UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS – UFAL

ESCOLA DE ENFERMAGEM E FARMÁCIA – ESENFAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENFERMAGEM – MESTRADO

CAMILA MOREIRA VASCONCELOS

Avaliação da migração celular, atividade antinflamatoria e antimicrobiana da Hyptis

pectinata L. Poit.: estudos in vitro e in vivo com vistas ao tratamento de feridas

MACEIÓ
2018
 CAMILA MOREIRA VASCONCELOS

Avaliação da migração celular, atividade antinflamatoria e antimicrobiana da Hyptis

pectinata L. Poit.: estudos in vitro e in vivo com vistas ao tratamento de feridas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Enfermagem da Universidade Federal
de Alagoas, na área de concentração Enfermagem no
Cuidado em Saúde e na Promoção da Vida e linha de
pesquisa Enfermagem, ciência, tecnologia e inovação
para o cuidado, sob orientação da Prof.ª Dr.ª Maria
Lysete de Assis Bastos

MACEIÓ
2018
 Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico Bibliotecária
Bibliotecário: Marcelino de Carvalho

V331a Vasconcelos, Camila Moreira.

Avaliação da migração celular, atividade antiflamatoria e antimicrobiana da
Hyptis pectinata L. Poit. : estudos in vitro e in vivo com vistas ao tratamento de feridas
/ Camila Moreira Vasconcelos. – 2019.
84 f. : il. color.

Orientadora: Maria Lysete de Assis Bastos.

Dissertação (Mestrado em Enfermagem) – Universidade Federal de Alagoas.
Escola de Enfermagem e Farmácia. Maceió, 2018.

Bibliografia: f. 72-84.

1. Plantas medicinais. 2. Hyptis pectinata. 3. Anti-Inflamatórios. 4. Cicatrização. I.

Título.

CDU: 633.88
Primeiramente a Deus, por ser essencial em minha
vida, autor de meu destino, meu guia, socorro
presente nos momentos mais difíceis. À minha família,
principalmente meus pais, José Eugênio e Alda
Maria, e meu irmão Ítalo, por serem sempre presentes
e atuantes em minha vida. Ao meu noivo, Rodrigo,
por todo amor e companheirismo. E à professora
Lysete, essencial em minha carreira acadêmica.
 AGRADECIMENTOS

Sou grata a Deus, o único e verdadeiro mestre no real sentido da palavra, pela luz
que guia meus passos e pela graça recebida de encerrar mais uma etapa na minha vida,
renovando os meus caminhos para um novo amanhecer;

Aos meus pais, Eugênio e Alda, por todo seu amor, momentos de compreensão e
suporte, e por sempre lutarem, incentivarem, investirem e acreditarem em minha educação;

Ao meu irmão Ítalo, que mesmo à distância, tornou-se meu maior orgulho, além de
ter me oferecido com o presente mais lindo da minha vida, a minha afilhada Maria Emanuele,
que, embora ainda muito pequena para compreender, é responsável por despertar um amor tão
puro e profundo, o qual renova minhas energias com alegria e esperança e dá sentido especial
à minha existência;

Ao meu noivo Rodrigo, minha fortaleza e meu conselheiro, por todo amor, carinho,
cuidado, paciência e apoio, por escutar minhas angústias e me incentivar com palavras de
enconrajamento, e por sempre acreditar em minha capacidade, nunca me deixando desistir nos
momentos de dificuldade;

À minha orientadora, professora Dra. Maria Lysete, pela sua dedicação em mais uma
orientação direcionada a mim e por sempre estar presente em minha vida acadêmica, pela
confiança em mim depositada, pela amizade, paciência e pelos ensinamentos tão valiosos que
nunca serão esquecidos;

Às docentes do Programa de Pós-Graduação em Enfermagem (PPGENF/UFAL) por

todo aprendizado transmitido durante as disciplinas cursadas;

Aos funcionários da Secretaria do Mestrado, em especial à Monique, por todo

suporte e esclarecimentos de dúvidas pertinentes ao decorrer do curso;

À professora Dra. Jamylle Souza Ferro, pela disponibilidade e por ter acompanhado
com muita paciência os testes de citotoxidade e cicatrização in vitro e ao seu aluno,
Julianderson Oliveira, que também foi fundamental para realização destes testes;

À professora Dra. Círia Vieira Barbosa, por todo auxílio, suporte e disponibilização
do laboratório bem como ao seu aluno Jefferson, também essencial em várias etapas desta
pesquisa;
 Ao Ednaldo, técnico do Laboratório de Química Medicinal, ao doutorando Edeíldo e
o mestrando Paulo, por ter acompanhado e auxiliado no teste de triagem fitoquímica e na
partição dos extratos brutos;

À professora Dra. Eliane Aparecida Campesatto e ao mestrando Geraldo Neto do

Laboratório de Farmacologia e Imunidade (LaFI) - ICBS/UFAL, pela disponibilidade,
paciência e por ter contribuído no teste, in vivo, de peritonite aguda induzida por carragenina;

Aos integrantes dos Laboratório de Pesquisa em Tratamento de Feridas (LpTF) por

todo auxílio na realização das atividades práticas rotineiras, em especial às alunas Ingrid,
Larissa, Roberta, Nathália, Hallana e Mariana. Pela imprescindível colaboração durante o
ensaio in vivo, agradeço, em especial, aos alunos Igor, Ancila, Brenda e Elizabeth; aos
mestrandos Joice, Wanderlei, Jefferson e Lucianna; à doutoranda Maria Gabriella; e às
professoras Dra. Regina Sales, Dra. Patrícia Sarmento, Dra. Fabiana Soares e Dra. Adriana
Todaro. À técnica Juscenir dos Santos, por toda tranquilidade, disponibilidade, suporte,
empenho, competência e profissionalismo para manter o laboratório organizado e ativo;

À minha turma de mestrado, pelos momentos de alegrias e descontração

compartilhados e apoio nos momentos difíceis durante essa caminhada;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), pelo

apoio financeiro;

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desse trabalho;

E às dificuldades que surgiram, pois ao serem superadas, tornam essa conquista mais
valiosa e gratificante.

Muito obrigada!
Não há ensino sem pesquisa e pesquisa sem
ensino. Esses que-fazeres se encontram um no
corpo do outro. Enquanto ensino continuo
buscando, reprocurando. Ensino porque busco,
porque indaguei, porque indago e me indago.
Pesquiso para constatar, constatando, intervenho,
intervindo educo e me educo. Pesquiso para
conhecer o que ainda não conheço e comunicar
ou anunciar a novidade.
Paulo Freire
 RESUMO

A espécie vegetal Hyptis pectinata, popularmente conhecida como sambacaitá ou canudinho,

têm recebido destaque por suas propriedades biológicas, principalmente relacionadas às
atividades cicatrizantes e antinflamatórias, e pelo amplo uso popular para tratar diversas
afecções. Desta forma, objetiva-se avaliar a atividade antinflamatória, antimicrobiana e de
migração celular de extratos de H. pectinata L. Poit. O material vegetal das folhas e galhos foi
coletado, macerado e filtrado para a obtenção dos extratos brutos. Em seguida, foi realizada a
partição dos extratos, obtendo-se as frações acetato de etila, clorofórmica, metanólica e
hexânica. Para determinar a atividade antimicrobiana das amostras, foi realizada o teste da
Concentração Inibitória Mínima e para avaliar a viabilidade celular foi realizado o ensaio do
MTT, investigando a presença de citotoxicidade. A ação antiedematogênica foi avaliada por
meio do teste de peritonite por carragenina. A atividade da MPO foi realizada por meio de
teste in vivo, a partir do exsudato extraído de Ratos Wistar. A avaliação da migração celular in
vitro foi realizada pelo método do Scratch Assay, com fibroblastos 3T3. Como resultado, na
análise fitoquímica foi evidenciada a presença de seis grupos, os quais: Flavonas, flavonóis e
xantonas; Catequinas; Esteroides livres; Triterpenos; Saponinas; Antraquinonas e Taninos
condensados. Com relação à Concentração Inibitória Mínima, os extratos brutos das folhas e
dos galhos da Hyptis pectinata inibiram as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus e
Staphylococcus epidermidis na concentração de 1000 µg/ mL, evidenciando fraca atividade
inibitória e ausência da atividade antimicrobiana para bactérias gram-negativas. O extrato
bruto das folhas apresentou viabilidade celular nas concentrações de 62,5 e 125 µg/mL, sendo
levemente citotóxico em 250 µg/mL. Já o extrato bruto dos galhos demonstrou ser
severamente citotóxico nas concentrações 125 e 250 µg/mL e moderadamente citotóxico em
62,5 µg/mL. No ensaio de peritonite, o grupo tratado com extrato bruto de galhos reduziu o
número de células para 5,73 ± 0,5 x 106 e tratado com o extrato de folhas para 6,03 ± 0,7 x
106, evidenciando-se uma redução da proliferação celular inflamatória em 67,61%, 65,91%,
respectivamente. O tratamento tópico dos ratos com 100 mg/g de creme Lanette® do extrato
bruto das folhas, 2 vezes ao dia, diminuiu a atividade de MPO, porém, não houve
significância estatística. A avaliação cicatrizante in vitro, evidenciou que o extrato bruto das
folhas não alterou a migração celular quando comparada ao controle positivo, e que o extrato
bruto dos galhos diminuiu a migração celular.

Palavras-chaves: Plantas medicinais. Hyptis pectinata. Agentes anti-Inflamatórios.

Cicatrização.
 ABSTRACT
Skin care is not a recent concern, since for centuries it has been investigated which can aid in
the preservation and recovery of the largest organ in the human body. It is from this
perspective that experimental studies based on medicinal plants that act in the healing and
inflammation process are being developed, and among them, the plant species Hyptis
pectinata have been highlighted by their biological properties and the wide popular use to
treat several diseases. The objective of this study was to evaluate the anti-inflammatory,
antimicrobial activity and cellular migration of extracts of H. pectinata L. Poit .. The plant
material of the leaves and branches was collected, macerated and filtered to obtain the crude
extracts. Then, the extracts were partitioned, obtaining ethyl acetate, chloroform, methanolic
and hexane fractions. In order to determine the antimicrobial activity of the samples, the
Minimum Inhibitory Concentration test was performed and the MTT assay was investigated
to evaluate cell viability, investigating the presence of cytotoxicity. The antidematogenic
action was evaluated through the carrageenan peritonitis test. Surgical wounds were
performed on the back of 36 Wistar rats and disks of polyvinyl alcohol sponges were inserted.
The animals were given specific treatment for each group (n = 9) and, after 48 hours of the
experiment, euthanized and exudate discs were removed, used as a source to measure MPO
activity. The evaluation of in vitro cell migration was performed by the Scratch Assay
method, with 3T3 fibroblasts. As a result, the presence of six groups was evidenced:
Flavones, flavonols and xanthones; Catechins; Free steroids; Triterpenes; Saponins;
Anthraquinones and condensed tannins. The crude extracts of leaves and branches of H.
pectinata inhibited the gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and Staphylococcus
epidermidis at a concentration of 1000 μg / mL, evidencing weak inhibitory activity and
absence of antimicrobial activity for gram-negative bacteria. The crude extract of the leaves
presented cell viability at concentrations of 62.5 and 125 μg / mL, being slightly cytotoxic at
250 μg / mL. On the other hand, the crude extract of the branches was shown to be severely
cytotoxic at concentrations of 125 and 250 μg / mL and moderately cytotoxic at 62.5 μg / mL.
In the peritonitis assay, the treated group with crude extract of branches reduced the number
of cells to 5.73 ± 0.5 x 106 and treated with the leaf extract to 6.03 ± 0.7 x 106, evidencing a
reduction in inflammatory cell proliferation in 67.61%, 65.91%, respectively. Topical
treatment of mice with 100 mg / g Lanette® cream of the leaf extract twice daily reduced
MPO activity, but there was no statistical sificance. The in vitro cicatrization evaluation
showed that the crude extract of the leaves did not alter the cell migration when compared to
the positive control, and that the crude extract of the branches decreased the cell migration.

Key-words: Medicinal plants. Hyptis pectinata. Anti-inflammatory agents. Healing.

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Ilustração da pele, com destaque o estrato córneo da epiderme, a 21

derme e a hipoderme.
Figura 2- Evolução do número relativo de células sanguíneas e fibroblastos 26
nas fases sequenciais do processo de cicatrização.
Figura 3- Alterações celulares e vasculares responsáveis pela 29
sintomatologia do processo inflamatório.
Figura 4- Hyptis pectinata L. Poit. 34
Figura 5- Processo de preparação dos extratos etanólicos de Hyptis 40
pectinata.
Figura 6- Processo de fracionamento dos extratos etanólicos de H. 41
pectinata.
Figura 7- Esquema geral da partição e separação dos prováveis e principais 46
metabólitos secundários presentes nos extratos da planta.
Figura 8- Esquema do ensaio de Peritonite induzida por Carragenina. 50
Figura 9- Placa de 12 poços com cultura de fibroblastos. 52
Figura 10- Esquema da técnica Ensaio da raspagem (Scratch assay): 53
VEDULA et al., 2013.
Figura 11- Prospecção fitoquímica para taninos – formação de precipitado 54
dos extratos brutos de galhos e folhas.
Figura 12- Manejo da triagem fitoquímica das frações da H. pectinata. 55
Figura 13- Viabilidade celular dos extratos brutos das folhas e galhos de H. 57
pectinata.
Figura 14- Número de células por mililitro de lavado intraperitoneal 59
contabilizados no ensaio de peritonite induzida por carragenina
pós - tratamentos.
Figura 15- Efeito de HPEF e HPEG na migração de fibroblastos 3T3. (A) 60
Fotomicrografias representativas das células feridas no intervalo
de 0 e 24 h após o arranhão. (B) A análise da taxa de migração
foi avaliada pelo software Imagem.
Figura 16- O efeito do extrato etanólico da H. pectinata (HPEF) sobre a 61
atividade da mieloperoxidase (MPO) após 48 h de indução da
ferida.
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Rendimento dos extratos e frações de H. pectinata. 55

Tabela 2- Efeito das frações dos extratos das folhas e do caule da H. 58
pectinata na viabilidade celular dos fibroblastos 3T3.
Tabela 3- Número de leucócitos contabilizados no ensaio de peritonite 59
induzida por carragenina pós - tratamentos.
 LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Colorações indicativas para a presença de antocianinas e 44

antocianidinas, flavonas, flavonóis e xantonas, chalconas,
auronas e flavanonóis.
Quadro 2- Prospecção fitoquímica do extrato etanólico das folhas e dos 54
galhos da Hyptis pectinata.
Quadro 3A- Identificação da atividade antimicrobiana in vitro dos extratos 56
brutos da H. pectinata.
Quadro 3B- Identificação da atividade antimicrobiana in vitro das frações da 56
H. pectinata.
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADP Adenosina difosfato

AINEs Antiinflamatórios não esteroidais
ANOVA Analysis of Variance
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AP Proteína ativadora
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
CC Controle de crescimento
CE Controle de esterilidade
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
CHCL3 Clorofórmio
CIM Concentração Inibitória Mínima
CL Concentração letal necessária para matar 50% de uma população
cm Centímetro
CN Controle negativo
CO2 Dióxido de Carbono
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
CP Controle positivo
DEMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
DP Desvio padrão
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGF Epidermal growth factor
ESENFAR Escola de enfermagem e farmácia
g Grama
h Hora
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
H2SO4 Ácido Sulfúrico
HCL Ácido clorídrico
HPEF Extrato bruto das folhas de H. pectinata
HPEG Extrato bruto dos galhos de H. pectinata
HTAB – Brometo de hexadeciltrimetilamônio
IMA Instituto do Meio Ambiente
KOH Hidróxido de potássio
MEC Matriz extracelular
MeOH Metanol
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milímetro
nm Nanômetro
MPO Mieloperoxidase
MTT Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
NaOH Hidróxido de sódio
Na2SO4 Sulfato de sódio
NF – Fator nuclear
NO – Óxido nítrico
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Phosphate buffered saline
PCR Proteína C reativa
PDGF Platelet-derived growth factor
PGs Prostaglandinas
pH Potencial Hidrogeniônico
PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
PVA Acetato de Polivinila
RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema
Único de Saúde
RNA Ácido ribonucléico
s Segundos
SBF Soro bovino fetal
SUS Sistema Único de Saúde
TGF TGF – Transforming growth factor
TNF TNF – Fator de Necrose Tumoral
TTC Cloreto de Trifenil Tetrazólio
U Undiade
UFAL Universidade Federal de Alagoas
UFC Unidade Formadora de Colônia
UTI Unidade de tratamento intensivo
°C Graus Celsius
µg Micrograma
µL Microlitro
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 16
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 20
2.1 O manto de revestimento do corpo 20
2.2 O processo de cicatrização 22
2.2.1 Fase inflamatória 24
2.2.1.1 Mecanismos vasculares 24
2.2.1.2 Mecanismos celulares 25
2.2.2 Fase proliferativa 26
2.2.3 Fase de maturação 27
2.3 Processo Inflamatório 28
2.4 As plantas no tratamento de lesões e a atuação da enfermagem 31
2.5 Considerações sobre a espécie Hyptis pectinata L. Poit 33
3 OBJETIVOS 38
3.1 Objetivo Geral 38
3.2 Objetivos Específicos 38
4 METODOLOGIA 39
4.1 Tipo de Estudo e locais dos experimentos 39
4.2 Aspectos éticos 39
4.3 Coleta do material vegetal e preparação do extrato 39

