ELISABETH EMILIA AUGUSTA DANTAS TÖLKE
“ESTUDOS ESTRUTURAIS EM ÓRGÃOS REPRODUTIVOS DE
Tapirira guianesnis AUBL. (ANACARDIACEAE)”
CAMPINAS
2013
i
ii
iii
AGRADECIMENTOS
Ao CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pela bolsa
de mestrado concedida durante os primeiros meses de desenvolvimento deste trabalho.
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela bolsa de
mestrado e reserva técnica concedida, que foram significativas para o desenvolvimento deste
trabalho.
Ao Departamento de Biologia Vegetal e ao Programa de Pós-graduação em Biologia
Vegetal da UNICAMP, pela excelência do curso oferecido.
À professora Dra. Sandra Maria Carmello Guerreiro pela orientação, por quem tenho
grande admiração e respeito. Agradeço pela paciência e pela confiança, agradeço pelos
ensinamentos que levarei comigo por toda uma vida.
Ao João Carlos, técnico do laboratório de taxonomia, pelo auxílio durante a realização das
coletas, sua ajuda foi de fundamental importância. Ao Tião, técnico da anatomia vegetal, pelos
serviços e ensinamentos prestados.
Aos professores Leonardo Galetto da Universidad Nacional de Córdoba e Silvia
Rodrigues Machado da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, pelos
ensinamentos em uma área que eu nunca havia explorado; a paciência e auxílio deles foram
fundamentais para a realização do trabalho.
Aos colegas pesquisadores do laboratório de Anatomia Vegetal: Carolina, Juliana,
Cristina, Rafael, Diego e Bárbara, por todo apoio durante todo o tempo que passei longe da
minha família. Obrigada, sem vocês eu não teria conseguido.
Ao Iranildo Melo e Ana Paula Lacchia por me incentivarem a buscar sempre mais, foram
eles os responsáveis pela minha inserção no mundo da Botânica, a quem serei eternamente grata.
São meus mestres e minha inspiração.
A todos os meus amigos que torceram por mim, me deram apoio e me fizeram sentir uma
pessoa querida. Agradeço por acreditarem que sou capaz.
iv
À minha família, especialmente aos meus pais, Lúcia e Jürgen. Agradeço pelo amor e
dedicação sem limites, por acreditarem em mim e por toda a força mesmo nos momentos mais
difíceis.
À Allysson Allan por compartilhar todos os momentos da realização deste trabalho. Foi
ele quem me deu força para continuar, mesmo nos momentos em que eu queria desistir. Agradeço
pela compreensão, apoio, companheirismo, amor, amizade e por suportar a distância durante todo
este tempo.
v
Sumário
Resumo
1
Abstract
3
Introdução geral
5
A família Anacardiaceae
5
O gênero Tapirira Aubl.
7
Estruturas secretoras em Anacardiaceae
9
Justificativa
16
Objetivos
16
Material e métodos
16
Referências
19
Capítulo 1. Nectário floral de Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae): aspectos
27
estruturais, ultraestruturais e composição química do néctar
Resumo
28
Abstract
29
Introdução
30
Material e Métodos
33
Microscopia de luz
33
Histoquímica
33
Microscopia eletrônica de transmissão
34
Análise da secreção produzida pelo tecido glandular
34
Resultados
36
Aspectos estruturais e histoquímica
36
Aspectos ultraestruturais
43
vi
Análise da secreção produzida pelo tecido glandular
53
Discussão
54
Referências
62
Capítulo 2. Ontogenia do pericarpo e semente de Tapirira guianensis Aubl.
70
(Anacardiaceae): aspectos estruturais, ultraestruturais e histoquímica
Resumo
71
Abstract
72
Introdução
73
Material e Métodos
75
Microscopia de luz
75
Histoquímica
76
Microscopia eletrônica de varredura
76
Microscopia eletrônica de transmissão
77
Resultados
77
Ontogenia e histoquímica do pericarpo
77
Aspectos ultraestruturais do endocarpo jovem
91
Ontogenia e histoquímica da semente
92
Discussão
99
Referências
107
Considerações finais
114
vii
Resumo
Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae) conhecida popularmente como pau-pombo é uma
espécie importante para uso madeireiro, medicinal e pode ser empregada na recuperação de áreas
degradadas e de matas ciliares. Diversas substâncias são produzidas em estruturas secretoras
específicas, sendo a presença de canais e cavidades secretoras característica universal da família.
Na literatura é relatada a presença de disco nectarífero intraestaminal nas flores de muitas
Anacardiaceae. No entanto, estudos anatômicos e histoquímicos recentes não comprovaram a
secreção de néctar por esta estrutura. Além disso, nestes trabalhos foi verificada a persistência do
disco intraestaminal no fruto maduro de T. guianensis, bem como a presença de um endocarpo
secretor em frutos não maduros. Aliado a estes fatores, a ontogenia de frutos e sementes também
é um tema pouco explorado frente ao grande número de espécies da família. A anatomia dos
frutos de Anacardiaceae tem-se mostrado de grande valor sistemático. Assim, o presente trabalho
consistiu em verificar a estrutura e ultraestrutura do disco glandular de flores e frutos de T.
guianensis, bem como examinar a natureza da secreção produzida e estudar a ontogenia do fruto
e da semente. Com os resultados alcançados foi possível determinar que a glândula floral das
flores hermafroditas de T. guianensis é uma glândula de secreção mista, produzindo néctar com
predominância de sacarose, lipídios e substâncias fenólicas. Ultraestruturalmente esta glândula
passa por mudanças profundas ao longo do desenvolvimento da flor, inicialmente rica em
amiloplastos e posteriormente plastídios desprovidos de amido e mitocôndrias repletas de
gotículas de óleo, indicando a mudança da secreção antes predominantemente hidrofílica para
lipofílica. No que diz respeito à anatomia do fruto, observou-se que o mesmo possui
características típicas da tribo Spondieae, porém algumas delas indicam uma condição menos
derivada da espécie, como ausência de opérculo e endocarpo relativamente fino quando
comparado com outras espécies da mesma tribo. O pericarpo possui grande quantidade de canais
resiníferos na região do mesocarpo, epicarpo produzindo substâncias fenólicas e lipídios, e por
meio de microscopia eletrônica de transmissão pôde-se observar o modo de secreção, as
organelas envolvidas do processo, bem como a estrutura celular. A semente provém de um óvulo
único, anátropo, bitegumentado, crassinucelado de funículo longo. A semente não possui camada
1
mecânica, tem a exotesta e endotégmen ricos em substâncias fenólicas, cristais no mesotégmen,
desenvolvimento de paquicalaza parcial, hipóstase fenólica e lipídica, permanência de funículo
aderido ao envoltório da semente, formando um arilo vestigial. O embrião armazena grande
quantidade de proteínas e amido, indicando uma condição de transição da espécie, pois em
Anacardiaceae as reservas são constituídas principalmente por proteínas e lipídios. O fruto e
semente apresentaram algumas características anatômicas possivelmente relacionadas à dispersão
como, formação de aerênquima no mesocarpo interno e na mesotesta, acúmulo de amido no
mesocarpo. O trabalho traz contribuições no estudo de glândulas florais em Anacardiaceae e na
área de ontogenia de frutos e sementes.
Palavras-chave: estruturas secretoras, ontogenia, pericarpo, semente.
2
Abstract
Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae) well-known as “pau-pombo” is an important species
with uses as timber, in medicine and can be employed recovering degraded areas and riparian
forests. Several substances are produced in specific secretory structures and the presence of
cavities and ducts are universal features in the family. In literature is reported the presence of an
intrastaminal receptacular nectary in the flowers of many Anacardiaceae, however anatomical
and histochemical recent studies did not support the nectar secretion by this structure.
Furthermore, in other studies were found the persistence of intrastaminal receptacular gland in T.
guianensis ripe fruits and the presence of a secretory endocarp in unripe fruits. Allied these
factors, the ontogeny of fruits and seeds is also a relatively unexplored subject, in contrast with
the large number of species from this family. The fruit anatomy of Anacardiaceae has proved
great systematic value. Thus, the present study verified T. guianensis structure and ultrastructure
of flowers and fruits intrastaminal gland and examined the nature of substances produced as well
the fruit and seed development. With the results obtained it was possible provide that the T.
guianensis floral gland of hermaphrodite flowers is a mixed secretion gland, producing nectar
with sucrose predominance, lipids and fenolic substances. Ultrastructurally, this gland undergoes
deep changes during the development of the flower, originally rich in amyloplasts and
subsequently chloroplasts devoids of starch and mitochondria replete with oil droplets, indicating
the change in the secretion predominantly hydrophilic to lipophilic. With respect to the fruit
anatomy, it was observed characteristics typical of the tribe Spodieae, but some of them indicate
a condition less derived of this species, such as lack of operculum and endocarp relatively thin
compared to other species of the same tribe. Pericarp has a large number of resiniferous ducts in
mesocarp region, and epicarp produces phenolic substances and lipids. By transmission electron
microscopy it was possible to observe the way of secretion, the organelles involved in process
and the cell structure. Seed comes from a single ovule, anatropous, bitegmic, crassinucelate with
longe funicle. Seed does not have mechanical layer, has exotest and endotegmen rich in phenolic
substances, crystals in mesotegmen, development of partial pachycalaza, phenolic and lipid
hypostasis, permanence of the funicle attached to the seed-coat, forming a vestigial aril. The
3
embryo stores large amounts of protein and starch, indicating a transitional condition in the
species, because Anacardiaceae reserves comprehend mainly protein and lipids. Fruit and seed
showed anatomical characteristics possibly related to dispersion, like formation of aerenchyma in
the inner mesocarp and mesotest, starch accumulations in mesocarp. The work brings
contributions in the study of Anacardiaceae floral glands and in the area of fruit and seeds
ontogeny.
Key-words: secretory structures, ontogeny, pericarp, seed.
4
Introdução geral
A família Anacardiaceae
A família Anacardiaceae foi descrita pela primeira vez por Lindley em 1830, sendo
incluída na ordem Sapindales por Cronquist (1981) juntamente com as famílias Julianiaceae e
Burseraceae, permanecendo até hoje na mesma ordem de acordo com a APG III (2009).
Benthan & Hooker (1862) foram os primeiros a proporem uma subdivisão da família em
duas tribos: Anacardieae e Spondieae, a primeira contendo apenas um lóculo no ovário; e a
segunda contendo de dois a cinco lóculos. A seguir, Marchand (1869) propôs a divisão em nove
tribos: Astronieae, Buchananieae, Mangifereae, Pistacieae, Rhoideae, Semecarpeae, Spondieae,
Tapirieae e Thyrsodieae. Posteriormente, Engler (1876) expandiu essa divisão para 11 tribos, no
entanto, com base no número de carpelos e de lóculos na flor e no fruto, morfologia do estilete,
inserção do óvulo e morfologia da flor, ele reduziu o número de tribos para cinco: Anacardiëae,
Dobineëae, Rhoëae, Semecarpeae e Spondiadeae (Engler 1892). Classificações mais recentes
foram propostas por Takhtajan (1987, 1997), Mitchell e Mori (1987) e Wannan & Quinn (1991).
Os dados da estrutura floral (Wannan & Quinn 1991), assim como os da anatomia do
pericarpo (Wannan & Quinn 1990), indicam que a divisão infrafamiliar em cinco tribos proposta
por Engler (1892) é artificial, e que Blepharocaryaceae e Julianiaceae devem ser incluídas na
família Anacardiaceae. As tribos Anacardiëae, Dobiniëae, Semecarpeae e Rhoëae são
reconhecidas como um grande grupo monofilético, juntamente com Blepharocaryaceae e
Julianiaceae (Wannan & Quinn 1990, Wannan & Quinn 1991, Aguilar-Ortigoza & Sosa 2004
Bachelier & Endress 2009). De acordo com os mesmos autores Spondiadeae e dois gêneros de
Rhoëae (Campnosperma Thwites e Pentaspadon Hook. f.) são muito diversos e são colocados em
um grupo artificial caracterizado por um conjunto de plesiomorfias. Embora existam estas
contradições, a classificação infrafamiliar proposta por Engler (1892) ainda é a mais aceita
(Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009).
Segundo Wannan & Quinn (1990, 1991) e Judd et al. (2007) o primeiro grupo
(Anacardiëae, Dobiniëae, Semecarpeae e Rhoëae) apresenta gineceu com três (ou menos)
carpelos, ovários uniloculares com placentação apical e frutos contendo endocarpo composto por
5
camadas de células regularmente arranjadas. Já Spondiadeae, Campnosperma Thwites e
Pentaspadon Hook. f. apresentam gineceu pentacarpelar, ovário multilocular e frutos com
endocarpo espesso devido a presença de esclereídes lignificadas arranjadas irregularmente.
Anacardiaceae reúne aproximadamente 600 espécies e 70 gêneros (Judd et al. 2007,
Barroso et al. 2007). No Brasil está representada por 14 gêneros e 57 espécies, sendo os gêneros
Schinus L., Anacardium L., Astronium Jacq. e Spondias L. os mais numerosos (Silva-Cruz &
Pirani 2011). Possui distribuição tropical e subtropical, com poucas espécies em regiões
temperadas, englobando arbustos ou árvores, raramente lianas ou ervas (Barroso et al. 2007, Judd
et al. 2007, Souza & Lorenzi 2008). Os mesmos autores destacam aspectos morfológicos que
caracterizam a família: folhas alternas compostas ou simples, sem estípulas; inflorescência
geralmente cimosa, podendo ocorrer panículas; flores pouco vistosas, geralmente unissexuadas,
actinomorfas, diclamídeas, disco nectarífero presente, ovário geralmente súpero com lóculos
uniovulados, placentação ereta ou pêndula; fruto em geral drupa ou sâmara.
Suas espécies são conhecidas pela produção de frutos comestíveis, madeira, goma,
resinas, taninos e outras substâncias utilizadas na medicina popular e na indústria (Dong & Bass
1993, Leon 2003, Pell 2004, Barroso et al 2007, Judd et al. 2007). Economicamente, destacam-se
Anacardium occidentale L. (cajueiro), Mangifera indica L. (mangueira), Spondias spp. (cajás),
Spondias tuberosa Arruda (umbuzeiro), Spondias purpurea L. (seriguela) como produtoras de
frutos comestíveis e, Astronium fraxinifolium Schott (gonçalo-alves), Astronium graveolens Jacq.
(guaritá), Myracrodruon urundeuva Allemão (aroeira), Lithraea molleoides (Vell.) Engl.
(aroeira-branca) e Schinopsis brasiliensis Engl. (braúna) como produtoras de madeira de boa
qualidade (Souza & Lorenzi 2008). Os autores ainda relatam a utilização ornamental de Schinus
terebinthifolius Raddi (aroeira-vermelha), Rhus succedanea L. (charão) e Schinus molle L.
(aroeira-salsa).
Possuem canais secretores bem desenvolvidos associados ao floema primário e
secundário, característica universal da família (Metcalfe & Chalk 1950, Joel & Fahn 1980,
Wannan & Quinn 1991, Venkaiah 1992, Carmello et al. 1995, Machado & Carmello-Guerreiro
2001, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009). A dermatite provocada por quase todas as espécies
da família é atribuída a compostos fenólicos e catecólicos ou a mistura de ambos produzidos em
canais ou cavidades secretoras (Correia et al 2006), tendo importância pelas propriedades tóxicas
6
e alergênicas (Mitchell 1990, Dong & Bass 1993). Os biflavonóides são substâncias fenólicas
comuns na maioria das espécies de Anacardiaceae (Aguilar-Ortigosa & Sosa 2004) e são
importantes na defesa da planta contra fungos patogênicos, insetos e herbívoros (Mitchell 1990,
Aguilar-Ortigosa & Sosa 2004).
