dos produtos extrados quando comparados com
aqueles extrados por tcnicas convencionais (PENEDO, 2007).
A tecnologia com fluidos supercrticos tem se desenvolvido consideravelmente em um
grande nmero de setores industriais. Fluidos supercrticos so empregados para extrao
de vrias substncias tais como a cafena do caf, nicotina do tabaco, leos de alimentos,
em corantes de tecidos fabris ou como fase mvel em cromatografia de fluidos supercrticos
(MARSAL et al., 2000).

19

O fluido quando submetido presso e temperatura acima de seu ponto crtico torna-
se supercrtico. Vrias propriedades dos fluidos so alteradas sob essas condies,
tornando-se parecidas com as de alguns gases e lquidos. A densidade do fluido supercrtico
similar dos lquidos, sua viscosidade assemelha-se dos gases e sua capacidade de
difuso intermediria entre os dois estados. Portanto, o estado supercrtico de fluidos pode
ser definido como o estado no qual lquido e gs so indistinguveis entre si. Devido sua
baixa viscosidade e alta capacidade de difuso (Tabela 1), os fluidos supercrticos
apresentam propriedades de transporte melhores que os lquidos, permitindo que as taxas
de extrao aumentem. Podem se difundir facilmente atravs de materiais slidos,
resultando em melhores rendimentos nas extraes (ANDREO; JORGE, 2006; BERNA et al.
2000).

Tabela 1 - Comparao de algumas propriedades fsicas do gs, lquido e fluido
supercrtico.
Propriedades fsicas
Gs
(1atm, 15 30C)
Fluido supercrtico
Lquido
15 30C T
C
, P
C
T
C
, 4P
C

Coeficiente de difuso (cm.s
-1
) 0,1-0,4 0,7 x 10
-3
0,2 x 10
-3
(0,2-2) x 10
-5

Viscosidade (g.cm
-1
.s
-1
) (1-3) x 10
-4
(1-3) x 10
-4
(3-9) x 10
-4
(0,2-3) x 10
-2

Densidade (g.L-
1
) (0,6-2) x 10
-3
0,2-0,5 0,4-0,9 0,6-1,6
autodifuso para gs e gs denso; mistura binria para lquido.
FONTE: TZIA; LIADAKIS, 2003.

Alguns fluidos tm sido examinados como solventes em estado supercrtico. Por
exemplo, hidrocarbonetos como hexano, pentano e butano, xido nitroso, hexafluoreto de
enxofre e hidrocarbonetos fluorados. Entre estes, o dixido de carbono (CO
2
) o mais
popular solvente supercrtico porque ele seguro, facilmente disponvel e tem um baixo
custo (REVERCHON; DE MARCO, 2006). Na anlise dos valores de presso e temperatura
crtica de diferentes solventes (Tabela 2) nota-se que existem substncias que possuem
condies muito brandas de operao, como o etano, etileno e clorotrifluormetano. Porm,
desvantagens como ser reativo, caro, pouco disponvel e deixar resduos aps o processo,
fizeram do dixido de carbono a opo melhor empregvel.
O uso da extrao com dixido de carbono supercrtico (SC-CO
2
) como solvente tem
um interesse crescente para a recuperao de compostos benficos sade, sendo por
isso, adequado para aplicao nas indstrias alimentcia e farmacutica. Dixido de carbono
um solvente ideal para a extrao de produtos naturais, porque de baixa toxicidade, no
explosivo, prontamente disponvel e fcil de remover a partir de produtos extrados. Por
fazer parte de um mtodo de extrao livre de solventes orgnicos, o uso do CO
2


20

favorvel ao meio ambiente e, alm disso, por possuir uma temperatura crtica de 31C
oferece a possibilidade de recuperar com o mnimo de danos possveis os compostos
naturais termossensveis, preservando suas propriedades bioativas. A desvantagem do
dixido de carbono supercrtico que os compostos polares muitas vezes so difceis de
extrair. Essa dificuldade pode ser facilmente resolvida usando pequenas quantidades de
modificadores orgnicos ou co-solventes (DANH et al., 2009; LAROZE et al., 2010; SALGIN,
2007).

Tabela 2 - Propriedades crticas de solventes que podem ser usados na extrao
supercrtica.
Solvente Temperatura Crtica (C) Presso Crtica (bar)
Dixido de carbono 31,10 73,76
Etano 32,30 48,84
Etanol 240,75 61,40
Etileno 9,30 50,36
Propano 96,70 42,45
Propileno 91,90 46,20
Ciclohexano 280,30 40,73
Benzeno 289,00 48,94
Tolueno 318,60 41,14
Clorotrifluormetano 28,90 39,21
Triclorofluormetano 198,10 44,70
Amnia 132,50 112,77
gua 374,20 220,48
FONTE: DIEHL, 2008.

Um empecilho propagao industrial desta tecnologia reporta-se ao custo inicial de
montagem da planta de operao. O equipamento que opera alta presso mais caro que
aqueles dos processos de separao convencionais, contudo, conforme Goodarznia e
Eikani (1998), o custo de funcionamento geralmente inferior, e isto faz com que o custo
total sejam comparveis quando o processo for conduzido em condies otimizadas e com
volume de extrao adequado.
Para possveis aplicaes industriais, a otimizao e avaliao do processo de
extrao com modelagem matemtica so fundamentais. Em mtodos clssicos, os
parmetros de processo so otimizados atravs da realizao de experimentos
concentrando-se em um fator de cada vez, o que mais trabalhoso e demorado, e tambm
ignora o efeito da interao entre os parmetros do processo. Comparado aos mtodos

21

clssicos, a metodologia de superfcie de resposta (ASR) mais eficiente pois, requer
menos dados e fornece os efeitos da interao entre as variveis na resposta. Por isso, tem
sido amplamente aplicada para aperfeioar os parmetros de processamento na produo
de alimentos e medicamentos, por exemplo (XIA et al., 2011).
Sobrepujando a dificuldade de custos e operando em condies de altos rendimentos,
o produto extrado atravs desta tecnologia de boa qualidade e pouco necessita de
operaes de refino posteriores. Portanto, os extratos obtidos via extrao com CO
2

supercrtico so geralmente reconhecidos como seguro (Generally Recognised as Safe -
GRAS) para ser usado na produo de alimentos. A tecnologia de extrao com SC-CO
2

tem sido aplicada na extrao de leos a partir de um grande nmero de materiais e seus
extratos tm demonstrado um alto potencial para futuras aplicaes em frmacos e
alimentos (ZHANG et al., 2010).
No processo de extrao, vrios fatores interferem no rendimento final, como o tipo de
matriz envolvida, por exemplo. Estudos comparativos de diferentes procedimentos de
secagem das matrizes vegetais mostraram que o melhor rendimento do soluto em estudo
obtido a partir da biomassa seca naturalmente (exposio ao ar), enquanto que o material
seco em estufa fornece menor rendimento. Anlises de microscopia eletrnica de varredura
mostraram que a amostra seca em estufa tem uma pelcula superficial slida que contrasta
com a superfcie porosa das matrizes secas ao ar (MOLYNEUX; COLEGATE, 2008).
Outro fator que influencia no rendimento da extrao o tamanho das partculas da
matriz vegetal. Como uma tendncia geral, a diminuio do tamanho das partculas gera um
aumento do rendimento de extrao. O menor tamanho de partcula facilita o acesso do
solvente de extrao at o soluto, reduzindo as limitaes de transferncia de massa. A
reduo das partculas , provavelmente, associada a uma quebra mais intensa da parede
celular e o rompimento da parede celular facilita a difuso do soluto (LAROZE et al., 2010).
Por exemplo, os leos so armazenados dentro de vesculas celulares. Aps a moagem,
estas vesculas podem ser danificadas levando a uma liberao mais rpida dos leos.
Assim, quanto mais as vesculas so danificadas, mais acessvel o soluto fica para o dixido
de carbono supercrtico, levando a um maior rendimento de extrao (MHEMDI et al., 2001).
A quantidade de gua disponvel presente no substrato tambm pode condicionar o
rendimento final do processo de extrao. Sahena et al. (2009) reportam que o alto teor de
umidade reduz o contato da matriz com o SC-CO
2
, devido consistncia pastosa que a
amostra apresenta, e nesses casos a umidade atua como uma barreira para a difuso da
SC-CO
2
na amostra, assim como para a difuso de lpidos para fora desta. O aumento da
recuperao lipdica com a diminuio do contedo de umidade tem sido demonstrada em
amostras midas tais como a carne e de peixe, embora a umidade no afeta a

22

extratabilidade destes a nveis baixos. Assim, amostras com alto teor de umidade so
geralmente liofilizadas antes da extrao com SC-CO
2
para melhorar a sua eficincia.
Ainda na reduo de partculas, a utilizao do CO
2
como agente de extruso pode
anteceder a prpria operao de extrao. Alguns autores propuseram um pr-tratamento
original para a extrao do leo de sementes que consistiu de uma rpida despressurizao
do sistema contendo a matriz vegetal e o CO
2
pressurizado no sentido de quebrar as clulas
das sementes. Foi mostrado que a despressurizao em poucos segundos a partir de
20MPa e 35C em condies atmosfricas aumentou a quantidade de leo recuperado na
extrao (BOUTIN; BADENS, 2009).
Outra aplicao que vem ganhando espao o processo de tingimento com CO
2

supercrtico. Esta tecnologia limpa se tornou uma alternativa vivel para o tingimento
convencional de tecidos, o qual utiliza quantidades excessivas de gua. As vantagens do
CO
2
supercrtico neste processo referem-se ao fato de poder ser reciclado, ser barato,
essencialmente no-txico, no inflamvel e ter fcil acesso s condies crticas. Alm
destas vantagens comuns a todas as suas aplicaes neste processo, os restos de corante
dissolvido no fluido supercrtico podem ser recuperados quando o fluido expandido.
Estudos mostram o sucesso desta tcnica no tingimento de polmeros (poli tereftalato de
etileno e polipropileno) e fibras naturais (algodo e l). Neste sentido, pesquisas seguem
estudando as condies operacionais que favorecem uma melhor solubilidade dos corantes
no fluido supercrtico, aperfeioando o processo (CABRAL et al., 2007).
Demonstrando algumas das aplicaes essenciais do CO
2
supercrtico em diferentes e
relevantes processos, vale revisar quelas que correlacionam o emprego de co-solventes ou
modificadores nos processos de extrao, mesmo porque tambm enfoque deste trabalho.

2.1.1 O uso de co-solvente

O uso de co-solventes em extrao com fluido supercrtico (pequenas quantidades de
solventes orgnicos combinados com CO
2
supercrtico) tem sido empregado para melhorar
a eficincia da extrao, aumentando a produtividade e modificando a seletividade do
processo. O co-solvente pode alterar algumas caractersticas da mistura de solventes (CO
2

e co-solvente), tais como polaridade e interaes especficas com o soluto, formando pontes
de hidrognio ou interagindo com stios ativos da matriz slida (DALMOLIN et al., 2010).
Propano/butano, metanol, etanol e outras substncias podem ser usadas como co-
solventes (POKORNY; YANISHLIEVA; GORDON, 2001). Alguns autores estudaram o uso
de etanol (EtOH) como co-solvente para obter extratos supercrticos e observaram que a
solubilidade do extrato aumentou com o aumento da concentrao deste co-solvente

23

(DALMOLIN et al., 2010). A presena de etanol afeta positivamente a extrao de polifenis.
Este fato est relacionado com as interaes covalentes (ligaes de hidrognio) e dipolo-
dipolo que aumentam a solubilidade de compostos fenlicos. Outros autores j mostraram
que a solubilidade de polifenis em (SC-CO
2
+ etanol) depende da polaridade final adquirida
pelo sistema de extrao (SERRA et al., 2010).
Os resultados do rendimento de extratos constituintes de compostos fenlicos na
extrao com fluido supercrtico aumentam diretamente com a polaridade do solvente. O
uso de etanol como co-solvente demonstrou-se particularmente vivel para melhorar o
rendimento desta frao fenlica. A uma temperatura constante, o aumento da presso
aumentou o rendimento devido ao aumento da densidade, j para uma presso constante, o
rendimento total e da frao fenlica decresceu quando a temperatura aumentou devido
reduo da densidade do solvente (GARCIA-SALAS et al., 2010).
Trabalhos de pesquisa que indicam a influncia de etanol como co-solvente
receberam especial ateno j que estes resultados serviram como parmetros indicativos
de procedimentos adaptados neste trabalho. Somado a isso, o EtOH foi escolhido como co-
solvente tambm por ser GRAS e por ser o Brasil um dos maiores produtores. Fatores como
este tambm devem ser considerados no estudo de processo.
Em estudo proposto por Sun e Temelli (2006) para a extrao de carotenides, foi
utilizado leo de canola como co-solvente, por possuir alta solubilidade em SC-CO
2
se
comparada ao -caroteno. Alm disso, leos vegetais constituem bons solventes para
carotenos. Nesta pesquisa, o rendimento de e -caroteno aumentou em duas vezes e o de
lutena aumentou cerca de quatro vezes com a incorporao de leo de canola como co-
solvente no processo de extrao.
Na pesquisa realizada por Vasapollo et al. (2004), foi utilizado leo de avel como co-
solvente da extrao de licopeno de tomates. As justificativas para a escolha do leo foram
baixo custo e sua baixa acidez que evita degradao do carotenide durante a extrao,
alm de reproduzir os mais altos rendimentos dentre os demais testados (amendoim,
amndoa e girassol). Os ndices de extrao de licopeno em condies otimizadas e na
presena de co-solvente chegaram a 60% sob a frao total extravel. Em outro trabalho
semelhante, foi verificado que a presena de leos vegetais como co-solvente aumentaram
o rendimento de extrao e contribuiram para a estabilidade do licopeno (YI et al., 2010).
O uso de co-solventes em condies especiais tambm tem sido proposto para
melhorar a solubilidade de diferentes solutos e/ou para aumentar a seletividade de extrao.
Um exemplo a aplicao de extrao por solvente avanado (ESA). Esta tcnica envolve o
uso de CO
2
, gua e/ ou solventes orgnicos a temperaturas e presses elevadas, de 40 a
200C, e de 3,3 a 20,3 MPa. Esta tcnica tem sido aplicada com sucesso na extrao de
solutos polares, incluindo as antocianinas do bagao de sabugueiro (SERRA et al., 2010).

24

Assim como o emprego de co-solvente na modificao da polaridade do CO
2

supercrtico e consequente modificao da solubilidade e seletividade do soluto, no h
como desenvolver estudos de extrao sem acompanhar o comportamento da cintica de
extraes. A cintica aponta a influncia do equipamento e condies operacionais na
extrao e caracteriza o processo especificamente para a matriz vegetal em estudo.

2.1.2 O estudo da cintica de extrao

O estudo das curvas de extrao supercrtica e o conhecimento dos efeitos das
variveis operacionais permitem a definio do volume do extrator e vazo de solvente.
Segundo a literatura, as curvas de extrao so claramente divididas em trs perodos,
controlados por diferentes mecanismos de transferncia de massa (MEZZOMO; MARTNEZ;
FERREIRA, 2009; PIANTINO et al., 2008):

(a) A curva inicia-se com o perodo de taxa de extrao constante: nesta fase a
superfcie externa das partculas coberta com soluto (de fcil acesso) e a
conveco o mecanismo de transferncia de massa dominante;
(b) No segundo perodo ocorre a taxa de extrao Falling, nesta etapa as falhas
do soluto na camada externa da superfcie da matriz aparecem e ento
inicia-se o mecanismo de difuso, fenmeno que atua combinado com a
conveco;
(c) Finalmente, ocorre o perodo de difuso controlada, onde a camada de
soluto na superfcie externa praticamente desapareceu e a transferncia de
massa ocorre principalmente por difuso do interior das partculas da matriz
slida.

O objetivo principal da modelagem das curvas de cinticas de extrao com fluido
supercrtico definir parmetros para desenho de processos, como as dimenses do
equipamento a ser projetado, fluxo do solvente e tamanho de partcula da matriz. Esses
parmetros so usados para predizer a curva total de extrao e dessa forma estimar a
viabilidade de processo em escala industrial. Vrios modelos matemticos so apresentados
na literatura para descrever a extrao com fluido supercrtico. Um modelo deve ser um
instrumento matemtico que reflete o comportamento fsico da estrutura slida e as
observaes experimentais. Desta forma, poder ser usado como uma ferramenta de
simulao para as curvas de cintica de EFS e depois, para aplicaes industriais desta
tecnologia (MEZZOMO; MARTNEZ; FERREIRA, 2009).