4.4 Fracionamento do extrato etanólico bruto da Hyptis pectinata 40

4.5 Análise Fitoquímica 41
4.5.1 Teste para saponinas 43
4.5.2 Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavanoides 43
4.5.3 Teste para fenóis e taninos 44
4.5.4 Teste para Antraquinonas, antronas e cumarinas 45
4.5.5 Teste para Leucocianidinas, Catequinas, Flavanonas 45
4.5.6 Teste para alcaloides 46
4.5.7 Teste para esteroides e triterpenos (Lieberman-Burchard) 46
4.6 Ensaio de viabilidade celular pelo teste colorimétrico do 47
Metiltetrazolium (MTT)
4.7 Microdiluição em Caldo 48
4.8 Ensaio de peritonite induzida por carragenina 49
4.9 Medida da atividade de mieloperoxidase (MPO) 50
4.9.1 Análise Estatística 52
4.10 Ensaio de migração celular in vitro utilizando Scratch assay 52
5 RESULTADOS 54
5.1 Análise Fitoquímica 54
5.2 Rendimento dos extratos etanólicos e suas frações 55
5.3 Concentração Inibitória Mínima (CIM) 56
5.4 Ensaio de viabilidade celular (teste colorimétrico do 57
Metiltetrazolium/MTT)
5.5 Ensaio Peritonite 58
5.6 Medida da atividade de mieloperoxidase (MPO) 60
5.7 Ensaio de migração celular in vitro utilizando Scratch assay 61
6 DISCUSSÃO 62
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PESPECTIVAS FUTURAS 71
REFERÊNCIAS 73
1 INTRODUÇÃO
O cuidado com a pele não é uma preocupação recente, pois há séculos se investiga o
que prejudica e o que pode auxiliar na preservação do maior órgão do corpo humano. Embora
o interesse pelas feridas tenha origem remota, ainda há muito para se descobrir e discutir,
desde as melhores práticas no cuidado até a etiologia de distúrbios que impactam não apenas
os indivíduos, mas também seus familiares e o sistema de saúde (GAMBA; PETRI; COSTA,
2016).
De fato, a pele apresenta inúmeros mecanismos de regeneração e reparação. A
migração celular, por exemplo, desempenha um papel importante em uma ampla variedade de
fenômenos biológicos. A migração de uma célula ou grupo de células, de uma área para outra,
geralmente em resposta a um sinal químico, é fundamental para diversas funções fisiológicas
do organismo e, diante do contexto, destaca-se o processo de cicatrização das feridas
(MEDEIROS; DANTAS-FILHO, 2016).
Nos seres humanos, o processo de cicatrização de feridas é universal, ocorrendo,
imediatamente após o ferimento, uma sequência de reações físicas, químicas e biológicas cuja
finalidade é reconstituir a integridade tecidual. Este evento dinâmico e complexo torna o
manejo de feridas dérmicas uma problemática à saúde, uma vez que o tratamento destes
agravos pode gerar altos custos financeiros, resistência a antibióticos, altos índices de
septicemia, incapacidade de restauração total da pele, impacto ao bem-estar geral do paciente,
podendo até causar a morte (MALAGUTTI, 2015).
Consequentemente, há uma grande prevalência de lesões em indivíduos tratados nas
instituições hospitalares e, no Brasil, estima-se que as lesões de pele representam uma
incidência de até 62,5% em unidade de terapia intensiva (UTI), de 42,6% em clínica médica
e de 39,5% em unidades cirúrgicas (PASSARETTI et al, 2016). Mesmo com os avanços
referentes à compreensão dos processos e fenômenos que envolvem as lesões e o
desenvolvimento de recursos e tecnologia para a reparação tissular, a incidência e a
prevalência das lesões ainda são altas.
Diversos fatores podem afetar o processo de cicatrização de feridas, como por
exemplo a idade, a imobilidade, o estado nutricional, as doenças associadas, o uso de
medicamentos contínuos, principalmente as drogas imunossupressoras, a localização
anatômica da ferida, a presença de tecido desvitalizado e de infecção e a presença de reação
inflamatória persistente.

16
 Em geral, a reposta inflamatória, quando controlada, é benéfica e culmina com a
eliminação do agente agressor e reparo do dano tecidual. Entretanto, se essa reação for
desregulada e persistente pode ocasionar graves danos aos tecidos do hospedeiro, levando ao
desenvolvimento de processos inflamatórias intensos (CALDER, 2013).
Desta forma, os profissionais da área de saúde se deparam constantemente com
desafios no tratamento de feridas com dificuldade de cicatrização, fazendo uso de recursos
alopáticos, homeopáticos ou ainda, da medicina popular, no intuito de acelerar esse processo
fisiológico com relação ao melhor resultado de formação de cicatriz e minimizar os danos
causados por estas afecções (FERREIRA et al, 2013).
Além disso, os elevados índices de efeitos colaterais advindos dos medicamentos para
tratar patologias relacionadas à deficiência cicatricial/inflamação aumentam ainda mais a
importância de estudos por novas opções terapêuticas que agreguem o mínimo de reações
colaterais possíveis. Destaca-se que alguns efeitos adversos dos anti-inflamatórios não
esteroidais (AINEs), medicamentos mais amplamente utilizados dentre os agentes
terapêuticos, incluem sonolência, cefaleia, tontura, icterícia, diarreia, vomito, úlcera e
hemorragia no trato gastrointestinal, oligúria e hematúria (OLSON, 2013).
Nesse sentido, grandes avanços no conhecimento do processo de reparação do tecido
lesado, bem como de todos os fatores nele envolvidos, e da comprovação das propriedades
biológicas de inúmeros produtos naturais, propiciou o desenvolvimento de mais de 2000
produtos utilizados, evidenciando, assim, cada vez mais o surgimento de inovações
tecnológicas para tratamento e cura das feridas (ARAÚJO, 2016; KORELO; FERNANDES,
2016; PASSARETTI et al, 2016).
É nessa perspectiva que estudos experimentais à base de plantas que atuam no
processo de cicatrização e inflamação estão sendo desenvolvidos. Com isso, os extratos
vegetais têm recebido destaque pelas propriedades biológicas de suas substâncias e por serem
reconhecidos empiricamente, há séculos, como recurso terapêutico para o tratamento de
feridas e de diversas doenças (BARRETO et al, 2013).
Entretanto, apesar da biodiversidade brasileira ser muito vasta, o potencial de seu uso
como fonte de novos medicamentos é pouco explorado. No mundo, entre as 250 e 500 mil
espécies de plantas estimadas, apenas uma pequena percentagem foi investigada
fotoquimicamente. No Brasil, com cerca de 55 mil espécies de plantas, apenas 0,4% da flora
foi explorada (BRASIL, 2012).

17
 De fato, a utilização de plantas como recurso terapêutico é uma prática generalizada na
medicina popular e tem aumentado acentuadamente nas últimas décadas. Dentre as diversas
espécies que possuem comprovação científica sobre suas propriedades medicinais, destacam-
se as pesquisas com espécies do gênero Hyptis, as quais se destacam pela sua importância
econômica e etnofarmacológica, cujos conhecimentos são transmitidos de geração a geração
até os dias de hoje.
A espécie vegetal Hyptis pectinata L. Poit., popularmente conhecida como
"sambacaitá" ou "canudinho” tem sido relatada como possuidora de ação cicatrizante,
antimicrobiana, antifúngica, anti-inflamatória, antinociceptiva e antioxidante. Devido a isto,
são amplamente utilizadas na medicina popular (BISPO et al, 2001; RAYMUNDO et al,
2001; NASCIMENTO et al, 2008; SANTOS et al, 2008; MARMITT et al, 2015; COSTA,
2016).
Sendo o cuidado com as feridas uma das atribuições inerente à assistência prestada
pela enfermagem, os inúmeros estudos publicados com esta temática demonstram a
importante responsabilidade do(a) enfermeiro(a) nesse processo e na busca de novas maneiras
de cuidar, estando atento às inovações de cuidado nesta área que visem à melhoria da
qualidade da assistência, minimizando os desconfortos do paciente, facilitando a prestação
dos cuidados de enfermagem e da equipe multiprofissional e diminuindo o tempo de
internação e os custos hospitalares (OLIVEIRA et al., 2016). Portanto, o (a) enfermeiro (a)
possui papel relevante no tratamento, orientação, acompanhamento da evolução do processo
cicatricial, bem como na avaliação de novos produtos que surgem no mercado (CARNEIRO;
SOUZA; GAMA, 2010). E para, além disso, seu importante papel nas pesquisas que
privilegiam o uso popular das plantas medicinais para tratamento de feridas.
Diante do apresentado, fica evidente a necessidade de investir em pesquisas básicas do
tipo experimental que utilizem tecnologias inovadoras, em uma perspectiva multidisciplinar,
com vistas a tratamentos alternativos que agreguem eficácia e ausência de efeitos colaterais.
Portanto, é proposta desta pesquisa responder a seguinte questão norteadora do estudo:
Extratos vegetais de Hyptis pectinata L. Poit possuem ação anti-inflamatória e contribuem
para o processo de cicatrização de feridas?
Uma vez que a literatura científica disponível evidencia que as substâncias presentes
em extratos e óleos essenciais oriundos de plantas do gênero Hyptis aceleram a cicatrização
de feridas e possuem propriedades anti-inflamatórias, sendo amplamente utilizadas na
medicina tradicional, torna-se relevante investir em estudos que atuam na busca por novas

18
opções terapêuticas; justificando-se, assim, a necessidade de pesquisar tais propriedades
biológicas da espécie Hyptis pectinata frente ao processo de cicatrização.

19
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 O manto de revestimento do corpo

O sistema tegumentar recobre o corpo, protegendo-o contra o atrito, a perda de água, a
invasão de micro-organismos e a radiação ultravioleta. Apresenta função de percepção
sensorial (tato, calor, pressão e dor), síntese de vitamina D, termorregulação, excreção de íons
e secreção de lipídios protetores e de leite. É constituído pela pele e seus anexos: pelos, unhas,
glândulas sebáceas, sudoríparas e mamária (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).
A pele é considerada o maior órgão do corpo, em peso e área de superfície. Esta área
pode variar aproximadamente de 1,7m² a 2,0m² (em indivíduos adultos), correspondendo em
torno de 5,5% da massa corporal. Diante desta extensão, existe grande variação de estrutura
de um local para outro do corpo. Além desta variação estrutural, observa-se uma oscilação do
pH entre 5,5 a 7,0 diante de toda a extensão da pele. Enquanto a pele recobre o corpo,
funcionando como invólucro de revestimento, sendo a maior interface entre o meio ambiente
e o corpo humano, exposta intensamente a variações como: temperatura, umidade, luz solar,
xenobióticos ambientais e ocupacionais (ALVES, 2015).
Uma das principais funções da pele é a proteção do organismo, por apresentar-se como
uma barreira funcional, limitando a penetração de substâncias exógenas presentes no
ambiente, como a invasão bacteriana e fúngica. Inclui também a proteção contra estímulos
danosos, como a luz ultravioleta e estímulos físicos. O estrato córneo é responsável pela
proteção contra atrito e perda de água e a melanina como proteção dos raios ultravioletas e, o
filme hidrolipídico, responsável pela defesa, manutenção do pH e hidratação do estrato córneo
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).
Outra função importante é o fato da pele ser um órgão sensitivo, isto é decorrente de
diferentes receptores para tato, pressão, dor e temperatura, definindo a pele como um dos
cinco órgãos do sentido. A termorregulação ocorre pela presença de termorreceptores
nervosos na pele, estes reagem estimulando as fibras nervosas a levarem informações até o
centro de regulação térmica no hipotálamo. A regulação da temperatura ocorre em caso de
perda de calor, aumentando o fluxo sanguíneo, consequentemente elevando a secreção de suor
e em caso de conservação de calor possui ação mínima devido à escassez de pelos (ALVES,
2015).
A atividade metabólica da pele ocorre de forma constante, observada pelos processos
de secreção que são realizados através de suas glândulas sebáceas com a eliminação do sebo e

20
sudoríparas com o suor. Além disso, a pele está relacionada à síntese de vitamina D3, que é
produzida por influência dos raios ultravioletas. Esta atua no metabolismo do cálcio e
formação do tecido ósseo, funcionando como antirraquítica (CARVALHO, 2010).
A pele consiste em uma complexa estrutura, onde está presente três camadas a
epiderme (camada de superfície), a derme (camada intermediária) e a hipoderme ou
subcutânea (camada profunda) (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013), conforme ilustrado na
figura 1.

Figura 1: Ilustração da pele, com destaque o estrato córneo da epiderme, a derme e a hipoderme.

Estrato córneo
Epiderme

Derme

Hipoderme

Fonte: https://www.eucerin.com.br/sobre-pele/conhecimentos-basicos-sobre-a-ele/estruture-e-
funcoes-da-pele

A epiderme, camada mais externa da pele, é constituída por células epiteliais

(queratinócitos) com disposição semelhante a uma “parede de tijolos”. Estas células são
produzidas na camada mais inferior da epiderme (camada basal ou germinativa). Em sua
evolução em direção à superfície sofrem processo de queratinização ou corneificação, que dá
origem à camada córnea, composta basicamente de queratina, uma proteína responsável pela
impermeabilização da pele (CARVALHO, 2010).
A renovação celular constante da epiderme faz com que as células da camada córnea
sejam gradativamente eliminadas e substituídas por outras, processo que acontece de forma
contínua. O estrato córneo é a principal barreira aos fármacos quando estes são aplicados
topicamente, além de ser ainda barreira para substâncias exógenas (ALVES, 2015).
21
 Além dos queratinócitos, encontram-se também na epiderme: os melanócitos, que
produzem o pigmento que dá cor à pele (melanina) e células de defesa imunológica (células
de Langerhans).
A derme, camada localizada entre a epiderme e a hipoderme, é responsável pela
resistência e elasticidade da pele. É constituida por tecido conjuntivo (fibras colágenas e
elásticas envoltas por substância fundamental), vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e
terminações nervosas. Os folículos pilossebáceos e glândulas sudoríparas, originadas na
epiderme, também se localizam na derme (CARVALHO, 2010).
A faixa na qual a epiderme e a derme se unem é chamada de junção dermo-
epidérmica. Nesta área, a epiderme se projeta em forma de dedos na direção da derme,
formando as cristas epidérmicas. Estas aumentam a superfície de contato entre as duas
camadas, facilitando a nutrição das células epidérmicas pelos vasos sanguíneos da derme
(MEDEIROS; DANTAS-FILHO, 2016).
A hipoderme, também chamada de tecido celular subcutâneo, é a porção mais
profunda da pele. É composta por feixes de tecido conjuntivo que envolvem células
gordurosas (adipócitos) e formam lobos de gordura. Sua estrutura fornece proteção contra
traumas físicos, além de ser um depósito de calorias (ALVES, 2015).

2.2 O processo de cicatrização

A pele consiste em uma barreira eficaz, entretanto, por se apresentar como um órgão
de interface do organismo com o meio ambiente, está exposta às agressões exógenas e, dentre
elas, destacam-se as feridas, que podem apresentar alterações na estrutura, função e aspecto
da mesma (MALAGUTTI, 2015).
Ferida é compreendida, do ponto de vista biológico, como uma agressão sofrida pelo
tegumento, uma imperfeição na qual há a quebra de sua integridade, afetando camadas
superficiais ou mais profundas podendo atingir até os órgãos. O processo cicatricial surge a
partir dessa injúria com o objetivo principal de restaurar/cicatrizar esse rompimento da
continuidade, sendo este um processo dinâmico, complexo, no qual a sua resposta está
diretamente ligada às condições gerais do indivíduo (BLANCK; GIANNINI, 2014).
A capacidade auto-regenerativa é um fenômeno universal nos organismos vivos. Nos
organismos multicelulares, está relacionada à presença de enzimas responsáveis pela
recuperação de elementos estruturais (como os constituintes do citoesqueleto, membranas e
paredes celulares), de moléculas de alta complexidade (como proteínas de elevada

22
complexidade estrutural, RNAs e o DNA) e, além destes, também ocorre o reparo de tecidos
que pode se dar de duas formas: (1) pela regeneração com a recomposição da atividade
funcional do tecido ou (2) pela cicatrização com restabelecimento da homeostasia do tecido
com perda da sua atividade funcional pela formação de cicatriz fibrótica (GURTNER;
NELIGAN, 2015).
Desta forma, a cicatrização de feridas é um processo complexo que consiste em
perfeita e coordenada cascata de eventos celulares, moleculares e bioquímicos que interagem
para que ocorra a reconstituição tecidual (MANDELBAUM; DI SANTIS, 2013). A
regeneração é a restauração perfeita da arquitetura do tecido pré-existente, na ausência de
formação de cicatriz, e embora seja o tipo ideal no universo de cicatrização de feridas, ela só é
observada no desenvolvimento embrionário, organismos inferiores ou em determinados
tecidos como ossos e fígado (BLANCK; GIANNINI, 2014).
A grande complexidade que geralmente está associada ao processo de reparação
tecidual envolve alguns fatores que podem afetar a cicatrização, chamados de sistêmicos e
locais. Entre os fatores sistêmicos destacam-se: a idade, a imobilidade, o estado nutricional,
doenças associadas e o uso de medicamentos contínuos, principalmente as drogas
imunossupressoras. Dentre os fatores locais, destacam-se a localização anatômica da ferida,
presença de tecido desvitalizado e, principalmente, a presença de infecção (SILVA et al.,
2017).
Os mecanismos da cicatrização em sequência ordenada de eventos foram descritos por
Carrel (1910), e divididos, em seguida, em cinco elementos principais: inflamação,
proliferação celular, formação do tecido de granulação, contração e remodelamento da ferida.
Posteriormente, esse processo foi reclassificado em três fases, divididas, didaticamente, em:
fase inflamatória, fase de proliferação ou de granulação e fase de remodelamento ou de
maturação (CLARK, 2005).
Estas não são mutuamente excludentes, mas sobrepostas no tempo. O reparo completo
de tecidos resulta de alternâncias sucessivas de reações anabólicas e catabólicas que têm os
leucócitos como um de seus mais importantes protagonistas. Na divisão do processo de reparo
em três fases, são considerados, prioritariamente, os aspectos macroscópicos e histológicos
predominantes em cada uma delas (GURTNER; NELIGAN, 2015).