O uso medicinal popular despertou interesse pelo estudo da composição química e
atividade biológica de seus extratos e metabólitos, sendo, nesse ponto de vista, os gêneros mais
estudados: Mangifera, Rhus, Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia,
Lithraea, Tapirira e Melanorrhoea (Correia et al. 2006). No estudo de muitas espécies desses
gêneros foi possível detectar flavonóides (principalmente biflavonóides), terpenos, esteróides,
xantonas, lipídios fenólicos e derivados (Anjaneyulu et al. 1999, Correia et al. 2001, Correia et
al. 2003, Braca et al. 2003, Correia et al. 2006, Shimizu et al. 2006, Ceruks et al. 2007,
Chryssagvi et al. 2008, Ono et al. 2008, Correia et al. 2008, Santos et al. 2010, Deveci et al.
2010, Tomaino et al. 2010, Moyo et al. 2010, Chaves et al. 2010).
No uso popular medicinal sobressaem-se Semecarpus anacardium L. f. utilizada no
tratamento da hanseníase e da debilidade nervosa (Bhatt & Ram 1992); Tapirira guianensis Aubl.
para hanseníase, diarréia e sífilis (Correia et al. 2008); utilização das cascas de Spondias tuberosa
Arruda no controle de diarréias, verminoses e escorbuto (Nascimento-Silva et al. 2008); Schinus
terebinthifolius Raddi, tendo propriedades febrífuga, homeostática e antitussígena (Machado &
Carmello-Guerreiro 2001), na cicatrização de feridas e úlceras, tratamento de inflamações
uterinas, atividades antimicrobiana, antiespasmódica e antireumática (Santos et al. 2010);
Myracroduon urundeuva Fr. All no tratamento de hemorragias, infecções respiratórias, urinárias
e distúrbios do sistema digestório, além de possuir efeito antiinflamatório e cicatrizante (Pacheco
et al. 2006); Pistacia lentiscus L. por conter propriedades diuréticas e por tratar a hipertensão,
tosse, dor de garganta, eczema, dores no estômago, cálculo renal e icterícia (Benhammou et al.
2008); Anacardium humile St. Hill. contra úlcera, gastrite e diarréia (Luiz-Ferreira et al. 2010).
O gênero Tapirira Aubl.
Tapirira Aubl. foi descrito por Aublet em 1775; em 1883 Engler deu ao gênero sua
presente circunscrição e o colocou na tribo Spondiadeae (Terrazas & Wendt 1995, VonTeichman 1990). O gênero inclui aproximadamente 28 espécies arbóreas (Tropicos 2012)
7
ocorrentes principalmente na América do Sul, estendendo-se pelo México, Peru, Paraguai e
Brasil (Terrazas & Wendt 1995). No Brasil ocorrem apenas quatro espécies: Tapirira guianensis
Aubl., T. obtusa (Benth.) J.D. Mitch., T. pilosa Sprague e T. retusa Ducke. As espécies são
amplamente distribuídas por todo território nacional, exceto nos Estados de Roraima, Amapá e
Rio Grande do Sul (Silva-Cruz & Pirani 2011). Os indivíduos podem atingir alturas superiores a
30 m e diâmetro acima de 1 m, sendo frequentes em florestas tropicais e florestas de altitude, bem
como em outras vegetações (Terrazas & Wendt 1995).
No que concerne à composição química de suas espécies e atividade biológica de seus
extratos e metabólitos é um dos gêneros mais estudados da família Anacardiaceae (Correia et al
2006). Em estudos fitoquímicos foram isolados flavonóides, terpenos, esteróides, ferulatos e
derivados de alquil e alquenil fenóis (David et al. 1998, Correia et al 2001, Correia et al 2003,
Correia et al 2008, Roumy et al. 2009).
Poucos trabalhos anatômicos foram realizados para o gênero, destacando-se VonTeichman (1990) no estudo acerca da estrutura do pericarpo e da semente de Tapirira guianensis
Aubl. e Lacchia (2006) evidenciando as estruturas secretoras presentes nos ápices caulinares, nas
folhas, nas flores e no fruto da mesma espécie, sendo destacada a presença de canais e idioblastos
em todos os órgãos estudados.
A espécie escolhida para este estudo foi Tapirira guianensis Aubl. conhecida
popularmente como pau-pombo, peito-de-pomba, cupuba ou camboatá (Silva-Cruz & Pirani
2011). É uma espécie arbórea, dióica (Fig. 1), importante para uso madeireiro, medicinal e para
ser empregada na recuperação de áreas degradadas e de matas ciliares (Lorenzi 2002, Lenza &
Oliveira 2005, Santana et al. 2009); florescendo de agosto à dezembro e frutificando de outubro à
março (Guimarães 2003, Lenza & Oliveira 2005). Está distribuída em todo território brasileiro
(Silva-Cruz & Pirani 2011), principalmente em áreas de solo úmido (Santana et al 2009).
É relatada para esta espécie atividade contra câncer humano de próstata e efeito
estimulante uterino e é utilizada na medicina popular contra lepra, diarréia e sífilis (David et al
1998, Correia et al 2003, Correia et al 2008).
8
Figura 1. Inflorescência de Tapirira guianensis Aubl. A. Inflorescência contendo
flores hermafroditas. B. Inflorescência contendo flores estaminadas. Barras: 1 cm
(A-B).
Estruturas secretoras em Anacardiaceae
Como dito anteriormente, a família Anacardiaceae é conhecida pela produção de
substâncias importantes na indústria, na medicina popular e de efeito alergênico (Dong & Bass
1993, Leon 2003, Pell 2004, Barroso et al. 2007, Judd et al. 2007). Todas estas substâncias são
produzidas e armazenadas por estruturas secretoras que, para esta família, podem ser de vários
tipos: canais, cavidades, idioblastos, tricomas glandulares e nectários (Metcalfe & Chalk 1950,
Wunnachit et al. 1992, Pell 2004, Judd et al. 2007, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009).
As estruturas secretoras de maior ocorrência em Anacardiaceae são os canais e cavidades,
tanto em órgãos vegetativos quanto reprodutivos (Metcalfe & Chalk 1950, Machado & CarmelloGuerreiro 2001, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009). Geralmente estão associados ao floema
primário, secundário e/ou medula (Metcalfe & Chalk 1950). Os canais podem produzir resina,
9
goma-resina ou goma; já nas cavidades é mais comum a produção de resinas e óleo-resinas
(Venning 1948, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009).
Alguns idioblastos podem estar
associados aos canais, como em Tapirira guianensis Aubl., ou ocorrerem dispersos em diferentes
órgãos vegetativos ou reprodutivos (Lacchia 2006).
Entre as estruturas secretoras também merecem destaque os tricomas glandulares
ocorrentes em algumas espécies, sendo poucos os estudos que fazem referência à composição
química do material exsudado (Metcalfe & Chalk 1950). A maioria desses tricomas está
associada às folhas (Paula & Alves 1973), podendo ocorrer também nos órgãos reprodutivos, tais
como flores, brácteas, eixos de inflorescência, ovário e pétalas (Lacchia 2006). Lacchia (2006)
denominou os tricomas glandulares presentes em primórdios foliares e ápices caulinares em
algumas espécies de Anacardiaceae de coléteres, por serem estes encontrados em órgãos jovens
em desenvolvimento e secretarem mucilagem dentre outras substâncias, sendo descritos pela
primeira vez para a família nesse trabalho.
Em Anacardium occidentale L., Wunnachit et al. (1992) consideraram os tricomas
presentes na base da corola ao redor do ovário, como produtores de néctar, sendo comprovada a
secreção da substância através de cromatografia. A mesma espécie foi estudada por Rickson &
Rickson (1998), sendo atribuído caráter nectarífero à secreção produzida pelos tricomas
glandulares que revestem depressões foliares. Lacchia (2006) por meio de testes histoquímicos
em folhas e tricomas glandulares das pétalas florais de Anacardium humile, detectou a presença
de compostos fenólicos lipossolúveis e polissacarídeos, apresentando duas hipóteses para estes
resultados, os tricomas produzem secreção mista ou são secretores de néctar com grande
quantidade de lipídios e compostos fenólicos. Os autores acreditam que a secreção atrai formigas
responsáveis pela proteção das folhas contra herbivoria.
Além dos tricomas glandulares que podem ser responsáveis pela produção de néctar Judd
et al. (2007) e Barroso et al. (2007) afirmam que em algumas espécies as flores de Anacardiaceae
possuem um disco nectarífero intraestaminal. Wannan & Quinn (1991), Von-Teichman & VanWyk (1994, 1996), Gallant et al. (1998) e Lacchia (2006) constataram a presença desse disco na
base do ovário de muitas espécies da família, no entanto não haviam estudos detalhados que
comprovassem a secreção de néctar por este disco. Von-Teichman & Van-Wyk (1994, 1996)
estudaram a estrutura anatômica da glândula presente em quatro espécies (Heeria argentea
10
Meisn., Ozoroa namaquensis (Sprague) I. von Teichman & A.E. van Wyk, Ozoroa paniculosa
(Sond.) R. Fern. & A. Fern. e Protorhus longifolia (Bernh.) Engl.). No entanto, não realizaram
nenhum estudo histoquímico ou bioquímico que comprovasse a composição do exsudato. No
trabalho de Lacchia (2006) foi comprovada a presença de disco glandular na base do ovário de
flores estaminadas e hermafroditas de Lithraea molleoides (Vell.) Engl. e Tapirira guianensis
Aubl. sendo que nesta última espécie, o mesmo permanece durante todo o desenvolvimento do
fruto. Por meio de testes histoquímicos a autora constatou a produção de substâncias lipofílicas e
polissacarídicas nessa estrutura, no entanto, também não ficou comprovada a secreção de néctar.
O presente estudo representa uma continuidade do trabalho “Estruturas secretoras em
órgãos vegetativos e reprodutivos de espécies de Anacardiaceae: anatomia, histoquímica e
ultraestrutura” desenvolvido como tese de doutorado por Lacchia (2006). Através dos dados
obtidos pela autora, constatou-se que a flor de Tapiria guianensis Aubl. possui um disco
intraestaminal e o mesmo persiste na base do fruto. Neste disco a epiderme tem inúmeros
estômatos e as células parenquimáticas possuem amido. A autora levantou em seu trabalho duas
hipóteses acerca da problemática: (1) a presença de estômatos na epiderme e de amido nas células
parenquimáticas do disco poderia levar a supor que este disco produziria néctar além de
substâncias lipídicas, sendo caracterizado como uma glândula mista; ou (2) esta glândula produz
apenas lipídios na região cortical e os estômatos são uma herança filogenética do grupo ao qual
pertence a espécie.
Outro aspecto interessante observado por Lacchia (2006) em T. guianensis foi a presença
de um endocarpo secretor em frutos não maduros. O conteúdo das células da camada do
endocarpo em contato com o lóculo reagiu positivamente para mucilagem e lipídios ácidos.
Também foi possível observar a presença de material com aspecto de gotas na superfície do
endocarpo e na testa da semente, no entanto, não foi possível caracterizar a composição química
exata da substância secretada. Estes resultados serviram de estímulo para análise dessas
substâncias secretadas para que por meio dos novos dados obtidos averiguar se o disco
intraestaminal presente na espécie em questão é um nectário floral.
Agrega-se a estes fatores acima mencionados a inserção da presente dissertação no projeto
de pesquisa intitulado “Estruturas secretoras em espécies vegetais do Cerrado: abordagens
morfológica, química e ecológica”, realizada na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
11
Filho – UNESP, Campus de Botucatu, liderada pela pesquisadora Profa. Dra. Silvia Rodrigues
Machado. O projeto tem por objetivo ampliar o conhecimento sobre aspectos da biologia e
química da secreção em espécies vegetais do Cerrado e reúne pesquisadores de diversas
instituições, inclusive da UNICAMP.
As estruturas secretoras em órgãos reprodutivos para a família Anacardiaceae ainda são
pouco estudadas se comparados ao volume de informações acerca dessas estruturas em órgãos
vegetativos (Tabela 1 e 2). Se considerarmos os estudos anatômicos, histoquímicos e bioquímicos
relacionados especificamente as estruturas produtoras de néctar, teremos então um número ainda
mais reduzido (Wunnachit et al. 1992; Rickson & Rickson 1998). Nas tabelas a seguir
apresentam-se resumidamente os estudos realizados com estruturas secretoras presentes em
órgãos vegetativos e reprodutivos em Anacardiaceae.
12
Tabela 1. Estruturas secretoras em órgãos vegetativos na família Anacardiaceae.
Espécies
Anacardium amapaense J.D.
Mitch.
Anacardium humile A. St.-Hil.
Canais
Cavidades
Idioblastos
Tricomas
Nectários
Autores
-
-
-
X
-
Mitchell (1992)
X
-
X
X
-
Lacchia (2006); Naranjo e Pernia
(1990);
Anacardium nanum A. St.-Hil.
X
-
-
X
-
Morretes (1967)
Anacardium occidentale L.
X
X
-
X
X
Nair et al. (1983); Torres e Jáurequi
(1999); Rickson e Rickson (1998);
Wunnachit et al. (1992)
Anacardium parvifolium Ducke
-
-
-
X
-
Mitchell (1992)
Anacardium spruceanum Benth.
Ex Engl.
Cotinus coggygria Scop.
X
X
X
X
-
Paula e Alves (1973)
X
-
X
-
-
Szabó (1971)
Lannea coromandelica (Houtt.)
Merr.
Lithraeae molleoides Engl.
X
-
-
-
-
Venkaiah (1992)
X
-
X
X
-
Lacchia (2006); Carmello et al.
(1995)
Mangifera indica L.
X
X
-
X
-
Venning (1948); 14. Tewfic e Habib
(1977); 15. Joel e Fahn (1980)a;
Torres e Jáurequi (1999)
Pachycormus discolor Coville ex
Standl.
Pistacia lentiscus L.
X
-
X
X
-
Gibson (1981)
X
-
X
-
-
Sawidis et al. (2000);
Pleiogynium solandri (Benth.)
Engl.
Rhus glabra L.
X
-
-
-
-
Venning (1948)
X
-
-
-
-
Fahn e Evert (1964)
Rhus succedanea L.
X
-
-
-
-
Harada (1937)
Rhus toxicodendron L.
X
-
-
-
-
Vassilyev (2000)
Rhus vernicifera DC.
X
-
-
-
-
Luo e Xu (1984)
13
Continuação tabela 1
Schinus lentiscifolius Marchand
X
-
X
X
-
Paviani (1965)
Schinus molle L.
X
-
X
X
-
Paviani (1965)
Schinus polygamus (Cav.) Cabrera
-
-
X
X
-
Paviani (1965)
Schinus terebinthifolius Raddi
X
-
X
-
-
Venning (1948); Paviani (1965)
Semecarpus anacardium L. f.
X
-
-
-
-
Bhatt e Ram (1992)
Spondias dulcis G. Forst.
X
-
X
X
-
Lacchia (2006); Venning (1948);
Sant’anna-Santos et al. (2006)
Spondias purpurea L.
-
X
-
X
Spondias tuberosa Arruda
X
-
-
X
Tapirira guianensis Aubl.
