The aim of the present study was to perform a qualitative and quantitative analysis of the effect... more The aim of the present study was to perform a qualitative and quantitative analysis of the effect of different sucrose concentrations combined with ethylene glycol in the preservation of vitrified porcine preantral follicles. Fragments of ovarian cortex were vitrified in cryotubes containing 200 μl of the vitrification solution (30% Ethylene Glycol; 20% Fetal Bovine Serum; 0 M-0.25 M - 0.75 M or 1 M sucrose) and stored in liquid nitrogen for a week. Histological analysis showed that after vitrification the number of normal follicles decreased compared to the fresh tissue (control). The percentage of normal primordial follicles was sucrose dose dependent. The percentage of normal primary follicles was similar in 0 M or 0.25 M sucrose, while higher concentrations (0.75 M and 1 M) increased significantly the percentage of abnormal follicles (p < 0.05). Morphometric analysis showed a statistically significant reduction in the total area of primordial follicles with 0.75 M sucrose and...
(CRISP2) could be linked to the proposed functional role of this protein in fertilization. Study ... more (CRISP2) could be linked to the proposed functional role of this protein in fertilization. Study finding: Our in vivo and in vitro observations reveal that Crisp2-knockout mice exhibit significant defects in fertility-associated parameters under demanding conditions, as well as deficiencies in sperm fertilizing ability, hyperactivation development and intracellular Ca2+ regulation. what is known already: Testicular CRISP2 is present in mature sperm and has been proposed to participate in gamete fusion in both humans and rodents. Interestingly, evidence in humans shows that aberrant expression of CRISP2 is associated with male infertility. study design, samples/materials, methods: A mouse line carrying a deletion in the sixth exon of the Crisp2 gene was generated. The analyses of the reproductive phenotype of Crisp22/2 adult males included the evaluation of their fertility before and after being subjected to unilateral vasectomy, in vivo fertilization rates obtained after mating with either estrus or superovulated females, in vitro sperm fertilizing ability and different sperm functional parameters associated with capacitation such as tyrosine phosphorylation (by western blot), acrosome reaction (by Coomassie Blue staining), hyperactivation (by computer-assisted sperm analysis) and intracellular Ca2+ levels (by flow cytometry). main results and the role of chance: Crisp22/2 males presented normal fertility and in vivo fertilization rates when mated with estrus females.However, the mutant mice showed clear defects in those reproductive parameters compared with controls under more demanding conditions, i.e. when subjected to unilateral vasectomy to reduce the number of ejaculated sperm (n ¼ 5; P , 0.05), or when mated with hormone-treated females containing a high number of eggs in the ampulla (n ≥ 5; P , 0.01). In vitro fertilization studies revealed that Crisp22/2 sperm exhibited deficiencies to penetrate the egg vestments (i.e. cumulus oophorus and zona pellucida) and to fuse with the egg (n ≥ 6; P , 0.01). Consistent with this, Crisp2-null sperm showed lower levels of hyperactivation (n ¼ 7; P , 0.05), a vigorous motility required for penetration of the egg coats, as well as a dysregulation in intracellular Ca2+ levels associated with capacitation (n ¼ 5; P , 0.001). limitations, reasons for caution: The analysis of the possible mechanisms involved in fertility disorders in men with abnormal expression of CRISP2 was carried out in Crisp2 knockout mice due to the ethical and technical problems inherent to the use of human gametes for fertilization studies. wider implications of the findings: Our findings in mice showing that Crisp22/2 males exhibit fertility and fertilization defects under demanding conditions support fertilization defects in sperm as a mechanism underlying infertility in men with aberrant expression of CRISP2. Moreover, our observations in mice resemble the situation in humans where fertility disorders can or cannot be detected depending on the accumulation of own individual defects or the fertility status of the partner. Finally, the fact that reproductive defects in mice are masked by conventional mating highlights the need of using different experimental approaches to analyze male fertility.study funding and competing interest(s): This study was supported by theWorld Health Organization (H9/TSA/037), the National Research Council of Argentina (PIP 2009-290), the National Agency for Scientific and Technological Promotion of Argentina (PICT 2011, 2023) and the Rene Baron Foundation to P.S.C. and by the MEXTof Japan to M.I. The authors declare that there are no conflicts of interest.