23
2.2.1 Fase inflamatória
A primeira fase do processo de cicatrização inicia com uma etapa precoce
caracterizada por fenômenos vasculares, hemostase e coagulação, e outra por mecanismos
marjoritariamente celulares. A lesão inicial dos tecidos provoca dano vascular com
hemorragia local. A resposta inflamatória hiperaguda, revelada clinicamente pelos sinais
cardinais de inflamação, pode durar geralmente 24 a 72 horas, podendo persistir até duas
semanas (LAUREANO; RODRIGUES, 2011).
Esta lesão induz a exposição do colágeno da matriz extracelular (MEC), permitindo a
ativação das plaquetas, a sua adesão, agregação e secreção de diversos mediadores
facilitadores da coagulação, possibilitando a hemostase. Da mesma forma, as plaquetas
também são responsáveis pela secreção de quimiocinas e de fatores de crescimento que
proporcionam a infiltração celular de leucócitos no sítio da lesão, incluindo neutrófilos e
macrófagos. Consquentemente, destacam-se duas subetapas caracterizadas por mecanismos
distintos, vasculares e celulares, cada um deles com células efetoras predominantes e
participação de numerosos mediadores químicos (GURTNER; NELIGAN, 2015).

2.2.1.1 Mecanismos vasculares

A hemostase inclui a formação de um coágulo de fibrina e a coagulação. Tal como
referido, as plaquetas são a primeira célula envolvida no processo de cicatrização. Após
exposição à MEC, são ativadas pelos componentes desta, presentes na parede vascular, o
colágeno fibrilar e a fibronectina. Após ativação, segue-se a adesão, agregação, libertação de
mediadores vasoativos (serotonina, ADP, tromboxano A2) ou de proteínas de adesão
(fibrinogênio, fibronectina, trombospondina e fator de Von Willebrand) e ativação de enzimas
(fator de Hageman). Estes mediadores perpetuam a ativação e secreção plaquetarias, assim
como a transformação, por parte da trombina produzida localmente, do fibrinogênio em
fibrina (GURTNER; NELIGAN, 2015).
Um segundo componente da hemostase é a cascata da coagulação, pelas vias
intrínseca e extrínseca. A primeira inicia-se pela ativação do fator XII e, a última, pela
libertação do fator tecidular pelos tecidos lesados. As plaquetas também contribuem para os
mecanismos celulares da fase inflamatória e para as etapas da fase proliferativa, porque o
coágulo de fibrina constitui uma matriz provisória para a migração de várias células
(leucócitos, queratinócitos, células endoteliais, fibroblastos) e é reservatório de fatores de
crescimento. As células plaquetarias também secretam vários fatores de crescimento (fator de

24
crescimento derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento de transformação-α (TGF-
α), fator de crescimento de transformação-β (TGF-β) e fator de crescimento epidérmico
(EGF)) igualmente importantes na progressão normal da cicatrização (MANDELBAUM; DI
SANTIS; 2013).

2.2.1.2 Mecanismos celulares

Esta etapa é dominada pelo influxo local de leucócitos, numa fase precoce com
predomínio de neutrófilos e monócitos e, posteriormente, com declínio no número de
neutrófilos e predomínio de macrófagos. Para além do contributo celular, estes mecanismos
são igualmente dependentes de mediadores químicos (GURTNER; NELIGAN, 2015).
Os neutrófilos e os monócitos são recrutados ao local da ferida por quimiocinas
libertadas durante a fase de hemostase e por mastócitos. Os neutrófilos desempenham funções
de lise e de fagocitose de bactérias e proteínas presentes no leito da ferida. A infiltração por
neutrófilos pode durar normalmente alguns dias, podendo prolongar-se nas situações de
contaminação da ferida. Estas células são também responsáveis pela libertação de proteases
(colagenase e elastase) que permitem a sua passagem pela membrana dos vasos
(MANDELBAUM; DI SANTIS; 2013).
Os receptores de integrina presentes na superfície destas células vão permitir a sua
comunicação com a MEC. Os monócitos são inicialmente recrutados pelas mesmas
quimiocinas que os neutrófilos. No entanto, o seu recrutamento é prolongado pela ação de
quimiocinas específicas dos monócitos, incluindo a quimiocina dos monócitos e a proteína
inflamatória dos macrófagos (ALVES, 2015).
Os produtos de degradação da MEC, como o colágeno, a fibronectina e a trombina,
são também específicos para os monócitos. Os macrófagos são considerados como a célula
reguladora mais importante da fase inflamatória. Permitem a lise e a fagocitose, contribuindo
para a progressão da cicatrização para a fase proliferativa, através da indução da angiogénese
e da formação de tecido de granulação (BLANCK; GIANNINI, 2014).
Os macrófagos são responsáveis, ainda, pela libertação de vários fatores de
crescimento (PDGF, TGF-α, TGF-β, fator de crescimento dos fibroblastos e fator de
crescimento do endotélio vascular). Também ativam os elementos celulares das fases
subsequentes da cicatrização, tais como fibroblastos e células endoteliais (figura 2)
(GATNAU et al, 2012).

25
 Tal como na etapa anterior, destaca-se a importância dos mediadores químicos na
progressão e regulação dos vários fenómenos envolvidos. Estes mediadores podem ser
agrupados em aminas vasoativas (histamina e serotonina), proteases plasmáticas (cininas e
sistema complemento), proteínas da coagulação, derivados do ácido araquidônico
(prostaglandinas e leucotrienos), radicais livres, citocinas e fatores de crescimento (SILVA et
al., 2017).

Figura 2: Evolução do número relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais do
processo de cicatrização.

Fonte: adaptado de WITTE; BARBUL, 1997.

2.2.2 Fase proliferativa

A fase proliferativa é responsável pelo “fechamento” da lesão propriamente dita,
sendo constituída por quatro etapas fundamentais: epitelização, angiogênese, formação de
tecido de granulação e deposição de colágeno. Esta fase tem início ao redor do 4º dia após a
lesão e se estende aproximadamente até o término da segunda semana. A epitelização ocorre
precocemente. Se a membrana basal estiver intacta, as células epiteliais migram em direção
superior, e as camadas normais da epiderme são restauradas em três dias. Se a membrana
basal for lesada, as células epiteliais das bordas da ferida começam a proliferar na tentativa de
restabelecer a barreira protetora (BLANCK; GIANNINI, 2014).
A angiogênese, essencial à formação do tecido de granulação, com aspecto granuloso,
avermelhado e pouco consistente, é estimulada para o suprimento de oxigênio e nutrientes
para a cicatrização por meio do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e é caracterizada pela
26
migração de células endoteliais e formação de capilares, necessária para a cicatrização
adequada (KIM et al, 2012).
A parte final da fase proliferativa é a formação de tecido de granulação. Os
fibroblastos e as células endoteliais são as principais células da fase proliferativa. Os
fibroblastos dos tecidos vizinhos migram para a ferida, porém precisam ser ativados para sair
de seu estado de quiescência. O fator de crescimento mais importante na proliferação e
ativação dos fibroblastos é o PDGF12. Em seguida é liberado o TGF-β, que estimula os
fibroblastos a produzirem colágeno tipo I e a transformarem-se em miofibroblastos, que
promovem a contração da ferida (MANDELBAUM; DI SANTIS; 2013).

2.2.3 Fase de maturação

A característica mais importante da terceira e última fase, a fase de maturação ou
remodelamento, é a deposição de colágeno de maneira organizada, por isso é a mais
importante clinicamente. O colágeno produzido inicialmente é mais fino do que o colágeno
presente na pele normal, e tem orientação paralela à pele. Com o tempo, o colágeno inicial
(colágeno tipo III) é reabsorvido e um colágeno mais espesso é produzido e organizado ao
longo das linhas de tensão. Estas mudanças se refletem em aumento da força tênsil da ferida
(MANDELBAUM; DI SANTIS; 2013).
Ocorre, nesta fase, a contração cicatricial, um movimento centrípeto das bordas da
ferida que produz uma diminuição da área lesada e, juntamente com a reepitelização, participa
ativamente para o fechamento da ferida. A delgada epiderme, formada inicialmente, é frágil
em decorrência da ausência das interdigitações entre o epitélio e o conjuntivo subjacente
(BLANCK; GIANNINI, 2014).
A reorganização da nova matriz é um processo importante da cicatrização.
Fibroblastos e leucócitos secretam colagenases que promovem a lise da matriz antiga. Mesmo
após um ano a ferida apresentará um colágeno menos organizado do que o da pele sã. O
objetivo final destes fenômenos complexos e coordenados será a formação de um tecido de
estrutura e função semelhantes às da pele íntegra (KIM et al, 2012).
É consenso, atualmente, que a resolução completa de uma ferida somente pode ser
considerada depois de concluída a maturação e remodelagem da matriz extracelular. Este
processo ocorre lentamente levando muitos meses ou às vezes anos e, mesmo assim, uma
cicatriz cutânea completamente madura possui apenas 70% da resistência da pele normal,

27
sendo que a função pré-cicatrização nunca é totalmente recuperada (GURTNER; NELIGAN,
2015).

2.3 Processo Inflamatório

Descrições das características clínicas da inflamação foram encontradas em papiros
egípcios, datados de aproximadamente 3000 a.C., mas o primeiro autor a listar os quatro
sinais cardinais da inflamação foi Celsius, um escritor romano do século I d.C., que relatou o
aumento no fluxo sanguíneo e a dilatação dos pequenos vasos (rubor), a permeabilidade
vascular aumentada (tumor) que levaria a um aumento na temperatura local (calor), à
passagem de células do sangue circulante e dor local (VAZ et al, 2014).
No século XIX, Virchow acrescentou ainda um quinto sinal que seria a perda de
função. Essas modificações são realizadas por mediadores inflamatórios gerados durante a
resposta imune. Duas principais classes de mediadores são as prostaglandinas e os
leucotrienos (RUH et al, 2013).
A pele como qualquer órgão do corpo está sujeita às injúrias do meio ambiente. Numa
lesão cutânea, por exemplo, o processo inflamatório representa uma fase crítica do reparo
tecidual, desencadeada em resposta a um determinado agente agressor. Sendo um mecanismo
de defesa, é orquestrado por um amplo contingente de mediadores químicos capazes de agir
no local da agressão ou sistemicamente (VAZ et al, 2014).

Desta forma, a imunidade natural consiste na primeira linha de defesa do organismo,

ocorrendo o recrutamento de leucócitos que impede, controla ou elimina a invasão por
patógenos e/ou danos teciduais no hospedeiro. A reação da imunidade natural, ou inflamação,
é uma resposta do organismo a estímulos nocivos, tais como trauma, invasão de partículas
estranhas, infecção de microrganismos, neoplasia maligna e reações autoimunes (VAZ et al,
2014).
Assim, o processo inflamatório sob um determinado ponto de vista, pode ser encarado
como um mecanismo de defesa do organismo e, como tal, atua destruindo (fagocitose e
anticorpos), diluindo (plasma extravasado) e isolando ou sequestrando (malha de fibrina) o
agente agressor, além de abrir caminho para os processos reparativos (cicatrização e
regeneração) do tecido afetado. Entretanto, a inflamação pode ser potencialmente danosa,
uma vez que em sua manifestação pode lesar o próprio organismo, às vezes de forma mais
deletéria que o próprio agente injuriante, como ocorre por exemplo na artrite reumatóide do
homem e em alguns tipos de pneumonia. Mas, a tendência da maioria dos estudiosos ao se
28
referir a este processo concentra-se em exaltar suas ações benéficas e minimizar as
indesejáveis (RUH et al, 2013).
Pode-se dividir a inflamação em dois grandes tipos, aguda e crônica. A inflamação
aguda, como o próprio nome refere, é caracterizada por ser a resposta inicial a um agente
agressor e o aparecimento dos sinais flogísticos. É limitada, durando poucos dias, podendo
resultar na cicatrização tecidual ou cronificação da inflamação. Também há diferenciação dos
tipos celulares e mediadores químicos envolvidos, em relação a inflamação crônica (VAZ et
al, 2014).
Algumas células participam ativamente da resposta inflamatória contra agentes
agressores (figura 3). A maioria delas chega ao local da injúria via corrente sanguínea, como
acontece com os polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos), os monócitos e os linfócitos.
Algumas dessas células cumprem a função de defesa elaborando substâncias específicas
(anticorpos e linfocinas) que neutralizam ou destroem o agente agressor - são os linfócitos e
plasmócitos da defesa imunológica (SILVA et al., 2017).

Figura 3: Alterações celulares e vasculares responsáveis pela sintomatologia do processo

inflamatório.

Fonte: https://belezanoar.net/2016/04/21/fisiopatologia-processo-inflamatorio-

O outro tipo celular desempenha sua função fagocitando e digerindo, no seu interior, o
agente agressor. É o caso dos macrófagos e leucócitos polimorfonucleares granulócitos
(neutrófilos e eosinófilos). Ainda se tem células endoteliais que quando ativadas produzem
substâncias que irão atuar sobre a coagulação e adesão leucocitária (ROBBINS, 2013).
A inflamação crônica representa o processo pelo qual o agente agressor se perpetua ou
a resposta orgânica não cessa levando a um estado permanente inflamatório, que pode ser
29
local ou sistêmico. Há destruição e reparo tecidual ocorrendo concomitante, frequentemente
sua sintomatologia, diferente da aguda que é bem marca pela flogose, é pouco intensa e de
início insidioso, até uma fase mais tardia, onde já há intenso dano (VAZ et al, 2014).
Na inflamação crônica, tem-se um repertório celular e químico diferente da inflamação
aguda, que leva a cronicidade da lesão, devido a continuidade do estímulo ou a não
modulação inflamatória pelo organismo. Essa resposta acaba, em longo prazo, sendo deletéria
ao organismo gerando dano tissular e posteriormente doenças relacionadas a perda da função
destes tecidos lesados. Em contraste com a inflamação aguda, onde predomina fenômenos
vasculares e exsudativos, tem-se um componente proliferativo com formação de fibrose. O
principal componente infiltrativo celular são as células mononucleadas (macrófagos,
linfócitos, plasmócitos). A destruição tissular é produzida pela permanência do agente
agressor ou pela ação das células inflamatórias, gerando o posterior reparo por fibrose
(ROBBINS, 2013).
Por conseguinte, uma inflamação extensa, prolongada ou não regulada, é altamente
prejudicial ao organismo e esta desregulação dos mecanismos biológicos e moleculares que
envolvem a resposta inflamatória pode causar sérios danos ao organismo, como por exemplo
septsemia, doenças infecciosas, traumas, asma, alergia, doenças autoimunes, rejeição de
transplantes, câncer, doenças neurodegenerativas, entre outros (RUH et al, 2013).
Os processos inflamatórios estão fortemente associados a diversas doenças crônicas,
tais como a síndrome metabólica, obesidade, diabetes mellitus, doenças coronárias e
autoimunes, pois os sistemas metabólico e imune estão intimamente ligados e agem de modo
interdependente. Muitos hormônios, citocinas, proteínas sinalizadoras, fatores de transcrição e
lipídios bioativos podem acionar ambos os sistemas de modo que o tecido adiposo passe a ter
uma função secretória de substâncias pró-inflamatória que antes eram associadas apenas ao
sistema imune, como as interleucinas-6 (IL-6), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e proteína
C-reativa (PCR) (ROBBINS, 2013).
Os impactos causados decorrentes dos inúmeros exames laboratoriais e internações
podem fazer com que o portador de doenças crônicas inflamatórias tenha alguns prejuízos por
causa do absenteísmo ao trabalho ou até mesmo perda do vínculo empregatício com
repercussões sociais e econômicas, além de manter elevados custos do tratamento (VAZ et al,
2014).
A abordagem terapêutica mais comum para reduzir a inflamação envolve o uso de
fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), entretanto tem sido limitada devido aos

30
seus efeitos colaterais, que incluem lesões gastrointestinais, renais e hepáticas. Por esse
motivo, a busca por substancias e coberturas que possam atuar na modulação da resposta
inflamatória com efeitos colaterais mínimos é intensa e estudos experimentais têm sido
conduzidos a fim de fornecer alternativas terapêuticas com tais finalidades (GOMEZ;
ROCHA; GOMBERG, 2016).