X
-
X
X
-
Torres e Jáurequi (1999)
Sant’anna (1975)
-
Lacchia (2006); Den Outer e VanVaenendaal (1986).
14
Tabela 2. Estruturas secretoras em órgãos reprodutivos na família Anacardiaceae.
Espécies
Canais
Cavidades
Idioblastos
Tricomas
Nectários
Autores
Anacardium curatellaefolium Saint-Hilaire
X
X
-
-
-
Paula e Heringer (1978)
Anacardium humile A. St.-Hil.
X
-
-
X
-
Lacchia (2006)
Anacardium occidentale L.
-
-
-
-
X
Wunnachit et al. (1992)
Anacardium spruceanum Benth. Ex Engl.
X
X
-
-
-
Paula e Alves (1973)
Astronium graveolens Jacq.
X
-
-
-
-
Heeria argentea Meisn.
X
-
X
-
-
Lannea discolor Engl.
X
-
X
-
-
Carmello-Guerreiro e Paoli
(2000)
Von-Teichman e Van-Wyk
(1996)
Von-Teichman (1987)
Lithraeae brasiliensis Marchand
X
-
X
-
-
Lithraeae molleoides Engl.
X
-
-
X
-
Mangifera indica L.
X
-
-
-
-
Ozoroa namaquensis (Sprague) I. von
Teichman & A.E. van Wyk
-
-
-
X
-
Protorhus namaquensis Sprague
X
X
X
-
-
Rhus problematodes Merxm. & Roessl.
X
-
X
-
-
Rhus succedanea L.
X
-
-
-
-
Schinus terebinthifolius Raddi
X
X
-
X
-
Schinopsis balansae Engl.
X
-
-
-
-
Machado e CarmelloGuerreiro (2001); CarmelloGuerreiro e Paoli (2002)
González e Vesprini (2010)
Smodingium argutum E. Mey. ex Sond.
X
-
-
-
-
Von-Teichman (1998)
Spondias mombin L.
X
-
X
-
-
Lozano (1986)
Tapirira guianensis Aubl.
X
-
-
X
-
Lacchia (2006)
15
Piennar e Von-Teichman
(1998)
Lacchia (2006); . CarmelloGuerreiro e Paoli (2005)
Venning (1948); Joel e Fahn
(1980)b
Von-Teichman e Van-Wyk
(1994)
Von-Teichman e Van-Wyk
(1994)
Von-Teichman e Van-Wyk
(1991)
Harada (1937)
Justificativa
A família Anacardiaceae é bastante representativa em território nacional e poucos
trabalhos abordam a estrutura de nectários e a química da secreção produzida por estas estruturas
(Wunnachit et al. 1992, Rickson & Rickson 1998). Do ponto de vista da ontogenia de frutos e
sementes também são poucos os estudos que abordam esse aspecto (Von-Teichman & Robbertse
1986, Von-Teichman 1987, Von-Teichman & Van-Wyk 1988, Von-Teichman & Van-Wyk 1993,
Von-Teichman & Van-Wyk 1994, Von-Teichman & Van-Wyk 1996, Li et al. 1999, CarmelloGuerreiro & Paoli 2002, González & Vesprini 2010), particularmente na tribo Spondiadeae (VonTeichman 1987), a maioria dos trabalhos relatam a anatomia de frutos e sementes já
desenvolvidos, o que pode gerar confusões na interpretação dos resultados.
Neste contexto, a análise anatômica e histoquímica dessas estruturas, bem como, as
análises químicas da secreção, oferecem a oportunidade de discutir o papel evolutivo e o papel
ecológico das estruturas aqui abordadas, bem como, fornecer dados que possam ser utilizados em
trabalhos filogenéticos.
Objetivos
Considerando o exposto anteriormente, este trabalho tem por objetivo geral:
Verificar a estrutura e ultraestrutura do disco glandular de flores e frutos, bem como,
examinar a natureza da secreção produzida e estudar a ontogenia do fruto e da semente de
Tapirira guianensis Aubl.
Material e Métodos
As coletas foram realizadas de acordo com as informações de distribuição, floração e
frutificação obtidas em Guimarães (2003), Lacchia (2006) e Lenza & Oliveira (2005). Três áreas
do Estado de São Paulo foram selecionadas: Estação Experimental de Itirapina (22º 13’ S; 47º 51’
O), Estação Experimental de Mogi Guaçú (22º 10’ S; 47º 07’ O) e fragmento em Sousas –
Distrito de Campinas (22º 51’ S; 46º 57’ O). Os locais de coleta estão representados na Figura 2.
16
Figura 2. Mapa do Estado de São Paulo (tom pastel) evidenciando os locais de coleta em áreas do
Sudeste Brasileiro.
A Estação Experimental de Itirapina tem área de 3.212,81 ha e abrange amostras
significativas da vegetação de Cerrado e Campo Cerrado. A área está envolta por áreas de
reflorestamentos de Pinnus spp. e Eucalyptus spp. (Silva 2005). Está localizada no município de
Brotas, no Estado de São Paulo, entre as coordenadas 22º 10’ a 22º 15’ S e 47º 45’ a 48º O. O
clima da região é do tipo Cwa de Köeppen (1948) – mesotérmico com inverno seco em que a
temperatura média do mês mais frio é inferior a 18ºC e a do mês mais quente é superior a 22ºC e
total das chuvas do mês mais seco não ultrapassa 30 mm (Silva 2005). De acordo com Silva
(2005) a precipitação média anual é 1.458,9 mm, o período chuvoso se concentra entre os meses
de outubro e março e corresponde a cerca de 80% da precipitação anual.
A Estação Experimental de Mogi Guaçú, onde está localizada a Fazenda Campininha, no
município de Mogi Guaçú, Estado de São Paulo, possui uma área de 2.706,28 ha. Abrange
vegetação de Cerrado sensu lato (de campo a cerradão) e possui algumas áreas de
17
reflorestamento de Eucalyptus spp. O clima da região é do tipo Cwa de Köeppen (1948), o
período chuvoso é bem marcado e concentra-se entre os meses de outubro e fevereiro, com
índices pluviométricos acima de 100 mm; o período de seca compreende os meses de junho a
agosto, característico da região (Leitão & Silva 2004). Ainda segundo os mesmos autores, os
meses mais quentes apresentam temperaturas superiores a 22ºC e os mais frios inferiores a 18ºC.
No município de Campinas, SP, há cerca de 200 fragmentos florestais que testemunham a
vegetação original (Santos & Kinoshita 2003). Neste trabalho foi selecionado um desses
fragmentos de Floresta Atlântica Estacional Semidecídua situado no Distrito de Sousas. Em
geral, nessa região o clima é do tipo Cwag’ de Köeppen (1958), temperado, moderadamente
chuvoso, de inverno seco não rigoroso, com precipitação média anual de 1.409 mm (Santos &
Kinoshita 2003). A temperatura média anual é de 21,4ºC, com médias máximas de 27,1ºC e
médias mínimas de 15,6ºC.
As coletas foram realizadas entre os meses de março a dezembro de 2011 e janeiro a
fevereiro de 2012 (Tabela 3). As regiões de coleta correspondem a margens de córregos ou
brejos, por serem estas as preferidas pela espécie. Vale salientar que as três áreas de coletas
correpondem a formações florestais.
Tabela 3. Listagem das coletas realizadas e órgãos coletados de Tapirira guianensis Aubl.
Data
Local
Órgãos coletados
25/03/2011
Estação Experimental de Itirapina
Frutos completamente desenvolvidos.
13/09/2011
Estação Experimental de Mogi Guaçú
Flores femininas.
17/10/2011
Fragmento em Sousas
Botões florais, flores femininas e masculinas e frutos em
vários estágios de desenvolvimento.
17/11/2011
Fragmento em Sousas
Frutos em vários estágios de desenvolvimento.
06/12/2011
Fragmento em Sousas
Frutos em vários estágios de desenvolvimento.
18/01/2012
Fragmento em Sousas
Frutos completamente desenvolvidos.
08/02/2012
Fragmento em Sousas
Frutos completamente desenvolvidos.
Os resultados obtidos foram organizados em dois capítulos:
Capítulo 1: Nectário floral de Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae): aspectos
estruturais, ultraestruturais e composição química do néctar.
18
Capítulo 2: Ontogenia do pericarpo e semente de Tapirira guianensis Aubl.
(Anacardiaceae): aspectos estruturais, ultraestruturais e histoquímica.
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26
CAPÍTULO 1
Nectário floral de Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae):
aspectos estruturais, ultraestruturais e composição química do
néctar
Elisabeth E. A. Dantas Tölke1, Leonardo Galetto2, Sílvia Rodrigues Machado3, Sandra Maria
Carmello-Guerreiro1
1. Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
2. Instituto Multidisciplinario de Biologia Vegetal - Universidad Nacional de Córdoba – (UNC –
CONICET)
3. Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP,
Campus de Botucatu
27
Resumo - Este estudo teve por objetivo investigar a estrutura e ultraestrutura do disco glandular
intraestaminal em flores estaminadas e hermafroditas e em frutos, bem como, verificar a
composição química da substância produzida em Tapirira guianensis Aubl (Anacardiaceae),
espécie amplamente distribuída em todo território brasileiro, particularmente em áreas de solo
úmido. Amostras do disco glandular em várias fases de desenvolvimento foram coletadas, fixadas
e processadas para estudos em microscopia de luz e eletrônica de transmissão, segundo as
técnicas convencionais. Testes histoquímicos foram empregados para identificar os principais
metabólitos presentes no tecido glandular. Este disco consiste em epiderme uniestratificada
recoberta por fina cutícula e parênquima vascularizado. Algumas evidências indicam que o néctar
é exsudado via estômatos. A composição química do néctar é semelhante para as flores
estaminadas e hermafroditas, tendo como açúcar predominante a sacarose; a concentração de
açúcares é de cerca de 10% em flores estaminadas e 49% em flores hermafroditas. A
ultraestrutura das células se altera significativamente durante os vários estágios de secreção, a
alteração mais evidente foi a redução dos amiloplastos entre as fases pré-secretora e secretora. Na
fase secretora foram observadas evidências que indicam mecanismo de secreção granulócrino e
écrino. Em todas as fases as células epidérmicas e subepidérmicas reagiram positivamente para
os testes histoquímicos que detectam lipídios e substâncias fenólicas. Com base nas análises
realizadas o nectário floral de T. guianensis pode ser classificado como uma glândula de secreção
mista, pois possui aparato celular para síntese de secreção hidrofílica e lipofílica, sendo esta
última predominante a partir da formação do fruto. Existe na literatura relato de glândulas
extraflorais que produzem néctar e lipídios, sendo classificadas como nectários sensu lato, o
mesmo é válido para a glândula floral de T. guianensis.
Palavras-chave: Estômatos modificados, nectário floral, lipídios, néctar, secreção.
28
Abstract – This work investigated the structure and ultrastructure of the intrastaminal
receptacular gland in staminate and pistillate flowers and fruits, as well verified the chemical
composition of the substance produced by Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae), a species
widely distributed throughout Brazil, particularly in areas the presence of moist soil. Samples of
receptacular gland in various stages of development were collected, fixed and processed to
studies in light and transmission electron microscopy according to conventional techniques.
Histochemical tests were employed to identify the major metabolites present in glandular tissue.
This receptacular gland consist of uniseriate epidermis covered with thin cuticle and vascularized
parenchyma. Some evidence indicates that the nectar is exuded via stomata. Chemical
composition of nectar is similar to the staminate and pistillate flowers, and predominant sugar is
sucrose; the sugar concentration is about 10% to staminate flowers and 49% to pistillate flowers.
The cells ultrastructure changes considerably during the various stages of secretion, the most
obvious change was the reduction of amyloplasts between the pre-secretory and secretory phases.
In the secretory phase were observed evidences indicating granulocrine and ecrine mechanism of
secretion. In all stages, epidermal and subepidermal cells reacted positively to histochemical tests
that detect lipids and phenolic substances. Based on analyses performed, floral nectar of T.
guianensis can be classified as a mixed secretion gland, because it has apparatus for synthesis of
hydrophilic and lipophilic secretion, the latter predominantly from fruit formation. There are
reports in literature of extrafloral glands informing the production of nectar and lipids, they are
classified as nectaries sensu lato, the same is applied to the floral gland on T. guianensis.
Keywords: Modified stomata, floral nectary, lipid, nectar, secretion.
29
Introdução
A família Anacardiacae é referida na literatura como tendo disco nectarífero
intraestaminal geralmente bem desenvolvido e algumas vezes transformado em pequenos
ginóforos (Cronquist 1981; Wannan & Quinn 1991; Gallant et al. 1998; Judd et al. 2007; Barroso
et al. 2007; Bernadello 2007). Em alguns trabalhos (Von-Teichman & Van-Wyk 1994, 1996) são
realizadas descrições anatômicas do disco nectarífero intraestaminal para representantes da
família, entretanto não foram realizados experimentos que comprovassem a secreção de néctar
por estas estruturas. Informações sobre a estrutura dos nectários florais e composição química do
néctar para a família ainda são escassas, sendo relatado apenas o trabalho de Wunnachit et al.
(1992) para Anacardium occidentale L. Nesta espécie, o néctar é exsudado via tricomas,
demonstrando que pode haver uma variação estrutural dentro da família. Até o momento não há
trabalhos que abordem a organização ultraestrutural de nectários em Anacardiaceae.
Lacchia (2006) constatou que a flor de T. guianensis possui um disco intraestaminal
persistente com a formação do fruto; seus dados relatam presença de estômatos na epiderme e
amido nas células parenquimáticas. A autora não confirmou em seu trabalho a secreção de néctar
por esta estrutura, no entanto confirmou a produção de lipídios. Os resultados desse trabalho
serviram de estímulo para análise da substância secretada. Portanto, este estudo teve por objetivo
investigar a estrutura e ultraestrura do disco glandular intraestaminal em flores estaminadas e
hermafroditas e em frutos, bem como, verificar a composição química da substância produzida
em Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae), espécie dióica e amplamente distribuída no
Cerrado brasileiro (Lorenzi 2002; Lenza & Oliveira 2005; Silva-Cruz & Pirani 2012).
O termo nectário foi introduzido por Linné em 1735 para designar estruturas
multicelulares responsáveis pela produção de néctar (Fahn 1979); estas estruturas podem ocorrer
tanto em órgãos vegetativos quanto em órgãos reprodutivos (nectário extrafloral e floral,
respectivamente) (Fahn 1979, 1988; Schimid 1988; Galetto & Bernadello 2004; Nepi 2007). Os
nectários florais desempenham importante papel na reprodução, uma vez que, o néctar é uma das
principais recompensas oferecidas ao polinizador, sendo bastante comum em várias famílias de
angiospermas polinizadas por animais – pássaros, pequenos mamíferos e insetos (Percival 1961;
Baker & Baker 1973a; Cruden et al. 1983; Galetto 1997; Davis et al. 1998; Vesprini et al. 1999;
30
Petanidou et al. 2000; Galetto & Bernadello 2004; Galetto & Bernadello 2005; Chalcoff et al.
2006; Mačukanović-Jocić et al. 2007; Nicolson 2007; Paiva & Machado 2008).