25

Os principais parmetros da EFS so a vazo do solvente, o tamanho da partcula do
slido e a durao do processo de extrao. Outros fatores determinantes do processo so
o poder de solubilizao e a seletividade do solvente com relao aos componentes de
interesse e a capacidade de difuso destes no fludo (BRUM, 2010).
Zizovic et al. (2007) discutem em sua reviso bibliogrfica que o modelo matemtico
amplamente utilizado no estudo de processo foi introduzido por Sovov. O pressuposto
bsico deste modelo que parte das clulas, unidades contendo hipoteticamente o soluto
so abertas pela moagem. O soluto facilmente acessvel a partir destas clulas trituradas
extrado primeiro, e a frao mais protegida pelas paredes celulares segue sendo extrada
mais lentamente. As vantagens deste modelo que ele pode ser aplicado em qualquer tipo
de matriz vegetal contendo diferentes tipos de solutos, lipdios ou leos essenciais, por
exemplo. A contribuio significativa para a modelagem da extrao supercrtica de leo
essencial foi dada por Reverchon, Donsi e Sesti (1993), que introduziram modelos baseados
no balano de massa diferencial no vaso extrator, fazendo analogia transferncia de calor.
Operaes de extrao supercrtica de leos essenciais foram modeladas e preditas em
macro-escala por muitos autores, e os resultados experimentais foram ajustados e descritos
em modelos posteriormente propostos. Mais recentemente, Sovov (2005) introduziu um
novo modelo para a extrao supercrtica de produtos naturais, o qual tambm se baseia no
conceito de clulas intactas e trituradas e com dois perodos de extrao, o primeiro regido
pelo equilbrio de fases e o segundo governado por difuso interna nas partculas.
Na extrao de leo de sementes peletizadas ou esmagadas, diz-se que a cintica de
extrao dividida em duas principais etapas. O leo livre extrado inicialmente a partir da
superfcie das partculas de semente a uma taxa constante que parcialmente determinada
por mecanismos de transferncia externa de massa. Na segunda etapa, quando o leo livre
na superfcie da partcula se esgota, a taxa de extrao determinada por mecanismos de
transferncia de massa interna do leo aprisionado nas clulas (del VALLE et al., 2004).
A modelagem matemtica da extrao com fluido supercrtico de solutos com alto
valor agregado a partir de matrizes vegetais, tais como ervas, sementes, folhas ou casca
dificultada pela existncia de estruturas diferenciadas para cada material. Antes da extrao,
o material geralmente modo para aumentar a superfcie em contato com o solvente SC-
CO
2
e tambm aumentar a acessibilidade do soluto aprisionado nas estruturas celulares e
com isso fornecer a cintica de transferncia de massa que tambm influenciada pela
forma das partculas. Na modelagem, normalmente empregam-se formas geomtricas
bsicas (cilindro, placa ou esfera). Para reduzir a complexidade do modelo, tambm
necessrio fazer suposies simplificadas sobre como o soluto distribudo dentro da matriz
slida que pode estar adsorvido na rede de poros, aprisionado dentro de estruturas
celulares ou distribudo de forma homognea dentro das partculas. As resistncias

26

envolvidas nos mecanismos de transferncia de massa tambm devem ser consideradas
como a resistncia de transferncia interna de massa, resistncia de transferncia externa
de massa ou uma combinao de vrias resistncias (OLIVEIRA; SILVESTRE; SILVA,
2011).

2.2 Pitanga (Eugenia uniflora L.)

A Pitanga, fruto da pitangueira (Eugenia uniflora L.) pertence famlia botnica das
Myrtaceae. uma planta frutfera nativa do Brasil, mas encontrada tambm no Norte da
Argentina e Uruguai. Apesar de constituir um cultivo tradicional das regies Sul e Sudeste
do Brasil, nos ltimos anos a regio Nordeste iniciou um cultivo mais tecnificado para
explorao comercial desta fruta de alto potencial econmico. A pitangueira (Figura 1)
frutifica de outubro a janeiro, sendo que a principal forma de comercializao a polpa
congelada (EMBRAPA, 2006). No que concerne produo e comercializao da fruta, no
se dispe de dados oficiais, tanto no Brasil quanto no mundo, no entanto estima-se que o
Brasil seja o maior produtor mundial. Os maiores plantios esto localizados no Estado de
Pernambuco, onde a regio possui cerca de 300 ha cultivados (BEZERRA et al., 2004;
SANTOS et al., 2002).
O fruto uma baga globosa, com sete a dez sulcos longitudinais de 1,5 a 5,0 cm de
dimetro e coroado com spalas persistentes, possuindo um aroma caracterstico intenso e
sabor doce e cido. No processo de maturao, o epicarpo passa de verde para amarelo,
alaranjado, vermelho, vermelho-escuro, podendo chegar at quase negro. No Brasil no se
conhecem variedades perfeitamente definidas de pitangueiras e em Pernambuco, comum
encontrar pitanga de colorao variando de alaranjada a avermelhada (LIMA; MLO; LIMA,
2002).
O valor nutricional da Pitanga relevante, j que ela apresenta elevado teor em
carotenides (225,9 mg.g
-1
) com valor de pr-vitamina A de 991 ER.100 g
-1
e teor de
vitamina C de 29,4 mg.100mg
-1
, podendo contribuir para o requerimento dirio destas
vitaminas na alimentao (MLO; LIMA; NASCIMENTO, 1999). Alm disso, a Pitanga
contm grandes quantidades de clcio, fsforo e antocianinas (SILVA, 2006). Devido ao seu
sabor altamente particular e seu contedo de carotenides, o cultivo da cereja brasileira,
como tambm chamada, tem-se demonstrado promissor aos programas de explorao
sustentvel na Mata Atlntica brasileira, um dos pontos de Conservao Internacional da
Biodiversidade do Cerrado. Esta ateno dada Pitanga nestes programas de explorao
sustentvel se deve ao fato da Mata Atlntica ser uma rea caracterizada pela baixa

27
atividade econmica e pela Pitanga ser cultivada, em sua grande maioria, em pomares
domsticos ou como atividade agrcola de pequena escala, ou ainda colhidas selvagemente
(CELLI; PEREIRA-NETTO; BETA, 2011).

Figura 1 - Pitangueira.

A polpa congelada da Pitanga tem elevado contedo de compostos fenlicos, os quais
so conhecidos pela sua atividade antioxidante. Dentro do grupo dos carotenides, no
estudo realizado por Filho et al. (2008), foram encontrados no extrato supercrtico da polpa
de Pitanga os seguintes compostos: All-trans-lutena, All-trans-zeaxantina, All-trans-
rubixantina, cis-rubixantina I, cis-rubixantina II, All-trans--criptoxantina, All-trans-licopeno,
13-cis-licopeno, All-trans--caroteno, All-trans--caroteno, (all-trans+9-cis)--caroteno e (13-
cis+15-cis)--caroteno. A respeito dos compostos fenlicos, a frao aquosa de frutos de
Pitanga contm antocianinas antioxidantes (BAGETTI et al., 2009).
O emprego das folhas de Eugenia uniflora L., cuja infuso tem sido utilizada na
medicina popular como anti-hipertensiva e antireumtica, bem conhecido no Brasil. As
folhas e frutos so empregados na medicina popular em vrias regies do pas, por serem
considerados excitantes, febrfugos, aromticos e antidisentricos. O extrato alcolico
utilizado em bronquites, tosses, febres, ansiedade e verminoses (AURICCHIO et al., 2007).
O extrato hidroalcolico das folhas diminuiu os nveis da enzima xantina oxidase,
supostamente envolvida no desencadeamento da gota, alm de ter apresentado
caractersticas de vaso-relaxante, antioxidante, antidiarrico, hipotrigliceridmico,
hipoglicmicos e propriedade bactericida, este ltimo tambm observado no leo essencial
(AMORIM et al., 2009). Ogunwande et al. (2005) demonstram efeitos como abaixamento

28

dos nveis de glicose sangunea e, diurtico, antifebril, anti-inflamatrio e contra doenas
estomacais.
H uma gama de fitoqumicos j identificados nas folhas da Pitanga, so eles os
compostos fenlicos da famlia dos flavonides como o miricitrina, quercetina e seus
derivados como a quercitrina 3-l-ramnosdeos, terpenides como monoterpenos, triterpenos,
sesquiterpenos, taninos hidrolisados como o eugeniflorina D1 e o eugeniflorina D2
(EMBRAPA, 2006). Em estudo com as cascas da rvore da Pitanga, realizado por Brandelli
et al. (2009), observou-se que essa tem a capacidade de inativar trofozotos de Giardia
lamblia (um dos mais comuns parasitas intestinais), com uma concentrao mnima inibitria
de 0,313 mg.mL
-1
de extratos. Alguns taninos hidrolisados presentes no extrato da folha
inibem o vrus Epstein-Barr, conhecido por estar intimamente associado ao carcinoma naso-
farngeo (LEE et al., 2000).
Um trabalho pioneiro realizado por Oliveira et al. (2006) mostra que o fruto da
pitangueira possui monoterpenos como componentes volteis majoritrios, sendo trans--
ocimeno, cis-ocimeno, -ocimeno e -pineno em sua composio e o fato do suco da
Pitanga ser usado na medicina popular brasileira contra diarreia, reumatismo, febre e
diabetes, pode estar relacionado ao fato do fruto possuir compostos volteis semelhantes
queles presentes nas folhas, cuja bioatividade tem sido comprovada cientificamente.
Considerando esta particularidade do fruto, o mesmo grupo de pesquisa estudou a
otimizao do processo de obteno de extratos de pitanga pelo emprego de CO
2

supercrtico (MALAMAN et al., 2011). Anlises sensoriais revelaram que os extratos ricos
em compostos volteis, principalmente os -damascenone, 5,6,7,7a-tetraidro-4-4-7a-trimetil-
2(4H)-benzofuranone, germacrene B, espatulenol, selina-1,3,7(11)-trien-8-one, 10-(1-
metiletenil)-(E, E)-3,7-ciclodecadien-1-one, farnesil acetone e 2-etil-2-metil-tridecanol
contriburam para a percepo da maior intensidade do aroma caracterstico da fruta, os
quais tambm esto presentes nas folhas como revelado pela literatura (PINO et al., 2003).
Neste estudo, a otimizao do processo revelou que as melhores condies de extrao
supercrtica foram aquelas que empregavam 200 bar e 50C.
Segundo Ogunwande et al. (2005) e Costa et al. (2009) o leo essencial da folha e do
fruto de Pitanga contm sesquiterpenos oxigenados dentre estes os principais so
isofurano-germacreno, germacreno B e germacrone. Componentes do leo essencial de
folhas de Pitanga foram identificados por CG/EM, o seu aroma foi classificado como
semelhante a "cogumelo", "madeira" e "especiarias", devido presena de furanodieno e
notas de "ervas daninhas" e "pepino", devido a presena de selinatrienone (selina-1, 3,7
(11)- trien-8-one), o componente em maior concentrao, recentemente sintetizado. Muitos
compostos volteis das folhas de Pitanga tambm so evidenciados no fruto, incluindo
selina-1, 3 , 7 (11)- trien-8-one. (OLIVEIRA; KAMIMURA; RABI, 2009).

29

Com relao a sua semente, existem poucos trabalhos que relatam a sua composio.
Bagetti e colaboradores (2009) avaliaram a composio nutricional e a atividade
antioxidante destas sementes e os resultados revelaram os carboidratos como a classe mais
abundante, compostos principalmente de fibras insolveis. A frao protica muito
reduzida e dentre os cidos graxos presentes, 45 a 47% destes so polinsaturados,
desejveis dieta humana por exercer efeito sobre a reduo da incidncia de doenas
cardiovasculares. Em outro estudo com semente de Pitanga realizado por Luzia, Bertanha e
Jorge (2010), foi obtido extrato etanlico das sementes para investigar seu potencial
antioxidante. A concentrao do extrato que alcanou uma atividade antioxidante de 50% foi
de 30,72 ppm. A concentrao de compostos fenlicos presentes nos extratos etanlicos de
semente de Pitanga tambm elevada, de 75,64mg.g
-1
extrato.
Segundo Andrade et al. (2009), a semente de Pitanga ainda possui uma protena, a
lectina, que exibe uma notvel atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella sp. com uma concentrao inibitria mnima de 1,5
g.mL
-1
, e moderadamente inibe o crescimento de Bacillus subtilis, Streptococcus sp. e
Escherichia coli com uma concentrao mnima inibitria de 16,5 g.mL
-1
.
Considerando a informao escassa da composio das sementes de Pitanga, a sua
possvel aplicao industrial, visto ao fato de ser resduo do processamento do fruto, o
histrico deste grupo de pesquisa na investigao da composio dos extratos supercrticos
das folhas e do fruto da Pitangueira e as informaes bibliogrficas que revelam sua alta
atividade antioxidante e antimicrobiana geraram o estmulo para o desenvolvimento deste
trabalho.

2.3 Compostos Terpnicos

Os leos volteis de plantas so conhecidos e utilizados desde a antiguidade por suas
propriedades biolgicas, especialmente antibacteriana, antifngica e antioxidante (SOUZA et
al., 2007). leos essenciais, tambm denominados leos volteis, geralmente extrados por
destilao das plantas, so lquidos hidrofbicos contendo compostos aromticos volteis.
Os leos essenciais so amplamente utilizados em perfumes, cosmticos, bem como em
alimentos e bebidas como aditivos de flavor. Alguns leos essenciais mostram vrias
atividades farmacolgicas e so considerados as fraes ativas mais importantes de
medicamentos fitoterpicos (DANG et al., 2010).
leos essenciais, com ou sem resinas e gomas so encontrados em estruturas
secretoras especializadas situadas dentro dos tecidos vegetais ou na superfcie da planta
(tricomas). O tipo de estrutura secretora especfico para a famlia ou espcie vegetal. O

30

processo de isolamento do leo essencial quer por extrao ou destilao, deve ser
dependente da forma como o leo est armazenado na estrutura vegetal e do tipo de
estrutura secretora. Estruturas secretoras no tecido da planta podem ser clulas secretoras,
cavidades secretoras ou canais secretores. Uma cavidade secretora normal em vegetais
so os dutos, os quais se alongam na forma de uma rede se estendendo desde as razes
atravs do caule at as folhas, flores e frutos (ZIZOVIC et al., 2007).
De acordo com a sua disposio na matriz vegetal, os leos essenciais so
classificados como leos superficiais ou subcutneos. O primeiro secretado pelas
glndulas superficiais, e o subcutneo secretado bem abaixo da superfcie externa do
material vegetal, como pela casca de rvores, entre as fissuras da madeira, nas flores secas
e brotos, nas sementes, razes e frutos (ARAUS; URIQUE; del VALLE, 2009). Os leos
essenciais tm uma composio complexa, contendo de algumas dezenas a centenas de
constituintes, especialmente hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos) e compostos
oxigenados (lcoois, aldedos, cetonas, cidos, fenis, xidos, lactonas, teres e steres).
Ambos os hidrocarbonetos e compostos oxigenados so responsveis pelos odores e
sabores caractersticos. O aroma de um leo o resultado da combinao dos aromas de
todos os seus componentes (POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGHI, 2007).
Terpenos podem ser originados tanto do metabolismo de carboidratos quanto de
lipdios e so classificados pelo nmero de unidades de isopreno que contm.
Monoterpenos contm duas unidades de isopreno (10 carbonos), sesquiterpenos contm
trs unidades de isopreno (15 carbonos) e diterpenos contm quatro unidades de isopreno
(20 carbonos). Desses grupos, os monoterpenos, e mais especificamente, os monoterpenos
oxigenados, so considerados os mais importantes na constituio do aroma de certas
frutas, como por exemplo, as ctricas. Limoneno, um hidrocarboneto monoterpnico que
possui um odor suave, o principal terpeno na maioria dos leos ctricos representando at
95%. Os terpenos oxigenados, muitas vezes, compreendendo menos de 5% do leo,
geralmente fornecem o sabor caracterstico de espcies ctricas diferentes. Por exemplo,
citral considerado o componente de impacto no sabor que caracteriza o leo de limo,
mas raro encontrar mais de 2% de citral neste leo essencial (REINECCIUS, 2006).
A via biossinttica proposta para a sntese de isopentenil difosfato (IPP) combina trs
molculas de acetil-co-enzima-A (acetil-CoA) para formar molculas de 3-hidroxi-3-
metilglutaril-Co-A (HMG-CoA) que por sua vez, so reduzidos a cido mevalnico e depois
fosforilados e descarboxilados para formar o IPP, o elemento chave na sntese natural dos
terpenos. Sabe-se que o IPP tambm pode ser formado atravs de uma via que no inclui o
cido mevalnico, mas ainda faltam evidncias para amparar a existncia desta alternativa.
A prxima etapa desta sntese envolve a combinao de unidades de IPP para formar
geranil difosfato, farnesil difosfato e geranil-geranil difosfato, que servem como precursores

31

das famlias mono-, sesqui- e diterpenos, respectivamente (Figura 2). Os demais membros
dessas famlias surgem a partir da ciclizao secundria ou modificao destes trs
precursores (REINECCIUS, 2006).

Figura 2 - Biossntese de compostos terpnicos a partir de isopentil difosfato em tecidos
vegetais.
Adaptado de REINECCIUS, 2006.