2.4 As plantas no tratamento de lesões e a atuação da enfermagem

O uso do poder curativo das plantas tem acompanhado a espécie humana, sendo que as
primeiras civilizações perceberam que determinadas espécies continham princípios
biologicamente ativ, os quais ao serem usados no combate às doenças, revelaram
empiricamente seu potencial terapêutico (MACHADO et al, 2017).
Ao longo dos séculos, produtos de origem vegetal constituíram as bases para
tratamento de diversas doenças, quer de forma tradicional, devido ao conhecimento das
propriedades de determinada planta, que é passado de geração a geração, quer pela utilização
de espécies vegetais, como fonte de moléculas ativas (PIRIZ et al., 2014).
Os primeiros registros do uso plantas no tratamento de doenças datam 3.000 anos a.C.
na China com a catalogação de 365 ervas medicinais, que foi reconhecida como primeiro
herbário do mundo. No Brasil, essa prática está enraizada nas culturas indígenas com os seus
curandeiros e pajés, sendo também muito influenciada pelos povos africanos e portugueses
(TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006). Uma das principais utilizações de plantas era
no tratamento das feridas, com a utilização de extratos e macerados das folhas para estancar
as hemorragias e favorecer o processo cicatricial (PIRIZ et al., 2014).
Além da ação cicatricial, anti-inflamatória e antimicrobiana que várias espécies
possuem, há certas vantagens ao se utilizar plantas para fins de tratamento e cura, quando
comparadas a drogas sintéticas, como, por exemplo, ausência de efeitos colaterais e reações
adversas intensas e abundância destas espécies no território brasileiro, permitindo, assim,
maior facilidade de acesso e valorização do emprego de preparações à base de plantas para
fins terapêuticos, nas duas últimas décadas (MACHADO et al, 2017).
Atualmente, as plantas medicinais são um dos maiores recursos naturais utilizados na
síntese de novos agentes terapêuticos. A diversidade de compostos biologicamente ativos
presentes nestas plantas representa uma alternativa promissora para a descoberta e o
desenvolvimento de potenciais agentes anti-inflamatórios, possivelmente com menores efeitos
adversos e com novas estratégias de controle da inflamação (SÉFORA-SOUSA; ANGELIS-

31
PEREIRA, 2013). Outros fatores têm colaborado para a utilização destas, tais como, as baixas
condições socioeconômicas da população, altos custos dos fármacos industrializados e difícil
acesso da população a assistência à saúde (MACHADO et al, 2017).
Considerando que as medicações não podem ser utilizadas continuamente devido
principalmente aos seus efeitos adversos, torna-se importante o conhecimento sobre a
utilização de plantas na prevenção e/ou no tratamento de afecções, conferindo uma segurança
no seu uso em longo prazo, adiando, portanto, as medicações alopáticas e consequentemente
seus efeitos colaterais (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006).
Dentro dessa prática, foi pactuada na Comissão Intergestores Tripartite, aprovada pelo
Conselho Nacional de Saúde no ano de 2005 e publicada por meio de Portaria GM nº 971, de
03 de maio de 2006, a Política Nacional de Práticas Complementares e Integrativas do SUS
(PNPIC) que propôs a inclusão das Plantas Medicinais e dos Fitoterápicos como opções
terapêuticas no Sistema Público de Saúde (BRASIL, 2012).
Essa política traz dentre suas diretrizes a elaboração da Relação Nacional de Plantas
Medicinais e de Fitoterápicos de interesse ao SUS (RENISUS) em 2009, que apresentou uma
lista com 71 diferentes espécies vegetais de interesse ao SUS visando o acesso seguro e o uso
racional pela população, de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2016). Desta forma,
é importante conceituar as diferenças entre os termos plantas medicinais, fitoterápicos e
fitoterapia.
De acordo com a definição proposta pela ANVISA, as plantas medicinais são aquelas
capazes de aliviar ou curar enfermidades e têm tradição de uso como remédio em uma
população ou comunidade. Para usá-las, é preciso conhecer a planta e saber onde colhê-la e
como prepará-la. Quando a planta medicinal é industrializada para se obter um medicamento,
tem-se como resultado o fitoterápico. Já o termo fitoterapia foi dado à terapêutica que utiliza
os medicamentos cujos constituintes ativos são plantas ou derivados vegetais, e que tem a sua
origem no conhecimento e no uso popular (BRASIL, 2012).
Acredita-se que o cuidado realizado com o uso de plantas medicinais seja favorável à
saúde humana, desde que o usuário tenha conhecimento prévio de sua finalidade, além dos
riscos e benefícios. Ademais, o profissional de saúde deve considerar tal recurso de origem
popular na sua prática de cuidar, viabilizando um cuidado singular, centrado nas crenças,
valores e estilo de vida das pessoas cuidadas (NUNES; MACIEL, 2013).
O profissional enfermeiro deve atentar tanto para as questões culturais da comunidade
quanto para a multidimensionalidade do ser humano. Desse modo, é necessário levar em

32
consideração o compromisso com o cuidar, o que pode favorecer não apenas diagnósticos,
resultados e intervenções de enfermagem, mas todo o planejamento da prática, tornando o
convívio das pessoas com processos inflamatórios, menos sofrível (SILVA et al, 2014).
O saber popular deve ser compreendido e acrescido de conhecimentos e atitudes
respaldados pelo saber científico, ampliando as pesquisas sobre a utilização de plantas
medicinais na perspectiva de garantir uma assistência integral e acolhedora por parte dos
profissionais do SUS (PIRIZ et al, 2014).
O importante é que o conhecimento sobre plantas medicinais possa contribuir,
efetivamente, na área da saúde, suprindo as necessidades básicas de cada população, aqui
especial, no que tange ao tratamento de inflamações, prática tão familiar à enfermagem. Neste
contexto, a enfermagem tem expandido sua visão em saúde no campo da pesquisa básica e
valorizado a cultura e a tradição popular pelo uso de plantas medicinais. Esta temática,
associada às condições econômicas do país e baseada na realização de pesquisas
experimentais, promove à incorporação de novos conhecimentos relacionados às práticas e
saberes da enfermagem (SILVA et al, 2014).
Sendo a assistência do enfermeiro, fundamental, na atenção primária, exige que este
profissional detenha conhecimentos técnico-científicos, além de discernimento para o
exercício de juízo profissional, não se restringindo apenas à execução de técnicas curativas,
para debelar a inflamação e prevenir infecções, que se caracteriza somente como uma tarefa
mecânica a ser executada em complacência com a prescrição médica (NUNES; MACIEL,
2013).
Desta forma, comprovar cientificamente e contribuir para o tratamento de lesões, por
meio da avaliação de novas coberturas associadas à ação de espécies vegetais, reafirma a
autonomia e o papel fundamental do enfermeiro na integralidade de suas ações (SILVA et al,
2014).

2.5 Considerações sobre a espécie Hyptis pectinata L. Poit

A espécie vegetal H. pectinata, conhecida popularmente em Alagoas como sambacaitá
ou canudinho (figura 4), pertence à família Lamiaceae e é constituída por 250 gêneros,
correspondendo a um dos principais gêneros da subfamília Nepetoideae que possui 280
espécies. Está presente em todo território nacional, nos domínios fitogeográficos amazônia,
caatinga, cerrado e mata atlântica, podendo desenvolver-se de forma selvagem ou cultivada

33
em volta de residências, principalmente nos Estados de Alagoas e Sergipe. Tem sido produto
frequente em barracas de raizeiros locais (CARVALHO et al, 2015).
Esta planta mede de um a dois metros de altura, com hábito herbáceo a arbustivo,
folhas opostas em pares cruzados, curto-pecioladas, de limbo ovalado-lanceolado, com base
levemente cordada e ápice agudo, com margem crenado denteada, coloração verde, densa
pilosidade branca em ambas as faces e glândulas produtoras de compostos voláteis
aromáticos. O caule apresenta formato quadrangular, ereto, estriados longitudinalmente,
ramificados na parte superior com ramos ascendentes, terminados em inflorescências de
aspecto aglomerado compostas por flores pequenas, bilabiais, hermafroditas, pentâmeras,
zigomorfas, com os estames presos ao lábio inferior da corola (KISSMAN; GROTH, 1995).
De acordo com vários autores, a morfologia da corola de Hyptis é característica das
espécies com mecanismo de polinização explosiva realizada na presença de insetos, sendo
considerada uma planta hermafrodita, anual reproduzida por sementes, com ciclo de 120 dias
(OLIVEIRA et al., 2011).

Figura 4. Hyptis pectinata L. Poit.

Fonte: http://tropical.theferns.info/image.php?id=Hyptis+pectinata

Apresenta uma distribuição pantropical, ocorrendo na América, desde os EUA, nos

estados do Hawaii e Califórnia, até a região sul do Brasil (EUA, 2005; KISSMAN; GROTH,
1995); bem como na África, tanto em países ao oeste do continente, como Costa do Marfim,
quanto em paises mais ao centro do continente como Camarões e Tanzânia. Na Ásia está
presente sobretudo na Índia. Na Oceania está presente no norte da Austrália, Nova Zelândia e
34
em várias outras ilhas banhadas pelo Pacífico, como as Ilhas Fiji (MALAN et al.,1988;
TCHOUMBOUGNANG et al., 2005; PIETSCHMANN et al, 1998).
Na grande maioria dos lugares onde ocorrem, suas folhas são tidas como um poderoso
e tradicional recurso terapêutico. No México, por exemplo, seu uso remete às civilizações
précolombianas e ainda hoje é usada pela população, sobretudo do meio rural, contra doenças
dos tratos respiratório e gastrintestinal, febres, infecções, dores musculares e reumatismo
(PEREDA-MIRANDA, 1993); na Guiana Francesa é usada contra a malária (VIGNERON et
al, 2005).
Independente da distância geográfica, as indicações populares de uso da H. pectinata
tendem a se repetir, ainda que a forma de utilização mude. No México, as folhas da planta são
utilizadas sob a forma de inalação contra rinofaringite e outros males respiratórios como na
Costa do Marfim, onde além desta modalidade também é utilizado o sumo, obtido das folhas
prensadas, levemente aquecido; como gotas nasais, para o mesmo fim (MALAN et al, 1988).
No Brasil, a Hyptis pectinata é muito valorizada por suas propriedades anti-
nflamatória e anti-séptica; sua principal forma de utilização popular é a ingestão de chás
(infusões e decocções), para as mais diversas indicações- problemas gástricos ou respiratórios,
câncer, infecções, febre- mas também é muito usada sob a forma de bochechos, contra
afecções da cavidade oral, e curativo, contra doenças de pele (MARMITT et al, 2015).
Muitas espécies dessa família são ricas em óleos essenciais, que são produtos voláteis,
proveniente do metabolismo secundário das plantas, conferindo as principais características
organolépticas do vegetal. Devido a essa particularidade, apresentam importância econômica,
sendo utilizadas na culinária, perfumarias e para fins terapêuticos (OLIVEIRA et al, 2011).
Com base nas diversas atividades medicinais atribuídas a Hyptis pectinata pela cultura
popular em vários países, pesquisadores em diferentes partes do mundo começaram a estudar
suas propriedades terapêuticas bem como sua composição química. Os primeiros estudos a
esse respeito foram realizados por MALAN e colaboradores (1988), que avaliaram as
propriedades antibacteriana e antimicótica do seu óleo essencial, de espécimes coletados na
Costa do Marfim (MALAN et al, 1988) e depois investigaram os seus constituintes químicos,
identificando 33 compostos, dentre os quais os principais foram: pcimenene (33.7%), timol
(26.0%), gama-terpineno (8.9%), alfa-thujeno (6.5%) e mycrene (5.0%). Isto permitiu
justificar pela presença do timol as propriedades antisépticas apresentadas pelo óleo essencial.
Além destes compostos, outros estudos já realizados identificaram também a presença
de sesquiterpenoides com altos teores de calamusenone, β-cariofileno, cis-β-guainene, óxido

35
de cariofileno. Outra pesquisa realizada com experimento in vivo comprovou que estes
compostos são responsáveis pela atividade antioxidante, antinociceptiva e anti-inflamatória
desta espécie (SERAFINI, 2012).
Por conseguinte, estudos com o extrato metanólico da H. pectinata, permitiram a
identificação e avaliação farmacológica de novos compostos orgânicos identificados como
pironas, o primeiro deles foi o hyptolide, que apresentou modesta atividade antimicrobiana
contra bactérias gram-psitivas e nenhuma atividade contra as amostras de bactérias gram-
negativas ou Candida albicans (ROJAS et al,1992). Do extrato clorofórmico foi isolada uma
pirona, a qual não apresentou atividade citotóxica, mas teve significativa atividade
antimicrobiana contra duas linhagens de Sthaphlococcus aureus multi-resistentes a vários
antibióticos (FRAGOSO-SERRANO; PEREDA, 2005).
A análise química do óleo essencial da H. pectinata mostrou, que variações genéticas
e o ambiente de armazenamento podem alterar a concentração entre os mesmos tipos de
princípios ativos, como os monoterpenos e sesquiterpenos – que são metabólitos secundários
de origem vegetal, com propriedades terapêuticas. Fatores atribuídos ao solo, clima,
sazonalidade, tempo e tipo de cultura também conseguem alterar a similitude das qualidades
físico-químicas do vegetal (MENEZES, 2015; JESUS et al, 2016).
A partir do conhecimento popular várias outras atividades farmacológicas da H.
pectinata foram pesquisadas e comprovadas. No sistema digestivo de ratos wistar, o extrato
aquoso reduziu significativamente as lesões gástricas induzidas por indometacina ou etanol,
além de também reduzir o esvaziamento gástrico, efeito esse relacionado com o sistema
opióide (FREIRE et al, 2000); o extrato apresentou ainda redução da motilidade
gastrintestinal, justificando o uso popular contra diarreia.
O óleo essencial da H. pectinata também apresentou significativa atividade
gastroprotetora, no modelo de úlcera induzida por etanol a 70 % em camundongos swiss
(SOUZA; BATISTA, 2005). Sobre o tecido hepático de ratos wistar, o extrato aquoso de
sambacaitá apresentou funções hepatoprotetora - observada pela redução dos índices de
fosfatase alcalina e do aspartato aminotransferase de animais submetidos à operação simulada
e hepatectomia parcial respectivamente – e hepatoregeneradora, demonstrada por marcador
imunohistoquímico sensível à proliferação celular (MELO et al, 2001; SILVA et al, 2002).
O extrato aquoso e óleo essencial da H. pectinata apresentou efeito antinociceptivo
demonstrado pelos modelos de nocicepção em camundongos: contorção abdominal induzida
por ácido acético a 0,6%; placa quente e, apenas para o extrato, formalina, nos quais foi

36
sugerido que esse efeito se deu por ação central e periférica do extrato. Nestes mesmos
trabalhos também foi avaliado o efeito antiedematogênico de ambos, em modelos de edema
de pata, em ratos, induzidos por carragenina e, apenas para o extrato aquoso, ácido
araquidônico, através dos quais foi sugerido um efeito inibitório das vias da ciclooxigenase e
lipoxigenase, para o extrato aquoso e, efeito inibitório da via da ciclooxigenase para o óleo
essencial (BISPO et al, 2001).
Pesquisas sobre o efeito curativo do vegetal propõem que esta planta tem ação
antileishmanial, investigação esta que é estimulada pela Organização Mundial da Saúde
(OMS), visto que o tratamento para leishmaniose é altamente tóxico, sendo necessário
monitoramento hospitalar devido ao risco de morte (FALCÃO; MENEZES, 2003).
Quanto a sua ação anti-inflamatória, Raymundo et al (2011) investigaram esta
atividade em óleos essenciais de H. pectinata, evidenciando resultados promissores para o
tratamento da inflamação. Outros estudos avaliaram o potencial anti-inflamatório de H.
capitata, H. verticillata (FALCÃO; MENEZES, 2003) e H. crenata (BRAVIM, 2008)
espécies do mesmo gênero da H. pectinata, demonstrando ser eficazes na modulação do
processo inflamatório.
Em relação à sua ação cicatrizante, apesar de vários estudos mencionarem a utilização
empírica da espécie H. pectinata para este fim (SANTOS; PADRÃO, 2016; NASCIMENTO
et al, 2016; GOMEZ; ROCHA; GOMBERG, 2016; FALCÃO, 2013; SILVA et al, 2002;
MALAN et al, 1988), são extremamente escassas, na literatura cietífica, pesquisas
experimentais que comprovem tal atividade biológica.

37
3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral:

Avaliar a atividade antinflamatória, antimicrobiana e de migração celular com vistas à
cicatrização de feridas de extratos de Hyptis pectinata L. Poit.

3.2 Objetivos Específicos:

- Identificar a viabilidade celular de macrófagos peritoniais por meio do Método
Colorimétrico do Metiltetrazólio (MTT);
- Avaliar, in vitro, a atividade antimicrobiana extratos brutos e fracionados de folhas e
galhos da H. pectinata;
- Determinar a atividade antinflamatória por meio do ensaio, in vivo, de peritonite
induzida por carragenina;
- Aferir a capacidade de migração celular com vistas à cicatrização de feridas.

38
4 METODOLOGIA

4.1 Tipo de Estudo e locais dos experimentos

Trata-se de uma pesquisa básica experimental, que visa produzir conhecimentos
novos, dentro do desenho. Os testes in vitro e in vivo foram realizados nos seguintes
laboratórios pertencentes à Universidade Federal de Alagoas/UFAL: Laboratório de Pesquisa
em Tratamento de Feridas da Escola de Enfermagem e Farmácia – LpTF/ESENFAR,
coordenado pela Profa. Dra. Mª Lysete de Assis Bastos; Laboratória de Química Medicinal,
coordenado peo Prof. João Xavier de Araújo Júnior, Laboratório de Pesquisa em Química dos
Produtos Naturais, coordenado pela Profa. Dra. Lúcia Maria Conserva do Instituto de
Química e Biotecnologia – LPqPN – Fitoquímica/IQB; Laboratório de Farmacologia e
Imunidade do Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde – LaFI/ICBS, coordenado pelas
Profas. Dras. Eliane Aparecida Campesatto e Magna Suzana Alexandre Moreira.