La inseminación artificial bovina ha sido la técnica de reproducción asistida de mayor difusión p... more La inseminación artificial bovina ha sido la técnica de reproducción asistida de mayor difusión por las ventajas que presenta en el mejoramiento genético, la prevención y control de enfermedades de transmisión sexual, la posibilidad de emplear toros con facilidad de parto y la optimización del manejo reproductivo del rodeo. La Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) suma beneficios tales como evitar la detección de celo, acortar el período de anestro post-parto y concentrar los partos en un período breve. El éxito de la IATF depende de múltiples factores entre los que se encuentra la calidad seminal. Ningún examen de semen in vitro presenta una correlación alta con la fertilidad, por lo cual debe desarrollarse un protocolo de control de calidad que estudie el mayor número posible de características de los espermatozoides. La selección de mejores muestras para IATF permitiría evitar la repetición en las inseminaciones o el repaso con monta natural. El objetivo del presente trabajo es encontrar indicadores seminales, a través de los análisis de rutina y del núcleo espermático, que estén asociados con tasas de preñez elevadas para IATF y permitan predecir el comportamiento de las dosis a campo. Se tomarán muestras aleatorias de cada partida de las dosis seminales congeladas ad hoc y se realizará el control de calidad espermático de rutina y el control nuclear. Se evaluarán: parámetros de motilidad espermática obtenidos por análisis computarizado (CASA), morfología, viabilidad, integridad acrosómica y funcionalidad de la membrana espermática. La evaluación del núcleo espermático incluirá: morfología nuclear, maduración de la cromatina, decondensación y fragmentación nuclear. Esta última, se realizará a través de una prueba desarrollada en nuestro laboratorio (FCV-UBA). Los responsables del CIAVT seleccionarán los establecimientos donde se realizarán los protocolos de IATF, así como los profesionales responsables de implementarlos, quienes recolectarán los resultados de preñez a campo. Sobre la base de estos resultados preliminares de nuestro grupo de trabajo y la experiencia de campo de los responsables del CIAVT, se espera encontrar asociación entre algunos de los parámetros seminales analizados y los porcentajes de preñez obtenidos por la técnica de IATF. Este proyecto intenta encontrar la existencia deindicadores de clasificación de fertilidad y de pérdidas embrionarias tempranas, lo que permitiría realizar una selección de los individuos más aptos para ser empleados como donantes para IATF. De esta forma, se podrían comercializar muestras de semen especialmente seleccionadas, con el valor agregado que esto conlleva.
La vitrificación de tejido ovárico permite conservar gran cantidad de ovocitos contenidos en folí... more La vitrificación de tejido ovárico permite conservar gran cantidad de ovocitos contenidos en folículos preantrales (FPA). El objetivo del presente trabajo fue analizar el efecto de distintas combinaciones de crioprotectores en la preservación de la estructura histológica de FPA porcinos durante la exposición (toxicidad) y en el proceso de vitrificación. Se analizó la respuesta frente a etilenglicol, dimetilsulfóxido (DMSO), y etilenglicol + DMSO, en presencia de sacarosa (0,25M); y la respuesta a etilenglicol asociado a concentraciones crecientes de sacarosa (0M; 0,25M; 0,75M y 1,0M). Los FPA primordiales tratados con etilenglicol presentaron menor cantidad de alteraciones morfológicas que los expuestos a DMSO y a la combinación de etilenglicol + DMSO (Control: 87%; etilenglicol: 52%; DMSO: 17% y etilenglicol + DMSO: 26%; Friedman, p<0,05). En los FPA primarios el etilenglicol resultó menos tóxico (Control: 70%; etilenglicol: 34%), mientras que la respuesta a la vitrificación del grupo etilenglicol + DMSO fue superior (20%). La vitrificación en presencia de concentraciones crecientes de sacarosa disminuyó significativamente el porcentaje de folículos primordiales normales (Control:64%; 0M: 48%; 0,25M: 42%; 0,75M: 12%; 1M: 9%). Para todos los tratamientos, los folículos primarios presentaron más daños. En conclusión, el medio de elección para la vitrificación resultó ser TCM 199-Hepes con 30% etilenglicol y 0 o 0,25M de sacarosa.
La utilización de la inseminación artificial en la especie porcina se ha incrementado enormemente... more La utilización de la inseminación artificial en la especie porcina se ha incrementado enormemente en los últimos años. Cuando se utiliza semen congelado se obtienen bajos porcentajes de concepción en comparación con los obtenidos con semen fresco o refrigerado. El objetivo de este trabajo fue comparar el efecto de diferentes diluyentes comerciales para semen refrigerado en el proceso de congelado y descongelado. Se utilizaron tres diluyentes de larga duración (Mr-A®, Androstar® y Porci-Star®) y uno de mediana duración (M III®). Se evaluaron: movilidad, integridad y funcionalidad de membrana plasmática e integridad acrosómica, en cuatro etapas diferentes del proceso. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros de calidad evaluados por lo que los diferentes prediluyentes no afectarían el proceso de congelado.