Sesquiterpenos so uma das classes estruturalmente mais diversificadas de produtos
naturais isolados de plantas, fungos, bactrias e invertebrados marinhos. Nas plantas eles
podem atuar contra parasitas, como predadores, ou para atrair polinizadores. Todas as
dezenas de milhares de sesquiterpenos conhecidos presentemente so derivados a partir
2x
1x
OPP
Tetraterpenos Fitoeno
Dipertenos
Geranilgeranil
difosfato
Poliprenis
Politerpenos
2x
CH
2
OPP
Isopentenil
difosfato
CH
2
OPP
Dimetilalil
difosfato
Hemiterpenos
3x
Sesquiterpenos
Esqualeno Triterpenos
2x
OPP
Farnesil difosfato
OPP
Geranil difosfato
Monoterpenos

32

de trezentas estruturas de hidrocarbonetos bsicos gerados por sesquiterpenos adenilato
sintases usando farnesil difosfato como substrato (GARMS; KLLNER; BOLAND, 2010).
Dentre os mtodos de obteno de leos essenciais a partir de fontes vegetais, a
destilao a vapor tem sido a mais tradicionalmente aplicada. Uma das desvantagens dos
mtodos de arraste a vapor ou hidrodestilao que os leos essenciais sofrem alterao
qumica j que os compostos sensveis ao calor podem ser facilmente destrudos. Portanto,
a qualidade do leo essencial extremamente prejudicada. Nesse nterim, os mesmos
autores relatam que a extrao dos componentes de leos essenciais com a utilizao de
solventes a alta presso, ou fluidos supercrticos, tem recebido muita ateno nos ltimos
anos, especialmente na indstria de alimentos, farmacutica e cosmtica, porque apresenta
uma alternativa aos processos convencionais, que normalmente empregam alta temperatura
(BOCEVSKA; SOVOV, 2007; POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGHI, 2007).
Alm da degradao trmica, a hidrodestilao de compostos volteis torna-se
ineficiente tambm por alguns desses componentes se dissolverem parcialmente na gua e
sua distribuio entre as fases leo essencial e gua no separador do aparelho de
destilao ficar desfavorecida. Assim, a extrao com SC-CO
2
mostra-se ser a tcnica de
escolha para o isolamento de steres monoterpnicos, alguns de seus lcoois, e
sesquiterpenos de plantas (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).
A extrao com CO
2
supercrtico tambm uma ferramenta poderosa na pesquisa de
fragrncias e de leos essenciais, especialmente porque o isolamento de componentes
volteis usando mtodos tradicionais, como a destilao a vapor ou de amostragem de
headspace dinmico produz extratos com fragrncia que podem no refletir as propriedades
de aroma do material natural. Com as condies de extrao que empregam temperaturas
brandas, a extrao com fluido supercrtico a mais adequada para isolar leos essenciais
de especiarias, flores, ervas, folhas, sementes e razes. Os extratos obtidos so geralmente
considerados como sensorialmente superiores aos concentrados produzidos pelas tcnicas
tradicionais. Uma desvantagem da extrao com CO
2
supercrtico, no entanto, a presena
de outros compostos no extrato que no contribuem para a impresso de fragrncia, tais
como hidrocarbonetos de cadeia longa ou lcoois parafnicos (MARSILI, 2002).
A co-extrao de substncias de baixa volatilidade como ceras cuticulares juntamente
com o leo essencial voltil tpico para extrao com SC-CO
2
de leos essenciais a partir
de material herbceo. Uma possibilidade de obter um leo essencial relativamente puro a
utilizao de separao em dois estgios. No primeiro estgio as substncias de baixa
volatividade e indesejadas so precipitadas e separadas do CO
2
supercrtico baixa
temperatura e o leo essencial, sendo mais solvel ao solvente, se separa deste aps uma
alterao na presso e temperatura no segundo separador (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).

33

A extrao com fluido supercrtico do leo essencial melhora a qualidade do leo
evitando o estresse trmico dos componentes terpnicos. No entanto, as condies de
extrao, principalmente presso e temperatura, responsveis pelo poder de solvente do
fluido supercrtico devem ser otimizadas, uma vez que estas variveis so diretamente
responsveis pela composio do extrato e, portanto, por suas propriedades funcionais. No
entanto, outros fatores como a geometria do leito fixo, o nmero de estgios de extrao e
separao, e o fluxo de solvente podem influenciar no desempenho do processo (LANGA et
al., 2009). Goodarznia e Eikani (1998) afirmam que a presso e a temperatura tima de
extrao para a obteno de alto rendimento de leos essenciais, resultando em
solubilidade insignificante dos outros componentes esto nas faixas de 80 a 100 bar e de 40
a 50 C.
Esta faixa de presso e temperatura foi estudada neste trabalho. Assim como o estudo
da extrao supercrtica, o estudo da aplicao dos extratos complementa os resultados de
forma a justificar a viabilidade da tecnologia empregada. Deste modo, anlises da
bioatividade dos extratos supercrticos das sementes de Pitanga foram contempladas neste
trabalho.

2.4 Ensaios para Deteco de Bioatividade de Extratos de Matrizes Vegetais

2.4.1 Atividade antioxidante

Em humanos, o desequilbrio entre espcies oxidantes e antioxidantes pode provocar
uma srie de desordens celulares, tais como peroxidao lipdica, danos protico-
enzimticos e inclusive, alteraes no DNA, as quais podem estar associadas a inmeros
processos deletrios, como o cncer, aterosclerose, diabetes mellitus, artrite reumatide,
distrofia muscular, catarata, desordens neurolgicas e do trato respiratrio alm de
envelhecimento precoce (BIANCO; SANTOS, 2010).
Recentemente, tem havido um interesse crescente em espcies reativas de oxignio
em sistemas biolgicos e seus papis como agentes causais implcitos na etiologia de uma
variedade de doenas crnicas. Assim, a ateno est sendo focada nas funes
bioqumicas de proteo dos antioxidantes naturais nas clulas dos organismos que os
contenham (MENSOR et al., 2001).
Para medir a capacidade antioxidante de alimentos e amostras biolgicas, diferentes
ensaios foram introduzidos. O conceito de capacidade antioxidante foi primeiro originado
para a qumica e mais tarde adaptado para a biologia, medicina, epidemiologia e nutrio.

34

Ele descreve basicamente a habilidade de molculas eletronicamente instveis em
neutralizar os radicais livres de sistemas biolgicos atravs de reaes de oxido-reduo
(redox). Este conceito fornece um quadro mais amplo dos antioxidantes presentes em uma
amostra biolgica, uma vez que considera os efeitos aditivo e sinrgico de todos os
antioxidantes e no somente o efeito de um dos compostos isolados, e podem, portanto,
causar benefcios sade como antioxidantes potenciais contra doenas mediadas pelo
estresse oxidativo (FLOEGEL et al., 2011).
Nos ltimos anos, vrios ensaios espectrofotomtricos foram adotados para medir a
capacidade antioxidante de alimentos, sendo os mais populares os ensaios que utilizam os
radicais 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) e o 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
(DPPH). Alm daquele que mede a capacidade de absoro de radicais de oxignio (ORAC)
e a capacidade de reduo de ons ferro em plasma (FRAP). A maioria destes ensaios
emprega o mesmo princpio, um composto radicalar sinttico de cor ou oxi-redutor gerado
e a capacidade de uma amostra biolgica para eliminar os radicais ou para reduzir o
composto redox-ativo monitorado por espectrofotmetro, juntamente com a aplicao de
um padro adequado para quantificar esta capacidade antioxidante, por exemplo, por
equivalente de Trolox (TEAC) ou equivalente de vitamina C (VCEAC). Alm disso, existem
dois tipos bsicos de mecanismos. Um deles baseia-se na transferncia de eltrons e
envolve a reduo de um oxidante de cor, como o ABTS, DPPH e ensaio FRAP. O outro
aborda uma transferncia de tomo de hidrognio, como no teste ORAC, em que os
antioxidantes e o substrato competem termicamente pelos radicais peroxila gerados
(FLOEGEL et al., 2011).
Em se tratando do estudo de extratos vegetais, os quais so compostos por uma
infinidade de substncias, alm de conhecer a capacidade antioxidante total, mais
recentemente tem-se agregado outras metodologias com o intuito de identificar os
compostos que mais contribuem para tal efeito. A cromatografia em camada delgada (CCD)
combinada com ensaio de inibio do radical DPPH um mtodo que tem a capacidade de
garantir a reao de oxi-reduo suficiente a partir do isolamento de grupos de
componentes com atividade antioxidante em uma mistura. Os compostos ativos, separados
em bandas, so vistos como manchas claras contra um fundo roxo na cromatoplaca. Testes
preliminares usando CCD possibilitam direcionar a separao de compostos antioxidantes
em cromatografia de alta resoluo como a anlise por cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE) (ZHAO, J. et al., 2010).
O radical DPPH (DPPH) tambm tem sido utilizado em CLAE com a finalidade de
indicar a atividade antioxidante de cada componente, a qual medida pela inibio destes
radicais livres. Embora a combinao da CLAE com as reaes de oxi-reduo usando
DPPH seja eficiente, o sistema on-line pode apresentar uma cintica de reao lenta que

35

permite uma caracterizao imprecisa da atividade antioxidante destes compostos. Alm
disso, esta tcnica desconsidera o efeito sinrgico que uma substncia pode exercer sob a
outra e assim, um composto que na prtica teria uma alta atividade antioxidante, por esta
tcnica (CLAE + DPPH) visualizado um baixo efeito, pois este composto analisado
individualmente (ZHAO, J. et al., 2010).
A interao de um potencial antioxidante com DPPH depende de sua conformao
estrutural. O nmero de molculas de DPPH que so reduzidas parece estar
correlacionado com o nmero de grupos hidroxila disponvel. sugerido que o DPPH livre
abstrai o hidrognio de molculas de compostos fenlicos que so doadores de eltrons.
Este poderia ser o mecanismo geral das reaes com flavonis antiperoxidativos, por
exemplo. Com base no mecanismo de reduo da molcula de DPPH extensivamente
descritos na literatura, que est correlacionada com a presena de grupos hidroxila na
molcula antioxidante, pode-se inferir que a grande atividade de extratos polares ,
provavelmente, devido presena de substncias com um grupo hidroxila disponvel,
fenlico ou no. Esta exigncia estrutural poderia estar ligada presena de flavonides ou
taninos condensados, por exemplo (MENSOR et al., 2001).
O radical 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS
+
) um conhecido
composto utilizado para a anlise colorimtrica de oxidantes qumicos diversos. A molcula
de ABTS incolor convertida para a cor azul-esverdeada na sua forma radicalar, pela
oxidao de um eltron. O ABTS
+
mostra fortes bandas de absoro de UV-vis em 415,
648, 728 e 812 nm, e conhecido por ser uma espcie radicalar mais duradoura, pois
diferente do radical DPPH que, quando formado s pode ser usado para anlises no mesmo
dia, o radical ABTS quando em soluo pode ser estocado por at um ms sob refrigerao.
Tem sido relatado que ABTS pode ser rapidamente formado por reaes com vrios radicais
inorgnicos, como OH, Br
2
-
e RS, e diversos radicais orgnicos, tais como radicais alcoxil
ou alcoxilperoxil. Alm disso, oxidantes no radicalares, como o cido percarboxlico,
ferrato, espcies de bromo e cloro, so conhecidos por reagir com ABTS para produzir
estequiometricamente ABTS
+
. Portanto, ABTS
+
tem sido utilizado como uma sonda cintica
para o estudo de reaes de neutralizao de radicais livres, bem como um reagente para a
anlise quantitativa de oxidantes qumicos (LEE; YOON, 2008). Este mtodo tem sido
aplicado para o estudo de fraes antioxidantes solveis em gua e antioxidantes
lipossolveis, compostos puros e extratos (RE et al., 1999).

2.4.2 Atividade antimicrobiana


36

A sobrevivncia e proliferao dos micro-organismos nos alimentos um problema
importante, que pode levar deteriorao e assim prejudicar a qualidade de produtos
alimentcios ou causar infeco e doena. Estima-se que as doenas diarricas de origem
alimentar j causam cerca de 4 a 6 milhes de mortes por ano, sendo crianas a maioria.
Apesar dos conservantes qumicos serem utilizados h anos, existem controvrsias j que
alguns podem causar problemas de sade respiratria, por exemplo. Portanto, necessrio
encontrar uma nova maneira de reduzir ou eliminar micro-organismos nos alimentos e
prolongar a vida de prateleira. Somado a isto, a crescente demanda dos consumidores por
produtos naturais tem levado investigao de novos agentes antimicrobianos a partir de
matrizes vegetais (LV et al., 2011).
O estudo para a descoberta de novas substncias com capacidade antimicrobiana tem
sido estimulado pela demanda dos consumidores que relacionam extratos obtidos de fontes
vegetais com sade e alimentos mais saudveis. Produtos naturais tm sido uma fonte
particularmente rica de agentes anti-infecciosos, produzindo, por exemplo, a penicilina, em
1940, as tetraciclinas em 1948 e os glicopeptdeos em 1955 (CUSHNIE; LAMB, 2005).
Dentre os extratos de matrizes vegetais j reconhecidamente antimicrobianos, destaca-se
os leos essenciais de cravo, organo, alecrim, tomilho, slvia e vanilina. Eles tm
geralmente ao inibitria mais expressiva contra bactrias Gram-positivas do que contra
bactrias Gram-negativas (HOLLEY; PATEL, 2005).
Vrios fatores relacionados aos prprios micro-organismos condicionam a resistncia
aos agente antimicrobianos, como a complexidade da parede celular. De acordo com Lv et
al. (2011), geralmente reconhecido que as clulas da fase logartmica do crescimento
microbiano so mais sensveis aos fatores de estresse externos, enquanto as clulas da
fase estacionria so mais resistentes. Este fenmeno pode ser explicado pelas mudanas
estruturais ou conformacionais na parede celular dos micro-organismos por ser uma
estrutura dinmica que pode se adaptar a mudanas fisiolgicas. Por exemplo, tem sido
demonstrado que no peptidoglicano de clulas de Escherichia coli ocorrem alteraes
evidentes durante a transio da fase logartmica (inicio do ciclo microbiano de grande
multiplicao dos micro-organismos) para fase estacionria (final do ciclo microbiano, no
qual o nmero de bactrias originadas praticamente igual ao nmero de bactrias que
morrem), incluindo o espessamento da camada de peptidoglicano e o aumento da grau de
ligaes cruzadas deste glico-polissacardeo. Isso mostra que o aumento das ligaes
qumicas no peptidoglicano tornam as clulas cultivadas h mais tempo mais difceis de
serem danificadas.
A Organizao Mundial de Sade no tem medido esforos para padronizar os testes
de susceptibilidade antimicrobiana a nvel internacional. Estudos colaborativos publicados
na dcada de 70 tiveram o objetivo de padronizar a diluio em caldos e testes de

37

susceptibilidade antimicrobiana em meios de cultura com diluio em gar. Depois, testes
de difuso em disco foram cuidadosamente padronizados para uso nos pases
escandinavos e nos Estados Unidos. Com a divulgao destes dois procedimentos, muitos
detalhes processuais passaram a ser cuidadosamente controlados e bem definidos. Uma
variedade de outros mtodos foram criados, mas houve pouco esforo para o controle de
variveis importantes, como a densidade de inculo, gar, condies de incubao, dentre
outros. Os testes padronizados de disco envolvem medir o dimetro de cada zona de
inibio e comparar com a concentrao inibitria mnima (CIM) obtida por testes de
suscetibilidade de diluio em gar ou caldo (SCHWALBE; STEELE-MOORE; GOODWIN,
2007).
Basicamente, maior poder antimicrobiano ter a substncia que conseguir um grande
halo de inibio (distncia sem crescimento microbiano) com uma baixa concentrao, o
que significa que esta substncia a uma concentrao baixa consegue reproduzir uma
resposta inibitria eficiente. Em teste de inibio de micro-organismos atravs da medio
do halo de inibio, existe uma classificao com trs nveis que leva em conta a distncia
entre a substncia teste presente no disco de papel e a cultura bacteriana, sendo ela: baixa
atividade (zona de inibio 12mm), atividade moderada (12mm < zona de inibio <20mm)
e forte atividade (zonas de inibio 20mm) (LV et al., 2011).
So vrias as classes de compostos qumicos que apresentam atividade
antimicrobiana. Dentre a classe dos flavonides, um grupo de substncias proveniente do
metabolismo secundrio de plantas que exibem inmeras propriedades, vrios compostos
mostraram possuir algum nvel de atividade antimicrobiana. So a apigenina, galangina,
pinocembrina, ponciretina, genkwanina, soforaflavanona G e seus derivados, naringina e
naringenina, galato de epigalocatequina e seus derivados, luteolina e luteolina 7-glicosdeo,
quercetina, 3-O-metilquercetina e vrios glicosdeos de quercetina e kaempferol e seus
derivados. Outras flavonas, glicosdeos de flavona, isoflavonas, flavanonas, isoflavanonas,
isoflavanas, flavonis, glicosdeos de flavonis e chalconas tambm exibem tal atividade
(CUSHNIE; LAMB, 2005).
Considerando o grande nmero de diferentes grupos de compostos qumicos
presentes em leos essenciais, mais provvel que a atividade antimicrobiana deles no
seja atribuda a um mecanismo especifico e que existem vrios pontos de susceptibilidade
nas clulas, que podem ser alvo de tais compostos. Alguns possveis mecanismos
antimicrobianos dos leos essenciais e seus componentes tm sido propostos, incluindo a
degradao da parede celular, danos membrana citoplasmtica, danos s protenas da
membrana, vazamento do contedo celular, coagulao do citoplasma e depleo do
transporte de prtons ativos. Portanto, para entender o modo preciso de ao e atividade

38

antimicrobiana de um leo essencial particular, o conhecimento da composio qumica
fundamental (RATTANACHAIKUNSOPON; PHUMKHACHORN, 2010).
Na reviso publicada por Cushnie e Lamb (2005), foi abordado o mecanismo de ao
de flavonides que podem compreender trs vias principais de inativao dos micro-
organismos: uma das vias a inibio da sntese de cidos nuclicos, atravs de ligao de
hidrognio formadas entre o flavonide com a cadeia de DNA ou intercalao dos anis do
flavonide com as bases dos cidos nuclicos e essa rota leva a inibio da sntese de DNA
e RNA. Outro mecanismo a inibio do funcionamento da membrana citoplasmtica por
meio da modificao das regies hidroflicas e hidrofbicas da membrana. Algumas
catequinas interagem com a bicamada lipdica pela penetrao direta e posterior interrupo
da funo de barreira, atravs da perda da permeabilidade seletiva. O terceiro mecanismo
a inibio do metabolismo de energia, atravs do bloqueio do consumo de oxignio celular e
da absoro de metablitos para a biossntese de macromolculas.
Em alimentos, com o objetivo de utilizar leos essenciais sem comprometer o seu
sabor, tem sido sugerido a combinao entre os extratos de plantas. Embora os leos
essenciais tenham maior atividade do que misturas de seus componentes principais, a
combinao destes componentes principais com outros constituintes com fraca atividade
pode resultar em um efeito aditivo, sinrgico ou antagonista. O leo essencial de organo
combinado com o de tomilho em doses baixas mostrou ser um potencial controlador do
crescimento de patgenos e micro-organismos deterioradores, enquanto que as
combinaes de leo essencial de organo com leo essencial de manjerona ou o leo
essencial de tomilho com o de slvia podem ser teis para o controle das principais
bactrias deterioradoras de alimentos, Gram-negativas ou Gram-positivas. Considerando
que os leos essenciais so geralmente reconhecidos como seguros (GRAS), a
possibilidade de reforar os seus efeitos antimicrobianos naturais pela adio de pequenas
quantidades de outros conservantes naturais pode ser uma maneira de alcanar um
equilbrio entre a aceitabilidade sensorial e eficincia antimicrobiana (GOI et al., 2009).