4.2 Aspectos éticos

O presente projeto de pesquisa encontra-se aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais da Universidade Federal de Alagoas (CEUA/UFAL), com nº41/2016, por se tratar de
um trabalho que envolve experimentos in vivo. Os protocolos foram conduzidos respeitando-
se os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal – CONCEA.

4.3 Coleta do material vegetal e preparação do extrato

Galhos e folhas da H. pectinata foram coletados em janeiro de 2017 em uma
propriedade privada (9º 32’29.0” S, 35º 45’43.9” W) no bairro Cidade Universitária,
município de Maceió - AL, os quais foram identificados e catalogados por técnicos do
Instituto de Meio Ambiente do Estado de Alagoas – IMA, com MAC nº 23601.
A secagem do material botânico foi realizada à sombra, com ar circulante durante 60
dias. Depois de dessecadas, as amostras vegetais foram trituradas, pesadas (galhos: 212g;
Folhas: 293,4g) e submetidas a um processo de maceração a frio com álcool etílico a 97%
(Figura 5). A filtração foi realizada a cada 72 h, até o esgotamento do processo de extração. A
cada filtração, a solução com extrato foi concentrada em evaporador rotativo a 40 ºC e
mantido em estufa banho-maria, na mesma temperatura, para evaporação do solvente residual
e obtenção do extrato bruto etanólico, que resultou em 4,4g dos galhos e 4,6 g das folhas.

39
Figura 5. Processo de preparação dos extratos etanólicos de Hyptis pectinata

Maceração dos galhos Extrato etanólico galhos

Maceração das folhas Extrato etanólico folhas

Fonte: Autora, 2018.

O solvente etanol (C2H5OH) apresenta uma baixa toxicidade, constituindo um fator

determinante no processo de extração de compostos ativos com a finalidade de fabricação de
fitomedicamentos. Também, possui um menor impacto ambiental e financeiro, frente aos
demais (SILVA; CAMPOS, 2013). Por isso, foi o eleito para a extração do material vegetal.

4.4 Fracionamento do extrato etanólico bruto da Hyptis pectinata

Depois de finalizada a etapa de extração, o passo sequencial foi a realização da
partição dos extratos brutos, em que se utilizou a ordem crescente de polaridade (MATOS,
2009), visando uma semi-purificação dos extratos brutos. Uma alíquota de 100 mg do extrato
etanólico bruto das folhas e galhos foi particionada em coluna filtrante sob vácuo, utilizando
como fase estacionária, sílica gel e como fase móvel, hexano (C 6H14), clorofórmio (CHCl3),
acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH), de acordo com a figura 6. A filtração foi
realizada utilizando-se os solventes puros, até que toda a coloração desaparecesse em todas as
soluções e da coluna, respectivamente.
40
 As soluções obtidas foram concentradas em evaporador rotativo. Posteriormente, os
materiais úmidos foram colocados em frascos adequados e secos em temperatura ambiente.
Ao final, foram obtidas quatro frações de galhos: (6,4 mg) hexânica, (2,7 mg) clorofórmica,
(3,9 mg) acetato de etila e (10,3 mg) metanólica; e quatro frações de folhas: (8,0 mg)
hexânica, (11,1 mg) clorofórmica, (3,8 mg) acetato de etila e (6,9 mg) metanólica.

Figura 6. Processo de fracionamento dos extratos etanólicos de H. pectinata.

Fase móvel: hexano, clorofórmio,

100 mg de extrato bruto Fase estacionária: 100 mg
acetato de etila e metanol.
de extrato bruto + sílica

Filtração
Fonte: Autora, 2017.

4.5 Análise Fitoquímica

A prospecção fitoquímica é um estudo dos princípios ativos vegetais que objetiva
descobrir os principais componentes existentes nas plantas, podendo identificar os grupos de
metabólitos secundários relevantes úteis enquanto marcadores químicos, sendo importante,
principalmente, quando ainda não são dispostos todos os estudos químicos com espécies de
interesse popular, possibilitando, assim, uma possível comparação com os dados presentes na
literatura (BESSA et al, 2013). Para este estudo, a prospecção fitoquímica foi realizada de
acordo com a metodologia proposta por Matos (2009).

41
 No geral, as plantas produzem compostos que são caracterizados em metabólitos
primários e secundários. Os primários possuem função estrutural, plástica e de
armazenamento de energia, estando relacionados a um conjunto de processos que
desempenham funções essenciais na planta, tais como fotossíntese, respiração, síntese de
aminoácidos e transporte de solutos. São encontrados em todas as células vegetais e, são
macromoléculas como açúcares, carboidratos, aminoácidos, lipídeos, proteínas, clorofila e
ácidos nucleicos (BRAZ FILHO, 2010).
Em contrapartida, a presença dos metabólitos secundários está associada com várias
funções ecológicas, possuindo um papel fundamental nos seus sistemas de defesa contra os
ataques de herbívoros, de patógenos, na competição entre as plantas, na atração de
organismos benéficos (simbiose, polinizadores), proteção contra estresse biótico (mudanças
de temperaturas, radiação solar, níveis de água e luz, deficiência de nutrientes minerais)
(BRAZ FILHO, 2010).
Embora não sejam essenciais para a vida das plantas, os metabólitos secundários
desempenham função importante na interação delas com o meio ambiente, contribui com
aromas, cores e a resistência a doenças e ou pragas (MOURA, 2015), o que, provavelmente,
têm alguma relação com o potencial efeito medicinal para os seres humanos, (VIZZOTTO;
KROLOW; WEBER, 2010).
Destaca-se a importância desses metabólitos de espécies vegetais para a área da saúde
e biotecnologia em decorrência dos benefícios para a espécie humana, relacionados às
propriedades biológicas que se caracterizam por diferentes usos como medicamentos,
herbicidas, perfumes, corantes, etc (PEREIRA; CARDOSO, 2012). Os metabólitos
secundários podem ser divididos em quatro classes, quais sejam terpenos, compostos
fenólicos, glicosídeos e alcaloides (GARCÍA; CARRIL, 2009).
Os testes qualitativos e semi-quantitativos realizados abragem ensaios para fenóis,
taninos, antocianinas, antocianidinas, flavonoides, leucoantocianidinas, catequina, flavanonas,
flavonóis, flavanonas, flavanonóis, xantonas, esteroides, triterpenos, saponinas, alcaloides,
antraquinonas, antronas e cumarinas. Para a realização dos testes foram retirados 30 mg de
cada amostra, que foram solubilizadas em 30 mL de etanol, sendo colocadas em tubos de
ensaio numerados.

42
4.5.1 Teste para saponinas
A palavra saponina ou saponosídio provém do fato de liberarem espuma quando
misturadas com água à semelhança do sabão. Constituem um grupo particular de heterosídios,
tendo uma parte lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra hidrofílica (carboidratos), que
determina a propriedade de redução da tensão superficial da água, característica de sua ação
emulsificante. Esse composto irrita a mucosa, provoca um relaxamento intestinal, aumenta as
secreções mucosas dos brônquios, também usada como diurético e desinfetante das vias
urinárias e anti-inflamatório (SANTOS et al, 2013).
O resíduo insolúvel em clorofórmio do teste anterior foi dissolvido em 10 mL de água
destilada e filtrado para um tubo de ensaio. Após agitação de aproximadamente dois minutos
foi observado se ocorreu a formação de espuma. O aparecimento de espuma persistente e
abundante indica a presença de saponinas.

4.5.2 Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavanoides

Os flavonoides constituem a maior classe de compostos fenólicos de plantas,
classificados em quatro grupos: Antocianinas, flavonas, flavonóis e isoflavonas. São
pigmentos naturais presentes nos vegetais que desempenham um papel fundamental na
proteção contra agentes oxidantes, como por exemplo, os raios ultravioletas, a poluição
ambiental, substâncias químicas presentes nos alimentos, entre outros. Atuam também, como
agentes terapêuticos graças à atividade como antioxidante, anti-inflamatório e antitumoral;
além de possuir ação antimicrobiana, por quebrar formação de complexos com as proteínas
das membranas plasmáticas das bactérias (OLIVEIRA et al., 2010; PEREIRA; CARDOSO,
2012).
Para avaliar a presença desses componentes foram preparados três tubos de ensaios,
que correspondeu à cada classe química. O pH do tubo 1 foi aferido para 3, a partir de uma
solução de ácido clorídrico (HCL) 3 mol/L. Nos tubos 2 e 3 o pH foi alcalinizado com
hidróxido de sódio (NaOH) 1 mol/L obtendo-se, um pH de 8,5 e 11 respectivamente. As
mudanças de coloração foram interpretadas da seguinte maneira, conforme apresentado no
quadro 1.

43
Quadro 1 - Colorações indicativas para a presença de antocianinas e antocianidinas, flavonas,
flavonóis e xantonas, chalconas, auronas e flavanonóis.
Coloração observada
Constituintes
Ácido pH = 3 Alcalino pH = 8,5 Alcalino pH = 11
Antocianinas e
Vermelha Lilás Azul-púrpura
antocianidinas
Flavonas, flavonóis e
- - Amarela
xantonas

Chalconas e auronas Vermelha - Vermelho púrpuro

Flavanonóis - - Vermelho laranja

Fonte: Matos, 2009.

4.5.3 Teste para fenóis e taninos

Os Taninos são compostos fenólicos hidrossolúveis com peso elevado. Estão
associados aos mecanismos de defesa das plantas contra insetos e são responsáveis pela
adstringência das plantas, ao precipitarem alcaloides, gelatina e outras proteínas formando um
complexo insolúvel em água com estes compostos. As ações farmacológicas relatadas
referem-se a antissépticos, antioxidantes, antídotos em intoxicação por metais pesados,
cicatrizantes, protetores, reepitelizantes e antidiarreicos (PEREIRA; CARDOSO, 2012) e
muitas atividades fisiológicas humanas, como a estimulação das células fagocíticas e ação
antitumoral, além das atividades antiinfectivas (MONTEIRO et al., 2005).
A palavra tanino é largamente usada, particularmente em literatura botânica,
originalmente derivada do termo "tanante", implicando que o material vegetal produza couro
a partir de peles. Ajudam no processo de cura das feridas, queimaduras e inflamações através
de uma camada protetora sobre a pele e ou mucosa danificada (MONTEIRO, 2005).
Para identificar a presença de tanino, foram adicionadas três gotas de uma solução
alcoólica de cloreto de ferro (FeCl 3) em um tubo de ensaio contendo 3 mL da solução
solubilizada. Em seguida, o mesmo foi agitado e a variação da coloração ou a formação de
precipitado é observada, onde a coloração entre azul e vermelho indica a presença de fenóis.
Por outro lado, a formação de um precipitado azul escuro, é indicativo de taninos
hidrolisáveis e a formação de precipitado verde, a presença de taninos condensados.

44
4.5.4 Teste para Antraquinonas, antronas e cumarinas
Antraquinonas são compostos orgânicos derivados do antraceno, formados a partir da
oxidação de fenóis. Algumas antraquinonas são utilizadas industrialmente como pigmentos ou
indicadores de pH e terapeuticamente como laxativos e catárticos, por agirem irritando o
intestino grosso e aumentando a motilidade intestinal (SOUZA et al., 2003).
As cumarinas são compostos que possuem em comum um anel aromático fundido em
um anel de lactonas condensado, com um princípio ativo natural existente em diversas plantas
como o guaco, o agrião, a ipeca, o cumaru, a canela, a chicória, entre outras, e em frutas como
o morango, a cereja, a framboesa e o damasco (SOUZA, 2005). São utilizadas como fixador
de perfumes, aromatizantes de alimentos, além de possuírem propriedades antibióticas,
broncodilatadora, anti-inflamatória, analgésica e também serem utilizadas em tratamentos
contra o câncer. Sua propriedade anticoagulante é exercida de forma indireta, através da
inibição da síntese dos fatores de coagulação dependentes da vitamina K (PINTO et al.,
2015).
Amostras foram solubilizadas em metanol, aplicadas na placa de cromatografia
delgada e eluídas com mistura de CHCl3: MeOH (9:1). Após eluição, foi borrifado hidróxido
de potássio (KOH) a 10% e, após esperar secar, foi observada a presença das cores indicativas
em luz ultravioleta no comprimento de onda de 365 nm. O surgimento de coloração azul é
indicativo de cumarina; vermelho de antraquinona; e amarelo de antrona.

4.5.5 Teste para Leucocianidinas, Catequinas, Flavanonas

As flavanonas são moléculas glicosiladas que são degradadas pelas enterobactérias
presentes no intestino delgado e absorvidas como compostos aglicona (hesperitina e
naringenina) e têm sido associadas a atividades hipolipidêmicas, anti-inflamatórias e
anticancerígenas (MANTHEY; BENDELE, 2008).
Catequinas são compostos incolores, hidrossolúveis, que contribuem para o amargor e
a adstringência do vegetal. Dentre seus benefícios à saúde humana destacam-se a redução na
incidência de certos tipos de câncer, redução do colesterol sérico e estimulação do sistema
imunológico (COZZOLINO, 2009).
Dois tubos de ensaios foram enumerados, no qual o primeiro ajustou-se o pH para 2
pela adição de HCL 1 mol/L e o segundo foi alcalinizado com NaOH 1 mol/L para pH 11.
Posteriormente, os tubos foram aquecidos por 3 minutos. As mudanças de coloração
observadas foram interpretadas da seguinte forma: se o tubo de pH 2 estiver com coloração

45
vermelha foi sugestivo de leucoantocianidinas; caso esteja com coloração pardo-amarelada foi
sugestivo de catequinas; já no tubo de pH 11, caso esteja com a coloração vermelho laranja
foi sugestivo de flavanonas.

4.5.6 Teste para alcaloides

A avaliação da presença de alcaloides foi realizada por meio da técnica de
cromatografia em camada delgada, utilizando a mistura de CHCl3: MeOH (9:1) como eluente.
Após eluição, o cromatograma foi revelado com reagente de Dragendorff. O surgimento de
manchas de cor alaranjada sugere a presença de alcaloides.
Na figura 7, estão descritos os metabólitos secundários que são obtidos de acordo com
a polaridade dos solventes utilizados para o fracionamento. Pode-se encontrar nas frações
oriundas dos extratos etanólicos, as prováveis classes de metabólitos secundários
(CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).

Figura 7. Esquema geral da partição e separação dos prováveis e principais metabólitos secundários
presentes nos extratos da planta.

Extrato Etanólico de
H. pectinata

Fração Fração Fração de Fração

Hexânica Clorofórmica Acetato de Etila Metanólica

Triterpenos Flavonoides
Terpenos Metoxilados Taninos
Saponinas
Esteroides Lignanas Xantonas
Taninos
Acetofenonas Lactonas Compostos
fenólicos Flavonoides
Flavonoides glicosilados
Sesquiterpenos Ácidos
triterpênicos Carboidratos
Cumarinas
Saponinas

Fonte: Adaptado de Cechinel Filho; Yunes, 1998.

4.5.7 Teste para esteroides e triterpenos (Lieberman-Burchard)

Esteroides e triterpenos constituem os óleos essenciais ou voláteis. Seu interesse
terapêutico dá-se pela importância dos glicosídeos cardiotônicos, que fazem parte desse
grupo. Destacando-se pela capacidade de inibir a absorção do colesterol da dieta, reduzindo

46
assim os níveis de colesterol circulante diminuindo com isso o risco de doença
cardiovasculares (PEREIRA; CARDOSO, 2012).
Uma alíquota da amostra foi diluída em 2 mL de clorofórmio (CHCl 3) e após, foi
realizada a filtração da solução em um funil coberto com sulfato de sódio (Na 2SO4) anidro
para a retirada da água residual. A solução resultante foi colocada em um tubo de ensaio onde
foi acrescido 1 mL de anidrido acético e, após agitação branda, foi adicionado ácido sulfúrico
concentrado (H2SO4). Posteriormente, foi realizada uma nova agitação e foi possível a
observação de mudança da coloração. A coloração azul evanescente seguida de verde
permanente indicará a presença de esteroides livres, já a coloração de parda até vermelha
indicará triterpenos pentacíclicos livres.