O néctar é uma substância que tem como componentes principais os açúcares, sendo
comuns outras substâncias em menor quantidade, como: aminoácidos, proteínas, lipídios,
antioxidantes, alcalóides, substâncias fenólicas, vitaminas, ácidos orgânicos, dentre outras (Baker
& Baker 1973a, 1983; Vesprini et al. 1999; Galetto & Bernadello 2005). De acordo com os
mesmos autores, os açúcares e os aminoácidos são os componentes mais significativos e têm
papel importante tanto do ponto de vista taxonômico quanto ecológico. A concentração dos
aminoácidos no néctar é consideravelmente inferior em relação aos açúcares e sua presença está
relacionada com a recompensa para insetos que não dispõem de outras fontes que forneçam os
componentes básicos para construção de proteínas (Baker & Baker 1983).
Análises de aminoácidos e carboidratos em néctar têm sido realizadas por diversos autores
(Percival 1961; Baker & Baker 1973b; Cruden & Toledo 1977; Cruden & Hermann-Parker 1979;
Gilliam et al. 1980; Baker & Baker 1983; Wunnachit et al. 1992; Galleto 1997; Galleto et al.
1997; Galleto et al. 1998; Davis et al. 1998; Vesprini et al. 1999; Galetto & Bernadello 2004;
Chalkoff et al. 2006; Canto et al. 2007; Wenzler et al. 2008). Estes estudos demonstram que as
diferenças na concentração dos principais carboidratos presentes no néctar (sacarose, frutose e
glicose) juntamente com a morfologia da inflorescência e da flor, estão relacionadas com o tipo
de polinizador e tem implicação taxonômica e filogenética; a composição química do néctar pode
variar entre indivíduos pertencentes à mesma família ou até mesmo entre indivíduos pertencentes
ao mesmo gênero.
Em Anacardiaceae apenas Anacardium occidentale L. teve a composição química do
néctar analisada (Wunnachit et al. 1992), havendo assim uma necessidade de novos estudos que
esclareçam algumas questões em relação a composição química do néctar e quais as diferenças na
química do néctar entre flores estaminadas e hermafroditas da mesma espécie.
Do ponto de vista anatômico, a estrutura, localização e topografia dos nectários florais
podem ser significativamente diferentes e específicas para cada família (Fahn 1979; Galetto
1997; Pacini et al. 2003; Galetto & Bernadello 2004; Galetto & Bernadello 2005; Sulborska &
Weryszko-Chmielewska 2007). De acordo com Bernadello (2007) essas estruturas apresentam
valor taxonômico, pois podem ser razoavelmente homogêneas ou mudarem drasticamente dentro
31
de alguns grupos, aliado ao fato de que podem ser facilmente adquiridas ou perdidas dentro de
uma linhagem, o que ajuda a entender a evolução do grupo. O aspecto estrutural do nectário
também tem importância na apicultura, na correlação entre estrutura e abundância do néctar
produzido (Sulborska & Weryszko-Chmielewska 2007). Os nectários podem ser classificados em
estruturais (disco glandular, tricomas glandulares e nectário septal) ou não estruturais, estes não
possuem uma estrutura diferenciada, nesse caso o néctar é exsudado via estômatos (Fahn 1979).
O nectário consiste em epiderme e tecido parenquimático especializado (Fahn 1979; Nepi
et al. 1996). A anatomia dos nectários foi estudada por diversos autores e ao longo do tempo a
nomenclatura utilizada para designar a estrutura do tecido nectarífero passou por modificações
(Tabela 1).
Tabela1. Organização anatômica do nectário de acordo com Fahn (1979), Durkee (1983) e Nepi
(2007).
Fahn (1979)
Durkee (1983)
Nepi (2007)
Função
Epideme
Epiderme
Epiderme
Diretamente envolvida na
produção e secreção de
néctar.
Tecido parenquimático
com feixes vasculares.
Tecido secretor.
Parênquima nectarífero.
Diretamente envolvidos na
produção e secreção de
néctar.
Parênquima subglandular
com feixes vasculares.
Parênquima subnectarífero
com feixes vasculares.
Não estão diretamente
envolvidos na produção do
néctar.
-
*Adaptado de Nepi (2007).
Em uma publicação mais recente Nepi (2007) propõe a modificação dos termos propostos
por Fahn (1979) e Durkee (1983) estruturando o tecido nectarífero em epiderme, parênquima
nectarífero e parênquima subnectarífero, sendo esta a nomenclatura adotada nos trabalhos mais
recentes.
A organização ultraestrutural dos nectários também varia muito entre as espécies, bem
como as fases do processo de secreção (Paiva & Machado 2008). A dinâmica da organização
celular durante a produção do néctar tem sido pouco estudada, destacando-se os trabalhos de Zer
& Fahn (1992), Figueiredo & Pais (1992), Razem & Davis (1999), Peng et al. (2004),
32
Stpiczynska et al. (2005), Paiva & Machado (2008). O conhecimento da organização estrutural e
ultraestrutural dos nectários aliado ao estudo da composição química do néctar permite esclarecer
o papel dessa secreção para o vegetal (Fahn 1979; Roshchina & Roshchina 1993, Rocha et al.
2010).
Material e Métodos
Flores em pré-antese e em antese de indivíduos masculinos e femininos e frutos em vários
estágios de desenvolvimento de Tapirira guinanensis Aubl. foram coletados em três áreas do
Estado de São Paulo: Estação Experimental de Itirapina (22º 13’ S; 47º 51’ O), Estação
Experimental de Mogi Guaçú (22º 10’ S; 47º 07’ O) e fragmento em Sousas – Distrito de
Campinas (22º 51’ S; 46º 57’ O). As coletas foram realizadas entre os meses de março a
dezembro de 2011 e janeiro a fevereiro de 2012.
Microscopia de luz
Para descrição anatômica das glândulas florais e do disco glandular do fruto jovem as
amostras foram fixadas em FAA (formaldeído, ácido acético, etanol 50%; 1:1:18 v/v) por 24
horas (Johansen 1940). O material foi desidratado em série butílica e incluído em Paraplast®
(Johansen 1940). Secções transversais e longitudinais com 10 µ m de espessura foram obtidas
com auxílio de micrótomo rotativo (Microm HM340E) e coradas com Azul de Astra e Safranina
(Gerlach 1984). Todas as lâminas foram montadas em resina sintética Entellan® e as imagens
capturadas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio óptico (Olympus
BX51).
Histoquímica
Para os testes histoquímicos foi utilizado material fixado em FAA (para substâncias
hidrofílicas) por 24 horas e em FNT (tampão fosfato, formalina; 9:1 v/v) (para substâncias
lipofílicas e substâncias fenólicas) por 48 horas. Os tratamentos realizados foram: Negro de
Sudão B (Pearse 1980), Sulfato Azul do Nilo (Cain 1947), Lugol (Berlyn & Miksche 1976),
Cloreto de Ferro III (Johansen 1940), Reagente de Wagner (Furr & Mahlberg 1981), Reagente de
Schiff (PAS) (McManus 1948), Vermelho de Rutênio (Johansen 1940), Ácido Tânico e Cloreto
33
de Ferro III (Pizzolato & Lillie 1973). As substâncias detectadas e suas respectivas reações
cromáticas positivas encontram-se na Tabela 2. Os resultados foram registrados por meio de
imagens capturadas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio óptico
(Olympus BX51).
Tabela 2. Testes histoquímicos utilizados na caracterização das substâncias presentes no disco
glandular de Tapirira guianensis Aubl.
Teste
Substância detectada
Reação cromática positiva
Lipídios totais
Azul a negro
Lipídios ácidos e neutros
Azul piscina para lipídios ácidos e
rosa a púrpura para lipídios neutros
Amido
Roxo a negro
Cloreto de Ferro III
Compostos fenólicos
Marrom e negro
Reagente de Wagner
Alcalóides
Vermelho
Polissacarídeos totais
Rosa
Pectinas
Rosa intenso
Mucilagens
Negro
Negro de Sudão B
Sulfato Azul do Nilo
Lugol
Reagente de Schiff (PAS)
Vermelho de Rutênio
Ácido Tânico e Cloreto de Ferro III
Microscopia eletrônica de transmissão
Na microscopia eletrônica de transmissão o material vegetal (nectário da flor hermafrodita
em fase de pré-antese e antese; disco glandular do fruto em vários estágios de desenvolvimento)
foi fixado em glutaraldeído 2,5%, em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3 durante 24 horas a uma
temperatura de 5ºC. Pós-fixado em tetróxido de ósmio 1% no mesmo tampão durante uma hora a
25ºC, desidratado em série crescente de solução de acetona e incluído em araldite (Machado &
Rodrigues 2004). As secções ultrafinas foram obtidas com navalha de diamante e coradas com
azul de metileno a 1% e contrastadas com acetato de uranila (Watson 1958) e citrato de chumbo
(Reynolds 1963). O material foi observado em microscópio eletrônico de transmissão Philips
E.M. 301.
Análise da secreção produzida pelo disco glandular
A secreção do disco glandular das flores foi submetida ao teste para detecção de glicose
através de tiras reagentes (Uri-test 11), cuja concentração de glicose foi estimada através da
34
mudança de coloração da área reativa da tira e comparada com a escala cromática fornecida pelo
fabricante. Para análise química do néctar as flores hermafroditas e estaminadas foram ensacadas
a fim de evitar potenciais danos causados pelos insetos, bem como, para preservação da secreção
a ser coletada. A secreção de cada morfotipo floral foi coletada com auxílio de tubos capilares de
vidro e armazenada em papel filtro Watman® n. 1 em baixa temperatura (Galetto & Bernadello
2005).
A composição dos açúcares foi verificada em 50 flores de cada indivíduo (três indivíduos
contendo flores estaminadas e três indivíduos contendo flores hermafroditas) totalizando 300
flores, em uma população pertencente ao fragmento de Sousas – Distrito de Campinas (22º 51’ S;
46º 57’ O). Após o armazenamento no papel filtro as amostras foram levadas ao laboratório e
redissolvidas em água destilada. Para análise quantitativa dos carboidratos presentes na secreção
foram utilizados kits reagentes para glicose, frutose e sacarose (®Sigma) seguindo-se as
metodologias propostas por Bergmeyer & Bernt (1974), Southgate (1976) e Kunsst et al. (1984).
Após o preparo dos reagentes as amostras foram levadas ao espectrofotômetro e tiveram suas
absorbâncias medidas no comprimento de onda de 340 nm. A seguir foi realizada a leitura e
efetuaram-se os cálculos para cada componente de acordo com as fórmulas a seguir:
mg (glicose)/ mL = (ΔA) (TV) (F) (0,029)
(SV)
mg (frutose)/ mL = (ΔA) (F) (0,614)
mg (sacarose)/ mL = (ΔA) (F) (1,21)
Em que:
ΔA = A teste – A branco total
TV= Volume total do ensaio
SV = Volume da amostra
F = Fator de diluição utilizado
A = Absorbância em 340 nm
Tomando-se os resultados obtidos, a partir da utilização das fórmulas, efetuou-se o
cálculo da taxa de açúcares para classificação da espécie de acordo com Baker & Baker (1982).
Reações calorimétricas para aminoácidos foram realizadas em escala de histidina de acordo com
a técnica de Baker & Baker (1975). Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão.
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Bioestat 5.3. Para comparação
das médias aritméticas foi utilizada a análise de variância (ANOVA) de acordo com o teste T em
nível de significância de 5% (p≤0,05).
35
Resultados
Aspectos estruturais e histoquímica
As flores de Tapirira guinanensis Aubl. são pequenas (2-3 mm de diâmetro),
actinomorfas, pentâmeras, dialipétalas e gamossépalas, com ambos os verticilos pouco vistosos
de cor esverdeada (Fig. 1A-B). A principal diferença morfológica entre elas é que na flor
hermafrodita, o gineceu é conspícuo, globoso e bem desenvolvido (Fig. 1A), o ovário é súpero
unilocular e uniovulado, possuindo três estigmas curtos e globosos (Fig. 1A), enquanto que na
flor estaminada o gineceu é atrofiado, piloso e não funcional (Fig. 1B).
Figura 1. Flores de Tapirira guianensis Aubl. A. Flor hermafrodita. B. Flor estaminada. (Dg = disco
glandular, Ov = ovário, Es = estigma). Barras: 0,5 cm (A-B).
Ambas as flores apresentam um disco glandular proeminente localizado ao redor do
gineceu (Fig. 1A-B). Este disco já é perceptível na fase de botão e após antese é capaz de secretar
uma substância incolor (aproximadamente 1 µL) durante vários dias. A secreção reagiu
fortemente em teste utilizando tiras reagentes para determinação de glicose (Uri-test 11), assim, a
secreção é considerada néctar e a glândula nectário. Na flor hermafrodita a glândula permanece
ativa em todas as fases do desenvolvimento desde ovário até fruto completamente desenvolvido,
no entanto pára de liberar néctar na fase de fruto jovem, sendo, portanto denominada apenas de
disco glandular a partir dessa fase. As observações de campo mostraram grande diversidade de
insetos visitando ambos morfotipos florais, predominantemente himenópteros (abelhas e vespas).
36
O nectário floral é estruturalmente semelhante em ambas as flores (estaminadas e
hermafroditas) tanto na fase de pré-antese quanto de antese (Fig.2A-B), localizado sempre em
volta do gineceu, possui 10 lobos distribuídos alternadamente em relação aos estames (Fig. 2A).
Consiste de epiderme secretora e de tecido parenquimático (Fig. 2C). A epiderme tem cor
alaranjada em material fixado em FAA e FNT, apresenta-se uniestratificada, constituída por
células de paredes delgadas e revestida por fina cutícula (Fig. 2E). Estômatos estão amplamente
distribuídos ao longo de toda a epiderme um pouco abaixo do nível das demais células (Fig. 2EF).
Não há uma divisão estrutural clara entre o parênquima nectarífero e subnectarífero, a não
ser pela região vascularizada típica de parênquima subnectarífero (Fig. 2C), no entanto, a região
vascularizada foi considerara a subnectarífera e a região logo abaixo da epiderme a nectarífera.
As células subepidérmicas são pequenas, justapostas e possuem citoplasma denso (Fig. 2C e E).
Há aumento do tamanho celular em direção à base do nectário (Fig. 2C). É possível visualizar
esparsamente cristais do tipo drusa em formato poliédrico (Fig. 2D e E).
O tecido vascular presente no nectário é uma continuação do sistema vascular do pedicelo
floral e está restrito à base do mesmo (Fig. 3A). O pedicelo possui um anel central de floema e
xilema e diversos canais secretores (Fig. 3A), estes estão presentes em todas as fases da flor. O
canal é formado por lume revestido por duas a quatro camadas de células epiteliais que se
distinguem das demais células do parênquima quanto ao formato, retangulares e achatadas (Fig.
3B).
37
Figura 2. Estrutura anatômica do nectário floral de Tapirira guianensis Aubl. em secções transversais (A)
e longitudinais (B-F). A. Localização do nectário em volta do gineceu. B. Posição intraestaminal do
nectário. C. Aspecto geral do nectário floral evidenciando a epiderme, parênquima nectarífero,
parênquima subnectarífero e feixes vasculares. D. Detalhe das drusas presentes no nectário em luz
polarizada. E. Detalhe da epiderme revestida por cutícula e drusas distribuídas esparsamente no
parênquima. F. Estômato modificado em posição inferior em relação às demais células da epiderme. (Gi =
gineceu, Ne = nectário, Ep = epiderme, Pn = parênquima nectarífero, Ps = parênquima subnectarífero, Fv
= feixe vascular, Ct = cutícula, Es = estômato, Dr = drusa). Barras: 100 µm (A-B), 50 µ m (C-D), 10 µm
(E-F).