El potencial fecundante del semen depende tanto de la movilidad espermática como de la integridad... more El potencial fecundante del semen depende tanto de la movilidad espermática como de la integridad y funcionamiento de sus membranas. El objetivo de este trabajo fue determinar mediante una triple tinción fluorocrómica (Hoechst 33342, Ioduro de Propidio, Pisum Sativum-Isotiocianato de Fluoresceína) la calidad de las membranas espermáticas en semen porcino fresco y refrigerado a 17ºC. Se analizaron 14 muestras de semen fresco y de semen refrigerado provenientes de cuatro verracos terminales híbridos cruza Austral. Se incubó el semen diluido con Pisum Sativum-Isotiocianato de Fluoresceína (0,01%), Ioduro de Propidio (0,05%) y Hoechst (0,1%). Los resultados se analizaron mediante estadística descriptiva. El porcentaje de células con acrosoma intacto fue inferior en el semen refrigerado tanto para espermatozoides con membrana plasmática intacta (Fresco: 59,6%; Refrigerado: 49,92%) como lesionada (Fresco: 16,74%; Refrigerado: 10,17%). Se pudo evidenciar que durante el proceso de refrigeración la membrana más afectada es la acrosomal.
La utilización de semen enfriado en inseminación artificial (IA) porcina sigue siendo una limitan... more La utilización de semen enfriado en inseminación artificial (IA) porcina sigue siendo una limitante, ya que la respuesta frente a temperaturas menores a 16 °C es aleatoria entre cerdos, y aún entre eyaculados del mismo cerdo. El objetivo del presente trabajo fue jerarquizar la capacidad para la conservación de dosis refrigeradas durante 4 días de tres diluyentes comerciales (de larga o media duración) de semen porcino (Androstar Plus®, MRA® y MIII®), analizando: viabilidad, funcionalidad de membrana, integridad acrosomal y movilidad en 11 eyaculados procedentes de 3 verracos. No existieron diferencias (p>0,05) entre diluyentes por lo que sería similar su capacidad de conservación durante un período de 4 días.
The aim of the present study was to perform a qualitative and quantitative analysis of the effect... more The aim of the present study was to perform a qualitative and quantitative analysis of the effect of different sucrose concentrations combined with ethylene glycol in the preservation of vitrified porcine preantral follicles. Fragments of ovarian cortex were vitrified in cryotubes containing 200 μl of the vitrification solution (30% Ethylene Glycol; 20% Fetal Bovine Serum; 0 M-0.25 M - 0.75 M or 1 M sucrose) and stored in liquid nitrogen for a week. Histological analysis showed that after vitrification the number of normal follicles decreased compared to the fresh tissue (control). The percentage of normal primordial follicles was sucrose dose dependent. The percentage of normal primary follicles was similar in 0 M or 0.25 M sucrose, while higher concentrations (0.75 M and 1 M) increased significantly the percentage of abnormal follicles (p < 0.05). Morphometric analysis showed a statistically significant reduction in the total area of primordial follicles with 0.75 M sucrose and...
(CRISP2) could be linked to the proposed functional role of this protein in fertilization. Study ... more (CRISP2) could be linked to the proposed functional role of this protein in fertilization. Study finding: Our in vivo and in vitro observations reveal that Crisp2-knockout mice exhibit significant defects in fertility-associated parameters under demanding conditions, as well as deficiencies in sperm fertilizing ability, hyperactivation development and intracellular Ca2+ regulation. what is known already: Testicular CRISP2 is present in mature sperm and has been proposed to participate in gamete fusion in both humans and rodents. Interestingly, evidence in humans shows that aberrant expression of CRISP2 is associated with male infertility. study design, samples/materials, methods: A mouse line carrying a deletion in the sixth exon of the Crisp2 gene was generated. The analyses of the reproductive phenotype of Crisp22/2 adult males included the evaluation of their fertility before and after being subjected to unilateral vasectomy, in vivo fertilization rates obtained after mating with either estrus or superovulated females, in vitro sperm fertilizing ability and different sperm functional parameters associated with capacitation such as tyrosine phosphorylation (by western blot), acrosome reaction (by Coomassie Blue staining), hyperactivation (by computer-assisted sperm analysis) and intracellular Ca2+ levels (by flow cytometry). main results and the role of chance: Crisp22/2 males presented normal fertility and in vivo fertilization rates when mated with estrus females.However, the mutant mice showed clear defects in those reproductive parameters compared with controls under more demanding conditions, i.e. when