4.6 Ensaio de viabilidade celular pelo teste colorimétrico do Metiltetrazolium (MTT)

O teste colorimétrico do Metiltetrazolium (MTT) é baseado na atividade das
mitocôndrias celulares pela redução do MTT, por meio das enzimas desidrogenases presente
nas mitocôndrias ativas, responsável pela clivagem do sal de tetrazólio (de coloração
amarelada) que resulta na formação de cristais de formazan (de coloração azul escura), sendo
utilizado para a avaliação da citotoxidade in vitro. A densidade óptica da reação resultante é
determinada pelo espectrofotômetro. Quanto mais escura a coloração ao fim da reação, maior
a viabilidade celular (MOSMANN, 1983).
Foram avaliadas somente as amostras que apresentarem as menores CIM nos
experimentos in vitro. Inicialmente, fibroblastos da linhagem 3T3 foram colocados em placas
de 96 poços com a densidade de 2x105. Cada poço foi cultivado com o meio Dulbecco Mem
(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, preenchido com 200 µL do meio das
células e e ficarão “over night” para melhor aderência das células à placa.
No dia seguinte, a amostra foi utilizada para tratar as células nas concentrações de
1000 µg/mL, 500 µg/mL, 100 µg/mL por 48 horas e após, foram levadas a estufa à 5% de
CO2. Como controle positivo foram utilizados poços com células lisadas e, para o controle
negativo, células cultivadas e adicionadas a dimetilsulfóxido (DMSO).
Após incubação total de 48 horas, o sobrenadante foi descartado e em cada cavidade
foi adicionado 100 µL de uma solução de MTT (500 µg/mL), sendo reincubado por mais 1
hora em estufa a 37°C à 5% de CO2. Passado o período, o sobrenadante foi desprezado e o
precipitado foi ressuspendido com 100 µL de DMSO. Uma hora antes de adicionar o MTT,
em três poços, as células foram lisadas com 2 µL de Triton 100x para comparação da morte
celular.
47
 Para a leitura das placas e quantificação do sal tetrazólio reduzido a formazan foi
necessário o auxílio de um leitor de microplacas no comprimento de onda de 550 nm. Para
obtenção dos resultados foi realizada uma análise por meio da média das absorbâncias, mais o
erro padrão da média (SEM) e diferenças estatísticas entre os grupos tratados e os de controle
que foram avaliados pelo teste Dunnett e ANOVA, no qual foi identificado por um asterisco
(p<0,05) os níveis de significância em comparação com os grupos controle. O percentual de
viabilidade celular foi calculado por meio da fórmula:

% Viabilidade = Absorbância do Tratamento x 100

Absorbância do controle negativo

4.7 Microdiluição em Caldo

A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos extratos e fracções
vegetais foi realizada por meio da técnica da microdiluição em caldo baseado no protocolo do
Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012). As cepas avaliadas foram:
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 31488),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922), devido à maior
predominância destas bactérias em lesões de pele (SANTOS et al., 2016).
Foram utilizadas microplacas de poliestireno estéreis, contendo cada uma delas 96
poços, com 12 colunas (1 a 12), sendo que as 3 últimas (10ª, 11ª e 12ª colunas) correspondem,
respectivamente, ao controle negativo (CN), controle de crescimento (CC) e controle de
esterilidade da placa (CE).
As 8 linhas da placa são codificadas pelas letras de A a H e inicialmente, todos os
poços foram preenchidos com 100 µL de caldo Brain Hearth Infusion (BHI). Um volume de
100 μL da solução estoque, na concentração de 1000 μg/mL das amostras de extratos brutos
das folhas, galhos e suas frações foram inoculadas, em triplicata, nas colunas de 1 a 9 da linha
A. Em seguida, uma alíquota de 100 μL do conteúdo de cada orifício da linha A foi
transferido para os orifícios da linha B, e após homogeneização o mesmo volume foi
transferido para a linha C, reproduzindo este procedimento até a linha H, desprezando-se após
homogeneização o excesso da diluição, obtendo-se concentrações decrescentes do extrato,
metade da concentração para cada linha a partir da linha B, em μg/mL (1000 µg/mL - linha A;

48
500 µg/mL - linha B; 250 µg/mL - linha D, continuamente, até a concentração 7,8 µg/mL na
linha H) (CLSI, 2012).
Posteriormente, em cada orifício foram adicionados 5 μL de inóculo microbiano. Os
inóculos foram preparados em solução salina estéril e a suspensão bacteriana foi determinada
pela turvação do tubo 0,5 da escala de Mc Farland (1,5 x 108 UFC/mL), diluída numa
proporção de 1:10 para se conseguir uma diluição 107 UFC/mL, sendo a concentração final
de bactérias entre 5 x 105 UFC/mL e 5 x 104 UFC/poço, ao inocular 5 μL dessa suspensão no
caldo (CLSI, 2012; FREITAS et al., 2013).
Os poços das colunas 10, 11 e 12 foram destinados para os testes de controle do
experimento. O orifício 10 foi utilizado para controle negativo (CN), avaliado por meio da
atividade inibitória do diluente DMSO a 2%, o orifício 11 utilizado para o controle de
crescimento (CC) usado avaliar viabilidade microbiana, foi plaqueado com caldo de cultivo e
5 µL do inóculo microbiano. No orifício 12 destinado para o controle de esterilidade (CE),
utilizou-se apenas o caldo de cultivo BHI.
As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35 ºC por 18 horas e após este
período foram adicionados 20 µL de cloreto 2,3,5 trifenil tetrazolium (TTC) a 5% em cada
poço. O TTC é um corante incolor na forma oxidada e torna-se vermelho quando reduzido por
ação enzimática dos microrganismos vivos, originando o trifenil formazam, que torna as
células vermelhas. Deste modo, a mudança de incolor para vermelho indica a presença de
microrganismo vivo, o que revela ausência de atividade das amostras testadas. No entanto,
ausência de coloração, significa resultado positivo para inibição das amostras sobre as
bactérias avaliadas (CLSI, 2012; FREITAS, 2013).

4.8 Ensaio de peritonite induzida por carragenina (FERRÁNDIZ & ALCARAZ, 1991)
Neste ensaio foi avaliada a atividade anti-inflamatória dos extratos e frações de H.
pectinata. 36 Camundongos da linhagem Swiss, adultos, de ambos os sexos, pesando entre 20
e 30g, foram distribuídos em seis grupos (n = 6), onde: grupo 1 – controle negativo (solução
salina, 10 mL/Kg, v.o.), grupo 2 – controle positivo (indometacina, 30 μmol/Kg, v.o.), grupo
3 – HPFB (extrato bruto das folhas, 100 mg/Kg, v.o), grupo 4 HPFG (extrato bruto dos
galhos, 100 mg/Kg, v.o.), grupos 5 – HPFAc (fração acetato de etila das folhas, 100 mg/Kg,
v.o.), grupo 6 – HPFCL (fração clorofórmica das folhas, 100 mg/Kg, v.o). O ensaio consistiu
na administração das amostras e dos padrões negativos e positivos, e após 30 minutos foi

49
administrado 250 μL (10mg/mL) de solução estéril de carragenina na cavidade peritoneal dos
animais.
Decorrido 4 horas da administração da carragenina, foi coletado o lavado peritoneal
após injeção na cavidade de 3 mL de tampão fosfato salina pH = 7,4 (PBS). A partir do
lavado peritoneal foi realizada a contagem dos leucócitos totais presentes no exsudato. Para
isso, a amostra foi diluída em azul de Tripan (1:20), e a contagem foi realizada em câmara de
Neubauer, sob microscópio óptico em objetiva de 10x. A figura 8 esquematiza, de forma
objetiva, os passos metodológicos percorridos para realização do ensaio de peritonite.

Figura 8. Esquema do ensaio de Peritonite induzida por Carragenina.

6 horas

T= 0h T = 40'
Coleta do lavado
TRATAMENTO ESTÍMULO SACRIFICÍCIO peritoneal Contagem
(veículo, amostra, Carragenina 250 DO ANIMAL celular
PBS - pH = 7,4
Indometacina) μL (10mg/ml) i.p

Fonte: SILVA, N.K.G, 2017.

4.9 Medida da atividade de mieloperoxidase (MPO)

O moldelo empregado foi descrito previamente por Muscará et al. (2000), com
adaptações. Foram utilizados 36 ratos machos Wistar (300-350 g) mantidos em gaiolas com
cama de xilana à temperatura de 22+2 ºC, com troca em dias alternados, em regime de luz
com ciclo claro-escuro de 12h, recebendo água ad libitum e dieta padrão. Os cremes foram
preparados a partir do creme Lanette® que é um creme hidratante constituído de base
aniônica para incorporar ativos. O creme do extrato etanólico das folhas de H. pectinata
(HPEF, 100 mg/g) foi preparado em graal de porcelana até se obter preparações homogêneas
para serem aplicados topicamente nos animais.
Discos de esponja de álcool polivinílico (PVA) foram confeccionados com diâmetro
de 6 mm por 2,75 mm de espessura e esterilizados em autoclave por 20 minutos a 121 °C. Em
seguida, em capela de fluxo laminar, foram colocados em placas estéreis de 96 poços.
Posteriormente, adicionou-se 25 μL de solução fisiológica a 0,9% em cada disco para que
fiquem umedecidos. A confecção das feridas foi realizada sob anestesia geral, com injeção

50
intramuscular de 0,1 mL/100 g de peso de uma solução composta por 1 mL de quetamina (50
mg) e 1 mL de xilazina (20 mg).
Realizou-se epilação do terço superior do dorso dos animais e a antissepsia efetuada
com clorexidina. Foram realizadas feridas cirúrgicas incisivas de 4 cm de comprimento. A
seguir, serão inseridos subcutaneamente discos de esponja de PVA embebidos em solução
salina, os quais foram alinhados longitudinalmente em ambos os lados da ferida, perfazendo
um total de 4 discos.
Em seguida, as feridas foram suturadas com três pontos cirúrgicos e os animais (n=9)
submetidos aos diferentes tratamentos (G1 = sem tratamento; G2= pomada com HPEF; G3 =
Controle positivo (pomada comercial Novaderm® - acetato de clostebol e sulfato de
neomicina, ambos 5 mg/g), G4= Controle Negativo (Creme Lanette®), com aplicação tópica,
uma vez ao dia, na dose de 0,4 mL.
Após 72h da indução da ferida, os animais foram novamente anestesiados com
xilazina e quetamina, eutanasiados e a pele dorsal removida cuidadosamente, bem como as
esponjas para coleta do exsudato.
Adicionou-se 70 µL de PBS às esponjas que foram retiradas dos animais e,
posteriormente, estas foram espremidas com pinças para obtenção do exsudato (o qual foi
utilizado na avaliação da atividade de MPO). Em 20 µL de exsudato foi adicionado igual
volume de tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 6,0) contendo 0,5% de brometo de
hexadeciltrimetilamônio (HTAB; Sigma Chem. Co., EUA). A seguir, as amostras foram
aquecidas durante 2h a 60 °C em estufa (para inativação de catalase endógena) e
centrifugados 10.000xg durante 5 min.
Após a centrifugação, os sobrenadantes foram coletados e usados como fonte para
medida da atividade de MPO. Dez microlitros desta solução foram adicionados a 200 mL de
tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,164 mg/mL de di-hidrocloreto de o-
dianisidina (Sigma Chemical Co., EUA) e 0,01% de água oxigenada.
No ensaio, à medida que o peróxido de hidrogênio for degradado ocorrerá à produção
de ânion superóxido, responsável pela conversão de o-dianisidina em composto de cor
marrom. A mudança de absorbância (DO) da mistura das amostras com a solução de o-
dianisidina em função do tempo de reação foi medida por espectrofotômetro à 450nm, durante
5 min a intervalos de 10s. Os resultados foram expressos como unidades (U) de MPO por mL
de exsudato. Uma unidade de MPO deve ser definida como aquela capaz de degradar 1 mol
de H2O2 por min a 25°C (BRADLEY et al., 1982).

51
4.9.1 Análise Estatística
Os dados foram analisados pelo teste de variância (ANOVA) com extensão post-hoc
de Dunnet. Utilizou-se o nível de significância de 5%, de modo que as diferenças observadas
foram consideradas significativas quando p < 0,05. Os gráficos foram gerados usando o
software GraphPad Prism.

4.10 Ensaio de migração celular in vitro utilizando Scratch assay

A migração dos fibroblastos é um passo chave para a cicatrização adequada das
feridas, por desempenharem um papel importante na produção e deposição de componentes
da matriz extracelular, tais como o colágeno (CHEN, et al., 2014; ZHANG, et al., 2016).
Assim, para avaliação do potencial cicatrizante in vitro foi utilizada a análise de migração
celular por meio do método Scratch assay, no qual se baseia na criação de uma área de
descontinuidade de uma monocamada celular por raspagem (um risco), ou seja, uma ferida e
o acompanhamento do seu fechamento, observando crescimento e migração de células em
direção ao centro, sendo monitorada por mensuração utilizando-se microscópio invertido de
fase (LIANG; PARK; GUAN, 2007; CORY, 2011).
Para este ensaio, utilizaram-se fibroblastos da linhagem 3T3 de tecido de embrião de
camundongo. A designação “3T3” corresponde ao crescimento desta linhagem celular,
originalmente em uma concentração de 3 x 10 5 células por cm², com um intervalo de
transferência (“T”) de 3 dias (ABREU, 2008).
Garrafas de cultivo estéreis (poliestireno) contendo meio de cultura DMEM
suplementado com 10% de soros fetal bovino (SBF) foram acrescidas com fibroblastos e
colocadas em estufa a 5% de CO2 a 37 °C por 24 horas, para alcançarem alta confluência.
Após a constatação da confluência da monocamada, realizou-se as subculturas utilizando-se a
solução de tripsina-EDTA para desprender as células aderidas. Posteriormente, os fibroblastos
foram semeados em placas de 12 poços (Figura 9) e mantidos em estufa a 5% de CO2 a 37
°C, até atingirem confluência máxima.

Figura 9. Placa de 12 poços com cultura de fibroblastos.

Fonte: PAGNANO et al, 2008.

52
 Constatado a confluência, o meio de cultura foi descartado e, em seguida, foi realizado
o ensaio de Scratch confeccionando a ferida, ou seja, com a ponta da pipeta de 200 μL fez-se
um risco em linha reta na região mediana da placa. Este procedimento proporciona uma
ruptura entre as células, causando uma lesão mecânica (Figura 10). Para a remoção dos
debridis resultantes da lesão, os poços foram lavados com solução salina tamponada com
fosfato (PBS).

Figura 10. Esquema da técnica Ensaio da raspagem (Scratch assay): VEDULA et al., 2013.

A B

% Convergência da ferida = (A-B)x100%

A
Fonte: Adaptado de VEDULA et al., 2013.

Logo após, foram adicionados os extratos brutos das folhas e galhos de H. pectinata às
placas na concentração de 31,3 µg/mL, utilizando os tempos de migração em horas que foram
de 0 e 24 horas (OLIVEIRA, 2009).
A migração dos fibroblastos foi avaliada por meio de fotografias, utilizando-se o
programa Adobe photoshop CS5, no qual se mensurou a área lesional nos momentos
referidos. As imagens foram captadas com câmera digital acoplada ao microscópio invertido
de fase, utilizando software NIS Elements F 3.2 e foram obtidas do mesmo campo de visão da
ferida, criando pontos de referência na parte externa da placa e na platina do microscópio com
marcadores de ponta fina.
Os dados foram expressos como média ± DP. A análise estatística determinada por
meio da análise de variância unidirecional (ANOVA), seguido por teste de Newnan-Keuls. As
diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando P <0,05.
Os gráficos foram gerados usando o software GraphPad Prism.

53
5 RESULTADOS

5.1 Análise Fitoquímica

Dos 16 grupos de metabolitos secundários testados, foi evidenciada a presença de seis
grupos, os quais: Flavonas, flavonóis e xantonas; Catequinas; Esteroides livres; Triterpenos;
Saponinas; Antraquinonas e Taninos condensados, conforme o resultado apresentado no
quadro 2 e figuras 11 e 12. Percebe-se que Flavonas, Flavonois, Xantonas, Catequinas e
Taninos condensados estiveram presentes tanto nos extratos das folhas quanto dos galhos.

Quadro 2- Prospecção fitoquímica do extrato etanólico das folhas e dos galhos da Hyptis pectinata.

Avaliação Qualitativa
Grupo químico Extrato bruto etanólico Extrato bruto etanólico
das folhas (HPEF) dos galhos (HPEG)
Flavonas, Flavonois e Xantonas + +
Catequinas + +
Esteroides livres + -
Triterpenos + +
Saponinas - +
Antraquinonas + -
Taninos condensados + +

Legenda: (+) = presente; (-) = ausente.

Fonte: Autora, 2017.

Figura 11. Prospecção fitoquímica para taninos – formação de precipitado dos extratos brutos de
galhos e folhas.

Fonte: Autora, 2018.

54
Figura 12. Manejo da triagem fitoquímica das frações da H. pectinata.

Fonte: Autora, 2018.

5.2 Rendimento dos extratos etanólicos e suas frações

O rendimento de um extrato ou de um fracionamento é calculado a partir da relação
percentual entre a massa de material vegetal utilizada no processo e a massa do material que
foi extraído seco (SILVA, 2017). Dessa forma, partindo-se de 293,4 g de folhas secas e 212 g
de galhos secos da espécie vegetal, foram obtidos 7,6 g de extrato bruto etanólico das folhas
(HPEF) e 6,4 g de extrato bruto etanólico dos galhos (HPEG), apresentando rendimento de
2,59 % e 3,02 %, respectivamente.
Ao partir de 3 g de extrato bruto de folhas e 2 g de extrato bruto de galhos para a
realização da partição, pôde-se calcular a proporção do rendimento das frações em relação à
massa total de material vegetal colhido.
O rendimento de cada extrato bruto etanólico e suas frações encontra-se descrito na
tabela 1, na qual observa-se que o HPEG e suas frações apresentam maiores rendimentos
quando comparado ao HPEF e suas frações. A fração do HPEG que apresentou maior
rendimento foi a clorofórmica (0,15%) e do HPEF foi a metanólica (0,09%). A tabela1
relaciona os rendimentos em grama e porcentagem dos extratos e suas frações.

Tabela 1. Rendimento dos extratos e frações de H. pectinata.

Amostras Rendimentos
(mg) (%)
HPEF 7600 2,59
Fração hexânica 80 0,07
Fração clorofórmica 69 0,06
Fração acetato de etila 38 0,03
Fração metanólica 111 0,09

55
 HPEG 6400 3,02
Fração hexânica 64 0,1
Fração clorofórmica 103 0,15
Fração acetato de etila 39 0,06
Fração metanólica 27 0,04

Fonte: Autora, 2018.

5.3 Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Os resultados da avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos brutos e
fracionados estão organizados nos quadros 3A e 3B.

Quadro 3A. Identificação da atividade antimicrobiana in vitro dos extratos brutos da H. pectinata.