2.4.3 Inibio da enzima arginase

Arginase uma metaloenzima trimrica contendo um sitio binuclear de mangans no
stio ativo de cada subunidade. No fgado de mamferos, uma enzima citoslica envolvida
no ciclo da uria, que converte a arginina em ornitina e uria. Em tecido no hepticos, a
arginase est envolvida na regulao da concentrao celular de L-arginina para a produo
de xido ntrico e ornitina e consequente biossntese de prolina e poliaminas. Nos seres
humanos, um desequilbrio na atividade de arginase no tecido extra-heptico est

39

relacionado a uma srie de distrbios fisiolgicos, tais como hipertenso e impotncia
sexual (SILVA; FLOETER-WINTER, 2010), alm de estar relacionado, segundo Silva et al.
(2002), na regulao da sntese de xido ntrico (NO) o qual modula a disponibilidade de L-
arginina e consequentemente est ligada aos processos citotxicos em mecanismos
imunolgicos de proteo contra doenas infecciosas.
No parasita protozorio Leishmania, a arginase desempenha um papel central na
infeco de macrfagos. Para os seres humanos, a inibio da arginase da Leishmania
pode ser considerada um alvo potencial no desenvolvimento de drogas contra a
leishmaniose, mas a necessria presena de um ou dois Mn
2+
em cada monmero deve ser
levada em conta. Esta exigncia pode ser crucial para a interpretao dos resultados de
inibio, porque a incapacidade de impedir a ao da arginase pode ser associado a uma
variao em seu estado de ativao (SILVA; FLOETER-WINTER, 2010).
Assim, de acordo com Silva et al. (2008) a inibio da arginase endgena de
macrfagos infectados tem um efeito teraputico devido a um aumento da produo de NO,
e a enzima codificada pelo parasita subverte a atividade microbiocida dos macrfagos
infectados em murinos. Tomadas em conjunto, estas evidncias sugerem que o arginases
de mamferos e da Leishmania podem ser usadas como alvos teraputicos relevantes no
tratamento da leishmaniose.
O fato de a inibio da enzima arginase afetar o desenvolvimento e
consequentemente o potencial patolgico importante, pois de acordo com Marques et al.
(2011), a leishmaniose uma das doenas tropicais mais negligenciadas, devido s poucas
ferramentas disponveis para o seu controle e tambm falta de critrios claros para a
gesto da doena. Leishmaniose representa um grupo de doenas parasitrias que se
espalhou pelo mundo, ocorrendo em 88 pases tropicais e subtropicais. Aproximadamente
350 milhes de pessoas vivem em reas de transmisso ativa de Leishmania, no qual 12
milhes de pessoas podem estar infectadas, e todos os anos estima-se que surjam cerca de
um a dois milhes de novos casos nas regies da frica, sia, Europa e Amricas,
diretamente afetadas pela leishmaniose. Mais de 90% dos casos cutneos aparecem nos
pases em desenvolvimento.


40

3 OBJETIVOS

O objetivo geral desse trabalho foi obter extratos de semente de Pitanga utilizando
CO
2
em estado supercrtico com e sem emprego de etanol como co-solvente e caracteriz-
los sob diferentes aspectos.
Especificamente, os objetivos constituram-se de:

Anlises de caracterizao da matria-prima (semente triturada), quanto s condies
de umidade, granulometria e densidade aparente;
Extrao supercrtica das sementes de Pitanga em diferentes condies de extrao,
otimizando o rendimento do processo, segundo condies operacionais delineadas
com base em planejamento experimental;
Determinao experimental da cintica de extrao, visando avaliar o comportamento
da obteno dos extratos;
Anlise dos extratos supercrticos de semente de Pitanga com relao presena de
compostos volteis e compostos fenlicos totais (CFT);
Determinao da bioatividade dos extratos (atividade antioxidante pelos mtodos de
inibio do radical DPPH e ABTS, atividade antimicrobiana dos extratos atravs da
determinao da Concentrao Mnima Inibitria, para diferentes micro-organismos e
atividade de inibio da enzima arginase verificando o efeito do extrato contra
leishmaniose).


41
4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 Obteno e Preparao da Semente de Pitanga

Frutas maduras de Pitanga nativa foram coletadas no campus da Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA) da Universidade de So Paulo (USP),
Pirassununga, Brasil. No Laboratrio de Tecnologia de Alta Presso e Produtos Naturais
(LTAPPN/FZEA/USP), as sementes foram selecionadas, lavadas para retirada de vestgios
da polpa, e secas em estufa com circulao de ar a 38C por 54 horas (Figura 3A). Baixa
temperatura foi aplicada com o intuito de evitar ao mximo a degradao de compostos
termossensveis, o que justifica o longo perodo de secagem.
As sementes secas foram descascadas e trituradas (Figura 3B) em moinho tipo
martelo (Buhlermiag, GE), para que se permitisse uma granulometria constante em todas as
extraes, sendo ento acondicionadas em embalagens plsticas impermeveis ao vapor
dgua para armazenamento refrigerado a -18C.

A B
Figura 3 - Semente de Pitanga seca inteira (A) e triturada (B).

4.2 Caracterizao da Amostra

4.2.1 Umidade

A umidade foi determinada pelo mtodo gravimtrico que considera a perda de massa
da amostra atravs da dessecao at peso constante (AOAC, 1995). A eq.(1) relaciona a
massa mida e a massa seca e fornece a percentagem de umidade na amostra.

42
Umidade {%{=
P-p
p
100 [1]
Onde: P: massa em gramas da amostra mida e p: massa em gramas da amostra seca.

4.2.2 Extrato etreo

O extrato etreo foi obtido atravs do mtodo de extrao de lipdios a quente,
utilizando Soxhlet, com ter de petrleo padro analtico (Synth, BR) como solvente
orgnico. Estes extratos, alm de caracterizar a amostra, foram utilizados na anlise
comparativa da composio com os extratos supercrticos, representando um extrato obtido
por um mtodo convencional de extrao. Durante a extrao Soxhlet, o solvente foi
continuamente aquecido e recuperado durante 6h, sendo removido depois do processo por
evaporao (IAL, 2008). A Figura 4 ilustra o aparato para a extrao tipo Soxhlet.

A

B
Figura 4 - Extrao da semente de Pitanga utilizando Soxhlet (A). Detalhe do arraste de
lipdios pelo solvente lquido (B).

4.2.3 Granulometria

A granulometria das sementes trituradas (200g) foi determinada em um jogo de seis
peneiras da srie padro Tyler, com agitao durante 15 min. O dimetro mdio foi
calculado pela relao descrita na eq.(2) (ASAE, 2008 - S319.4).

d
mg
= log
-1
w
i
logd
i
n
i-1
w
i
n
i-1
[2]
Onde: d
i
= (d
i
.d
i+1
)
0,5
; d
i:
abertura nominal da i-sima peneira (mm); d
i+1
: abertura nominal da
peneira maior que a i-sima peneira (mm); w
i
: massa do material retido na i-sima peneira.

43

4.2.4 Densidade aparente

Para a determinao da densidade aparente, utilizou-se o leito fixo de 300 cm
3

(extrator) como recipiente de volume padro. Por 10 vezes seguidas, completou-se o seu
volume com a semente de Pitanga triturada e depois de retirada do extrator, a massa foi
mensurada em um bquer previamente tarado. A densidade aparente foi obtida pela relao
entre a mdia das massas e o volume do leito fixo.

4.3 Obteno dos Extratos com CO
2
Supercrtico

4.3.1 Processo de extrao

O procedimento de extrao consistiu em promover o contato entre as sementes
trituradas, que estavam acondicionadas no extrator de leito fixo de 300 cm
3
, com o CO
2

supercrtico em condies pr-estabelecidas de presso (P) e temperatura (T) em um
delineamento experimental. O controle da presso foi realizado por uma bomba de alta
presso, enquanto que a temperatura de operao foi mantida atravs de um banho
termostatizado, no qual o extrator foi acondicionado. O extrato, separado do gs, foi
continuamente coletado em um frasco coletor imerso em banho de gelo e o CO
2

quantificado em um rotmetro, medidor de vazo de gs s condies ambientes. Ao final
do processo, os extratos foram pesados e relacionados com a massa de sementes secas
acondicionadas no extrator para o clculo do rendimento global. A Figura 5 mostra o
equipamento utilizado no presente experimento e o produto final do processo, o extrato
supercrtico.


44

A

B
1: cilindro de CO2; 2: manmetro do cilindro; 3: banho termostatizado; 4: tanque de refrigerao do CO2; 5:
bomba HPLC; 6: painel de comando do banho termostatizado; 7: banho termostatizado do extrator; 8: tanque
pulmo; 9: manmetros tipo Bourbon do tanque pulmo (esquerda) e do extrator (direita); 10: extrator; 11:
vlvulas de estanque e vlvulas micromtricas; 12: medidor de vazo em condies ambiente.

Figura 5 - Sistema de extrao com CO
2
supercrtico do LTAPPN, FZEA/USP (A). Extrato
supercrtico de semente de Pitanga (B).

4.3.2 Delineamento Composto Central Rotacional

As condies operacionais do procedimento experimental foram definidas de acordo
com o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR)

com P e T como variveis
independentes. Foram considerados cinco nveis com quatro pontos estrela e triplicatas no
ponto central (Tabela 3) (RODRIGUES; IEMMA, 2009).

Tabela 3 - Nveis dos dois fatores, presso e temperatura, no DCCR.
Fatores
Nveis
- -1 0 +1 +
Presso P (Kgf.cm
-2
) 83 110 175 240 267
Temperatura T (C) 31 35 45 55 59
= 1,41

Esse delineamento experimental gerou uma matriz com 11 ensaios (Tabela 4), os
quais foram realizados aleatoriamente. Para todos os testes, foi padronizado um tempo de
equilbrio esttico de 16h (perodo em que a matriz fica em contato com o CO
2
nas
condies supercrticas definidas no DCCR, sem ocorrer o arraste do extrato) e o tempo de
extrao dinmica, tambm padronizado para todos os ensaios, foi de 6h.


45

Tabela 4 - Matriz do DCCR de dois fatores incluindo trs pontos centrais para o estudo do
efeito da presso e temperatura nos extratos da semente de Pitanga.
Ensaios
Variveis codificadas Variveis
P T (P) (Kgf.cm
-2
) T (
C)
1 -1 -1 110 35
2 +1 -1 240 35
3 -1 +1 110 55
4 +1 +1 240 55
5 -1.41 0 83 45
6 +1.41 0 267 45
7 0 -1.41 175 31
8 0 +1.41 175 59
9
e
0 0 175 45
10
e
0 0 175 45
11
e
0 0 175 45
e = pontos centrais

4.3.3 Extrao supercrtica com co-solvente (SC-EtOH)

Com o objetivo de comparar com os extratos obtidos pelo uso somente do CO
2

supercrtico, fez-se uma extrao supercrtica utilizando Etanol (EtOH) padro analtico
(Synth, BR) como co-solvente (SC-EtOH). Adicionou-se 30 mL de etanol em 72 g de
sementes trituradas, o suficiente para umedec-las e acondicionou-se a matriz embebida
em EtOH no extrator e procedeu-se a extrao nas condies de 175 Kgf.cm
-2
e 45C, as
condies do ponto central do DCCR tambm com 16h de tempo de equilbrio esttico e 6h
de extrao.

4.3.4 Purificao do extrato supercrtico obtido com co-solvente

Extratos obtidos com EtOH e outros solventes polares normalmente extraem taninos
com alto grau de polimerizao de matrizes vegetais. Sendo as sementes ricas em taninos e
visando estudar a composio da frao dos extratos supercrticos obtidos por SC-EtOH
isentos destes taninos com alto grau de polimerizao, diluiu-se 100 mg do extrato bruto,
obtido pelo emprego do co-solvente (SC-EtOH), em 2,5 mL de metanol (MeOH) de grau
cromatogrfico (J.T.Baker, USA) e adicionou-se 32,5 mL de clorofrmio padro analtico
(Synth, BR). Esta soluo foi estocada a 4C durante 3h na ausncia de luz e logo em

46

seguida, centrifugada (FANEN 215, BR) a 4.000 rpm e 5C durante 10 min. O sobrenadante
separado do decantado foi rotaevaporado uma presso de 600 mmHg (YAMATO RE-41,
JP), temperatura ambiente e ausncia de luz (LHUILLIER et al., 2007).

4.4.5 Cintica de extrao

Baseando-se nas condies operacionais que favoreceram os mais altos rendimentos,
selecionou-se o ponto central do DCCR (175 Kg.cm
-2
e 45C), estudou-se a cintica durante
18h de extrao dinmica, com trocas de frascos de coleta a cada 20 min. Foram
mensuradas as vazes volumtricas e a massa do extrato obtido para cada intervalo. Os
valores experimentais da taxa de transferncia de massa para cada 20 min geraram a curva
cintica (Origin v. 8.0, USA), que tambm foi expressa em funo da vazo volumtrica de
CO
2
.

4.4 Caracterizao dos Extratos

4.4.1 ndice de refrao

O ndice de refrao dos extratos supercrticos de semente de Pitanga foi mensurado
em refratmetro (LAMBDA 2WAJ, ATTO Instruments Co, HK), em funo da luz de sdio no
comprimento de onda de 589,3 nm e temperatura de 20C e 40C. A calibrao do
aparelho foi feita com gua destilada, cujo ndice de refrao de 1,3330 a 20C (IAL,
2008). Para manter a temperatura constante durante as mensuraes, circulou-se gua
proveniente de um banho termostatizado na temperatura de leitura.

4.4.2 Caracterizao dos extratos em cromatografia em camada delgada (CCD)

A anlise foi feita em todos os extratos obtidos a uma concentrao de 5.000 ppm, em
MeOH de grau cromatogrfico (J.T.Baker, USA).
Para a visualizao da presena de terpenos nos extratos foi utilizado como revelador
uma soluo cida de Anisaldedo (Sigma Aldrich, GE) preparada conforme descrito por
Wagner e Bladt (2009). Como fase estacionria utilizou-se placas de Slica Gel 60 F
254
e
como fase mvel, uma soluo de tolueno (Merck,GE), acetato de etila grau cromatogrfico
(Mallinckrodt Chemicals, USA) (93:7, v:v). Aps a eluio da amostra, o Anisaldedo foi
aspergido sobre a placa, seco com o auxlio de um secador de cabelos (Airstyle 130, BR) e

47

aquecido com uma pistola trmica (Steinel, HL 1605S, USA) at que se visualizassem as
bandas eludas com colorao variada.
Para cada banda visualizada na cromatoplaca, relacionou-se as distncias percorridas
pelas bandas e a distncia percorrida pelo solvente (eq.3) para se obter o fator de reteno
(R
f
) relativo a cada banda. O R
f
uma constante fsica de uma determinada substncia,
desde que se observem as condies de corrida (caractersticas da cromatoplaca, a
qualidade e quantidade da fase mvel, a temperatura, o volume e a concentrao das
substncias aplicadas) (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1995).

R
f
=
distncia {cm, mm{ percorrida pela substncia
distncia {cm, mm{ percorrida pela frente da fase mvel
[3]

Na anlise da atividade antioxidante nos extratos, utilizou-se como fase mvel uma
soluo de tolueno (Merck, GE), acetato de etila (Mallinckrodt Chemicals, USA) (95:5, v:v) e
como revelador, uma soluo metanlica de 0,05% do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH) (Sigma Aldrich, GE) aspergido sobre a placa aps eluio e secagem. As placas
foram incubadas temperatura ambiente e ao abrigo da luz e ento ocorreu a visualizao
das bandas. Aquelas que apresentaram colorao amarela sob o fundo roxo mostraram o
indicativo de reao de oxi-reduo, indicando componentes com atividade antioxidante.

4.4.3 Anlise do perfil de volteis por cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro
de massas (CG/EM)

A composio voltil dos extratos, a uma concentrao de 400 ppm em MeOH foi
analisada por meio de cromatgrafo gasoso com espectrmetro de massas acoplado
(CG/EM) (QP 2010 Plus, Shimadzu, JP) com injetor automtico (AOC-5000, SWI). Nesta
anlise utilizou-se uma coluna capilar Rtx
-5MS (30 m 0,25 mm id 0,25 m df, 5% difenil/

95% dimetilpolisiloxano) (Restek, USA) e Hlio, como gs de arraste a uma presso interna
de 60 psi. Foi injetado 1L dos extratos para uma razo de split de 1:20. A temperatura do
injetor foi de 220C e a da interface entre a coluna e a fonte de ons foi de 250C. A
temperatura do forno foi regulada de forma a se obter uma rampa linear de 60 a 246C em
um gradiente de 3C por minuto (ADAMS, 2009). A energia de ionizao foi de 70 eV na
fonte, e a faixa de varredura de massas foi de 50 a 500m/z.
O tratamento dos espectros foi feito atravs do software GCMS solutions ver. 2.5 que
possui como base de dados as bibliotecas NIST 08 e NIST 08s. Alm das bases de dados
existentes no software do CG/EM, como ferramenta de auxlio na identificao dos

48

componentes presentes nos extratos, calculou-se o ndice de Kovats (KI) (eq. 4) e Van der
Dool e Kratz (AI) (eq. 5) (ADAMS, 2009). Para tal, foi utilizado um padro de alcanos C
10
C
40
(Fluka, GE), que foi analisado no CG/EM nas mesmas condies dos extratos e os
tempos de reteno, bem como as respectivas temperaturas.