subjected to unilateral vasectomy to reduce the number of ejaculated sperm (n ¼ 5; P , 0.05), or when mated with hormone-treated females containing a high number of eggs in the ampulla (n ≥ 5; P , 0.01). In vitro fertilization studies revealed that Crisp22/2 sperm exhibited deficiencies to penetrate the egg vestments (i.e. cumulus oophorus and zona pellucida) and to fuse with the egg (n ≥ 6; P , 0.01). Consistent with this, Crisp2-null sperm showed lower levels of hyperactivation (n ¼ 7; P , 0.05), a vigorous motility required for penetration of the egg coats, as well as a dysregulation in intracellular Ca2+ levels associated with capacitation (n ¼ 5; P , 0.001). limitations, reasons for caution: The analysis of the possible mechanisms involved in fertility disorders in men with abnormal expression of CRISP2 was carried out in Crisp2 knockout mice due to the ethical and technical problems inherent to the use of human gametes for fertilization studies. wider implications of the findings: Our findings in mice showing that Crisp22/2 males exhibit fertility and fertilization defects under demanding conditions support fertilization defects in sperm as a mechanism underlying infertility in men with aberrant expression of CRISP2. Moreover, our observations in mice resemble the situation in humans where fertility disorders can or cannot be detected depending on the accumulation of own individual defects or the fertility status of the partner. Finally, the fact that reproductive defects in mice are masked by conventional mating highlights the need of using different experimental approaches to analyze male fertility.study funding and competing interest(s): This study was supported by theWorld Health Organization (H9/TSA/037), the National Research Council of Argentina (PIP 2009-290), the National Agency for Scientific and Technological Promotion of Argentina (PICT 2011, 2023) and the Rene Baron Foundation to P.S.C. and by the MEXTof Japan to M.I. The authors declare that there are no conflicts of interest.
La inseminación artificial bovina ha sido la técnica de reproducción asistida de mayor difusión p... more La inseminación artificial bovina ha sido la técnica de reproducción asistida de mayor difusión por las ventajas que presenta en el mejoramiento genético, la prevención y control de enfermedades de transmisión sexual, la posibilidad de emplear toros con facilidad de parto y la optimización del manejo reproductivo del rodeo. La Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) suma beneficios tales como evitar la detección de celo, acortar el período de anestro post-parto y concentrar los partos en un período breve. El éxito de la IATF depende de múltiples factores entre los que se encuentra la calidad seminal. Ningún examen de semen in vitro presenta una correlación alta con la fertilidad, por lo cual debe desarrollarse un protocolo de control de calidad que estudie el mayor número posible de características de los espermatozoides. La selección de mejores muestras para IATF permitiría evitar la repetición en las inseminaciones o el repaso con monta natural. El objetivo del presente trabajo es encontrar indicadores seminales, a través de los análisis de rutina y del núcleo espermático, que estén asociados con tasas de preñez elevadas para IATF y permitan predecir el comportamiento de las dosis a campo. Se tomarán muestras aleatorias de cada partida de las dosis seminales congeladas ad hoc y se realizará el control de calidad espermático de rutina y el control nuclear. Se evaluarán: parámetros de motilidad espermática obtenidos por análisis computarizado (CASA), morfología, viabilidad, integridad acrosómica y funcionalidad de la membrana espermática. La evaluación del núcleo espermático incluirá: morfología nuclear, maduración de la cromatina, decondensación y fragmentación nuclear. Esta última, se realizará a través de una prueba desarrollada en nuestro laboratorio (FCV-UBA). Los responsables del CIAVT seleccionarán los establecimientos donde se realizarán los protocolos de IATF, así como los profesionales responsables de implementarlos, quienes recolectarán los resultados de preñez a campo. Sobre la base de estos resultados preliminares de nuestro grupo de trabajo y la experiencia de campo de los responsables del CIAVT, se espera encontrar asociación entre algunos de los parámetros seminales analizados y los porcentajes de preñez obtenidos por la técnica de IATF. Este proyecto intenta encontrar la existencia deindicadores de clasificación de fertilidad y de pérdidas embrionarias tempranas, lo que permitiría realizar una selección de los individuos más aptos para ser empleados como donantes para IATF. De esta forma, se podrían comercializar muestras de semen especialmente seleccionadas, con el valor agregado que esto conlleva.