Concentração inibitória mínima dos extratos brutos (µg/ mL)

Microrganismo HPEF HPEG
Staphylococcus aureus 1000 1000
Staphylococcus epidermidis 1000 1000
Escherichia coli NI NI
Pseudomonas aeruginosa NI NI

Legenda NI = Não Inibiu.

Fonte: Autora, 2018.

Quadro 3B. Identificação da atividade antimicrobiana in vitro das frações da H. pectinata

Concentração inibitória mínima das frações (µg/ mL)

Microrganismo F1 F2 F3 F4 G1 G2 G3 G4
Staphylococcus aureus NI 1000 1000 NI NI NI NI NI
Staplylococcus epidermidis NI 1000 1000 NI NI NI 1000 NI
Escherichia coli NI NI NI NI NI NI NI NI
Pseudumonas aeruginosa NI NI NI NI NI NI NI NI

Legenda: F=Folhas; G=Galhos; 1= Hexano; 2= Clorofórmio; 3=Acetato e 4=Metanol; NI=Não Inibiu.

Fonte: Autora, 2017.

56
 Dessa forma, ao analisar o quadro 3A, observa-se que os extratos brutos das folhas e
dos galhos da H. pectinata inibiram as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus e
Staphylococcus epidermidis na concentração de 1000 µg/ mL, evidenciando fraca atividade
inibitória. Não houve inibição da atividade antimicrobiana para bactérias gram-negativas,
evidenciando ausência desta atividade para tais bactérias. Já nos extratos fracionados das
folhas e galhos, de acordo com o quadro 3B, evidencia-se que as frações clorofórmica e em
acetato de etila das folhas inibiram as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus e
Staphylococcus epidermidis na concentração de 1000 µg/ mL e a fração acetato de etila dos
galhos inibiu a bactéria Staphylococcus epidermidis na concentração de 1000 µg/mL,
demostrando fraca atividade inibitória para ambas. As demais apresentaram ausência de
inibição do crescimento bacteriano.

5.4 Ensaio de viabilidade celular (teste colorimétrico do Metiltetrazolium/MTT)

Conforme apresentado na figura 13, o tratamento com o extrato bruto dos galhos
(HPEG), em todos os testes de concentração, diminuiu a viabilidade dos fibroblastos.
Observou-se que o aumento da concentração da EEG induziu um declínio no número de
células viáveis, levando a uma redução de 41% (62,5 μg / mL), 73,3% (125 μg / mL) e 73,1%
(250 μg / mL) com P <0,001.

Figura 13. Viabilidade celular dos extratos brutos das folhas e galhos de H. pectinata.
HPEG
HPEF

Fonte: Autora, 2017.

Por outro lado, a incubação com o extrato bruto das folhas HPEF a 62,5 e 125 μg/mL
não teve efeito sobre a viabilidade celular dos fibroblastos. No entanto, o tratamento com
57
HPEF a 250 μg / mL induziu uma diminuição de 46,9% (P <0,001) na porcentagem de células
viáveis quando comparado com o grupo controle. A tabela 2 apresenta resultados descritos
obtidos por meio desse teste.

Tabela 2. Efeito das frações dos extratos das folhas e do caule da H. pectinata na viabilidade celular
dos fibroblastos 3T3.

Extratos Concetração (μg/mL) Viabilidade celular ± DP (%)

EEG 62.5 59.27 ± 3.78
125 26.75 ± 4.22
250 26.91 ± 1.47
EEF 62.5 95.82 ± 7.04
125 126.37 ± 3.12
250 53.17 ± 5.39

Fonte: Autora, 2018.

5.5 Ensaio Peritonite

No ensaio de peritonite, foram testadas as amostras (HPEF, HPEG, fração
clorofórmica e acetato de etila das folhas) que apresentaram atividade antimicrobiana frente a,
pelo menos, duas espécies bacterianas, de acordo com os resultados obtidos pela CIM. Desta
forma, todas as doses dos extratos brutos e frações reduziram a migração celular em relação
ao número de leucócitos totais por mL (***p < 0,001), conforme demostram figura 14. A
tabela 3 apresenta a relação do número de leucócitos contabilizados pós-tratamento.
O tratamento com solução salina 10 mL/Kg (grupo controle negativo) induziu uma
migração leucocitária para a cavidade peritoneal de 17,7 ± 0,6 x 106. Do contrario, no grupo
controle positivo tratado com indometacina (anti-inflamatório não esteroidal padrão: 30
µmol/Kg), evidenciou-se redução da migração de leucócitos para 7,67 ± 0,5 x 106,
significando uma equivalente a 43,31%. No grupo tratado com HPEG, houve uma redução do
número de células para 5,73 ± 0,5 x 106, enquanto que o tratado com HPEF reduziu o número
de células para 6,03 ± 0,7 x 106. Já o grupo que foi administrada a fração acetato de etila das
folhas, houve redução do número de células para 5,63 ± 0,8 x 106 e, por fim, no grupo tratado
com a fração de clorofórmio das folhas para 5,60 ± 0,9 x 106; desta forma, foi evidenciado
uma redução da proliferação celular inflamatória em 67,61%, 65,91%, 68,17%, 68,36%,
respectivamente.
58
Tabela 3. Número de leucócitos contabilizados no ensaio de peritonite induzida por carragenina pós -
tratamentos.

Nº de Leucócitos
Tratamentos % inibição
Totais/mL
Solução Salina (10 mL/Kg) 1,77 ± 0,6 x 107 -
Indometacina (30 µmol /Kg) 7,67 ± 0,5 x 106 *** 56,69%
HPEG (100 mg/Kg) 5,73 ± 0,5 x 106 *** 67,61%
HPEF (100 mg/Kg) 6,03 ± 0,7 x 106 *** 65,91%
6 ***
Fração acetato de etila das 5,63 ± 0,8 x 10 68,17%
folhas (100 mg/Kg)
Fração clorofórmica das 5,60 ± 0,9 x 106 *** 68,36%
folhas (100 mg/Kg)

Fonte: Autora, 2017.

Nota: Os dados representam a média ± e.p.m. dos grupos tratados comparados ao controle (SAL) por
meio da One-way ANOVA, seguidos do Teste de Dunnet, com ***p < 0,001.

Figura 14. Número de células por mililitro de lavado intraperitoneal contabilizados no ensaio de
peritonite induzida por carragenina pós - tratamentos.

H H
P P
E E
G F

Fonte: Autora, 2017.

Legenda: HPEG – extrato bruto dos galhos; HPEF – extrato bruto das folhas; HPFAc – fração acetato
de etila das folhas; HPFCl – fração clorofórmica das folhas.

59
Nota: Os dados representam a média ± e.p.m. dos grupos tratados comparados ao controle (SAL) por
meio da One-way ANOVA, seguidos do Teste de Dunnet, com ***p < 0,001.

5.6 – Medida da atividade da Mieloperoxidase (MPO)

O resultado da atividade da mieloperoxidase evidenciada nos grupos tratados durante
o ensaio encontra-se descrito na figura 15. O tratamento tópico dos ratos com 100 mg/g de
creme Lanette® do HPEF, 2 vezes ao dia, diminuiu a atividade de MPO, um indicador de
neutrófilos, após 48 h da indução da ferida em ratos (Figura 2), porém, não foi
estatisticamente significante (p=0,26). O grupo que não recebeu tratamento também diminuiu
a atividade de MPO, mas não houve significância (p=0,32).
A preparação comercial Novaderm® não foi capaz de diminuir a atividade de MPO,
quando comparado ao grupo de animais controle (veículo), entretanto, não apresentando
significância (p=0,51).

Figura 15. O efeito do extrato etanólico da H. pectinata (HPEF) sobre a atividade da mieloperoxidase
(MPO) após 48 h de indução da ferida.

0.8
Absorbância (550 nm)

0.6

0.4

0.2

0.0
rm
o

F
to
ul

PE
en

de
íc

H
am
Ve

a
ov
at

N
tr
m
Se

Nota: Os ratos foram tratados, 2 vezes ao dia, com veículo (0,4 mL de creme Lanette®), HPEF
(100mg/g) ou preparação comercial Novaderm®. Os resultados estão expressos como média ± EPM
da atividade de MPO em unidades (U) mL-1 de exsudato.

Fonte: Autora, 2017.

60
5.7 – Ensaio de migração celular in vitro utilizando Scratch assay
Conforme apresentado na figura 16, o tratamento com HPEF diminui a migração de
fibroblastos em 27% (p <0,05) quando comparada com a grupo de controle. O tratamento com
EEG, por sua vez, não alterou o migração de fibroblastos.

Figura 16. Efeito de HPEF e HPEG na migração de fibroblastos 3T3. (A) Fotomicrografias
representativas das células feridas no intervalo de 0 e 24 h após o arranhão. (B) A análise da taxa de
migração foi avaliada pelo software ImageJ.

(A) HPEG HPEF

Controle
(B) HPEG
HPEF
Fechamento da ferida (%)

Concentração (μg / mL)

Fonte: Autora, 2018.

61
6. DISCUSSÃO
Identificou-se, no presente estudo, que a H. pectinata apresenta os metabólitos
secundários flavonas, flavonóis e xantonas; catequinas; esteroides livres; triterpenos;
saponinas; antraquinonas e taninos condensados. Entretanto, os fenóis, alcaloides e cumarinas
estavam ausentes. Estes achados corroboram, parcialmente, com o estudo de Costa (2016),
pois o autor evidenciou ausência de alguns fenóis, bem como de triterpenos, na referida
espécie. No entanto, a composição química de extratos e óleos essenciais de H. pectinata é
variável (SANTOS et al, 2008), e alguns autores relataram resultados diferentes. Barbosa
(2009) e Pereira (2014) identificaram a presença de esteroides livres, saponinas e
sesquiterpênicos na H. pectinata, enquanto que Santos et al (2008) identificaram
majoritariamente compostos sesquiterpênicos, com altos índices de calamusenona (24,64%),
β- cialofileno (18,34%) e óxido de cariofileno (18%). Lira (2006), detectou a presença de
alcaloides, taninos e flavonoides e ausência de esteroides e saponinas nos extratos aquosos
das folhas de H. pectinata.
Considerando que substâncias como os compostos fenólicos podem ser responsáveis
pelo efeito de proteção contra os riscos de muitos processos patológicos e exercem atividade
antioxidante (OLIVEIRA et al., 2004; SILVA, 2008), os resultados obtidos estimulam a
continuidade dos estudos para avaliar a ação antioxidante de substâncias isoladas da espécie
estudada neste trabalho
Os metabólitos secundários são estruturas complexas de baixo peso molecular que
possuem atividades biológicas marcantes e baixas concentrações (BERG; LUBERT, 2008).
Eles são essenciais para a sobrevivência e continuidade das espécies vegetais, pois têm como
funções a proteção contra os ataques de herbívoros e patógenos, bem como auxilia na
competição com outros vegetais e favorece a atração de polinizadores, dentre outras funções.
É provável que essa importância ecológica tenha alguma relação com o efeito medicinal para
humanos (PEREIRA, 2012).
Devido à presença de taninos e vários outros fenóis, as espécies de Hyptis são
comumente utilizadas no tratamento de infecções gastrointestinais, dor e contra fungos
(OLIVEIRA et al., 2004; SILVA, 2008). Pesquisa avaliou a atividade biológica do extrato
aquoso das folhas Hyptis suaveolens (mesmo gênero da H. pecitnata), identificando efeitos
analgésicos e antiedematogênico (SANTOS et al., 2007),
Produtos que contenham em seus constituintes flavonoides e flavonas apresentam
atividades antioxidantes, anti-inflamatória e antibacteriana têm um grande potencial de

62
exploração na área cosmética (PERRUCHON, 2002). Sendo assim, a presença de flavonoides
na Hyptis pectinata pode indicar atividade antioxidante, anti-inflamatória e antibacteriana.
Compostos fenólicos como flavonas, flavonoides e xantonas isoladas de folhas e galhos de
plantas da espécie Hyptis evidenciaram efeito anticoagulante e protetor cardiovascular, além
disso, atua na inibição da proteína tirosina fosfatase prevenindo a hiperglicemia (OH et al,
2005).
Essas classes de metabólitos apresentam, ainda, importantes atividades terapêuticas
anticarcinogênicos e antivirais (ARAÚJO, 2008). Outra atividade relacionada aos flavonoides
é sua ação antioxidante devido à presença de hidroxilas aromáticas. Alguns flavonoides como
rutina e quercetina têm mostrado melhor atividade antioxidante do que o ácido ascórbico que
é considerado um potente redutor. Os flavonoides possuem ainda propriedade antibiótica
provavelmente relacionada à capacidade de formar complexos com proteínas solúveis e com a
parede de células bacterianas (FLAMBÓ, 2013).
A espécie Hyptis canun, outra espécie do gênero Hyptis, apresenta como propriedade
medicinal a ação antifúngica, antiulcerativa, analgésica, anticancerígena, antimicrobiana,
propriedades medicinais estas que correspondem à presença de substâncias químicas que têm
como principais grupos de metabólitos secundários os alcalóides e flavonóides (DI STASI e
HIRUMA-LIMA, 2002). Assim, como os alcaloides também estão presentes na Hyptis
pectinata, atribui-se a possibilidade desta espécie apresentar as mesmas atividades medicinais
da H. canun.
A composição dos metabólitos secundários nas plantas é resultado do balanço entre
sua formação e transformação, que ocorrem durante o crescimento. Diversos metabólitos
secundários são normalmente sintetizados e acumulados constitutivamente nas plantas,
enquanto outros têm sua biossíntese induzida apenas após a ativação por fatores do ambiente
(BRANQUINHO, 2015).
De fato, os metabólitos secundários representam a interface química entre as plantas e
o ambiente. Os estímulos decorrentes do ambiente, no qual a planta se encontra, podem
redirecionar a rota metabólica, ocasionando a biossíntese de diferentes compostos. Dentre
estes fatores, podem-se ressaltar as interações planta/microrganismos, planta/insetos e
planta/planta; idade e estádio de desenvolvimento, fatores abióticos como luminosidade,
temperatura, pluviosidade, nutrição, época e horário de coleta, bem como técnicas de colheita
e pós – colheita (ADAMS, 2007; MENEZES et al; BRANQUINHO, 2015; JESUS, 2016). É
válido ressaltar que estes fatores podem apresentar correlações entre si, não atuando

63
isoladamente, podendo exercer influência conjunta no metabolismo secundário (MORAIS,
2009).
Estudo realizado por Arrigoni-Blank et al (2010) que avaliou a influência dos horários
de colheita e secagem das folhas sobre o teor e rendimento do óleo essencial da H. pectinata,
identificou que não houve diferenças significativas da secagem e dos horários de colheita.
Por outro lado, pesquisas recentes comprovaram que, após análise da composição
química do óleo essencial de H. pectinata, as variações genéticas e o ambiente de
armazenamento podem alterar a concentração entre as mesmas espécies de princípios ativos,
como os monoterpenos e sesquiterpenos; além disso, fatores atribuídos ao solo, clima,
sazonalidade, tempo e tipo de cultura também conseguem alterar a similitude das qualidades
físico-químicas do vegetal (MENEZES, 2015; JESUS, 2016).
A prospecção fitoquímica dos extratos etanólicos e das frações da H. pectinata
realizada no presente estudo evidenciou a presença de metabólitos secundários de grande
importância biológica. Entretanto, os resultados de diferentes prospecções podem sofrer
variações e discrepâncias devido às técnicas de separação empregadas, os solventes utilizados
e à sua polaridade. Por isso, diferentes resultados podem ocorrer em comparações qualitativas
e até mesmo quantitativas destes metabólitos de uma mesma espécie, pois cada genótipo
responde de forma diferente às condições ambientais.
Desta forma, devido a existência de poucos relatos sobre variações de constituintes
químicos e rendimento em óleo essencial e de extratos de H. pectinata, ressalta-se a
necessidade de estudos que envolvam técnicas agronômicas mais peculiares para cada
espécie, uma vez que o comportamento é muito variado de espécie para espécie.
A massa total de folhas coletadas foi de 293,4 gramas, obtendo-se 7,6g de extrato;
apresentando, desta forma, rendimento de 2,59%. Para os galhos, o rendimento dos extratos
obtidos foi de 3,02%. Sales et al. (2007), estudando o óleo essencial das folhas Hyptis
marrubioides, outra espécie do gênero Hyptis, identificaram 26 compostos que representaram
96- 99% dos constituintes voláteis. Estes dados sugerem uma ampla quantidade de compostos
voláteis presentes nas espécies do gênero Hyptis, o que pode justificar o baixo rendimento dos
extratos vegetais obtidos neste estudo, pois o próprio processo de obtenção do extrato pode ter
influenciado no seu rendimento.
A atividade citotóxica apresentada pelos tipos de extratos de H. pectinata encontra-se
descrita em poucas pesquisas na literatura. Neste estudo, os extratos brutos foram testados
frente aos fibroblastos 3T3, os quais apresentaram citotoxidade severa para àqueles

64
procedentes dos galhos nas concentrações 125 e 250 μg/mL, com mais de 50% de
inviabilidade celular, e na concentração de 62,5 μg/mL revelou-se-se moderadamente
citotóxico. Já os oriundos das folhas, nas concentrações 62,5 e 125 μg/mL demonstram-se
atóxicos, sendo que na concentração de 250 μg/mL induziu a um declínio no número de
células viáveis, levando a uma redução de 46,83 (p <0,001) da viabilidade celular.
Corroborando com estas informações, a administração do extrato aquoso de folhas da
H. pectinata em ratos revelou baixa toxicidade (BISPO et al., 2001; ARRIGONIBLANK et
al., 2008). Da mesma forma, Barbosa (2009), utilizando testes de toxicidade frente a larvas de
Artemia salina, evidenciou que as folhas desta espécie apresentaram CL50>1000 μg/mL. Em
continuidade a este mesmo estudo, a H. pectinata (sambacaitá) demonstrou, ainda, certa
especificidade para as células de linhagem tumoral de cólon humano (HCT-8).
A citotoxidade corresponde a uma das atividades apresentadas pelas espécies da
família Lamiaceae (FALCÃO; MENEZES, 2003). Estudos realizados com H. pectinata
comprovaram atividades moluscicida contra Biomphalaria pfeifferi e Bulinos glabiosus.
Plantas do gênero Hyptis martiusii apresentaram atividade antitumoral (COSTA-LOTUFO et
al., 2004) citotóxica (ARAÚJO et al., 2006), inseticida (ARAÚJO et al., 2003) e contra as
larvas de Culex quinquefasciatus (COSTA et al., 2005).
Estudos experimentais que investigaram a atividade antimicrobiana apresentada pelas
plantas da espécie H. pectinata encontram-se relatados em poucos trabalhos na literatura.
Com relação à CIM, as frações em clorofórmio e acetato de etila das folhas e dos galhos e os
extratos brutos de H. pectinata demostraram fraca atividade antimicrobiana (1000 µg/mL)
frente às bactérias gram-positivas, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. As
demais amostras não foram capazes de promover a inibição dos microrganismos testados.
Santos et al (2008), ao avaliarem a atividade antimicrobiana do óleo essencial da
sambacaitá frente a bactérias gram-positivas e negativas, evidenciaram atividade
antimicrobiana com CIM que variou de 12,5 a 50 µg/mL para gram-positivas e entre 200 a
300 µg/mL para gram-negativas. Os referidos autores identificaram três sesquiterpenos
(calamusenona, cariofileno e óxido de cariofileno) como componentes majoritários desta
espécie vegetal, correlacionando estes componentes, como responsáveis pela ação
antimicrobiana acima descrita. Também estudando o óleo essencial da mesma espécie,
Nascimento et al. (2008) demonstraram a ação antimicrobiana contra cepas de Streptococcus
mutans através do método de difusão em disco.