38
Figura 3. Tecido vascular e canais secretores no pedicelo de Tapirira guianensis Aubl. em secções
transversais. A. Pedicelo com feixes vasculares em um anel central, sempre associados aos canais
secretores. B. Canal secretor associado ao feixe vascular e envolto por bainha de células secretoras. (Cs =
canal secretor, Fv = feixe vascular). Barras: 50 µm (A), 20 µm (B).
Com o desenvolvimento do fruto os canais secretores ampliam consideravelmente o seu
tamanho em direção à região central da glândula, antes restritos apenas ao pedicelo (Fig. 4A-D).
O citoplasma das células parenquimáticas é pouco denso e ainda é possível observar drusas
dispersas por todo o parênquima (Fig. 4A e C). Estruturalmente não há alterações significativas
em relação às fases anteriores.
Os testes histoquímicos revelaram a presença de lipídios na epiderme secretora do
nectário de todas as fases das flores estaminadas, hermafroditas e do disco glandular dos frutos,
acontecendo o mesmo para as células subepidérmicas (Fig. 5A-B); compostos fenólicos e
polissacarídeos também foram encontrados nas mesmas estruturas (Fig. 5C-D). A presença de
amido no protoplasto das células parenquimáticas foi expressiva na fase de pré-antese (Fig. 5E),
mas ausente durante a antese e fases posteriores (Fig. 5F). As células da bainha, que envolve os
canais secretores, reagiram positivamente para o Cloreto Férrico 10%, Negro de Sudão B e
Sulfato Azul do Nilo, demonstrando a presença de compostos fenólicos e lipídios. A secreção dos
canais apresentou uma fração lipofílica e outra hidrofílica, sendo positiva para as reações com
Negro de Sudão B, Sulfato Azul do Nilo e PAS.
39
Figura 4. Secções longitudinais do disco glandular do fruto de Tapirira guianensis Aubl. em diferentes
fases do desenvolvimento. A. Disco glandular do fruto jovem. B. Fruto jovem. C. Disco glandular do
fruto completamente desenvolvido, com pouca ou nenhuma diferença em relação à fase anterior. D.
Canais secretores em fruto completamente desenvolvido. (Ep = epiderme; Pq = parênquima; Fv = feixe
vascular; Dr = drusas; Cs = canal secretor; Dg = disco glandular). Barras: 20 µm (A e C); 200 µm (B e
D).
No disco glandular do fruto jovem as reações na epiderme foram fortemente positivas
para lipídios e compostos fenólicos, não havendo nenhuma diferença em relação à fase
precedente (flor em antese). Nestas fases não foi possível observar nenhuma substância sendo
secretada para o exterior do disco glandular, no entanto as células epidérmicas e subepidérmicas
permanecem em atividade secretora, evidenciada através dos testes histoquímicos (Tabela 3).
40
Tabela 3. Testes histoquímicos na glândula de flores hermafroditas em pré-antese, antese e em
frutos jovens de Tapirira guianensis Aubl:
Testes histoquímicos
Pré-antese
Antese
Fruto jovem
Negro de Sudão B
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
(++)
(++) (Fig 5A)
(++)
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
(++)
(++) (Fig 5B)
(++)
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
(++)
(++) (Fig 5C)
(++)
ep., sub., pq.
(-)
(-)
(++) (Fig 5E)
(Fig 5F)
Reagente de Wagner
(-)
(-)
(-)
Reagente de Schiff
ep., sub., pq., id., ba.
ep., sub., id., ba.
ep., sub., id., ba.
(++)
(++) (Fig 5D)
(++)
p.c.
p.c.
p.c.
(++)
(++)
(++)
(-)
(-)
(-)
Sulfato Azul do Nilo
Cloreto de Ferro III
Lugol
Vermelho de Rutênio
Ácido Tânico/ Cloreto de
Ferro III
(++) fortemente positivo, (-) negativo. Destaque em cinza para o teste que apresentou mudanças dentre as diferentes
fases analisadas. (ep.: epiderme; sub.: células subepidérmicas; pq.: parênquima; ba.: bainha do canal secretor; id.:
idioblastos; p.c.: parede celular).
41
Figura 5. Testes histoquímicos no nectário floral e disco glandular do fruto de Tapirira guianensis Aubl.
em secções longitudinais. A. Reação positiva para Negro de Sudão B em flor hermafrodita na fase de préantese. B. Reação positiva para Sulfato Azul do Nilo em fruto na fase jovem. C. Reação positiva para
Cloreto Férrico em flor hermafrodita em antese. D. Reação positiva para PAS em flor estaminada em fase
de pré-antese. E. Reação positiva para Lugol em flor estaminada na fase de pré-antese. F. Reação negativa
para Lugol em flor estaminada na fase de antese. Barras: 20 µm (A, C e D); 50 µm (B, E e F).
42
Aspectos ultraestruturais
Baseando-se nas alterações histoquímicas e estruturais observadas nas flores
hermafroditas, os resultados obtidos foram agrupados em três fases distintas: fase I –
representada pelas flores em pré-antese; fase II – representada pelas flores em antese; e fase III –
representada pelo disco glandular presente em frutos jovens. As fases foram denominadas de présecretora, secretora e pós-secretora, respectivamente. A nomenclatura das regiões anatômicas do
nectário segue a sugerida por Nepi (2007).
Fase I - Na fase pré-secretora as células da epiderme mostram vacúolo grande, totalmente
preenchido por conteúdo fenólico e com as demais organelas em posição parietal (Fig 6A);
algumas células possuem pequenas vesículas próximas à membrana celular, algumas delas
contendo material fibrilar (Fig. 6B). O citoplasma é bastante denso, devido à grande quantidade
de ribossomos dispersos, o que dificulta a visualização das organelas (Fig. 6A). A cutícula tem
aspecto heterogêneo e apresenta microcanais em diversos pontos (Fig. 6C).
As células do parênquima nectarífero exibem diversos estágios de secreção (Fig. 7A).
Todas com vacúolos de tamanho reduzido, alguns de conteúdo elétron-denso, indicando a
presença de substâncias lipofílicas (óleos e substâncias fenólicas) (Fig. 7A-B), núcleo grande
com nucléolo evidente (Fig. 7A), citoplasma denso contendo ribossomos, mitocôndrias,
dictiossomos pouco desenvolvidos e segmentos de retículo endoplasmático rugoso (Fig. 7A-D),
este se encontra associado a pequenas vesículas (Fig. 7C). Os plastídios armazenam grãos de
amido, pouco numerosos, em processo final de degradação (Fig. 7A). Em algumas células
observam-se gotas de lipídios sempre próximas à membrana plasmática (Fig. 7D). As células
estão interligadas através de plasmodesmos (Fig. 7B e D) e espaços periplasmáticos são evidentes
(Fig. 7B e D).
As células do parênquima subnectarífero armazenam grande quantidade de amido nos
plastídios (Fig. 8A-B). Um grande vacúolo preenche toda célula, alguns com inclusões fenólicas,
empurrando as organelas para a posição parietal (Fig. 8A-C). Material fibrilar é visualizado no
interior dos vacúolos (Fig. 8A-C). Estas células encontram-se associadas aos elementos de vaso
(Fig. 8C), espaços intercelulares são evidentes entre algumas células (Fig. 8A).
43
Figura 6. Aspectos ultraestruturais da
epiderme do nectário de Tapirira
guianensis Aubl. em fase présecretora. A. Células com vacúolo
proeminente de conteúdo fortemente
elétron-denso e citoplasma denso. B.
Vesículas próximas à membrana
plasmática (seta = material fibrilar). C.
Detalhe da cutícula evidenciando
diversos
microcanais
(setas
=
microcanais). (Va = vacúolo; Ve =
vesícula; Ci = citoplasma; Ct =
cutícula; Pc = parede celular; Ol =
gota de óleo). Barras: 1 µm (A); 2 µ m
(B e C).
44
Figura 7. Ultraestrutura do parênquima nectarífero do nectário floral de Tapirira guianensis Aubl. em
fase pré-secretora. A. Aspecto geral de células em diferentes estágios de secreção, célula da esquerda em
estágio inicial e célula da direita em estágio final. B. Detalhe evidenciando plasmodesmos (setas),
mitocôndria, plastídios contendo grãos de amido e espaço periplasmático (asteriscos). C. Detalhe de uma
célula mostrando o retículo endoplasmático rugoso associado a pequenas vesículas, mitocôndrias, vacúolo
de conteúdo fenólico. D. Destaque para as gotas de óleo próximas à membrana celular, dictiossomos,
retículo endoplasmático e mitocôndrias. (Va = vacúolo; Ve = vesícula; Nu = núcleo; Mi = mitocôndria; Pl
= plastídio; Re = retículo endoplasmático; Di = dictiossomo; Ol = gotas de óleo; Fe = vacúolo contendo
substância fenólica). Barras: 2 µm (A-D).
45
Figura 8. Ultraestrutura do parênquima subnectarífero do nectário floral de Tapirira guianensis Aubl. em
fase pré-secretora. A. Aspecto geral do tecido subnectarífero. B. Plastídio contendo grãos de amido;
inclusões osmiofílicas dispersas no vacúolo; organelas em posição parietal; C. Célula associada ao
elemento de vaso. (Pl = plastídio; Va = vacúolo; Ev = elemento de vaso). Barras: 2 µm (A-C)
46
Fase II – De maneira geral, na fase secretora ocorre aumento no número de plastídios,
mitocôndrias, retículo endoplasmático e ribossomos. A epiderme já possui as organelas mais
visíveis que na fase anterior, com núcleo grande em posição periférica, plastídios contendo
pequenas gotas osmiofílicas, retículo endoplasmático e inúmeras mitocôndrias (Fig. 9A-B). O
citoplasma é bastante denso devido à presença de ribossomos (Fig. 9A-B). Estas células ainda
possuem um grande vacúolo de conteúdo elétron-denso, assim como na fase anterior, no entanto
também se observa pequenas vesículas próximas a membrana plasmática (Fig. 9A-B).
As células subepidérmicas exibem padrão semelhante à fase anterior, com algumas
células em estágios diferentes de secreção (Fig. 10 A-B); no ápice da secreção as células possuem
núcleo proeminente, retículo endoplasmático, citoplasma rico em ribossomos, inúmeros
plastídios contendo gotas lipídicas, mitocôndrias e plastídios de tamanho bastante reduzido
quando comparado à fase pré-secretora (Fig. 10 A); nas células que se encontram em um estágio
posterior o vacúolo possui tamanho maior, ocupando quase toda a célula, e em seu interior há
material fibrilar (Fig. 10 B). Gotas de óleo foram encontradas próximas à membrana plasmática
de algumas células (Fig. 10 B), bem como pequenas vesículas (Fig. 10 D); o núcleo está quase
sempre próximo ao retículo endoplasmático rugoso (Fig. 10 C). Um aspecto interessante é que
nesta fase os plastídios não acumulam amido como na fase anterior, no entanto, estão repletos de
material lipofílico (plastoglóbulos) (Fig. 10 D).
No parênquima subnectarífero a diferença mais marcante em relação à fase anterior foi o
número reduzido de plastídios contendo reserva de amido, estes também demonstram tamanho
menor (Fig. 10 E). Esta característica é reconhecida como fase final de hidrólise dos grãos de
amido. As células dessa região possuem espaços intercelulares, tem as organelas em posição
parietal, vacúolo único ocupando quase que a totalidade da célula, pode-se observar número
elevado de gotículas elétron-densas dispersas nas células, principalmente na periferia dos
vacúolos; além disso, gotas de óleo também estão presentes (Fig. 10 F). Em algumas regiões
também foi possível visualizar elementos de tudo crivado associados a células companheiras,
confirmando a presença de feixes vasculares nesta região do nectário (Fig. 10 F).
47
Figura 9. Aspectos ultraestruturais da epiderme do nectário floral de Tapirira
guianensis Aubl. em fase secretora. A. Células com vacúolo proeminente, núcleo
grande em posição periférica, plastídios contendo gotículas lipofílicas e pequenas
vesículas próximas a membrana plasmática. B. Detalhe de células da epiderme.
(Nu = núcleo; Pl = plastídio; Va = vacúolo; Ve = vesícula; Re = retículo
endoplasmático rugoso; Mi = mitocôndria). Barras: 2 µm (A-B).
48
Figura 10. Ultraestrutura do parênquima glandular (A-D) e subglandular (E-F) do nectário floral de
Tapirira guianensis Aubl. no ápice da secreção. A. Aspecto geral das células subepidérmicas. B. Célula
subepidérmica em estágio final de secreção, com vacúolo tomando a maior parte da célula. C. Detalhe do
núcleo próximo ao retículo endoplasmático. D. Detalhe do plastídio contendo inclusões lipídicas e
vesículas próximas a membrana plasmática. E. Aspecto geral do tecido subnectarífero com abundância de
gotas elétron-densas (setas). F. Tecido vascular na região subnectarífera. (Mi = mitocôndria; Pl = plastídio
contendo plastoglóbulos; Va = vacúolo; Ve = vesícula; Nu = núcleo; Ol = gotas de óleo; Re = retículo
endoplasmático; Cc = célula companheira; Ec = elemento de tubo crivado). Barras: 2 µm (A-F)
49
Fase III – Nesta fase o vacúolo das células epidérmicas da glândula presente no fruto
jovem ocupa praticamente todo o volume celular, em seu interior se observa material elétrondenso, com algumas células já em fase final de secreção (Fig 11 A). As células subepidérmicas se
encontram em fase final de secreção, no entanto, diversas gotículas de lipídios são encontradas
próximas à membrana plasmática (Fig. 11 B), bem como, algumas vesículas (Fig. 11 C). As
organelas se encontram em posição parietal, devido ao grande volume vacuolar, não sendo
possível distingui-las com facilidade. O vacúolo acumula substâncias elétron-densas de aspecto
heterogêneo (Fig 11 B). O citoplasma ainda é rico em ribossomos e observam-se alguns
plastídios contendo gotas de material lipofílico (Fig 12 A-B).
As células do parênquima subnectarífero possuem um único vacúolo ocupando todo o
volume celular, empurrando as organelas para a periferia da célula (Fig. 12 B), pouco material
osmiofílico é encontrado e os plastídios estão completamente ausentes, divergindo da fase
secretora (Fig 10 E-F). As demais fases dos frutos apresentaram padrão semelhante, portanto não
foram aqui descritas.
50
Figura 11. Eletromicrografias do disco
glandular do fruto jovem de Tapirira
guianensis
Aubl.
A.
Células
epidérmicas. B. Aspecto geral das
células subepidérmicas (seta = gotas de
óleo). C. Detalhe de uma célula
subepidérmica
mostrando
gotas
lipídicas e vesículas. (Va = vacúolo; Ve
= vesícula; Ol = gotas de óleo). Barras:
2 µm (A-C).
51
Figura 12. Eletromicrografias do disco
glandular do fruto jovem de Tapirira
guianensis Aubl. A. Detalhe de uma célula
subepidérmica
mostrando
plastídios
contendo gotas lipídicas e algumas vesículas
próximas a membrana celular. B. Plastídio
contendo inclusões lipídicas C. Células da
do parênquima subnectarífero exibindo
grande vacúolo que ocupa quase todo o
volume celular. (Pl = plastídio, Va =
vacúolo; Ve = vesícula). Barras: 2 µm (AC).