La vitrificación de tejido ovárico permite conservar gran cantidad de ovocitos contenidos en folí... more La vitrificación de tejido ovárico permite conservar gran cantidad de ovocitos contenidos en folículos preantrales (FPA). El objetivo del presente trabajo fue analizar el efecto de distintas combinaciones de crioprotectores en la preservación de la estructura histológica de FPA porcinos durante la exposición (toxicidad) y en el proceso de vitrificación. Se analizó la respuesta frente a etilenglicol, dimetilsulfóxido (DMSO), y etilenglicol + DMSO, en presencia de sacarosa (0,25M); y la respuesta a etilenglicol asociado a concentraciones crecientes de sacarosa (0M; 0,25M; 0,75M y 1,0M). Los FPA primordiales tratados con etilenglicol presentaron menor cantidad de alteraciones morfológicas que los expuestos a DMSO y a la combinación de etilenglicol + DMSO (Control: 87%; etilenglicol: 52%; DMSO: 17% y etilenglicol + DMSO: 26%; Friedman, p<0,05). En los FPA primarios el etilenglicol resultó menos tóxico (Control: 70%; etilenglicol: 34%), mientras que la respuesta a la vitrificación del grupo etilenglicol + DMSO fue superior (20%). La vitrificación en presencia de concentraciones crecientes de sacarosa disminuyó significativamente el porcentaje de folículos primordiales normales (Control:64%; 0M: 48%; 0,25M: 42%; 0,75M: 12%; 1M: 9%). Para todos los tratamientos, los folículos primarios presentaron más daños. En conclusión, el medio de elección para la vitrificación resultó ser TCM 199-Hepes con 30% etilenglicol y 0 o 0,25M de sacarosa.
La utilización de la inseminación artificial en la especie porcina se ha incrementado enormemente... more La utilización de la inseminación artificial en la especie porcina se ha incrementado enormemente en los últimos años. Cuando se utiliza semen congelado se obtienen bajos porcentajes de concepción en comparación con los obtenidos con semen fresco o refrigerado. El objetivo de este trabajo fue comparar el efecto de diferentes diluyentes comerciales para semen refrigerado en el proceso de congelado y descongelado. Se utilizaron tres diluyentes de larga duración (Mr-A®, Androstar® y Porci-Star®) y uno de mediana duración (M III®). Se evaluaron: movilidad, integridad y funcionalidad de membrana plasmática e integridad acrosómica, en cuatro etapas diferentes del proceso. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros de calidad evaluados por lo que los diferentes prediluyentes no afectarían el proceso de congelado.
El potencial fecundante del semen depende tanto de la movilidad espermática como de la integridad... more El potencial fecundante del semen depende tanto de la movilidad espermática como de la integridad y funcionamiento de sus membranas. El objetivo de este trabajo fue determinar mediante una triple tinción fluorocrómica (Hoechst 33342, Ioduro de Propidio, Pisum Sativum-Isotiocianato de Fluoresceína) la calidad de las membranas espermáticas en semen porcino fresco y refrigerado a 17ºC. Se analizaron 14 muestras de semen fresco y de semen refrigerado provenientes de cuatro verracos terminales híbridos cruza Austral. Se incubó el semen diluido con Pisum Sativum-Isotiocianato de Fluoresceína (0,01%), Ioduro de Propidio (0,05%) y Hoechst (0,1%). Los resultados se analizaron mediante estadística descriptiva. El porcentaje de células con acrosoma intacto fue inferior en el semen refrigerado tanto para espermatozoides con membrana plasmática intacta (Fresco: 59,6%; Refrigerado: 49,92%) como lesionada (Fresco: 16,74%; Refrigerado: 10,17%). Se pudo evidenciar que durante el proceso de refrigeración la membrana más afectada es la acrosomal.
La utilización de semen enfriado en inseminación artificial (IA) porcina sigue siendo una limitan... more La utilización de semen enfriado en inseminación artificial (IA) porcina sigue siendo una limitante, ya que la respuesta frente a temperaturas menores a 16 °C es aleatoria entre cerdos, y aún entre eyaculados del mismo cerdo. El objetivo del presente trabajo fue jerarquizar la capacidad para la conservación de dosis refrigeradas durante 4 días de tres diluyentes comerciales (de larga o media duración) de semen porcino (Androstar Plus®, MRA® y MIII®), analizando: viabilidad, funcionalidad de membrana, integridad acrosomal y movilidad en 11 eyaculados procedentes de 3 verracos. No existieron diferencias (p>0,05) entre diluyentes por lo que sería similar su capacidad de conservación durante un período de 4 días.
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under demanding conditions, as well as deficiencies in sperm fertilizing ability, hyperactivation development and intracellular Ca2+
regulation.
what is known already: Testicular CRISP2 is present in mature sperm and has been proposed to participate in gamete fusion in both
humans and rodents. Interestingly, evidence in humans shows that aberrant expression of CRISP2 is associated with male infertility.
study design, samples/materials, methods: A mouse line carrying a deletion in the sixth exon of the Crisp2 gene was generated.