65
 Devido à importância do papel dos leucócitos nos processos inflamatórios agudos e
crônicos, muita atenção tem sido atribuída a modelos animais de inflamação aguda que
permitam a quantificação estimativa da migração desses leucócitos. Os modelos animais
envolvendo cavidades como a pleural, a peritoneal e o modelo de inflamação na bolsa de ar
permitem que a migração celular, mediadores inflamatórios e extravasamento plasmático
sejam quantitativamente mensurados após um processo inflamatório agudo, induzido por
diferentes agentes irritantes aplicados no interior da cavidade (SEDGWICK; LEES, 1986).
Vale ressaltar que a inflamação aguda é caracterizada por dilatação dos vasos,
exsudação de plasma e migração celular para o local da lesão (SHERWOOD;
TOLIVERKINSKY, 2004), desta forma, seguindo o aumento na permeabilidade vascular, há
o infiltrado celular, principalmente de neutrófilos, que contribuem para a o processo
inflamatório através da produção, dentre outros mediadores, de radicais livres derivados do
oxigênio, como o ânion superóxido e radicais hidroxilas (POSADAS et al., 2004). Um
modelo clássico que vem sendo utilizado há muito tempo para avaliar a atividade anti-
inflamatória de novos compostos é o ensaio de peritonite induzida por carragenina.
Este teste é caracterizado pela indução de resposta inflamatória persistente após a
administração de carragenina na cavidade peritoneal (PASSOS et al., 2007; MARIOTTO et
al., 2008). A literatura descreve que a carragenina é um agente flogístico indireto que no
peritônio de ratos induz a migração de neutrófilos dependentes da ativação de macrófagos
residentes (SOUZA et al., 1988). Estudos mostram que a injeção de carragenina no peritônio
de ratos induz a expressão da NO sintase e COX-2, levando assim a liberação de grande
quantidade de NO e PGs (HATANAKA et al., 1999).
A administração intraperitoneal da carragenina provoca migração celular, ou seja, um
infiltrado de neutrófilos e leucócito, que são oriundos da vênula mesentérica para cavidade
peritoneal. Esse evento ocorre em consequência da vasodilatação e do aumento da
permeabilidade vascular e da liberação de vários mediadores inflamatórios, tais como TNF-α,
IL-1β, IL-8 e prostaglandina E2 (PAULINO et al., 2008).
A inibição da migração dos leucócitos para a cavidade peritoneal ocorre por dois
mecanismos: a inibição da produção de substâncias quimiotáticas e/ou a inibição da expressão
de moléculas de adesão, haja vista que os leucócitos necessitam de substâncias quimiotáticas
que facilitem sua migração para o local onde está ocorrendo à injúria, inflamação, para então
desencadearem seus efeitos na tentativa de destruir o agente agressor (SHERWOOD;
TOLIVERKINSKY, 2004).

66
 Alguns estudos mostram que os AINES reduzem a ativação de fatores de transcrição
como a Proteína Ativadora – 1 (AP-1) e o fator nuclear NF-κB, fatores relacionados com a
ativação de genes de citocinas primárias como TNF-α e IL-1β, substâncias potentes em
muitas ações envolvidas na migração leucocitária. A redução do influxo leucocitário também
está associada à inibição da mieloperoxidase (PEREIRA et al., 2006), enzima importante nos
processos inflamatórios.
No ensaio de peritonite para verificação do potencial anti-inflamatório da H. pectinata,
foi observado que o pré-tratamento com os extratos brutos e as frações clorofórmica e acetato
de etila das folhas e galhos da sambacaitá reduziu estatisticamente a migração leucocitária,
sendo semelhante à indometacina, usada como fármaco de referência.
Entretanto, existem algumas vantagens no uso de plantas medicinais em relação aos
fármacos sintéticos, tais como a diminuição dos efeitos colaterais e reações adversa e,
consequentemente, menores contraindicações, fácil acesso e diversidade da flora brasileira.
No caso da sambacaita, particularmente, a ausência de toxicidade dos extratos brutos das
folhas nas concentrações testadas, em associação as vantagens mencionadas, apontam
perspectivas favoráveis para o seu uso com a finalidade terapêutica como anti-inflamatório
natural.
Corroborando com esses resultados, Raymundo et al (2011), ao avaliarem a ação
antinflamatória do óleo essencial de H. pectinata, constata que houve inibição do processo
inflamatório induzido por tratamento subcutâneo com carragenina no ensaio de bolsa de ar,
reduzindo a migração celular, o volume de exsudato, a concentração de proteína e de
mediadores inflamatórios (óxido nítrico, prostaglandina E2, IL-6 e TNF-α).
Entretanto, estudos experimentais que avaliam a atividade anti-inflamatória
relacionada à espécie H. pectinata e e ao gênero Hyptis são extremamente escassos na
literatura. O ensaio de peritonite induzida por carragenina foi avaliado em estudo realizado
com o óleo essencial de Hyptis crenata, outra espécie do gênero Hyptis, constatando
diminuição significativa do número total de leucócitos em 47,55% em comparação ao grupo
controle positivo (BRAVIM, 2008). Destaca-se que os polimorfonucleares são as principais
células a migrarem para a cavidade peritoneal, nesta fase inicial da resposta inflamatória, no
modelo experimental usado (SALEH; CALIXTO; MEDEIROS, 1999).
Nos neutrófilos, a mieloperoxidase (MPO) é a principal enzima, sendo liberada a partir
dos grânulos azurófilos primários e desempenha importante papel microbicida na resposta a
infecção bacteriana (LAU; BALDUS 2006; GUILPAIN et al., 2008; LORIA et al., 2008;

67
ARNHOLD; FLEMMIG, 2010). Esta enzima apresenta atividade oxidativa e inflamatória
(LORIA et al., 2008). No fagossoma de neutrófilos, a MPO converte o peróxido de
hidrogênio e íons cloro em ácido hipocloroso (HClO) e água (LAU; BALDUS 2006;
GUILPAIN et al., 2008; LORIA et al., 2008; ARNHOLD; FLEMMIG, 2010).
A MPO é conhecida por ser um marcador de neutrófilos ativados (LAU & BALDUS
2006; GUILPAIN et al., 2008; LORIA et al., 2008). A migração de neutrófilos para o tecido
inflamado é avaliada pela determinação da atividade da MPO, pois durante esta ativação, uma
quantidade considerável desta enzima é liberada para o meio extracelular (ARNHOLD &
FLEMMIG, 2010). Os neutrófilos em apoptose liberam MPO e são removidos pelos
macrófagos, o que é importante para a resolução da inflamação (ARNHOLD; FLEMMIG,
2010).
Por conseguinte, a MPO está envolvida em várias doenças, especialmente aquelas
relacionadas à inflamação mediada por neutrófilos como: doença arterial coronária, artrite
reumatóide, doença inflamatória do intestino, asma, câncer (GUILPAIN et al., 2008)
aterosclerose, esclerose múltipla e glomerulonefrite (ARNHOLD; FLEMMIG, 2010). Nestas
doenças se observa o aumento significativo da atividade desta enzima (ARNHOLD;
FLEMMIG, 2010).
Neste estudo, sugere-se que a inflamação induzida pela inserção subcutânea dos discos
de espojas de PVA nos animais provocou aumento da atividade da MPO. Observou-se que o
grupo tratado com o HPEF (100mg/g) teve o acúmulo de neutrófilos reduzidos quando
comparados com o grupo tratado com o veículo. Entretanto, os resultados oriundos deste
ensaio in vivo não foram estatisticamente significantes, sendo necessária a repetição do
mesmo para melhor elucidação deste teste.
A medicina no final do último milênio e começo do século XXI vem observando
crescente emprego de drogas no tratamento de feridas. A propósito, as investigações não têm
se limitado ao desenvolvimento de fármacos sintéticos, e sim na tentativa cada vez mais
frequente de isolar princípios ativos oriundos de extratos vegetais.
O emprego de plantas medicinais no processo de cicatrização de feridas é mencionado
em vários estudos experimentais (BASTOS, 2008; REZENDE NETO, 2011; BARRETO et
al, 2013; VASCONCELOS, 2016; POVOAS, 2016), sendo utilizados a partir de extratos
vegetais, óleos essenciais, substancias isoladas, dentre outros, que são empregados na forma
de pomadas, géis, membranas etc.

68
 Apesar de vários estudos mencionarem a utilização empírica da planta H. pectinata
para cicatrização de feridas (SANTOS; PADRÃO, 2016; NASCIMENTO et al, 2016;
GOMEZ; ROCHA; GOMBERG, 2016; FALCÃO, 2013; SILVA et al, 2002; MALAN et al,
1988), são escassas, na literatura, pesquisas experimentais que comprovem tal atividade
biológica.
VASCONCELOS et al (2016) realizaram estudo que objetivou avaliar a ação
terapêutica do extrato etanolico de folhas de Hyptis pectinata em feridas limpas induzidas em
ratos. Foi evidenciado que o extrato não apresentou melhores resultados na redução do
diâmetro da ferida, em lesões excisivas induzidas em ratos, quando comparado ao grupo de
controle positivo.
Por outro lado, pesquisa experimental in vivo que avalaiou a cicatrização de feridas em
ratos Wistar revelou que a espécie Hyptis sauveolens, pertencente ao mesmo gênero e família
da H. pectinata, promoveu uma maior reepitelização das lesões após o tratamento de 10 dias
(SHIRWAIKAR, 2003).
Corroborando com estes resultados, Antonio (2005) comprovou que o creme de Hyptis
suaveolens promoveu uma maior reepitilização das feridas cutâneas realizadas cirurgicamente
na região dorsal do tórax de camundongos (Mus musculus), contribuindo, assim, para uma
melhor cicatrização.
Shenoy, et al., (2009), testando os extratos aquosos, alcoólicos e de éter de petróleo de
Hyptis suaveolens em modelos de cicatrização de feridas em ratos, evidenciou que o extrato
de éter de petróleo demonstrou melhor atividade cicatrizante em comparação com os outros
extratos, na dose de 500 mg/kg (v.o), após o tratamento de 10 dias, sendo maior o período de
epitelização e a força de granulação. O estudo histopatológico deste extrato também revelou
mais colágeno e macrófagos em comparação com os outros extratos.
Neste estudo, a avaliação de uma possível atividade cicatrizante foi realizada
utilizando-se de um bioensaio in vitro com o emprego do Scratch assay, o qual avaliou a
migração celular dos extratos brutos de H. pectinata nos intervalos de tempos de 0 e 24 horas.
Para o extrato bruto dos galhos, foi observada uma diminuição da migração dessas
células após 24h da “lesão”. Em relação ao extrato bruto das folhas, não foi observada
migração significativa quando comparada ao seu controle, sugerindo que a ação cicatrizante
da H. pectinata pode não envolver a migração dos fibroblastos 3T3, mas sim, diferentes
mecanismos celulares com a participação outros tipos de células, além de eventos moleculares
e bioquímicos.

69
 Em contratapartida, estudos histológicos obtidos provientes de lesões em ratos Wistar,
nas quais foram tratadas com H. suaveolens, demonstraram aumento do número de
fibroblastos (SHENOY, 2009).
Sabe-se que as fases inflamatória, proliferativa e de maturação do processo cicatricial
são dependes do tipo e da extensão do dano, do estado de saúde do indivíduo e do potencial
do tecido em reparar (SWAMYA et al., 2007). A intervenção em qualquer uma destas fases,
inclusive na fase inflamatória, poderia, eventualmente, levar a uma promoção no processo de
cura (MUKHERJEE et al, 2000). Portanto, é importante considerar o potencial anti-
inflamatório demonstrado pelos extratos de H. pectinata demonstrados neste estudo como um
fator benéfico para o processo de cicatrização de feridas.
Entretanto, constando-se que dados conclusivos sobre a atividade cicatrizante em
feridas da H. pecinata oriundos de pesquisas experimentais são extremamente escassos na
literatura, estudos mais conclusivos que abordem testes complexos com ensaios in vivo, são
necessários para a confirmação desta atividade biológica.

70
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS
A prospecção fitoquímica identificou a presença dos seguintes metabólitos
secundários Flavonas, flavonóis e xantonas; Catequinas; Esteroides livres; Triterpenos;
Saponinas; Antraquinonas e Taninos condensados.
Os resultados do MTT indicaram que o extrato das folhas apresentou viabilidade
celular nas concentrações de 62,5 e 125 µg/mL, sendo levemente citotóxico em 250 µg/mL.
Já o extrato bruto dos galhos demonstrou ser severamente citotóxico nas concentrações 125 e
250 µg/mL e moderadamente citotóxico em 62,5 µg/mL.
A CIM do extrato das folhas e galhos e das frações clorofórmica e acetato de etila das
folhas e a fraçao acetato de etila dos galhos foi de 1000 µg/mL apenas para as bactérias S.
aureus, S. epidermidis, evidenciando fraca atividade antimicrobiana. Frente aos
microrganismos Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
aeruginosa e Escherichia coli os extratos brutos das folhas e galhos e as suas frações
metanolicas, clorofórmica, hexânica e acetato de etila não apresentaram atividade inibitória.
O ensaio de peritonite evidenciou forte inibição da migração celular dos extratos
brutos das folhas galhos e das frações clorofórmica e acetato de etila das folhas, quando
comparados ao controle positivo, sugerindo elevada atividade anti-inflamatória.
A avaliação de migração celular pelo método do Scratch assay evidenciou que o
extrato bruto das folhas não alterou a migração celular quando comparada ao grupo controle
negativo, e que o extrato bruto dos galhos diminuiu a migração celular.
Assim, os resultados deste estudo sugerem que a H. pectinata possa atuar de forma
benéfica ao processo de reparo tecidual, ao inibir a resposta inflamatória exacerbada por meio
da diminuição da migração leucocitária ao local da lesão.
Desta forma, este estudo de caráter preliminar sobre as atividades biológicas da
sambacaitá pode constituir uma base de trabalho para investigações futuras. Considera-se a
importância da continuidade de estudos com esta espécie vegetal, principalmente para
isolamento do princípio ativo da planta melhor investigação da atividade cicatrizante.
Além disso, futuras investigações poderão centrar-se no desenvolvimento de
coberturas contendo o princípio ativo da H. pectinata com o objetivo de auxiliar no processo
de reparo tecidual de modo a restaurar, manter e melhorar a função do tecido lesionado.
Neste intuito, o laboratório de Química de Produtos Naturais pertencente a
Universidade Federal de Alagoas atua, dentre outras práticas, no desenvolvimento e na
caracterização de membranas de colágeno, realizando parcerias com outros laboratórios,

71
inclusive com o Laboratório de Pesquisa no Tratamento de Feridas, o qual a pesquisadora
deste trabalho é vinculada, com o objetivo de investir em pesquisas básicas do tipo
experimental que utilizem tecnologias inovadoras, em uma perspectiva multidisciplinar, com
vistas a tratamentos alternativos que agreguem eficácia e ausência de efeitos colaterais.
Portanto, para a continuação desta pesquisa, tem-se como perspectivas futuras o
desenvolvimento e a caracterização de membranas de colágeno contendo o princípio ativo da
espécie vegetal Hyptis pectinata L. Poit., bem como a avaliação destas membranas a cerca das
atividades anti-inflamatória e cicatrizante in vivo.

72
REFERÊNCIAS

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método de quantificação de proteínas totais em células 3T3. 2008. 104 f. Dissertação
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