KI {x{= 100P
z
+ 100
(logRT {x{- logRT (P
Z
)
logRT {P
Z+1
{- logRT {P
Z
{
[4]

Onde: RT(x) o tempo de reteno do analito; RT(P
z
) o tempo de reteno do alcano
imediatamente anterior ao do analito; RT(P
z+1
) o tempo de reteno do alcano
imediatamente posterior ao do analito.

AI (x)=100Pz+100
T{x{ - T {Pz{
(T (P
Z+1)
- T {P
Z
{)
[5]

Onde: T(x) a temperatura no tempo de reteno do analito; T(P
z
) a temperatura no
tempo de reteno do alcano imediatamente anterior ao do analito; T(P
z+1
) a temperatura
no tempo de reteno do alcano imediatamente posterior ao do analito.

Com vistas a quantificar os sesquiterpenos em maior concentrao nos extratos,
utilizou-se o mtodo de normalizao externa e, como padro o monoterpeno R-(+)-
limonene (Sigma Aldrich, GE) em diferentes concentraes nas mesmas condies de
anlise de CG/EM que os extratos, e fez-se uma curva padro com o eixo das ordenadas
sendo as reas dos picos e o eixo das abscissas sendo as concentraes em ppm das
diluies (Figura 6).
A partir da equao gerada com o ajuste linear dos pontos experimentais, quantificou-
se os sesquiterpenos relacionando-os concentrao em Equivalente de Limoneno
(EqLim). A concentrao dos terpenos nos extratos tambm foi uma resposta analisada no
DCCR, utilizando a anlise de superfcie de resposta (ASR).


49

Figura 6 Curva padro de Limoneno para o clculo da concentrao de sesquiterpenos
expresso em Equivalente de Limoneno (EqLim) dos extratos de semente de Pitanga.

4.4.4 Anlise de compostos fenlicos totais (CFT)

Compostos polifenlicos so relevantes por agirem contra as patologias cardacas,
hipertenso arterial e degenerao relacionada idade. Polifenis totais so comumente
quantificados pelo mtodo Folin-Ciocalteu. Uma srie de estudos tem apresentado o
contedo total de polifenis de produtos alimentares, a fim de estabelecer comparaes com
outros produtos similares e informaes mais detalhadas sobre este sub-grupo de
antioxidantes que compreendem, principalmente os flavonides, ligninas e taninos
(WOOTTON-BEARD; MORAN; RYAN, 2011).
A concentrao de compostos fenlicos totais foi determinada usando a metodologia
descrita por Singleton e Rossi (1965). Foram adicionados 1 mL dos extratos diludos em
MeOH grau cromatogrfico (J.T.Baker, USA) 1.000 ppm, a 5 mL de soluo de reagente
de Folin-Ciocalteu (Haloqumica, BR) diluda em gua destilada (1:10, v:v). Aps 10 min, 4
mL de soluo aquosa com 7,5% de carbonato de sdio anidro padro analtico (Synth, BR)
foi adicionado. Depois de 2h em temperatura ambiente sem a presena de luz, as medidas
das absorbncias foram feitas em espectrofotmetro (Biospectro SP 22, BR) com
comprimento de onda variando entre 400 e 800 nm. O branco foi preparado similar aos
extratos, porm com 1mL de MeOH em substituio soluo contendo os extratos.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
500.000
1.000.000
1.500.000
2.000.000
2.500.000
3.000.000
3.500.000
y = 48221,1229 + 21191,0373x
R
2
= 0,9957
r
e
a

d
o

p
i
c
o
Concentrao de Limoneno (ppm)

50

cido Glico (Fluka, SWI) foi utilizado na determinao da curva padro (0, 20, 30, 40
e 60 ppm) (Figura 7). A concentrao de fenlicos totais foi calculada e expressa em mg
equivalente de cido Glico (GAE) por 100 g de sementes de Pitanga secas.

Figura 7 - Curva padro de cido glico para determinao quantitativa de compostos
fenlicos totais.

4.4.5 Atividade antioxidante pelo mtodo DPPH

DPPH um radical livre, estvel a temperatura ambiente, que produz uma soluo
violeta em etanol. Na redox, ele reduzido na presena de molculas antioxidantes,
resultando no descoloramento da soluo para amarelo (MENSOR et al., 2001). Em um
tubo de ensaio, adicionou-se a 3,9 mL da soluo metanlica (J.T.Baker, USA) 610
-5
M
de DPPH (Sigma Aldrich, GE) e uma alquota de 0,1 mL de diferentes concentraes de
todos os extratos. As leituras foram realizadas em espectrofotmetro (Biospectro SP 22, BR)
a 515 nm, sendo todas as determinaes realizadas em triplicata e acompanhadas de um
controle sem o antioxidante. A queda na leitura da densidade tica dos extratos adicionados
de radical DPPH foi correlacionada com o controle, estabelecendo-se a porcentagem de
descolorao do DPPH, a qual indicou a atividade antioxidante para os extratos obtidos nos
diferentes testes (BRAND-WYLLIANS et al., 1995).

0 10 20 30 40 50 60
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
y = 0,00169 + 0,0104x
R
2
= 0,9998
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a
cido glico (ppm)

51

4.4.6 Atividade antioxidante pelo mtodo ABTS

Para a determinao da atividade antioxidante pelo mtodo do radical cido 2,2'-
azinobis-(3-etil-benzotiazolino-6-sulfnico) (ABTS
+
) (Sigma Aldrich, GE), usou-se a
metodologia descrita por Re et al. (1999), com adaptaes de Rufino et al. (2007).
Inicialmente o ABTS
+
foi formado a partir da reao de 7 mM de ABTS
+
com 140 mM de
persulfato de potssio padro analtico (Synth, BR). Esta soluo foi incubada a temperatura
ambiente e na ausncia de luz por 16 h. Transcorrido esse tempo, a soluo foi diluda em
etanol padro analtico (Synth, BR) at a obteno de uma soluo com absorbncia de
0,70 ( 0,02) no comprimento de onda de 734 nm. No momento da mensurao da atividade
antioxidante, foram misturados 30 L de todos os extratos diludos em diferentes
concentraes com 3 mL da soluo contendo o radical e determinou-se a absorbncia em
espectrofotmetro (Biospectro SP 22, BR) a 734 nm, aps 9 horas de reao, perodo
necessrio para o alcance da estabilidade das leituras das absorbncias. Como soluo
padro, usou-se o antioxidante sinttico Trolox (Sigma Aldrich, GE) nas concentraes de
100 a 2.000 M em EtOH e a resposta da ativao deste antioxidante nas reaes de oxi-
reduo com o ABTS
+
(Figura 8) indicada pela queda da absorbncia com a concentrao
de antioxidante foi utilizada para indicar a atividade antioxidante dos extratos. Todas as
leituras foram realizadas em triplicata, e os resultados foram expressos em mM de Trolox
por 100g de sementes secas.

Figura 8 - Curva padro que relaciona a concentrao de Trolox com a resposta da inibio
do ABTS+ com leitura feita a 734 nm.
0 500 1000 1500 2000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a
Concentrao de Trolox (M)
y = - 2,9356E-4x + 0,6838
R = 0,9804

52

4.4.7 Determinao da atividade antimicrobiana - concentrao inibitria mnima

A determinao da atividade antimicrobiana foi realizada no Laboratrio de
Microbiologia e Micotoxicologia de Alimentos na Faculdade de Zootecnia e Engenharia de
Alimentos (FZEA/USP). Estas anlises foram realizadas para os extratos obtidos com CO
2

supercrtico, ponto central do DCCR, com o CO
2
supercrtico e etanol como co-solvente (SC-
EtOH), via Soxhlet e a frao purificada do extrato obtido na extrao SC-EtOH. Os testes
utilizaram as cepas Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Bacillus subtilis ATCC 6623,
Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 (CEFAR, BR),
conforme metodologia descrita por Andrade et al. (2010) e DallStella (2008).
As cepas puras das bactrias foram repicadas em 10 mL de caldo nutriente (Oxoid,
UK) e incubadas a 35C, 24 h antes do teste. Aps as 24 horas de incubao, as
absorbncias dos tubos contendo o caldo e os micro-organismos foram comparados com a
absorbncia do tubo 0,5 da escala de MacFarland, equivalente a 1,510
8
unidades
formadoras de colnias pra cada mL (UFC.mL
-1
), por meio de densitmetro UV (Suspension
Turbidity Detector, DEN-1, LV) em comprimento de onda de 625 nm.
O teste consistiu em inocular assepticamente os extratos diludos em MeOH (1.000;
500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,625 ppm) no caldo Mueller-Hinton (Oxoid, UK) j contendo
as bactrias incubadas (1,510
8
UFC.mL
-1
) e aps mais 24 h de incubao a 37C, avaliou-
se a concentrao inibitria mnima (CIM), definida como a mais baixa concentrao onde
no ocorre desenvolvimento microbiano. Esta anlise constituiu em verificar a ausncia da
turbidez no tubo contendo a amostra, como um indicativo da inibio do crescimento das
bactrias. A organizao das diluies dos extratos bem como os controles (tubos 8 e 9)
est listada na Tabela 5.
O controle negativo (tubo 8) se faz necessrio para eliminar a possibilidade de
resultados falso-positivos em funo da turbidez apresentada pelo extrato. O controle
positivo (tubo 9) indica o crescimento dos microorganismos, sem a influncia das amostras,
nas mesmas condies do ensaio. A leitura do resultado, atravs da anlise visual da
turbidez, foi realizada pela comparao de cada tubo com o controle negativo, sendo
considerado como CIM a menor concentrao da amostra nas diluies estudadas em que
no houve crescimento bacteriano, verificada pela limpidez da amostra contida nos tubos.
Todos os ensaios foram realizados em duplicata.


53

Tabela 5 Diluio e contedo dos tubos de ensaio para determinao da Concentrao
Inibitria Mnima.
Tubo Diluio Contedo
1 1:1ou 1000 ppm 1 mL do extrato
2 1:2 ou 500 ppm 1 mL do extrato e 1 mL de caldo Mueller Hinton
3 1:4 ou 250 ppm 1 mL do 2 tubo e 1 mL de caldo Mueller-Hinton
4 1:8 ou 125 ppm 1 mL do 3 tubo e 1 mL de caldo Mueller-Hinton
5 1:16 ou 62,5 ppm 1 mL do 4 tubo e 1 mL de caldo Mueller-Hinton
6 1:32 ou 31, 25 ppm 1 mL do 5 tubo e 1 mL de caldo Mueller-Hinton
7 1:64 ou 15,625 ppm mL do 6 tubo e 1 mL de caldo Mueller-Hinton
8 - 1:64 ou 15,625 ppm (controle negativo)
9 - 1mL de caldo (controle positivo)

4.4.9 Inibio da enzima arginase

A determinao da inibio da enzima arginase foi realizada no Laboratrio de
Imunologia e Parasitologia da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
Universidade de So Paulo (FZEA/USP). A enzima arginase foi obtida de duas fontes, a
partir do fgado de rato e replicada atravs do protozorio Leishmania amazonensis,
modificado geneticamente na sua forma pr-mastigota, que cresce em ambiente extracelular
e possui flagelo. Para a produo da enzima no protozorio, primeiramente o gene
responsvel pela produo da arginase foi isolado e amplificado em reao em cadeia de
polimerase (PCR), adicionado a um organismo vetor, neste caso, a E. coli BL21 como
plasmdio e finalmente conjugado a outros protozorios, que uma vez assimilando o DNA
com alta expresso de arginase, iniciam a sua produo (SILVA et al., 2008). As enzimas
provenientes do fgado de rato e da Leishmania amazonensis foram purificadas por tcnicas
de cromatografia de afinidade com metal imobilizado e cromatografia de troca inica. O
eluato foi ento usado para teste de inibio da arginase neste trabalho.
Para este teste, foram utilizados os seguintes extratos, com composio diferentes: (1)
o extrato supercrtico de sementes de Pitanga obtido nas condies de 175 Kgf.cm
-2
e 45C,
ponto central do DCCR, (2) extrato obtido pelo mtodo Soxhlet, (3) extrato supercrtico em
que se utilizou Etanol como co-solvente (SC-EtOH) e (4) frao purificada do extrato SC-
EtOH. Todos os extratos foram diludos a 1.000 ppm em MeOH grau cromatogrfico
(J.T.Baker, USA). O ensaio de inibio continha 10 mL de arginase de fgado de rato, 100
mM de L-arginina (pH 9,6) como substrato e 40 mL dos extratos que compunham o volume
final de reao de 100 mL aferindo com gua destilada. A mistura de reao foi incubada
por 15 minutos a 37C. Para a arginase da Leishmania, o procedimento foi o mesmo

54

diferindo somente a procedncia da enzima. O controle para os experimentos foi um a
mistura contendo o substrato, o solvente e a enzima arginase. Atividade de arginase foi
determinada por ensaio espectrofotomtrico, no qual a leitura da absorbncia do tubo
contendo os extratos foi relacionada com as leituras do controle negativo, sem os analitos
(BERGMEYER, 1985). A enzima utilizada neste ensaio foi capaz de produzir 100 mM de
uria por minuto. Todos os testes foram realizados em triplicata.

4.5 Anlise Estatstica

As anlises de caracterizao da amostra (umidade, densidade aparente e extrato
etreo) foram apresentadas apenas em mdias seguidas dos desvios padres. As variveis
dependentes obtidas como respostas, tais como o rendimento da extrao, a concentrao
de compostos fenlicos totais e os compostos sesquiterpnicos majoritrios de interesse,
foram analisados por ASR do DCCR com as duas variveis independentes (P e T)
(BARROS; SCARMINIO; BRUNS, 1996). A anlise de superfcie foi feita empregando o
programa STATISTICA v.7.0 (USA). Os resultados de bioatividade (ao antioxidante,
antimicrobiana e inibio da enzima arginase) foram apresentados em mdias de triplicatas
das anlises.


55

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao da Semente de Pitanga

As sementes de Pitanga secas e trituradas apresentaram uma porcentagem de
umidade aproximada de 13% (Tabela 6). Vale ressaltar que tal resultado expressa as
condies em que a semente se encontrava no momento da extrao supercrtica aps a
secagem (38C por 54h), e no o seu verdadeiro contedo de gua, o qual, segundo Bagetti
et al. (2009), chega a ser 58,6%. O valor mdio de extrato etreo obtido foi de 0,52%. Como
a preparao da amostra para anlise no influencia no teor de lipdios, estes esto
similares ao encontrado por Bagetti et al. (2009).

Tabela 6 - Umidade e extrato etreo da semente de Pitanga seca e triturada.
Ensaio % Umidade % Extrato etreo
1 12,50 0,56
2 12,80 0,59
3 12,90 0,41
Mdia 12,73 0,17 0,52 0,07

O valor mdio da densidade aparente (
a
) medida empiricamente foi de 0,482 g.cm
-3

para as sementes de pitanga trituradas. As massas das sementes acondicionadas no
extrator nos dez ensaios e seu respectivo valor so apresentadas na Tabela 7.

Tabela 7 - Densidade aparente da amostra de semente de Pitanga seca e triturada.
Ensaio Massa da semente (g) Densidade (g/cm
3
)
1 143,74 0,479
2 145,04 0,483
3 145,69 0,486
4 143,28 0,477
5 144,31 0,481
6 145,93 0,486
7 145,93 0,486
8 144,95 0,483
9 143,56 0,478
10 144,90 0,483
Mdia 144,73 0,92 0,482 0,003


56

Com as massas retidas nas seis peneiras da srie Tyler indicada para anlise de
granulometria (Tabela 8), obteve-se o dimetro mdio das partculas de 0,48 mm. Este valor
foi obtido pela relao entre a massa de sementes retida em cada peneira como demonstra
a eq.(2). De acordo com Oliveira (2010), esse parmetro muito importante, pois est
relacionado com a resistncia interna transferncia de massa. Muitas vezes, para
aumentar o rendimento de extrao, pode-se reduzir o tamanho das partculas, com a
finalidade de aumentar a rea de contato entre o slido e o solvente, diminuindo, desta
forma, a distncia que o soluto percorre no interior da partcula porosa para a superfcie.
Porm, a reduo da granulometria do slido no pode ser realizada de forma indefinida,
pois partculas muito pequenas tendem a formar aglomerados e interromper a passagem do
solvente pelo leito, alm de proporcionar perda de compostos volteis em matrizes vegetais
ricas em leos essenciais, por exemplo. De um modo geral, so utilizadas partculas com
dimetro mdio entre 0,25 e 2 mm. O dimetro encontrado nesse estudo est dentro do
intervalo de trabalho recomendado.

Tabela 8 Massa de sementes de Pitanga secas e trituradas retidas nas peneiras usadas
na determinao do dimetro mdio das partculas.
Mesh Abertura (mm) Massa retida (%) Massa retida (g)
10 1,700 0,02 0,05
14 1,180 4,49 8,99
20 0,850 20,38 40,75
28 0,600 16,15 32,30
35 0,425 12,42 24,83
48 0,300 16,24 32,49
Resduo < 0,300 30,15 60,31
* As fraes de Tyler/Mesh 10 e o resduo no entraram no clculo do dimetro mdio.