52
Análise da secreção produzida pelo tecido glandular
A secreção coletada dos morfotipos florais foi diluída em água (2:1) e, segundo a escala
cromática das tiras reagentes, a secreção apresenta concentração máxima de glicose em torno de
100 mg/dl (1,0 mg/ml) para as flores estaminadas e 600 mg/dl (6,0 mg/ml) para as flores
hermafroditas (Fig. 13). Utilizando a tabela de conversão proposta por Galetto & Bernadello
(2005), estes valores equivalem a 10% e 49%, respectivamente, o que demonstra acentuada
diferença entre as concentrações do néctar entre indivíduos com flores estaminadas e de flores
hermafroditas.
Figura 13. Tiras reagentes para determinação de glicose (Uri-test
11) em destaque (retângulo vazado) a reação cromática positiva
fornecida pelo fabricante à esquerda e resultados obtidos neste
trabalho à direita (B = branco, M = indivíduos com flores
estaminadas, F = indivíduos com flores hermafroditas).
A análise da composição de açúcares e concentração de aminoácidos mostra-se
semelhante entre os indivíduos analisados (Tabela 4). Os três açúcares (frutose, glicose e
sacarose) foram detectados em todas as amostras e sua proporção foi bastante homogênea entre
53
os indivíduos amostrados. As poucas variações ocorridas não foram significativamente diferentes
entre si (p>0,05).
Tabela 4. Composição química do néctar de Tapirira guianensis Aubl.
Variaveis
Flores estaminadas
Flores hermafroditas
(n=150)
(n=150)
1,62 ± 0,56
0,64 ± 0,28
0,074
% Sacarose
48,34% ± 0,18
57,47% ± 0,05
0,563
% Frutose
30,01% ± 0,09
29,40% ± 0,02
0,903
% Glicose
21,56% ± 0,08
13,10% ± 0,06
0,449
r = S/G+F
1,03 ± 0,70
1,33 ± 0,35
0,644
rh = G/F
0,71 ± 0,08
1,03 ± 0,54
0,354
Escala de histidina
Teste T pareado
(mg/mL)
A composição do néctar é analisada mostrando os açúcares individuais (sacarose, frutose e glicose) e as taxas de
açúcares (r) e hexoses (rh) entre as flores estaminadas e as flores hermafroditas. Os dados tabelados estão expressos
como média ± desvio padrão. As variáveis não foram significativamente diferentes entre as flores estaminadas e as
flores hermafroditas (p>0,05). Foram amostrados três indivíduos femininos e três masculinos, num total de 50 flores
por indivíduo.
As flores estaminadas e hermafroditas apresentam néctar sacarose dominante (r>1,0) e a
relação de hexoses (rh) demonstra que a frutose é predominante, tanto nos indivíduos que
possuem flores hermafroditas (rh = 1,03), quanto nos que possuem flores estaminadas (rh =
0,71). As variáveis avaliadas não diferiram significativamente entre os morfotipos florais
(p>0,05), demonstrando que a sexualidade do indivíduo não interfere na composição química do
néctar (Tabela 4).
Discussão
Os resultados obtidos neste trabalho, principalmente com relação à composição
predominante da secreção, permitem classificar o disco glandular das flores hermafroditas e
estaminadas de T. guianensis como nectários florais. Alguns aspectos da estrutura floral de
Anacardiaceae foram elucidados no trabalho de Wannan & Quinn (1991), os autores realizaram
um estudo comparativo entre 17 gêneros desta família, observando um disco nectarífero
intraestaminal na maioria das espécies. Scholefield (1982), Von-Teichman (1987), VonTeichman & Van-Wyk (1994), Von-Teichman & Van-Wyk (1996), Gallant et al. (1998) e Von54
Teichman (1998) também observaram a presença de um disco nectarífero intraestaminal em
algumas espécies de Anacardiaceae.
As diferenças morfológicas do nectário floral entre espécies da família Anacardiaceae são
bastante acentuadas e podem refletir a relação filogenética entre os táxons (Von-Teichman &
Van-Wyk 1994; Von-Teichman & Van-Wyk 1996; Von-Teichman 1998). O disco nectarífero de
T. guinanensis apresenta epiderme secretora recoberta por cutícula, estômatos modificados e
parênquima com região vascularizada conforme já descrito para Protorhus longifólia (Bernh.)
Engl., P. namaquensis Sprague (Von-Teichman & Van-Wyk 1994), Smodingium argutum E.
Mey. ex Sond. (Von-Teichman 1998) e para Heeria argentea Meisn. (Von-Teichman & VanWyk 1996). O mesmo apresenta características típicas de tecido nectarífero, como células
pequenas com paredes celulares finas, núcleo relativamente grande, vacúolos pequenos e
citoplasma denso (Fahn 1979; Durkee 1983; Nepi et al. 1996; Galetto & Bernadello 2005; Nepi
2007). Vale ressaltar que T. guianensis é única espécie da família, até o momento, em que a
glândula floral permanece até o desenvolvimento completo do fruto.
Em T. guianensis estômatos modificados estão presentes ao longo da epiderme, sendo esta
a rota mais provável para a saída do néctar. Os estômatos modificados também estão presentes
em Protorhus longifolia, P. namaquensis (Von-Teichman & Van-Wyk 1994), Smodingium
argutum (Von-Teichman 1998) e Heeria argentea (Von-Teichman & Van-Wyk 1996). Já em
Anacardium occidentale as células da epiderme não são secretoras e o néctar é exsudado via
tricomas multicelulares que se elevam acima da epiderme com a liberação da secreção dando-se
através da cutícula dos tricomas (Wunnachit et al. 1992). Lacchia (2006) observou a presença de
um disco glandular nectarífero intraestaminal nas flores de Lithraea molleoides Engl., já em
Anacardium humile A. St. Hill. foram observados tricomas glandulares na região basal da face
adaxial das pétalas, no entanto, a autora sugere que estes tricomas produzem uma secreção mista
de natureza mucilaginosa e predominantemente lipídica.
Na maioria das angiospermas, o néctar pode ser exsudado por diversas vias: tricomas,
poros, por ruptura ou permeabilidade da cutícula, ou via estômatos modificados (Fahn 1979,
O’Brien et al. 1996, Nepi 2007, Varassin et al. 2008). O termo estômatos modificados foi
utilizado pela primeira vez por Fahn (1979) para designar nectários que não tem a secreção
liberada por um tecido nectarífero diferenciado, mas é exsudada por estômatos que normalmente
55
perderam a habilidade de fechar o poro estomático. Alguns outros estudos descrevem esses
estômatos modificados envolvidos na secreção do néctar em outras famílias (Davis & Gunning
1992; Galetto & Bernadello 1992, Zer & Fahn 1992; Nepi et al. 1996; O’Brien et al. 1996; Fahn
& Shimony 2001; Wist & Davis 2006; Paiva & Machado 2008; Varassin et al. 2008). Não é
eliminada a possibilidade de algum néctar ser exsudado via cutícula, pois em microscopia
eletrônica de transmissão foram observados alguns canais na cutícula, podendo ser esta uma rota
provável de eliminação da secreção, pois eles podem aumentar a porosidade e facilitar a
passagem de macromoléculas por esta estrutura (Wist & Davis 2006, Rocha & Machado 2009,
Melo et al. 2010, Stpiczyńska et al.2011).
As características ultraestruturais aqui observadas como núcleo proeminente, citoplasma
denso, abundância de retículo endoplasmático, dictiossomos ativos, mitocôndrias, ribossomos,
plasmodesmos, vacúolos pequenos durante o estágio de secreção, dentre outras, são relatadas
para diversos nectários de angiospermas e são indicativos de alta atividade metabólica (Fahn
1979, Durkee 1983, Nepi et al. 1996, Stpiczyńska et al. 2005, Paiva & Machado 2006). A
ultraestrutura das células secretoras muda significativamente durante os estágios da atividade do
nectário. As alterações ultraestruturais verificadas nas fases pré-secretora e secretora foram
similares àquelas de outras famílias (Zer & Fahn 1992, Figueiredo & Pais 1992, Fanh & Shimony
2001, Stpiczyńska et al. 2005, Horner et al. 2007, Paiva & Machado 2008), sugerindo que estas
alterações estão envolvidas na conversão dos açúcares que comporão o néctar .
Os resultados dos testes histoquímicos e ultraestrutura levantam a hipótese de que todo o
nectário é especializado na síntese, acúmulo e liberação do néctar, constituindo-se numa unidade
funcional (Fahn 1979, Paiva & Machado 2008, Rocha & Machado 2009). Em T. guianensis foi
possível observar grãos de amido nas flores em pré-antese, enquanto que durante a antese os
mesmos estão ausentes, provavelmente o amido é utilizado no metabolismo da planta para síntese
do néctar, assim como descrito em outras espécies (Nepi et al. 1996; Fahn & Shimony 2001;
Horner et al. 2007, Rocha & Machado 2009). Esta característica foi considerada como um marco
estrutural capaz de separar a fase pré-secretora (grãos de amido abundantes) das fases secretora e
pós-secretora (grãos de amido escassos ou ausentes). A presença de amido em um estágio présecretor e ausência no período posterior indicam que esse carboidrato foi utilizado como recurso
56
na formação dos açúcares do néctar ou está envolvido fornecendo energia para o processo
secretor (Fahn & Shimony 2001, Stpiczyńska et al. 2005).
Fahn & Shimony (2001) afirmam que o pré-néctar (sacarose) é originado no floema e é
armazenado principalmente nos plastídios sob a forma de grãos de amido, que são hidrolisados
em frutose e glicose para fase secretora do néctar. A presença de retículo endoplasmático está
bastante relacionada com a translocação de açúcares do sítio de produção do pré-néctar até as
células responsáveis pela transformação do pré-néctar em néctar (Rocha & Machado 2009).
As mudanças ultraestruturais observadas durante os vários estágios de secreção também
indicam que a participação das organelas pode variar em dados momentos da secreção. Células
em que predominam dictiossomos estão relacionadas com a produção de secreção hidrofílica
(Durkee 1983) e células onde há predomínio de retículo endoplasmático estão relacionadas com a
síntese de secreção lipofílica, podendo atuar também na translocação e/ou concentração
temporária de açúcares (Durkee 1983, Figueiredo & Pais 1992, Paiva & Machado 2008).
Dictiossomos foram observados apenas na fase pré-secretora, não sendo possível confirmar se
estão presentes nas fases posteriores, indicando produção de substâncias hidrofílicas nesta fase; o
retículo endoplasmático rugoso é abundante tanto na fase que antecede o período secretor quanto
na fase secretora propriamente dita, sendo um indicativo de que as células também possuem
aparato necessário para a produção de substâncias lipofílicas, sendo esta produção mais
acentuada a partir da fase II. Os vacúolos são áreas de conversão da sacarose (Durkee 1983)
sendo pequenos e numerosos na fase I; o aumento do volume do vacúolo em estágio pós-secretor
normalmente está associado com eventos autofágicos e de senescência, sendo evidenciado
também pelo material fibrilar presente em seu interior (Durkee 1983, Razem & Davis 1999).
De acordo com os testes histoquímicos a epiderme secretora do nectário floral e do disco
glandular dos frutos de T. guianensis produz substâncias lipofílicas, polissacarídeos e compostos
fenólicos. As células da epiderme e subepiderme apresentam vacúolo com conteúdo fortemente
elétron-denso, que correspondem às substâncias fenólicas detectadas nos testes histoquímicos.
Estes compostos encontram-se compartimentalizados nos vacúolos, no entanto, podem tornar o
néctar tóxico, caso sejam exsudados via cutícula, ou repelir alguns visitantes, visto que alguns
insetos podem se alimentar de tecidos florais (Galetto & Bernadello 2005; Nicolson 2007). Estas
57
substâncias, muitas vezes, lhes conferem um odor e sabor particular que pode ser essencial para a
manutenção de certos grupos de polinizadores (Southwick 1990; Galetto & Bernadello 2004).
A presença de lipídios no néctar é bastante comum em diversas espécies (Baker & Baker
1973a; Fahn 1979, 1988; Rocha & Machado 2009), no entanto, a produção é tão pequena que é
possível detectar apenas traços, juntamente com aminoácidos, proteínas, fenólicos e
antioxidantes; o que se observa em T. guianensis é que há uma produção elevada de lipídios e
fenólicos, comprovada por meio dos testes histoquímicos e microscopia eletrônica de
transmissão. A secreção de óleos por flores é uma característica bastante particular (Neff &
Simpson 2005), e a ocorrência de uma glândula de secreção mista, que secreta tanto néctar
quanto lipídios, é aqui relatada pela primeira vez na família Anacardiaceae. Os lipídios e
compostos fenólicos podem ser exsudados para a superfície via permeabilidade da cutícula, uma
vez que a mesma oferece uma passagem para as substâncias lipossolúveis, enquanto que para as
substâncias hidrofílicas se constitui em uma barreira (Nepi et al. 1996), no entanto, não ficou
confirmada a liberação dessas substâncias para o meio externo, confirmando-se apenas produção
e acúmulo das mesmas.
Segundo Neff & Simpson (2005) a produção de lipídios atua na atração de abelhas,
oferecendo estas substâncias como recompensa ao polinizador, sendo duas vezes mais energético
que o néctar, ou ainda podem fazer parte dos componentes dos óleos voláteis, servindo como
atrativos odoríferos. Plastoglóbulos e gotas de óleo nos vacúolos ou dispersas no citoplasma,
mais evidentes na fase secretora e pós-secretora, são uma evidência ultraestrutural da produção
de lipídios por esta glândula e são bastante similares a plastídios envolvidos na síntese de
terpenóides em glândulas lipofílicas (Gleizes et al. 1980, Figueiredo & Pais 1992, Turner et al.
1999, Stpiczyńska et al. 2005, Machado et al. 2006, Possobom et al. 2010), sendo características
pouco comuns em tecidos nectaríferos (Rocha & Machado 2009). Os plastoglóbulos também
permitem a troca de lipídios entre os compartimentos membranares (Bréhelin & Kessler 2008).
Odor e néctar são elementos importantes para manter o relacionamento entre a planta e o
polinizador: o odor floral é responsável pela atração de longa distância, enquanto o néctar
constitui a principal recompensa floral (Melo et al. 2010). Melo et al. (2010) estudando algumas
espécies de Orchidaceae perceberam que as características estruturais e ultraestruturais de
nectários florais e osmóforos são bastante semelhantes, sendo que nestas últimas há um
58
predomínio de retículo endoplasmático e poucos dictiossomos, característica compatível com a
fase secretora de T. guianensis.
A capacidade de secretar tanto néctar quanto lipídios também é relatada nos nectários
extraflorais de Diplopterys pubipetala (A. Juss.) W.R. Anderson & C. Davis e Hiptage sericea
Hook. f. (Malpighiaceae) (Subramanian et al. 1990, Possobom et al. 2010), foi observado que
estas espécies possuem o aparato subcelular para secretar tanto substâncias hidrofílicas quanto
lipofílicas, assim como ocorre em T. guianensis. Estudos sobre elaióforos em Malpighiaceae
sugerem que nectários e elaióforos são estruturas homólogas, exibindo semelhanças na estrutura
anatômica e no mecanismo de secreção, diferindo apenas quanto à natureza química das
substâncias (Subramanian et al. 1990, Vogel 1990, Vinson et al. 1997, Castro et al. 2001,
Possobom et al. 2010). Vogel (1990) levanta a hipótese de que as glândulas produtoras de óleo,
elaióforos, tiveram origem a partir de nectários, podendo ser esta uma característica de transição
presente na espécie estudada.