The analyses of the reproductive phenotype of Crisp22/2 adult males included the evaluation of their fertility before and after being subjected
to unilateral vasectomy, in vivo fertilization rates obtained after mating with either estrus or superovulated females, in vitro sperm fertilizing
ability and different sperm functional parameters associated with capacitation such as tyrosine phosphorylation (by western blot), acrosome reaction
(by Coomassie Blue staining), hyperactivation (by computer-assisted sperm analysis) and intracellular Ca2+ levels (by flow cytometry).
main results and the role of chance: Crisp22/2 males presented normal fertility and in vivo fertilization rates when mated with
estrus females.However, the mutant mice showed clear defects in those reproductive parameters compared with controls under more demanding
conditions, i.e. when subjected to unilateral vasectomy to reduce the number of ejaculated sperm (n ¼ 5; P , 0.05), or when mated with
hormone-treated females containing a high number of eggs in the ampulla (n ≥ 5; P , 0.01). In vitro fertilization studies revealed that
Crisp22/2 sperm exhibited deficiencies to penetrate the egg vestments (i.e. cumulus oophorus and zona pellucida) and to fuse with the egg
(n ≥ 6; P , 0.01). Consistent with this, Crisp2-null sperm showed lower levels of hyperactivation (n ¼ 7; P , 0.05), a vigorous motility required
for penetration of the egg coats, as well as a dysregulation in intracellular Ca2+ levels associated with capacitation (n ¼ 5; P , 0.001).
limitations, reasons for caution: The analysis of the possible mechanisms involved in fertility disorders in men with abnormal
expression of CRISP2 was carried out in Crisp2 knockout mice due to the ethical and technical problems inherent to the use of human gametes for
fertilization studies.
wider implications of the findings: Our findings in mice showing that Crisp22/2 males exhibit fertility and fertilization defects
under demanding conditions support fertilization defects in sperm as a mechanism underlying infertility in men with aberrant expression of
CRISP2. Moreover, our observations in mice resemble the situation in humans where fertility disorders can or cannot be detected depending
on the accumulation of own individual defects or the fertility status of the partner. Finally, the fact that reproductive defects in mice are masked by conventional mating highlights the need of using different experimental approaches to analyze male fertility.study funding and competing interest(s): This study was supported by theWorld Health Organization (H9/TSA/037),
the National Research Council of Argentina (PIP 2009-290), the National Agency for Scientific and Technological Promotion of Argentina (PICT 2011, 2023) and the Rene Baron Foundation to P.S.C. and by the MEXTof Japan to M.I. The authors declare that there are no conflicts of interest.
control de enfermedades de transmisión sexual, la posibilidad de emplear toros con facilidad de parto y la optimización del manejo reproductivo del rodeo. La Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) suma beneficios tales como evitar la detección de celo, acortar el período de anestro post-parto y concentrar los partos en un período breve. El éxito de la IATF depende de múltiples factores entre los que se encuentra la calidad seminal. Ningún examen de semen in vitro presenta una correlación alta con la fertilidad, por lo cual debe desarrollarse un protocolo de control de calidad que estudie el mayor número posible de características de los espermatozoides. La selección de mejores muestras para IATF permitiría evitar la repetición en las inseminaciones o el repaso con monta natural. El objetivo del presente trabajo es encontrar indicadores seminales, a través de los análisis de rutina y del núcleo espermático, que estén asociados con tasas de preñez elevadas para IATF y permitan predecir el comportamiento de las dosis a campo. Se tomarán muestras aleatorias de cada partida de las dosis seminales congeladas ad hoc y se realizará el control de calidad espermático de rutina y el control nuclear. Se evaluarán: parámetros de motilidad espermática obtenidos por análisis computarizado (CASA),
morfología, viabilidad, integridad acrosómica y funcionalidad de la membrana espermática. La evaluación del núcleo espermático incluirá: morfología nuclear, maduración de la cromatina, decondensación y fragmentación nuclear. Esta última, se realizará a través de una prueba desarrollada en nuestro laboratorio (FCV-UBA). Los responsables del CIAVT seleccionarán los establecimientos donde se realizarán los
protocolos de IATF, así como los profesionales responsables de implementarlos, quienes recolectarán los resultados de preñez a campo. Sobre la base de estos resultados preliminares de nuestro grupo de trabajo y la experiencia de campo de los responsables del CIAVT, se espera encontrar asociación entre algunos de los parámetros seminales analizados y los porcentajes de preñez obtenidos por la técnica de IATF. Este proyecto intenta encontrar la existencia deindicadores de clasificación de fertilidad y de pérdidas embrionarias tempranas, lo que permitiría realizar una selección de los individuos más aptos para ser empleados como donantes para IATF. De esta forma, se podrían comercializar muestras de semen especialmente seleccionadas, con el valor agregado que
esto conlleva.