5.2 Determinao de Rendimento Global

O rendimento global das extraes supercrticas (R) foi obtido pela relao entre a
massa do extrato obtido no final da extrao e a semente de Pitanga empacotada no
extrator de leito fixo. Alm do rendimento, a Tabela 9 apresenta os valores de outros
resultados como a quantidade de compostos fenlicos totais (CFT), e a concentrao dos
principais compostos volteis, -elemeno e germacrone, expresso em EqLim. As diferentes
condies operacionais de P e T influenciaram em cada uma destas respostas e as anlises
de superfcies de respostas (ASR) iro indicar se esta influncia foi significativa ou no.
.

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57

58
(CO
2
= 674,89 kg.m
-3
) foi to elevado quanto aquele obtido no ensaio 2 (CO
2
= 896,08
kg.m
-3
) e isto se deve influencia da temperatura que no ensaio 8 de 59C enquanto que
no ensaio 2 de 35C (Tabela 9).
Nas proximidades do ponto crtico do solvente um pequeno aumento na presso
aumenta substancialmente a densidade do solvente e, consequentemente, aumenta o poder
de solvatao do fluido. Por outro lado, um pequeno aumento na temperatura perto do ponto
crtico diminui a densidade do solvente e, consequentemente, seu poder de solvatao.
Assim, a solubilidade de solutos em fluidos supercrticos aumenta abruptamente, prximo ao
ponto crtico com a elevao da presso em condies isotrmicas. Apesar do aumento da
temperatura diminuir o poder de solvatao do solvente, isso eleva a presso de vapor do
soluto. Portanto, a variao da solubilidade com a temperatura depende da presso e este
fato explica o rendimento dos extratos (Figura 9).
Este comportamento comum em extratos vegetais e foi tambm observado por
Boutin e Badens (2009), quando obtiveram extratos supercrticos de sementes oleaginosas
e por Kopcapk e Mohamed (2005) no estudo da solubilidade de cafena.

Figura 9 Rendimento das extraes de semente de Pitanga em funo da densidade do
CO
2
supercrtico.

Os rendimentos dos extratos supercrticos de semente de Pitanga variaram de 0,16%
a 0,48%, sendo a mdia de 0,38%. Como os maiores valores de rendimento foram obtidos
no ponto central, usou-se essa condio operacional na extrao com o co-solvente (SC-
EtOH). Porm, na extrao com o co-solvente, foi obtido um rendimento de apenas 0,35%.
Isso pode ser explicado pela alterao na polaridade do fluido e consequentemente na sua
solubilidade resultante da incorporao do etanol. Considerando o rendimento obtido
-1,11E-15
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
R
e
n
d
i
m
e
n
t
o

(
%
)

Densidade do fluido supercrtico (Kg/m)

59
quando o co-solvente foi usado, nota-se que as condies de presso e temperatura
estudadas neste ensaio no so as condies que levam a um rendimento aumentado com
a adio de EtOH, e mais estudos seriam necessrios para se chegar s condies
operacionais adequadas para otimizar o processo quando EtOH empregado como co-
solvente, mesmo porque o aumento da polaridade do fluido supercrtico ocasionado pela
adio do EtOH ir proporcionar a solubilizao de compostos polares diferentes daqueles
obtidos quando somente o CO
2
supercrtico utilizado como solvente.
Analisando a influncia dos fatores estudados (P e T) no rendimento da extrao
com CO
2
supercrtico, o diagrama de Pareto (Figura 10) mostra na anlise de efeitos, que
apenas a presso foi significativa para esta resposta, ao nvel de 95% de significncia.

Figura 10 - Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas no rendimento de extratos
supercrticos de semente de Pitanga.

Os coeficientes de regresso da equao preditiva do rendimento dos extratos de
sementes de Pitanga (R) em funo das variveis independentes (P e T) so apresentados
na Tabela 10. Nos modelos matemticos gerados a partir destes coeficientes (eq.6 e 7)
nota-se que os coeficientes significativos foram aqueles relacionados presso e, nem
mesmo a interao entre P e T, apresentou coeficientes significativos nos modelos.
Na anlise de varincia (ANOVA) apresentada na Tabela 11, para os delineamentos
experimentais de primeira e segunda ordem para o rendimento da extrao supercrtica,
nota-se que ambos os modelos, linear e quadrtico comprovam que h efeito significativo de
pelo menos uma das variveis estudadas, j que o valor do teste F calculado (F
calc
),
comparado com o F tabelado (F
tab
) para uma distribuio F a 95% de confiana foi maior. Os

60

coeficientes de determinao (R
2
) (Modelo linear 0,76 e Modelo quadrtico 0,95) calculados
sugerem que o modelo de segunda ordem possui um bom ajuste dos dados experimentais
reta de regresso, apresentando uma boa capacidade preditiva para o rendimento do
extrato.

Tabela 10 - Coeficientes de regresso significativos para modelos linear e quadrtico que
simulam o rendimento dos extratos de semente de Pitanga obtidos com CO
2
supercrtico.

Resposta Coeficientes de regresso
Linear
Quadrtico
R = 0,394 +0,105P
R = 0,22 + 0,05P - 0,035P
[6]
[7]

Tabela 11 - ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR para o
rendimento (%) dos extratos.
Modelo linear ou de primeira ordem
Fonte de
Variao
Soma dos
Quadrados SQ
Graus de
Liberdade GL
Quadrado
mdio QM
F
calculado
F
tabelado

Regresso (R) 0,057 1 0,057 95 6,61
Resduo (r) 0,003 5 0,0006
Total (T) 0,060 6
Modelo quadrtico ou de segunda ordem
Fonte de
Variao
Soma dos
Quadrados SQ
Graus de
Liberdade GL
Quadrado
mdio QM
F
calculado
F
tabelado

Regresso (R) 0,114 2 0,057 152 4,46
Resduo (r) 0,003 8 0,000375
Total (T) 0,117 10
Ftabelado com 95% de confiana .
O Fcalc. (QMR/QMr) maior que o Ftab. no nvel de 95% de confiana

Ainda possvel visualizar, atravs da anlise de superfcie de resposta (ASR) gerada
pelo modelo de segunda ordem (Figura 11) que para o intervalo de P e T estudado a regio
otimizada aquela com maiores valores de P para toda a faixa de T. O fato de poder operar
o equipamento em uma regio com baixas temperaturas obtendo um bom rendimento
acarreta na garantia da integridade das substncias termossensveis. Desse modo, a
extrao com CO
2
supercrtico pode apresentar grande vantagem em relao aos mtodos
convencionais, nos quais algumas vezes, obrigatoriamente, devem ser usadas altas
temperaturas. Ainda, com emprego de temperaturas brandas, o consumo de energia
menor o que representa uma considerao econmica a ser analisada.


61

efeitos das variveis independentes no rendimento da extrao.

5.3 Determinao de Cintica de Extrao

Uma vez que os investimentos na construo de uma unidade de EFS so elevados, a
otimizao das condies operacionais do processo so essenciais no sentido de tornar a
tcnica economicamente atraente. Este o objetivo da modelagem matemtica dos
experimentos, atravs da qual as curvas cinticas de extrao so analisadas a fim de se
determinar parmetros relacionados ao desenvolvimento de processos. As curvas cinticas
de extrao fornecem informaes consistentes relacionadas presso, temperatura e
vazo de solvente, auxiliando o desenvolvimento e aumento de escala de processos de
extrao supercrtica (TAKEUCHI, 2009).
A curva cintica do ensaio cujos maiores rendimentos foram obtidos (175 Kgf.cm
-2
e
45C) ponto central do DCCR esto expressas em taxa de massa em funo do tempo
(Figura 12) e razo de massa em funo da vazo de CO
2
(Figura 13). As curvas obtidas
mostram o comportamento tpico da cintica de extrao com fluido supercrtico. Na primeira
regio da curva a transferncia de massa controlada pela conveco do soluto presente
na superfcie da matriz vegetal; a segunda regio expressa a diminuio da transferncia de
massa ocasionada pela difuso do soluto do centro da matriz para a superfcie e pela
conveco, e a terceira na qual no se tem soluto facilmente disponvel na matriz e a
difuso do centro para a superfcie o principal mecanismo de obteno do extrato.

62

Nas curvas cinticas da extrao supercrtica de sementes de Pitanga (Figuras 12 e
13) observa-se que duas fases merecem maior ateno. Na primeira fase ocorre um rpido
aumento acumulado da massa de extrato em um curto perodo o que reflete na rpida
solubilizao do extrato pelo CO
2
supercrtico e a segunda fase (plat da curva) indica que a
mobilidade do extrato das sementes para o solvente quase nula. comum no visualizar
distintivamente todas as trs fases tpicas de uma curva de cintica, principalmente quando
a solubilidade do extrato alta no CO
2
supercrtico.

Figura 12 Massa acumulada de extrao em funo do tempo de extrao.

Na extrao do leo de vetiver estudado por Danh et al. (2009), foram observadas
apenas duas fases. Inicialmente, o aumento na quantidade total de CO
2
supercrtico
utilizado resultou em um aumento acentuado no rendimento. No entanto, medida em que
mais CO
2
supercrtico foi utilizado na extrao, incrementos menores na produo de leo
foram ocorrendo. Os resultados podem ser explicados com base na distribuio de leos
dentro das clulas da raiz. Na fase inicial, o leo extrado da superfcie das partculas, e a
solubilidade do leo em CO
2
supercrtico controla a transferncia de massa. Na ltima
etapa, o leo a partir de clulas intactas vai se difundido e a transferncia de massa
controlada pela difuso do leo de dentro das partculas. A taxa de transferncia de massa
baixa e incrementos de rendimento de leo so insignificantes em comparao com o
perodo de extrao rpida.

0 250 500 750 1000 1250
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Extrao 1
Extrao 2
M
a
s
s
a

a
c
u
m
u
la
d
a

(
g
)
Tempo acumulado de extrao (min)

63

Figura 13 Massa acumulada de extrao em funo do volume acumulado de CO
2
.

No estudo da cintica de extrao de alecrim-do-campo (PIANTINO et al., 2008), o
primeiro perodo foi quase inexistente, cerca de 50% do extrato foi obtido com
aproximadamente 20 g de CO
2
(primeiro perodo) e os outros 50% com 400 g de CO
2
. Neste
estudo tambm foi notado que no existe uma tendncia de combinar os rendimentos
globais a diferentes dimetros mdios de partculas aps longos perodos de tempo,
indicando que a difuso no o nico fenmeno que limita a extrao durante o perodo de
diminuio das taxas de extrao.

5.4 Caracterizao dos Extratos

Em complementao ao estudo da otimizao do processo de extrao, os extratos
tambm foram preliminarmente caracterizados com relao presena de terpenos, e sua
indicao de respectiva atividade antioxidante, e quantitativamente quanto concentrao
dos compostos volteis e concentrao de compostos fenlicos totais (CFT) presentes, alm
da sua bioatividade (efeito antioxidante in vitro, ao antimicrobiana e de inibio da enzima
arginase). Algumas de suas caracterizaes foram tratadas como respostas s diferentes
condies operacionais, as quais foram analisadas por anlise de superfcie de resposta
(ASR).

0 350 700 1050 1400 1750
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Extrao 2
Extrao 1
M
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s
s
a

a
c
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(
g
)
Vazao acumulada (m
3
)

64
5.4.1 ndice de refrao e cromatografia em camada delgada

O ndice de refrao de uma substncia a relao entre a velocidade da luz no
vcuo e a velocidade da luz na substncia testada (JORGE; LOPES, 2003) e constitui um
dos mais importantes parmetros pticos dos materiais, desempenhando um papel
importante em caracterizaes fsicas e qumicas das substncias. Medies precisas do
ndice de refrao de lquidos e variaes neste ndice, dependendo da concentrao de
solues, indicam as propriedades moleculares de compostos qumicos e a caracterizao
de lquidos em processos qumicos. Um conhecimento preciso do ndice de refrao
apresenta uma viso sobre a pureza e a reprodutibilidade do material para instrumentao
ptica (SAMEDOV, 2006).
A Figura 14 apresenta o ndice de refrao a 20 e 40 C dos extratos supercrticos de
semente de Pitanga, os quais variaram de 1,503 a 1,519 a 20C e de 1,490 a 1,510 a 40C.
Destaca-se tambm a similaridade dos ndices de refrao para os ensaios E9, E10 e E11,
os quais foram obtidos nas mesmas condies operacionais.

Figura 14 ndice de refrao dos extratos SFE de sementes de Pitanga a 20 e 40C.

O ndice de refrao encontrado nos extratos est de acordo com o que Baser e
Buchbauer (2010) afirmam, que para leos essenciais este ndice fica em uma escala de
1,4500 a 1,5900, a 20 C. Assim, pode-se dizer que os componentes presentes nos extratos
supercrticos de semente de Pitanga possuem esta caracterstica de leo essencial. Os
dados deste estudo esto similares aos de leos essenciais obtidos por outros mtodos,
como no trabalho de Bousbia et al. (2009), que obteve leo essencial de alecrim por micro-
ondas e hidrodifuso e para os dois mtodos, encontrou valores de 1,468 e 1,470,
1,475
1,480
1,485
1,490
1,495
1,500
1,505
1,510
1,515
1,520
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11
n
d
i
c
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d
e

r
e
f
r
a
o

Extratos de Semente de Pitanga
20C
40C

65
respectivamente. O leo essencial de tomilho obtido na pesquisa de Golmakani e Rezaei
(2008) por tcnicas como hidrodestilao assistida por micro-ondas e hidrodestilao
convencional tambm apresentou um ndice de refrao similar ao dos extratos da semente
de Pitanga, 1,503 a 20C.
A Figura 15 mostra a revelao de diversos compostos terpnicos em cromatoplacas,
totalizando sete substncias diferentes. Porm, nem todas aparecem em todos os extratos.
A exemplo, o composto 7 no aparece nos extratos 1, 2, 3 e 5. A presena destes
compostos terpnicos nos extratos Soxhlet, SC-EtOH e SC-EtOH purificado tambm so
diferenciados, havendo menor nmero de bandas que indicam os terpenos revelados. A
determinao qualitativa de terpenos por CCD revelou a presena destes compostos em
todos os extratos analisados, sugerindo que possuem leo essencial em sua composio, o
que convm com a anlise de ndice de refrao. Os leos essenciais so misturas
complexas que podem conter 100 ou mais compostos orgnicos. Seus constituintes podem
pertencer s mais diversas classes de compostos, porm os terpenos e os fenilpropenos
so as classes de compostos mais comuns. Os terpenos encontrados com maior frequncia
nos leos essenciais so os mono- e sesquiterpenos, bem como os diterpenos, que so
constituintes minoritrios (CASTRO et al., 2004).

Figura 15 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel
60 F254 com fase mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo para a
deteco de terpenos.

Naturalmente, os leos essenciais desempenham um papel importante na proteo
das plantas que os contm. Apresentam funes como agentes antibacterianos, antivirais,
antifngicos, inseticidas e tambm contra herbvoros por reduzir seu apetite pelas plantas.
Eles tambm podem atrair alguns insetos para favorecer a disperso de plen e sementes,
ou repelir outros indesejveis. Atualmente, cerca de 3.000 leos essenciais so conhecidos,
dos quais 300 so comercialmente importantes, principalmente para as indstrias

66

farmacutica, odontolgica, de alimentos, agronmica, sanitria, indstrias de cosmticos e
perfumes, para os mais diversos fins (BAKKALI et al., 2008).
Atravs da relao entre a medida da eluio dos compostos revelados e da fase
mvel na CCD, calculou-se o ndice de reteno para todos os componentes encontrados
(Tabela 12). Os extratos que tiveram o etanol como co-solvente na extrao supercrtica SC-
EtOH ou SC-EtOH purificado a apresentaram um componente distinto dos demais (C
6
) com
maior ndice de reteno e menor polaridade que os demais.
Terpenos provenientes de leos essenciais de plantas slica Gel 60 F
254
usando como
fase mvel tolueno e acetato de etila (93:7) mostram que alguns destes compostos tm
ndice de reteno em uma zona que varia de 0,2 0,9 aproximadamente (WAGNER;
BLADT, 2009), o que coincide com os ndices determinados experimentalmente neste
trabalho (Tabela 12).

Tabela 12 ndice de reteno dos compostos revelados pela Cromatografia em Camada
Delgada dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel 60 F
254
com fase
mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo.
EXTRATO C
1
C
2
C
3
C
4
C
5
C
6
C
7

SC-1 0,23 0,29 0,40 0,55 0,68 - -
SC-2 0,25 0,32 0,41 0,53 0,65 - -
SC-3 0,23 0,33 0,41 0,53 0,63 - -
SC-4 0,23 0,32 0,43 0,55 0,65 - 0,81
SC-5 0,21 0,33 0,43 0,55 0,68 - -
SC-6 0,21 0,32 0,43 0,55 0,68 - 0,86
SC-7 0,21 0,32 0,41 0,57 0,71 - 0,88
SC-8 0,18 0,23 0,34 0,44 0,72 - 0,89
SC-9 0,18 0,25 0,34 0,44 0,69 - 0,88
SC-10 0,18 0,25 0,34 0,44 0,69 - 0,86
SC-11 0,18 0,26 0,35 0,46 0,68 - 0,86
SOXHLET 0,20 0,26 - - 0,68 - 0,89
SC-EtOH - - - - - 0,78 0,91
SC-EtOH Purificado 0,20 0,26 - - - 0,78 0,94

Utilizando a mesma fase mvel, mas revelando com o radical livre DPPH, com o intuito
de verificar a atividade antioxidante, foi possvel visualizar manchas amarelas, indicativas da
inibio do radical livre (Figura 16). Assim, possvel que os terpenos revelados tenham
atividade antioxidante, tal como revela Souza et al. (2007), o qual afirma que comprovada
a ao provedora e termotolerncia, fotoprotetora e antioxidante de monoterpenos de

67
plantas, relacionadas especialmente sua capacidade de captar radicais de oxignio
oriundos do processo fotossinttico.