Por meio dos testes histoquímicos e análise ultraestrutural, observou-se que o disco
glandular do fruto perde a capacidade de secretar néctar e produz apenas fenólicos e lipídios,
como detectado também no trabalho de Lacchia (2006), atuando provavelmente na proteção do
fruto contra a herbivoria (Fahn 1979; Roshchina & Roshchina 1993). Estas susbtâncias também
podem estar envolvidas na defesa química do fruto aumentando o potencial reprodutivo do
indivíduo, uma vez que estas substâncias são tóxicas e antibióticas e diminuem a ovoposição
(Lacchia 2006).
A presença de drusas contendo cristais no tecido nectarífero não foi relatada para outras
espécies de Anacardiaceae; estes podem servir como uma barreira física e química para proteger
o nectário e o gineceu contra insetos e outros organismos que podem usá-lo como fonte de
alimento (Korth et al. 2006, Horner et al. 2007). Segundo Paiva & Machado (2005), esses cristais
também podem atuar na eliminação do excesso de cálcio citossólico, muito comum no floema e
imediações de tecidos secretores, bem como auxiliar o transporte via simplasto.
A presença de numerosos plasmodesmos conectando as células parenquimáticas do
nectário é uma forte evidência de que o transporte do pré-nectar ocorre via simplasto,
característica observada em muitas outras espécies de angiospermas (Fahn 1979, Zer & Fahn
1992, Figueiredo & Pais 1992, Stpigynska et al. 2003, Wist & Davis 2006, Sulborska et al. 2007,
59
Possobom et al. 2010, Paiva 2011). No entanto, a partir da fase II são observados alguns espaços
intercelulares, que podem indicar transporte via apoplasto (Fahn 1979).
As vesículas secretoras próximas a membrana plasmática associadas ao retículo
endoplasmático em T. guianensis, são indicativos de forma de liberação da secreção do tipo
granulócrina, pois o retículo endoplasmático é a organela mais comum envolvida na produção de
vesículas secretoras em células nectaríferas (Durkee 1983, Fahn 2000), além disso, pequenas
vesículas estão amplamente distribuídas próximas a membrana plasmática. No entanto, as células
também possuem indicativo de liberação écrina, pois é comum a presença de gotas de óleo. Já
foi observado em outros trabalhos que é possível uma mesma estrutura possuir ambos os modos
de liberação da secreção (Zer & Fahn 1992, Razem & Davis 1999).
Percival (1961) estudou 889 espécies de angiospermas e dividiu as mesmas em três
grupos de acordo com o tipo de açúcar predominante no néctar: (1) predomínio de sacarose, (2)
proporção igualitária entre sacarose, glicose e frutose, (3) predominância de frutose e glicose.
Posteriormente Baker e Baker (1982) confirmaram as observações realizadas por Percival (1961)
de que certas espécies conservam uma determinada proporção entre sacarose, glicose e frutose,
no entanto, os autores dividiram as espécies estudadas em quatro grupos, de acordo com a
proporção entre os três açúcares, atribuindo uma taxa baseada no cálculo S/(G+F) (S=sacarose;
G=glicose; F=frutose): (1) sacarose dominante (r >1,0), (2) rico em sacarose (0,5-1,0), (3) rico
em hexose (0,1-0,5) e (4) hexose dominante (<0,1), sendo esta a classificação mais aceita
atualmente.
Em T. guianensis constatou-se, no presente trabalho, que o néctar na fase floral é sacarose
dominante (r > 1,0) tanto nos indivíduos contendo flores estaminadas quanto nos indivíduos
contendo flores hermafroditas. A composição química do néctar em Anacardiaceae havia sido
estudada apenas em uma espécie – Anacardium occidentale L. por Wunnachit et al. (1992).
Nessa espécie foi verificada que a relação dissacarídeos/monossacarídeos é de 0,08 para as flores
hermafroditas e de 0,13 para as flores estaminadas, mostrando que essas flores têm
predominância de hexoses (frutose e glicose) em sua composição. Em A. occidentale não houve
diferença significativa entre a composição química do néctar entre os morfotipos florais, assim
como em T. guianensis. Algumas famílias são caracterizadas por uma determinada relação
dissacarídeos/monossacarídeos, como Lamiaceae e Ranunculaceae, que têm um néctar com
60
predominância de sacarose (Baker & Baker 1983) e Solanaceae, com predominância de hexoses
(Galetto et al. 1998), outras apresentam diferenças entre os gêneros, como Scrophulariaceae
(Baker & Baker 1983). Devido à carência de estudos não é possível discutir com precisão as
tendências gerais para Anacardiaceae.
A concentração do néctar é altamente influenciada pelos fatores ambientais,
especialmente pela temperatura e pela umidade (Clalkoff et al. 2006; Pacini et al. 2003, Nepi et
al. 2007). Tapirira guianensis é encontrada em áreas úmidas e alagadiças (Santana et al. 2009) e
de acordo com Wunnachit et al. (1992) um ambiente seco explica altas concentrações de néctar, o
oposto acontece para ambientes úmidos. Além disso, a rápida evaporação do néctar, geralmente
em flores que possuem a corola pouco profunda, causa um aumento na concentração (Galetto et
al. 1998). Foram encontradas diferenças pronunciadas entre os indivíduos estudados, as flores
hermafroditas exibem maior concentração de açúcares, fator que pode estar relacionado ao
microhabitat em volta das flores; como as inflorescências masculinas tem maior quantidade de
flores, a umidade é mantida por mais tempo, reduzindo a evaporação do componente aquoso do
néctar, estando assim menos concentrado.
A concentração dos aminoácidos no néctar é consideravelmente inferior em relação aos
açúcares e sua presença está relacionada com a recompensa a insetos que não dispõem de outras
fontes que forneçam os componentes básicos para construção de proteínas (Baker e Baker 1983).
As diferenças na concentração de aminoácidos entre os morfotipos florais de T. guianensis não
foram significativamente diferentes (p>0,05), porém os valores mais elevados nas flores
estaminadas poderiam estar relacionados com uma provável contaminação por pólen. A
morfologia das flores, em especial nas flores estaminadas, contribui para que isto aconteça, uma
vez que o nectário fica totalmente exposto; com a visitação dos polinizadores pode haver então
contaminação desse tecido por grãos de pólen.
Com base nas análises ultraestruturais e histoquímicas o nectário floral de T. guianensis
pode ser classificado como uma glândula de secreção mista, pois possui aparato celular para
síntese de secreção hidrofílica e lipofílica, sendo esta última predominante a partir da formação
do fruto;
a secreção liberada durante a antese é predominantemente hidrofílica composta
principalmente por açúcares, confirmado através do teste em glicofita. Existe na literatura relato
de glândulas extraflorais que produzem néctar e lipídios (Subramanian et al. 1990, Machado et
61
al. 2008, Possobom et al. 2010), sendo classificadas como nectários sensu lato (Durkee et al.
1984, Machado et al. 2008), o mesmo é válido para o nectário de T. guianensis. Estudos
estruturais e químicos com outras espécies da família Anacardiaceae são necessários para
verificar se essa característica se repete no grupo.
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69
CAPÍTULO 2
Ontogenia do pericarpo e semente de Tapirira guianensis Aubl.
(Anacardiaceae): aspectos estruturais, ultraestruturais e
histoquímica
Elisabeth E. A. Dantas Tölke1, Sandra Maria Carmello-Guerreiro1, Sílvia Rodrigues Machado2
1. Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
2. Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP,
Campus de Botucatu
70
Resumo – Anacardiaceae reúne aproximadamente 600 espécies e 70 gêneros, tem distribuição
tropical e subtropical. A maioria das espécies apresenta fruto do tipo drupa, podendo ocorrer
também frutos do tipo sâmara. Este trabalho teve como objetivo descrever a ontogenia do
pericarpo e da semente de Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae). Ovário e frutos em várias
fases de desenvolvimento foram coletados, fixados e processados para estudos em microscopia de
luz, eletrônica de varredura e de transmissão, segundo as técnicas convencionais. Testes
histoquímicos foram empregados para identificar os principais metabólitos presentes nos tecidos.
O epicarpo, originado da epiderme externa do ovário, é formado por uma camada de células
recoberta por cutícula. O mesocarpo, originado a partir do tecido fundamental ovariano, é divido
em três regiões distintas: mesocarpo externo formado por células colenquimáticas; mesocarpo
mediano contendo canais secretores associados aos feixes vasculares e células parenquimáticas
alongadas contendo reserva de amido; e mesocarpo interno com espaços intercelulares
conspícuos e braquiesclereídes. O endocarpo sensu lato é formado por três a quatro camadas de
esclereídes de vários tipos mais cristais, derivado da epiderme interna ovariana e de uma camada
de células do tecido fundamental. T. guianensis apresenta o mesmo padrão geral das espécies
drupóides já estudadas na família, com endocarpo lignificado e presença de canais resiníferos no
mesocarpo. O óvulo é único, anátropo, de inserção lateral-apical, bitegumentado, crassinucelado,
com funículo longo e hipóstase visível na região da calaza. A semente completamente
desenvolvida é exalbuminosa, não possui camada mecânica e é considerada parcialmente
paquicalazal. O embrião concentra reservas de amido e proteínas. Apesar da produção acentuada
de goma-resina nos canais secretores e compostos fenólicos em geral, os frutos são dispersos por
pássaros indicando que o efeito negativo que estes produtos químicos têm sobre dispersores de
sementes deve ser de alguma forma compensado pelos benefícios obtidos através da redução
microbiana e ataque de insetos.
Palavras-chave: Anacardiaceae, canais secretores, desenvolvimento, drupa, pau-pombo,
paquicalaza.
71
Abstract – Anacardiaceae has 600 species and 70 genera approximately, tropical and subtropical
distribution. Most species presents the drupe fruit, but may also occurs samara. This work
described the ontogeny of pericarp and seed on Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae).
Ovary and fruits in various stages of development were collected, fixed and processed for studies
in light, scanning and transmission electron microscopy according to conventional techniques.
Histochemical tests were employed to identify the major metabolites present in the tissue. The
epicarp, originated from outside epidermis of the ovary, is formed by a layer of cells covered by
cuticle. The mesocarp, originated from fundamental ovarian tissue, is divided into three distinct
regions: outer mesocarp formed by colenchymatic cells, median mesocarp containing starch
reserves, and inner mesocarp with conspicuous intercellular spaces and brachisclereids. The
endocarp sensu lato comprises three to four layers of different types of sclereids and crystals,
derived from ovarian inner epidermis and from a cell layer of fundamental tissue. T. guianensis
has the same general pattern of drupoid species already studied in the family, with lignified
endocarp and presence of resin ducts on mesocarp. The ovule is unique, anatropous, inserted
apical-lateral, bitegmic, crassinucellate with longe funicle and hypostases visible in region of
chalaza. The seed fully developed is exabulminous, has not mechanical layer and is considered
partially pachychalazal. The embryo concentrates reserves of starch and protein. Despite the
marked production of gum-resin in the secretory ducts and phenolic compounds in general, the
fruits are dispersed by birds, indicating that the negative effect of these chemicals on seed
dispersers should be somehow compensated by the benefits achieved by reducing microbial and
insect attack.
Keywords: Anacardiaceae, secretory ducts, development, drupe, “pau-pombo”. Pachychalaza.
72
Introdução
Anacardiaceae reúne aproximadamente 600 espécies e 70 gêneros (Judd et al. 2007,
Barroso et al. 2007). No Brasil está representada por 14 gêneros e 57 espécies, sendo os gêneros
Schinus L., Anacardium L., Astronium Jacq. e Spondias L. os mais numerosos (Silva-Cruz &
Pirani 2012). Possui distribuição tropical e subtropical, com poucas espécies em regiões
temperadas, englobando arbustos ou árvores, raramente lianas ou ervas (Barroso et al. 2007, Judd
et al. 2007, Souza & Lorenzi 2008).
A família é tradicionalmente subdividida em cinco tribos: Anacardiëae, Dobineëae,
Rhoëae, Semecarpeae e Spondiadeae (Engler 1892). A maioria das espécies possui fruto drupóide
(Wannan & Quinn 1990, Gonzalez & Vesprini 2010) podendo ser encontrados também frutos do
tipo sâmara (Souza & Lorenzi 2008). Wannan & Quinn (1990) estudaram frutos pertencentes a
29 gêneros de Anacardiaceae e reconheceram dois tipos básicos de endocarpo: (1) o tipo
Spondias – composto por uma massa de esclerênquima de orientação irregular e (2) o tipo
Anacardium – caracterizado por uma epiderme interna lignificada e arranjo em camadas,
incluindo esclereídes em paliçada. O primeiro tipo foi encontrado na tribo Spondiadeae, em dois
gêneros da tribo Rhoëae (Campnosperma e Pentaspadon) e em um gênero da tribo Anacardiëae
(Buchanania). O segundo tipo ocorre nas tribos Rhoëae (exceto nos gêneros Campnosperma e
Pentaspadon), Semecarpeae, Dobineëae e Anacardiëae (exceto no gênero Buchanania).
Diante do grande número de espécies que compreendem a família os estudos anatômicos
dos frutos e sementes ainda são incipientes e apenas alguns trabalhos envolvem a ontogenia de
alguns deles (Roth 1974, Von-Teichman & Robbertse 1986, Von-Teichman 1987, Von-Teichman
& Van-Wyk 1988, Von-Teichman 1991, Von-Teichman & Van-Wyk 1993, Von-Teichman &
Van-Wyk 1994, Von-Teichman & Van-Wyk 1996, Li et al. 1999, Carmello-Guerreiro & Paoli
2002, González & Vesprini 2010). Nesses trabalhos são enfocadas as diferenças estruturais entre
espécies de uma mesma tribo buscando caracteres que possam ser utilizados para delimitar
melhor as tribos ou até mesmo os gêneros.
Barroso et al. (2007) afirmam que o mesocarpo dos representantes dessa família pode ser
carnoso (gêneros Mangifera e Spondias) ou lacunoso com canais ou cavidades (gêneros
Anacardium, Astronium e Myracroduon). Nestes últimos o sistema secretor é bastante
desenvolvido e os canais e/ou cavidades ocupam quase todo o mesocarpo (Carmello-Guerreiro &
73
Paoli 2000). As substâncias produzidas podem ter importância na indústria, na medicina popular
e ainda provocarem efeito alergênico (Dong & Bass 1993, Leon 2003, Pell 2004, Barroso et al.
2007, Judd et al. 2007).
Estruturas secretoras são bastante comuns em frutos de Anacardiaceae (Harada 1937,
Paula & Alves 1973, Paula & Heringer 1978, Joel & Fahn 1980, Lozano 1986, Von-Teichman
1987, Wannan & Quinn 1990, Von-Teichman 1990, Von-Teichman & Van-Wyk 1993, VonTeichman & Van-Wyk 1994, Von-Teichman & Van-Wyk 1996, Piennar & Von-Teichman 1998,
Von-Teichman 1998, Li et al. 1999, Machado & Carmello-Guerreiro 2001, Carmello-Guerreiro
& Paoli 2000, Carmello-Guerreiro & Paoli 2002, Carmello-Guerreiro & Paoli 2005, Lacchia
2006, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009, González & Vesprini 2010), podendo ser encontrados
canais, cavidades ou idioblastos. As estruturas de maior ocorrência são os canais e cavidades
podendo estes produzir resina, goma-resina, óleo-resina ou goma (Venning 1948, Metcalfe &
Chalk 1950, Lacchia 2006, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009).