tratados con etilenglicol presentaron menor cantidad de alteraciones morfológicas que los expuestos a DMSO y a la combinación de etilenglicol + DMSO (Control: 87%; etilenglicol: 52%; DMSO: 17% y etilenglicol + DMSO: 26%; Friedman, p<0,05). En los FPA primarios el etilenglicol resultó menos tóxico (Control: 70%; etilenglicol: 34%), mientras que la respuesta a la vitrificación del grupo etilenglicol + DMSO fue superior (20%). La vitrificación en presencia de concentraciones crecientes de sacarosa disminuyó significativamente el porcentaje de folículos primordiales normales (Control:64%; 0M: 48%; 0,25M: 42%; 0,75M: 12%; 1M: 9%). Para todos los tratamientos, los folículos primarios presentaron más daños. En conclusión, el medio de elección para la vitrificación resultó ser TCM 199-Hepes con 30% etilenglicol y 0 o 0,25M de sacarosa.
plasmática e integridad acrosómica, en cuatro etapas diferentes del proceso. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros de calidad evaluados por lo que los diferentes prediluyentes no afectarían el proceso de congelado.
Austral. Se incubó el semen diluido con Pisum Sativum-Isotiocianato de Fluoresceína (0,01%), Ioduro de Propidio (0,05%) y Hoechst (0,1%). Los resultados se analizaron mediante estadística descriptiva. El porcentaje de células con acrosoma intacto fue inferior en el semen
refrigerado tanto para espermatozoides con membrana plasmática
intacta (Fresco: 59,6%; Refrigerado: 49,92%) como lesionada
(Fresco: 16,74%; Refrigerado: 10,17%). Se pudo evidenciar que
durante el proceso de refrigeración la membrana más afectada es la acrosomal.
movilidad en 11 eyaculados procedentes de 3 verracos. No existieron diferencias (p>0,05) entre diluyentes por lo que sería similar su capacidad de conservación durante un período de 4 días.
under demanding conditions, as well as deficiencies in sperm fertilizing ability, hyperactivation development and intracellular Ca2+
regulation.
what is known already: Testicular CRISP2 is present in mature sperm and has been proposed to participate in gamete fusion in both
humans and rodents. Interestingly, evidence in humans shows that aberrant expression of CRISP2 is associated with male infertility.
study design, samples/materials, methods: A mouse line carrying a deletion in the sixth exon of the Crisp2 gene was generated.
The analyses of the reproductive phenotype of Crisp22/2 adult males included the evaluation of their fertility before and after being subjected
to unilateral vasectomy, in vivo fertilization rates obtained after mating with either estrus or superovulated females, in vitro sperm fertilizing
ability and different sperm functional parameters associated with capacitation such as tyrosine phosphorylation (by western blot), acrosome reaction
(by Coomassie Blue staining), hyperactivation (by computer-assisted sperm analysis) and intracellular Ca2+ levels (by flow cytometry).
main results and the role of chance: Crisp22/2 males presented normal fertility and in vivo fertilization rates when mated with
estrus females.However, the mutant mice showed clear defects in those reproductive parameters compared with controls under more demanding
conditions, i.e. when subjected to unilateral vasectomy to reduce the number of ejaculated sperm (n ¼ 5; P , 0.05), or when mated with
hormone-treated females containing a high number of eggs in the ampulla (n ≥ 5; P , 0.01). In vitro fertilization studies revealed that
Crisp22/2 sperm exhibited deficiencies to penetrate the egg vestments (i.e. cumulus oophorus and zona pellucida) and to fuse with the egg
(n ≥ 6; P , 0.01). Consistent with this, Crisp2-null sperm showed lower levels of hyperactivation (n ¼ 7; P , 0.05), a vigorous motility required
for penetration of the egg coats, as well as a dysregulation in intracellular Ca2+ levels associated with capacitation (n ¼ 5; P , 0.001).
limitations, reasons for caution: The analysis of the possible mechanisms involved in fertility disorders in men with abnormal
expression of CRISP2 was carried out in Crisp2 knockout mice due to the ethical and technical problems inherent to the use of human gametes for
fertilization studies.