Figura 16 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga em Cromatografia de
Camada Delgada, em placa de Slica Gel 60 F
254
com fase mvel tolueno e acetato de etila
(93:7 v:v) e revelador uma soluo 0,05% do radical DPPH.

Em trabalho realizado por Zhao J. e colaboradores (2010), com leos essenciais de
diferentes espcies de crcuma a anlise de CCD, com revelador constitudo do radical
DPPH a 0,04%, indicou que os padres utilizados (curzereno, germacrone e furanodienone)
demonstraram atividade antioxidante. Nesta anlise os autores identificaram previamente
alguns compostos existentes no leo essencial com base no ndice de reteno. Ainda,
placas reveladas foram escaneadas para determinar a contribuio da ao antioxidante de
cada composto.
O efeito protetor de leos essenciais foi estudado, via modelagem, na bicamada
lipdica de membranas celulares por Beretta et al. (2011). Eles mostraram que alguns
componentes de leos essenciais exercem uma ao antiperoxidante por interagir rpido e
de maneira estvel com a face externa da bicamada fosfolipdica das membranas celulares
sendo este mais um indicativo de ao antioxidante de leos essenciais.

5.4.2 Composio voltil dos extratos

As Figuras 17 e 18 apresentam os cromatogramas de ons totais dos extratos
supercrticos de sementes de Pitanga, ensaios de 1 a 8 e de 9 a 11, respectivamente, bem
como o extrato Soxhlet. Na Figura 18 observa-se em destaque a ampliao da regio onde
os principais picos se concentram. Os extratos obtidos com CO
2
supercrtico modificado pelo

68

co-solvente (EtOH), diludos na mesma concentrao dos extratos obtidos quando SC-CO
2

foi empregado, no apresentaram os compostos volteis visualizados nas Figuras 18 e 19.
Nos cromatogramas, os picos que mais se destacam aparecem nos tempos de reteno
28,53 e 33,72 min, sendo, respectivamente, -elemeno e germacrone. Para cada extrato, a
Tabela 13 mostra a rea percentual dos volteis encontrados.
Entre os extratos supercrticos, os teores dos volteis majoritrios, -elemeno e
germacrone expressos pela soma da rea percentual dos picos, variaram de 75,18% a
81,60% nos extratos. Para o germacrone, a rea percentual dos picos variaram para as
diferentes condies operacionais, de 33,04% para o ensaio 6 at 38,02% para os ensaios 1
e 7. O -elemeno apresentou variao na rea percentual dos picos de 36,70% para o
ensaio 5 at 46,14 % para o ensaio 4.
Os extratos obtidos pelo mtodo de extrao Soxhlet tambm apresentam os volteis
majoritrios, porm em menores quantidades quando comparadas aos obtidos pelo
emprego de SC-CO
2
. O -elemeno aparece nos extratos entre 1,65 at 3,21 ppm em EqLim,
o furanodieno est presente de 0,57 a 0,80 ppm e a concentrao do germacrone varia de
1,85 at 2,72 ppm. Isso pode ser explicado pela alta temperatura empregada nesta
extrao, que ao longo das 6h de extrao promove a degradao das substncias mais
sensveis, a exemplo dos compostos terpnicos.

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71

Como ferramentas de identificao dos componentes presentes nos extratos, utilizou-
se primeiramente as bibliotecas NIST e NIST08 acopladas ao software. Os espectros de
massa do -elemeno e do germacreno dos extratos apresentaram uma porcentagem de
similaridade de 91 a 93% em comparao com os espectros existentes no programa. A
Figura 19 mostra o espectro de massa do -elemeno e do germacrone dos extratos de
semente de Pitanga bem como os espectros de massa dos mesmos compostos da
biblioteca NIST.
Em segunda instncia, calculou-se o ndice de Kovatz (eq.3) para os componentes e
comparou-se com os valores reportados na literatura, como mostrado na Tabela 13. Os
valores de IK calculados para os componentes volteis da semente de Pitanga so prximos
dos valores referenciados.
Em relao ao terceiro componente mais intenso, o furanodieno, a similaridade
mostrada pela biblioteca NIST e NIST08 indicava ser o curzereno, com valores de 71 a 77%
de semelhana entre o composto proveniente dos extratos e o padro apresentado pela
biblioteca. Calculando o ndice de Kovatz para esse componente observou-se uma grande
diferena com os valores de KI para o curzereno disponveis na literatura, em torno de 1470
e o valor encontrado neste estudo, 1650.
Um estudo recentemente realizado por Chang e colaboradores (2011) analisou a
influncia das condies de anlise de cromatografia gasosa sobre a quantificao de
substncias termossensveis como os compostos volteis em leo essencial de Pitanga. Foi
visualizada a converso estrutural de furanodieno a curzereno sob condies de
aquecimento da rampa de temperatura da coluna similares realizada neste estudo, e, sob
condies brandas de corrida esta converso no foi verificada pelo autores. De acordo com
esse trabalho, possvel que se tenha concentraes parciais de cada um dos compostos
(furanodieno e curzereno) nos extratos, porm, levando em considerao o KI calculado e
aqueles reportados na literatura, foi considerado que a substncia presente na frao voltil
da semente de Pitanga o furanodieno.
Os componentes encontrados, germacrone, furanodieno e -elemeno pertencem ao
grupo dos sesquiterpenos germacranos, aos quais so atribudos vrios efeitos, tais como
de intermedirios de biossntese de vrios sesquiterpenos, como feromnios sexuais e de
alarmes, anti-inflamatrio, agentes anticancergenos, atividade antiplasmodial, atividades
antibacteriana e antifngica, atividade fitotxica, inibidor de necrose tumoral, atividade
nematicida, atividade citotxica, atividade inibitria de tirosinase e outras diversas atividades
biolgicas (ADIO, 2009).

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73

Estudos sobre a atividade biolgica do germacrone so limitados. No entanto,
pesquisas demonstraram que este composto exerce atividade antitumoral pela induo a
apoptose de clulas de cncer de pulmo (ZHONG et al., 2011). Na China, o leo essencial
de Curcuma zedoaria administrado como medicamento e o germacrone, que aparece na
sua formulao como um dos principais componentes, to importante que chega a ser
considerado uma substncia chave no controle de qualidade da produo deste leo
essencial (ZHAO, Y. et al., 2010).
Furanodieno, o terceiro sesquiterpeno mais intenso nos extratos de semente de
Pitanga, foi identificado por possuir efeitos analgsicos, efeitos anti-inflamatrios e efeitos
protetores sobre leso heptica induzida por D-galactosamina/lipopolissacardeo ou de
necrose tumoral fator-alfa. Este resultado demonstrou que furanodieno tem efeito de
proteo sobre a funo imunolgica. O furanodieno no s tem ao antitumor direta, mas
tambm pode ter outras atividades, tais como melhorar a funo imunolgica do corpo e
ativar a capacidade antitumoral do prprio organismo, o que indica que furanodieno
vantajoso em comparao com as atuais drogas clnicas quimioterpicas. Ele mostra
potencial para ser um agente antitumor clinicamente eficaz, devido ao seu potente efeito
anticncer e baixa toxicidade (BA et al., 2009).
Para compreender de que forma as variveis operacionais influenciam a presena de
um componente isolado no extrato, foi aplicada a metodologia de superfcie de resposta
para chegar s condies operacionais que favoreceriam o fracionamento desses
compostos. A concentrao destes sesquiterpenos foi determinada por normalizao
externa como descrito no item 4.4.3. A concentrao (ppm) dos dois principais componentes
presentes no extrato (germacrone e -elemeno) em equivalente de limoneno (EqLim) foi
determinada para os 11 ensaios (Tabela 9).
Em relao ao germacrone, o diagrama de Pareto (Figura 20) mostra que a presso e
a interao entre presso e temperatura exerceram influncia significativa, ao nvel de 95%
de significncia, na obteno deste sesquiterpeno nos extratos. Para o -elemeno, pode ser
observado que somente a interao entre a presso e temperatura foi significativa.
A Tabela 14 mostra os modelos matemticos, linear e quadrtico, que relacionam o
comportamento das variveis (P e T) com a concentrao de germacrone (eqs. 8 e 9) e -
elemeno (eqs. 10 e 11) presentes nos extratos. Para o germacrone, o coeficiente de
regresso para o modelo de primeira ordem 0,80 e de segunda ordem 0,72. Pelo valor
dos coeficientes, nota-se que os modelos no tm uma boa capacidade preditiva. O mesmo
pode-se dizer para os coeficientes de regresso para os modelos de -elemeno, os quais
so 0,83 para o de primeira ordem e 0,53 para o de segunda ordem.


74

A

B
Figura 20 - Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na obteno de
germacrone (A) e -elemeno (B) nos extratos supercrticos de semente de Pitanga.

Tabela 14 - Coeficientes de regresso para modelos linear e quadrtico que simulam a
concentrao dos sesquiterpenos (Germacrone e -elemeno) nos extratos de semente de
Pitanga obtidos com CO
2
supercrtico.
Resposta Coeficientes de regresso
Concentrao de Germacrone (ppm EqLim)
Linear
Quadrtico
R= 18,673 - 5,615P 7,960PT
R= 14,363 - 2,660P + 3,475P - 7,960PT
[8]
[9]
Concentrao de -elemeno (ppm EqLim)
Linear
Quadrtico
R= 21,457 7,185PT
R= 18,072 - 7,185PT
[10]
[11]

Em concordncia com o diagrama de Pareto e os modelos apresentados, as anlises
de varincia (Tabelas 15 e 16) demonstram, atravs da comparao dos valores de F
calculado (F
calc
) e o F tabelado com 5% de probabilidade (F
tab
), que h pelo menos uma das
variveis influenciando a concentrao destes sesquiterpenos no extrato supercrtico das
sementes de Pitanga j que o F
calc
foi consideravelmente maior que o F
tab
para os dois
componentes.
Similar ao que ocorre com o germacrone, embora no se tenha modelos que
consigam predizer adequadamente os valores experimentais para o -elemeno, a anlise de
varincia mostrou significncia ao nvel de 95% para os modelos linear e quadrtico, como
apresenta a Tabela 16.


75

fatores para a concentrao de germacrone (ppm EqLim) dos extratos.
Fonte de
Variao
Soma dos
Quadrados SQ
Graus de
Liberdade GL
Quadrado
mdio QM
F
calculado
F
tabelado

Regresso (R) 509,452 2 180,241 98,762 6,94
Resduo (r) 5,182 4 1,825
Total (T) 514,634 6
Fonte de
Variao
Soma dos
Quadrados SQ
Graus de
Liberdade GL
Quadrado
mdio QM
F
calculado
F
tabelado

Regresso (R) 534,547 3 178,183 240,78 4,35
Resduo (r) 5,182 7 0,740
Total (T) 539,729 10
Ftabelado com 95% de confiana

fatores para a concentrao de -elemeno (ppm EqLim) dos extratos.
Fonte de
Variao
Soma dos
Quadrados SQ
Graus de
Liberdade GL
Quadrado
mdio QM
F
calculado
F
tabelado

Regresso (R) 410,917 1 410,917 140,87 6,61
Resduo (r) 14,584 5 2,9168
Total (T) 425,501 6
Fonte de
Variao
Soma dos
Quadrados SQ
Graus de
Liberdade GL
Quadrado
mdio QM
F
calculado
F
tabelado

Regresso (R) 505,239 1 505,239 311,68 5,12
Resduo (r) 14,585 9 1,621
Total (T) 519,824 10
Ftabelado com 95% de confiana

Na avaliao das variveis operacionais dos modelos de segunda ordem para a
concentrao dos dois sesquiterpenos, a anlise da superfcie de resposta indicou que,
dentro da faixa estudada, altas temperaturas e baixas presses proporcionam uma maior
concentrao destes volteis nos extratos (Figura 21). Estas condies so inversas ao
rendimento do extrato. Valores de alta temperatura favorecem a extrao de componentes

76

volteis demonstrando que, para estas situaes, a influncia desta varivel na presso de
vapor dos componentes pode ser o fator mais importante a ser considerado na extrao
supercrtica, tal como pode ser visualizado na Tabela 9.

A
B
efeitos das variveis independentes na concentrao de germacrone (21.A) e -elemeno
(21.B) nos extratos.

Embora no se possa avaliar pontualmente a influncia de altos valores da
temperatura e baixas densidades, j que a faixa de temperatura estudada nestes ensaios
so relativamente baixas, de 30 a 60
C aproximadamente, nota-se que o experimento cuja

menor densidade do CO
2
foi aplicada, foi aquela que resultou na maior concentrao dos
dois principais sesquiterpenos para um valor de temperatura de 55
C. Essa temperatura
dentro do delineamento experimental aplicado nesse estudo elevada, mas comparado a
outros mtodos de extrao, como o arraste a vapor, ainda pode ser considerada branda.
Na verdade, hidrocarbonetos monoterpenos como compostos no-polares de peso
molecular relativamente baixo so muito solveis em SC-CO
2
e, portanto, altamente
provvel que eles possam ser completamente extrados da matriz. Devido sua alta
volatilidade, no entanto, eles se separam apenas parcialmente do CO
2
gasoso e se
precipitam no coletor; e uma outra parte escapa dissolvida no gs. Assim, no caso de
monoterpenos mais correto medir a eficincia da coleta do extrato do que o rendimento de
extrao (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).


77
5.5 Anlise da Bioatividade do extrato Supercrtico de Semente de Pitanga

5.5.1 Quantificao dos compostos fenlicos totais

Compostos fenlicos so substncias ativas provenientes do metabolismo secundrio
encontrados em muitas plantas, mas suas propriedades antioxidantes e vrias outras aes
biolgicas especficas ainda no so bem conhecidas. Eles so empregados com frequncia
como antioxidantes naturais em alimentos, produtos farmacuticos e cosmticos (PIANTINO
et al., 2008).
A Tabela 9 mostra os resultados da concentrao de compostos fenlicos totais dos
extratos supercrticos para cada ensaio baseado no DCCR. Os compostos fenlicos totais
variaram de 18,08 a 73,48 ppm de GAE nos extratos. Verifica-se que os extratos obtidos
tm uma quantidade considervel de compostos fenlicos totais devido a baixa polaridade
que no se apresenta favorvel a extrao desta classe, mas quando feita a equivalncia
para a massa da semente, devido ao rendimento baixo das extraes em geral, a
concentrao final diminui (0,010 a 0,034 mg GAE100
-1
g sementes).
Neste estudo, o comportamento das variveis estudadas (P e T) na quantidade de
compostos fenlicos totais, mostra que nenhum destes fatores influenciou na extrao de
mais ou menos compostos fenlicos quando estas variveis foram modificadas no processo.
A no significncia de cada uma destas variveis no processo ou mesmo da interao entre
elas pode ser visualizada atravs do diagrama de Pareto (Figura 22).

Figura 22 - Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na quantidade de
compostos fenlicos dos extratos de semente de Pitanga.


78

Como era esperada, a anlise de varincia mostrou que no houve significncia das
fatores estudados no processo ao nvel de 95% do limite de confiana para ambos os
modelos (dados no mostrados). Os coeficientes de determinao (R
2
) calculados foram
0,50 para o modelo linear e 0,71 para o modelo quadrtico e este fato indica tambm que os
modelos gerados no possuem boa capacidade preditiva quanto ao comportamento da
concentrao de fenlicos totais nos extratos quando diferentes condies de T e P so
empregadas no processo.
Muito do interesse dos compostos fenlicos das plantas so em flavonides. Os
flavonides so alguns dos compostos antioxidantes mais poderosos e eficazes disponveis
para os seres humanos que so incapazes de produz-los, por isso devem ser ingeridas a
partir dos alimentos e suplementos. Vrios estudos tm mostrado que a ingesto normal de
flavonides atravs da ingesto de uma variedade de frutas e legumes no suficiente para
manter os nveis recomendados de radicais livres sob controle (PALANISAMY et al., 2008).

5.5.2 Quantificao da atividade antioxidante

O mtodo DPPH baseado na medio espectrofotomtrica da variao da
concentrao de DPPH resultante da reao do DPPH com um composto antioxidante.
Durante a reao, a molcula de DPPH com um eltron de valncia desemparelhado no
tomo de nitrognio reduzido por um tomo de hidrognio a partir do antioxidante. A
atividade antioxidante dos compostos analisados determinada a partir da cintica desta
reao (DAWIDOWICZ; WIANOWSKA; OLSZOWY, 2012).
A Tabela 17 apresenta o percentual de inibio do radical DPPH pelos diferentes
extratos de semente de Pitanga. A atividade antioxidante dos extratos obtidos por EFS
baixa se comparado aos demais, pois nesse estudo utilizou-se concentraes dos extratos
em at 10.000 ppm e no se chegou a 50% de atividade redutora do radical DPPH. Os
extratos supercrticos de rambutam, planta nativa do sudeste asitico, tambm no exibiram
qualquer atividade antioxidante frente ao radical DPPH (PALANISAMY et al., 2008), porm
os seus resduos quando extrados com etanol apresentaram potencial similar aos extratos
etanlicos obtidos neste trabalho. O extrato supercrtico das folhas de Pitanga tambm
exibem uma atividade bastante reduzida frente ao radical DPPH (MARTINEZ-CORREA et
al., 2011). O mtodo que avalia a atividade antioxidante pelo uso de DPPH no o mais
adequado para os extratos obtidos por EFS, pois este radical interage mais especificamente
com compostos hidroflicos e os extratos provenientes da extrao supercrtica sem
modificadores so de maneira geral hidrofbicos.