wider implications of the findings: Our findings in mice showing that Crisp22/2 males exhibit fertility and fertilization defects
under demanding conditions support fertilization defects in sperm as a mechanism underlying infertility in men with aberrant expression of
CRISP2. Moreover, our observations in mice resemble the situation in humans where fertility disorders can or cannot be detected depending
on the accumulation of own individual defects or the fertility status of the partner. Finally, the fact that reproductive defects in mice are masked by conventional mating highlights the need of using different experimental approaches to analyze male fertility.study funding and competing interest(s): This study was supported by theWorld Health Organization (H9/TSA/037),
the National Research Council of Argentina (PIP 2009-290), the National Agency for Scientific and Technological Promotion of Argentina (PICT 2011, 2023) and the Rene Baron Foundation to P.S.C. and by the MEXTof Japan to M.I. The authors declare that there are no conflicts of interest.
control de enfermedades de transmisión sexual, la posibilidad de emplear toros con facilidad de parto y la optimización del manejo reproductivo del rodeo. La Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) suma beneficios tales como evitar la detección de celo, acortar el período de anestro post-parto y concentrar los partos en un período breve. El éxito de la IATF depende de múltiples factores entre los que se encuentra la calidad seminal. Ningún examen de semen in vitro presenta una correlación alta con la fertilidad, por lo cual debe desarrollarse un protocolo de control de calidad que estudie el mayor número posible de características de los espermatozoides. La selección de mejores muestras para IATF permitiría evitar la repetición en las inseminaciones o el repaso con monta natural. El objetivo del presente trabajo es encontrar indicadores seminales, a través de los análisis de rutina y del núcleo espermático, que estén asociados con tasas de preñez elevadas para IATF y permitan predecir el comportamiento de las dosis a campo. Se tomarán muestras aleatorias de cada partida de las dosis seminales congeladas ad hoc y se realizará el control de calidad espermático de rutina y el control nuclear. Se evaluarán: parámetros de motilidad espermática obtenidos por análisis computarizado (CASA),
morfología, viabilidad, integridad acrosómica y funcionalidad de la membrana espermática. La evaluación del núcleo espermático incluirá: morfología nuclear, maduración de la cromatina, decondensación y fragmentación nuclear. Esta última, se realizará a través de una prueba desarrollada en nuestro laboratorio (FCV-UBA). Los responsables del CIAVT seleccionarán los establecimientos donde se realizarán los
protocolos de IATF, así como los profesionales responsables de implementarlos, quienes recolectarán los resultados de preñez a campo. Sobre la base de estos resultados preliminares de nuestro grupo de trabajo y la experiencia de campo de los responsables del CIAVT, se espera encontrar asociación entre algunos de los parámetros seminales analizados y los porcentajes de preñez obtenidos por la técnica de IATF. Este proyecto intenta encontrar la existencia deindicadores de clasificación de fertilidad y de pérdidas embrionarias tempranas, lo que permitiría realizar una selección de los individuos más aptos para ser empleados como donantes para IATF. De esta forma, se podrían comercializar muestras de semen especialmente seleccionadas, con el valor agregado que
esto conlleva.
tratados con etilenglicol presentaron menor cantidad de alteraciones morfológicas que los expuestos a DMSO y a la combinación de etilenglicol + DMSO (Control: 87%; etilenglicol: 52%; DMSO: 17% y etilenglicol + DMSO: 26%; Friedman, p<0,05). En los FPA primarios el etilenglicol resultó menos tóxico (Control: 70%; etilenglicol: 34%), mientras que la respuesta a la vitrificación del grupo etilenglicol + DMSO fue superior (20%). La vitrificación en presencia de concentraciones crecientes de sacarosa disminuyó significativamente el porcentaje de folículos primordiales normales (Control:64%; 0M: 48%; 0,25M: 42%; 0,75M: 12%; 1M: 9%). Para todos los tratamientos, los folículos primarios presentaron más daños. En conclusión, el medio de elección para la vitrificación resultó ser TCM 199-Hepes con 30% etilenglicol y 0 o 0,25M de sacarosa.
plasmática e integridad acrosómica, en cuatro etapas diferentes del proceso. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros de calidad evaluados por lo que los diferentes prediluyentes no afectarían el proceso de congelado.
Austral. Se incubó el semen diluido con Pisum Sativum-Isotiocianato de Fluoresceína (0,01%), Ioduro de Propidio (0,05%) y Hoechst (0,1%). Los resultados se analizaron mediante estadística descriptiva. El porcentaje de células con acrosoma intacto fue inferior en el semen
refrigerado tanto para espermatozoides con membrana plasmática
intacta (Fresco: 59,6%; Refrigerado: 49,92%) como lesionada
(Fresco: 16,74%; Refrigerado: 10,17%). Se pudo evidenciar que
durante el proceso de refrigeración la membrana más afectada es la acrosomal.
movilidad en 11 eyaculados procedentes de 3 verracos. No existieron diferencias (p>0,05) entre diluyentes por lo que sería similar su capacidad de conservación durante un período de 4 días.