79

O uso do co-solvente (SC-EtOH) de fato aumentou a capacidade antioxidante deste
extrato, destacando a atividade de 94,20% para a concentrao de 5.000 ppm. Diferente do
que seria esperado, as concentraes maiores de extrato exibem uma atividade antioxidante
menor. Esse comportamento tpico de atividade pr-oxidante e faz parte do mecanismo de
ao das substncias antioxidantes. Uma vez ultrapassado a concentrao antioxidante
mxima, o excesso assume uma caracterstica oposta e induz mecanismos de oxidao. Dai
e Mumper (2010) afirmam que antioxidantes fenlicos se comportam como pr-oxidantes
nas condies que favoream sua auto-oxidao, por exemplo, em pH elevado, com altas
concentraes de ons de metal de transio e em presena de molcula de oxignio.
Fenlicos de cadeia curta que so facilmente oxidados, como a quercetina, cido glico,
possuem atividade pr-oxidantes, enquanto alto peso molecular de compostos fenlicos,
como taninos condensados hidrolisveis, tm atividade pr-oxidante pouca ou nenhuma.

Tabela 17 Atividade antioxidante dos extratos de semente de Pitanga pelo percentual de
inibio do radical DPPH em trs concentraes e pelo mtodo de varredura do radical
ABTS.
Extratos
DPPH ABTS
(M Trolox ppm
-1

extrato)
10.000 ppm 7.500 ppm 5.000 ppm
SC (ensaio 1 E1) 12,99 7,56 6,07 0,089
SC (ensaio 2 E2) 16,99 8,17 5,94 0,074
SC (ensaio 3 E3) 10,67 5,59 4,99 0,073
SC (ensaio 4 E4) 21,4 17,06 5,38 0,102
SC (ensaio 5 E5) 17,58 10,35 5,37 0,021
SC (ensaio 6 E6) 22,29 15,23 6,68 0,117
SC (ensaio 7 E7) 12,62 15,43 6,68 0,040
SC (ensaio 8 E8) 11,83 13,25 6,53 0,079
SC (ensaio 9 E9) 13,02 14,1 6,33 0,070
SC (ensaio 10 E10) 14,45 9,99 6,71 0,073
SC (ensaio 11 E11) 13,80 7,60 7,89 0,141
Soxhlet 35,51 34,79 14,60 0,040
SC-EtOH 19,85 24,94 94,20 0,611
SC-EtOH Purificado 13,05 11,60 34,52 0,136
Mdias de trs repeties; Extrato supercrtico (SC); Extrato supercrtico com etanol como co-solvente (SFE-
EtOH), frao purificada do extrato supercrtico com etanol como co-solvente (SFE-EtOH Purificado).

Ultimamente, tem sido proposto que a ao pr-oxidante poderia ser um mecanismo
de ao importante para as propriedades anticncer e induo de apoptose do resveratrol.

80

Alm disso, foi demonstrado que h uma correlao interessante entre as atividades
antioxidante e pr-oxidante e citotoxicidade de polifenis na dieta. Cada antioxidante na
verdade um agente redox (reduo-oxidao) e, portanto, pode se tornar um pr-oxidante
para acelerar a peroxidao lipdica e/ou induzir danos ao DNA em condies especiais.
Estudos tm revelado efeitos pr-oxidantes das vitaminas antioxidantes e vrias classes de
polifenis derivados de plantas, tais como flavonides, taninos e curcumina (LASTRA;
VILLEGAS, 2007).
Provavelmente, as concentraes do extrato supercrtico com co-solvente nas anlises
de atividade antioxidante encontravam-se na faixa de transio antioxidante/pr-oxidante j
que a atividade foi menor para as maiores concentraes (Tabela 17). O extrato SC-EtOH
purificado, tambm conservou essa caracterstica, porm com uma capacidade antioxidante
menor, 34,52%. A purificao do extrato aplicada neste trabalho foi direcionada para
eliminao de taninos com alto grau de polimerizao. O procedimento adotado pode, se as
propores de solvente no forem mantidas, extrair tambm outros compostos fenlicos.
Pelo fato dos extratos obtidos com SC-EtOH certamente no possurem elevada quantidade
de polmeros com alto grau de polimerizao, possivelmente outros componentes foram
eliminados no processo de purificao.
A Tabela 17 apresenta os resultados dos ensaios de atividade antioxidante pelo
mtodo de varredura do radical ABTS. Os resultados expressam a quantidade, em M, de
Trolox equivalente em 1 ppm de extrato. Como pode ser observado, os extratos possuram
diferentes respostas, que variaram no extrato de 0,021 a 0,611 M Trolox.ppm
-1
de extrato.
Esses valores so considerados baixos quando comparados com polpas de frutas, que em
estudo de Kuskoski et al. (2005), reportou valores de 2,0 (polpa de cupuau) a 67,6 (polpa
de acerola) M de Trolox equivalente para diversas polpas de frutas estudadas. Mais uma
vez, o extrato obtido pela extrao supercrtica com o co-solvente obteve a maior
concentrao de Trolox equivalente. O extrato supercrtico E5, proveniente da extrao em
condies brandas e com a menor densidade do fluido, foi o que apresentou a menor
capacidade antioxidante.
De acordo com Wootton-Beard, Moran e Ryan (2011), pode-se identificar diferenas
entre os resultados que podem ser atribudos aos mecanismos dos prprios mtodos. Em
primeiro lugar, o ensaio ABTS
+
uma transferncia de eltrons, em que compostos
antioxidantes diferentes doam um ou dois eltrons para reduzir o radical catinico.
Independentemente do potencial de doao de antioxidantes individuais, todos eles tm
tempo para reagir completamente dando uma medio precisa da atividade antioxidante
total no ponto final do ensaio. O ensaio de inibio do radical DPPH baseada na reao
normal de transferncia de tomo de hidrognio que ocorre entre os antioxidantes e os
radicais peroxila. Em vez de radicais peroxila, radicais de nitrognio mais estveis e menos

81

transitrios so criados, com a qual alguns antioxidantes reagem mais lentamente do que
seria com o radical peroxila em um sistema biolgico.

5.5.3 Determinao da atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana do extrato supercrtico, daquele obtido por Soxhlet, do
extrato obtido pelo SC-EtOH e da sua respectiva frao purificada foi testada para
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis. As
diluies empregadas e a metodologia seguida esto descrita no item 4.4.7 deste trabalho.
Os testes aplicados tiveram por objetivo a determinao da concentrao inibitria mnima
(CIM) e sua relao com a composio dos diferentes extratos ricos em compostos
terpnicos extrados via Soxhlet ou utilizando CO
2
supercrtico ou em compostos com maior
polaridade, como aqueles dos extratos provenientes da extrao com co-solvente e a sua
frao purificada.
A Figura 23 mostra a diluio seriada das amostras submetidas anlise da CIM,
segundos aps a incubao e depois de 24h. A interpretao dos resultados foi feita pela
anlise visual dos tubos contendo o caldo e os microrganismos comparando-os com o
controle negativo, sem crescimento bacteriano.
A concentrao inibitria mnima ou a mais baixa concentrao onde no ocorre
desenvolvimento microbiano foi de 125 ppm para todos os extratos (Tabela 18). Embora se
conhea que as bactrias Gram (-) so mais resistentes agresso de substncias
antibiticas oriundas de plantas pela complexidade maior da sua parede celular do que as
bactrias Gram (+), neste trabalho no houve diferenas na atividade dos extratos aplicados
entre as cepas utilizadas. Assim como no estudo realizado por Bouzada et al. (2009), os
resultados no evidenciam a maior sensibilidade das bactrias Gram (+).


82

Tubos logo aps a inoculao dos extratos com os micro-organismos

Tubos 24 horas aps a inoculao dos extratos
Figura 23 - Diluio seriada do extrato supercrtico de semente de Pitanga para
determinao da concentrao inibitria mnima.

Os resultados apontaram que uma concentrao dos diferentes extratos de 125 ppm
capaz de inibir o crescimento dos micro-organismos testados. Alguns estudos indicam que
os leos essenciais tm uma maior atividade antibacteriana do que uma mistura de seus
principais componentes. Isso porque os componentes minoritrios presentes no leo
essencial so importantes para a atividade dos componentes principais, e a combinao
entre eles pode produzir um efeito sinrgico. Exemplificando, cnfora e eucaliptol,
componentes gerais dos leos essenciais de muitas plantas, possuem grupos oxigenados
em sua estrutura e estes grupos so responsveis por aumentar a atividade antimicrobiana
de terpenides. Desse modo, pela composio dos leos essenciais, as combinaes de
diferentes componentes bioqumicos podem aumentar a eficcia antimicrobiana
distintamente (LV et al., 2011).
A literatura cientfica divulga a CIM de alguns extratos obtidos por extrao com fludo
supercrtico, por exemplo, Oliveira (2010) analisou extratos supercrticos de bagao de uva
obtidos em diferentes condies de P e T e apresentou valores de CIM superiores a 500
ppm para S. aureus e acima de 1.000 ppm para E. coli. Extratos supercrticos de cogumelo

83

shiitake foram testados por Kitzberger (2005), em Micrococcus luteus e Bacillus cereus. e
para os seus diferentes extratos, a menor CIM foi de 250 ppm. Outro estudo, realizado por
Busatta (2006), com extrato supercrtico de organo e manjerona no indicou atividade
antibacteriana logo no teste de formao do halo de inibio. Em comparao com todos
esses estudos, nota-se que os resultados encontrados com os extratos de semente de
Pitanga so promissores, indicando uma alta inibio do crescimento de micro-organismos,
visto que a concentrao inibitria encontrada foi menor que todos os estudos
referenciados.

Tabela 18 - Concentrao inibitria mnima (ppm) dos diferentes extratos de semente de
Pitanga.
Micro-organismos Gram
Extratos
Extrato-9 Soxhlet SC-EtOH Purificado
Escherichia coli - 125 125 125 125
Staphylococcus aureus + 125 125 125 125
Pseudomonas aeruginosa - 125 125 125 125
Bacillus subtilis + 125 125 125 125
Mdias de 3 repeties.

Em estudo realizado por Bouzada et al. (2009), que utilizou extrato metanlico de
folhas de Pitanga, chegou-se a altos valores de atividade antimicrobiana, com zonas de
inibio de 1,9 e 2,2 cm contra Salmonella typhimurium e Shigella sonnei, respectivamente.
Ao contrrio do que era esperado, o extrato etanlico das folhas de Pitanga no exibiu
qualquer efeito antimicrobiano contra Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus (COUTINHO et al., 2010). A divergncia entre resultados oriundos
de uma mesma matriz refora a ideia de que a escolha do mtodo de extrao crucial para
a visualizao de diversas atividades biolgicas.

5.5.4 Determinao da inibio da enzima arginase

Na Leishmania, a arginase responsvel pela produo da ornitina, um aminocido
precursor de poliaminas requeridas na proliferao do parasita, desta forma a ao inibitria
desta enzima age no controle desta doena.
Os extratos utilizados nestes experimentos foram: o extrato supercrtico (SC) obtido
nas condies de 175 Kgf.cm
-2
e 45C, ponto central do DCCR (Tabela 9), extrato obtido
pelo mtodo Soxhlet, extrato supercrtico em que se utilizou etanol como co-solvente (SC-

84

EtOH) e a frao purificada do extrato supercrtico com etanol como co-solvente (SC-EtOH
Purificado) todos diludos a 1.000 ppm em metanol. Na Tabela 19 visualiza-se a
porcentagem de inibio da arginase isolada de fgado de rato e produzida da prpria
Leishmania para estes diferentes extratos determinada por ensaio espectrofotomtrico.

Tabela 19 - Porcentagem (%) da atividade de inibio da arginase isolada de fgado de rato
e da Leishmania
Arginase de fgado de rato
Extrato SC SC-EtOH SC-EtOH Purificado Soxhlet
14,99 42,37 23,66 33,65
Arginase de Leishmania
SC SC-EtOH SC-EtOH Purificado Soxhlet
21,01 48,48 17,93 37,59
Mdias de 3 repeties.

Os resultados mostram que o extrato obtido quando etanol foi usado como co-solvente
na extrao supercrtica (SC-EtOH) foi o que apresentou maior atividade inibitria da
arginase. Este comportamento indica que os compostos com maior polaridade, que so
extrados devido alterao da solubilidade do CO
2
pelo etanol (solvente polar) agem com
maior eficincia na inibio desta enzima. Nada se pode inferir sobre o modo de inibio da
enzima, mas sabe-se que algumas substncias conseguem se ligar ao complexo arginase-
L-arginina e desse modo deslocar o on hidrxido que ligado ao stio de mangans
presente na enzima. O deslocamento desse on hidrxido faz a enzima perder a sua funo
e dessa forma ela no consegue metabolizar a arginina (TORMANEN, 2003).
A importncia da inibio da arginase pode ser vista por dois prismas. O primeiro
que quando esta enzima inativada, prejudica o metabolismo vital do protozorio
Leishmania, atividade com enfoque neste trabalho e, desse modo pode contribuir no
controle da patologia causada por ele (SILVA et al., 2002). Por outro lado, estudos tm
mostrado que a inibio da arginase aumenta a funo endotelial e diminui a presso
sangunea em mamferos, o que pode contribuir para o desenvolvimento de novas drogas
que combateriam a hipertenso arterial (BAGNOST et al., 2009).
Com os resultados obtidos, constata-se que o extrato supercrtico de sementes de
Pitanga, principalmente aqueles obtidos quando etanol foi usado como co-solvente pode ser
objeto de estudos no desenvolvimento de medicamentos que possam atuar na inibio da
arginase no controle da leishmaniose e como medicamento para hipertenso.


85

6 CONCLUSES

Os extratos supercrticos de sementes de Pitanga foram caracterizados com relao a
presena de alguns componentes e foram realizados testes de bioatividade cujos resultados
mostram possveis aplicaes em campos diversificados. O rendimento da extrao mostrou
ser maior quando realizado sob altas presses, e a no influencia da temperatura indica que
baixos valores desta varivel podem ser usados no processo, o que no agride os
componentes termolbeis, alm de economizar no consumo de energia. Os compostos
fenlicos apresentaram uma concentrao elevada nestes extratos. Mesmo o CO
2

supercrtico no tendo afinidade pela extrao de compostos polares tanto que nenhum dos
fatores estudados influenciaram positiva ou negativamente na sua obteno.
O perfil de volteis realizado por CG/EM indicou como componentes majoritrios nos
extratos os sesquiterpenos -elemeno e germacrone, que desempenham inmeras
atividades biolgicas como reporta a literatura. A presena de volteis, terpenos, foi
demonstrada previamente por CCD, que tambm apresentou resultados positivos para a
respectiva atividade antioxidante. Assim, estes compostos apolares altamente solveis em
CO
2
supercrticos tambm tm esta bioatividade.
A atividade antioxidante embora presente, quantitativamente mostrou ser baixa, tanto
quando analisada pelo mtodo de inibio do radical DPPH quanto pelo ABTS. Porm, o
extrato obtido quando etanol foi usado como co-solvente mostrou-se mais ativo, diferente
dos demais. Ele tambm se destacou na inibio da arginase, com quase 50% de atividade
inibidora desta enzima. Quanto ao ensaio antimicrobiano, todos os extratos, independente
da polaridade do solvente de extrao, obtiveram uma concentrao mnima inibitria
elevada, superior a muitos outros extratos supercrticos.
Frente ao exposto, nota-se que estudo da semente de Pitanga atravs da aplicao da
tecnologia supercrtica gerou uma caracterizao inovadora e que abre espao para mais
pesquisas, direcionadas a busca por resultados mais promissores.


86

7 SUGESTO PARA TRABALHOS FUTUROS

Este grupo de pesquisa sentiu-se motivado a investigar uma matriz vegetal pouco
estudada tal como a semente de Pitanga, pertencente a uma planta com inmeras
propriedades reconhecidas pela literatura. Porm, sabe-se que numa pesquisa cientfica
coerente, necessrio delimitar os objetivos do trabalho de modo a torn-lo executvel
dentro de um determinado prazo. Sendo assim, esta dissertao, que aborda o estudo dos
extratos supercrticos de sementes de Pitanga apresentou resultados consistentes com os
objetivos vislumbrados. Entretanto, o estudo de tais extratos ser continuado, com vistas a
abranger aspectos diferenciados da sua caracterizao. Dessa forma, em complementao
ao trabalho apresentado, ainda esto previstas anlises futuras com os extratos
supercrticos de sementes de Pitanga, como apontado a seguir:
Quantificao do teor de flavonides presentes, visto que outros estudos apontam ser
este o principal grupo constituinte da frao fenlica quantificada neste estudo;
Anlise do perfil sensorial dos extratos por CG-olfatometria (Sniffing), onde se
pretende determinar a contribuio odorfera de cada composto voltil na composio
do perfil sensorial dos extratos;
Anlise de perfil de cidos graxos, para determinar qual classe de lipdios (saturados
ou polinsaturados) est presente nos extratos e
Quantificao da atividade antioxidante pelo mtodo do -caroteno, que se configura
como o mtodo mais adequado para visualizao desta bioatividade em extratos
constitudos na grande maioria por compostos apolares.


87

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

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C aproximadamente, nota-se que o experimento cuja

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