Tapirira Aubl. reúne aproximadamente 28 espécies arbóreas (Tropicos 2012), no Brasil
ocorrem apenas quatro espécies: T. guianenses Aubl., T. obtusa (Benth.) J.D. Mitch., T. pilosa
Sprague e T. retusa Ducke; o gênero é amplamente distribuído por todo território nacional (SilvaCruz & Pirani 2012). Poucos trabalhos anatômicos foram realizados para o gênero, destacando-se
Von-Teichman (1990) no estudo acerca da estrutura do pericarpo e da semente de Tapirira
guianensis Aubl. e Lacchia (2006) evidenciando as estruturas secretores presentes no ápice
caulinar, nas flores e no fruto da mesma espécie, sendo destacada a presença de canais e
idioblastos em diversos órgãos, no entanto não foi realizado estudo ontogenético do fruto e
semente da espécie.
A espécie selecionada para este estudo foi Tapirira guianensis Aubl., pertencente à tribo
Spondiadea, conhecida popularmente como pau-pombo, peito-de-pomba, cupuba ou camboatá
(Silva-cruz & Pirani 2012). É uma espécie arbórea, dióica, importante para uso madeireiro,
medicinal e pode ser empregada na recuperação de áreas degradadas e de matas ciliares (Lorenzi
2002, Lenza & Oliveira 2005, Santana et al. 2009). É distribuída em todo território brasileiro
(Silva-cruz & Pirani 2012), principalmente em áreas de solo úmido (Santana et al 2009). Os
frutos de T. guianensis são do tipo drupa, elipsóides, quase esféricos e ideiscentes (Barroso 1999,
Barroso et al. 2007, Santana et al. 2009).
74
Este trabalho teve como objetivo estudar a ontogenia do fruto e da semente de Tapirira
guianensis Aubl., Desta forma os dados apresentados vêm para auxiliar os estudos taxonômicos e
filogenéticos na família, relacionar a estrutura anatômica do fruto com os possíveis modos de
dispersão e contribuir com os trabalhos relacionados às estruturas secretoras presentes em
Anacardiaceae.
Material e Métodos
Flores em antese de indivíduos femininos e frutos em vários estágios de desenvolvimento
de Tapirira guinanensis Aubl. foram coletados em três áreas do Estado de São Paulo: Estação
Experimental de Itirapina (22º 13’ S; 47º 51’ O), Estação Experimental de Mogi Guaçú (22º 10’
S; 47º 07’ O) e fragmento em Sousas – Distrito de Campinas (22º 51’ S; 46º 57’ O). As coletas
foram realizadas entre os meses de março a dezembro de 2011 e janeiro a fevereiro de 2012.
Microscopia de luz
No estudo ontogenético do pericarpo, flores e frutos foram coletados, sendo o tamanho
usado como critério inicial para o estabelecimento das fases de desenvolvimento: estádio I
(ovário medindo de 2-3 mm), estádio II (fruto medindo de 3-5 mm), estádio III (fruto medindo de
5,1-8 mm) e estádio IV (fruto medindo de 8,1-10 mm). No estudo ontogenético da semente o
óvulo e as sementes foram isolados a partir das flores e frutos, respectivamente, sendo
estabelecidas três fases, baseando-se nas características anatômicas observadas: estádio I (óvulo),
estádio II (semente em desenvolvimento) e estádio III (semente completamente desenvolvida).
As amostras foram fixadas em FAA (formaldeído, ácido acético, etanol 50%; 1:1:18 v/v)
por 24 horas (Johansen 1940), desidratadas em série etílica e estocadas em etanol 70%. Para as
análises anatômicas o material foi incluído em hidroxietilmetacrilato (Historesin® Leica) de
acordo com a técnica de Gerrits & Smid (1983) seguindo as recomendações do fabricante.
Secções transversais e longitudinais com 7-8 µm de espessura foram obtidas com auxílio de
micrótomo rotativo (Microm HM340E) e coradas com Azul de Toluidina a 0,05% em tampão
acetato (pH = 4,7) (O’Brien et al. 1964). Todas as lâminas foram montadas temporariamente em
água e as imagens capturadas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio
óptico (Olympus BX51).
75
Histoquímica
Para os testes histoquímicos foi utilizado material fixado em FAA (para substâncias
hidrofílicas) por 24 horas e em FNT (tampão fosfato, formalina; 9:1 v/v) (para substâncias
lipofílicas e substâncias fenólicas) por 48 horas. Os tratamentos realizados foram: Negro de
Sudão B (Pearse 1980), Sulfato Azul do Nilo (Cain 1947), Lugol (Berlyn & Miksche 1976),
Cloreto de Ferro III (Johansen 1940), Reagente de Wagner (Furr & Mahlberg 1981), Reagente de
Schiff (PAS) (McManus 1948), Vermelho de Rutênio (Johansen 1940), Ácido Tânico e Cloreto
de Ferro III (Pizzolato & Lillie 1973) e Azul-Preto de Anilina (Fisher 1968). As substâncias
detectadas e suas respectivas reações cromáticas positivas encontram-se na Tabela 1. Os
resultados foram registrados por meio de imagens capturadas com câmera digital (Olympus
DP71) acoplada ao microscópio óptico (Olympus BX51).
Tabela 1. Testes histoquímicos utilizados na caracterização das substâncias presentes no
pericarpo e na semente de Tapirira guianensis Aubl.
Teste
Substância detectada
Reação cromática positiva
Negro de Sudão B
Lipídios totais
Azul a negro
Sulfato Azul do Nilo
Lipídios ácidos e neutros
Azul piscina para lipídios ácidos e
rosa a púrpura para lipídios neutros
Lugol
Amido
Roxo a negro
Cloreto de Ferro III
Compostos fenólicos
Marrom e negro
Reagente de Wagner
Alcalóides
Vermelho
Reagente de Schiff (PAS)
Polissacarídeos totais
Rosa
Vermelho de Rutênio
Pectinas
Rosa intenso
Ácido Tânico e Cloreto de Ferro III
Mucilagens
Negro
Azul-Preto de Anilina
Proteínas
Azul profundo a negro
Microscopia eletrônica de varredura
Para análise micromorfológica, o material fixado em FAA por 24 horas (Johansen 1940),
foi desidratado em série etílica e estocado em etanol 70%. Posteriormente foi desidratado em
série etílica, seco pelo método do ponto crítico com CO2, montado e metalizado com ouro. As
observações e imagens foram obtidas através de Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
Jeol JSM 5800 LV a 10 kV com câmera digital acoplada.
76
Microscopia eletrônica de transmissão
Na microscopia eletrônica de transmissão o material vegetal (endocarpo do fruto jovem –
fase I) foi fixado em glutaraldeído 2,5%, em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,3 durante 24 horas a
uma temperatura de 5ºC. Pós-fixado em tetróxido de ósmio 1% no mesmo tampão durante uma
hora a 25ºC, desidratado em série crescente de solução de acetona e incluído em araldite
(Machado & Rodrigues 2004). As secções ultrafinas foram obtidas com navalha de diamante e
coradas com azul de metileno a 1% e contrastadas com acetato de uranila (Watson 1958) e citrato
de chumbo (Reynolds 1963). O material foi observado em microscópio eletrônico de transmissão
Philips E.M. 301.
Resultados
Ontogenia e histoquímica do pericarpo
Baseando-se nas alterações anatômicas que ocorrem durante o desenvolvimento do fruto,
os resultados obtidos foram agrupados em quatro estádios: estádio I – representado pelo ovário da
flor em antese; estádio II – fruto muito jovem; estádio III – fruto jovem no qual se verifica o
alongamento ou crescimento celular; estádio IV – fruto completamente desenvolvido (Fig. 1). O
pericarpo do fruto foi dividido em três regiões claramente diferenciadas em todas as fases de
desenvolvimento: exocarpo, mesocarpo e endocarpo.
Figura 1. Flores e frutos de Tapirira guianensis Aubl. Estádio I – Ovário (Ov), estádio II –
fruto muito jovem (3-5 mm), estádio III – fruto jovem no qual se verifica o alongamento ou
crescimento celular (5,1-8 mm) e estádio IV – fruto completamente desenvolvido (8,1-10 mm).
77
Estádio I – O ovário de T. guianensis é unilocular constituído de epiderme externa, tecido
fundamental contendo drusas na região externa, canais secretores associados ao floema dos feixes
vasculares e epiderme interna que se divide periclinalmente formando duas camadas (Fig. 2). A
epiderme externa do ovário é unisseriada, composta por células justapostas, recobertas por
cutícula espessa e contem estômatos (Fig. 3A). As reações histoquímicas são positivas para
substâncias fenólicas (Fig. 3B), lipídios (Fig. 3C) e polissacarídeos (Fig. 3D).
O ovário é piloso (Fig. 4A), recoberto por tricomas tectores e glandulares (Fig 4B-E). Os
tricomas glandulares são multicelulares e multisseriados na porção secretora (3-4 camadas) (Fig.
4B e D); os tectores são alongados, multicelulares e unisseriados de ápice afilado com parede e
cutícula espessa (Fig. 4C e E). A região fundamental do ovário pode ser dividida em três regiões,
baseando-se no tamanho, arranjo e conteúdo celular. A região mais externa, subjacente à
epiderme ovariana externa, é constituída por células parenquimáticas em processo intenso de
divisão celular. Esta região é constituída por oito a dez camadas de células, de núcleo evidente e
paredes delgadas (Fig. 2). Podem-se visualizar drusas distribuídas ao longo de toda essa região
(Fig. 2). Na porção mediana (Tecido fundamental mediano) encontram-se canais secretores em
diferenciação, associados ao floema dos feixes vasculares (Fig. 2; Fig. 5A-B). As células que
formam o epitélio dos canais possuem conteúdo fenólico, lipídico, proteíco e polissacarídico
(Tabela 3). A região interna do ovário é constituída por 12 a 15 camadas de células
parenquimáticas em processo intenso de divisão celular em vários planos, com núcleo evidente e
paredes celulares delgadas (Fig. 2), no qual é observado um único feixe vascular de grande
calibre (Fig. 5C). A epiderme interna da parede ovariana é bisseriada, formada por células
justapostas, de núcleo evidente de posição central (Fig. 5D).
78
Figura 2. Aspecto geral do ovário de Tapirira guianensis
Aubl. em corte transversal. Microscopia de luz e detalhe
das drusas em luz polarizada na região externa do tecido
fundamental. (Ee = epiderme ovariana externa; Dr =
drusas; Cs = canal secretor com células trabeculares; Ei =
epiderme ovariana interna; Te = tecido fundamental
externo; Tm = tecido fundamental mediano; Ti = tecido
fundamental interno). Barra: 20 µm.
79
Figura 3. Epiderme externa
ovariana de Tapirira guianensis
Aubl. em cortes transversais. A.
Detalhe da epiderme externa
ovariana em que se visualizam
estômato (Es) e cutícula (Ct). B.
Reação positiva para o Cloreto
férrico, evidenciando a presença de
substâncias fenólicas. C. Reação
positiva para o Negro de Sudão B,
evidenciando a presença de lipídios.
D. Reação positiva para o PAS,
evidenciando a presença de
polissacarídeos. Barras: 20 µm (A),
50 µm (B-D).
80
Figura 4. Tricomas tectores e glandulares presentes no ovário de Tapirira guianensis Aubl. A. Aspecto
geral do ovário em microscopia eletrônica de varredura. B. Eletromicrografia do tricoma glandular. C.
Eletromicrografia dos tricomas tectores. D. Corte longitudinal de tricoma glandular multicelular com
porção secretora multisseriada. E. Corte longitudinal de tricoma tector multicelular unisseriado. Barras:
200 µm (A), 20 µm (B, D, E), 10 µm (C).
81
Figura 5. Tecido fundamental ovariano e epiderme interna ovariana de Tapirira guianensis Aubl. A.
Região mediana do tecido fundamental em corte transversal mostrando os canais secretores associados aos
feixes vasculares (Ep = epitélio dos canais; Fv = feixe vascular). B. Região mediana do tecido
fundamental em corte transversal mostrando os canais secretores (Ep = epitélio dos canais; Lc = lume do
canal secretor). C. Feixe vascular de grande calibre na região interna do ovário em destaque em secção
longitudinal. D. Epiderme interna em secção transversal, as setas apontam células em divisão periclinal.
Barras: 10 µm (B), 20 µm (A, C-D).
Estádio II – Os frutos jovens são verdes com glândula intraestaminal persistente e
apresentam intensa atividade mitótica. O aspecto geral do pericarpo nessa fase pode ser
visualizado na figura 6A. O epicarpo, derivado da epiderme externa ovariana é bastante
semelhante à epiderme externa da parede do ovário, formada por uma camada de células
recobertas por cutícula (Fig. 7A).
82
Nessa fase ainda é possível observar tricomas tectores e glandulares recobrindo toda a
superfície externa do epicarpo, só que em menor quantidade em relação à fase anterior (Fig. 7B).
Os tricomas são morfologicamente idênticos aos descritos anteriormente.
Figura 6. Aspecto geral do fruto (Estádio II) de
Tapirira guianensis Aubl. em corte transversal. (Ec =
epicarpo; Dr = drusas; Me = mesocarpo externo; Mm
= mesocarpo mediano; Mi = mesocarpo interno, En =
endocarpo). Barra: 50 µm.
83
Figura 7. Detalhes do epicarpo do fruto (Estádio II) de Tapirira guianensis Aubl. A. Secção transversal
mostrando detalhe do epicarpo e mesocarpo externo (Ec = epicarpo; Ct = cutícula; Dr = drusa). B.
Eletromicrografia do epicarpo evidenciando tricomas tectores (Tt) e glandulares (Tg). Barras: 20 µm (A),
100 µm (B).
O mesocarpo se desenvolve a partir do tecido fundamental do ovário sendo possível
distinguir três zonas (Fig. 6A). Na mais externa, denominada de mesocarpo externo, há um
aumento no número de camadas, passando a ser constituída por aproximadamente 20 camadas de
células parenquimáticas, ainda em processo de divisão celular em vários planos e por células
contendo drusas, amplamente distribuídas (Fig. 6 e 7A).
Na zona mediana, denominada de mesocarpo mediano, estão dispostos em um único
círculo os canais secretores (Fig. 8A-E) associados aos feixes já bem desenvolvidos (Fig. 6). Os
canais são formados por epitélio e bainha secretores, as reações histoquímicas são positivas para
lipídios, compostos fenólicos, polissacarídeos e proteínas (Fig. 8A-E). Células degeneradas do
epitélio são lançadas no lume e novas células provenientes da bainha parenquimática são
diferenciadas em epitélio, substituindo as células degeneradas (Fig. 8H). Em secção longitudinal
pode-se observar com clareza que a estrutura em questão é um canal e não uma cavidade (Fig.
8I), no entanto, em secções transversais (Fig. 8 F-G) em algumas regiões é possível observar a
fusão de dois ou mais canais (anastomose) (Fig. 8G).
84
Figura 8. Secções transversais (A-H) e longitudinais (I) dos canais secretores do ovário e dos frutos de
Tapirira guianensis Aubl. A. Reação positiva para Azul do Nilo. B. Reação positiva para PAS. C. Reação
positiva para Cloreto Férrico. D. Reação positiva para Negro de Sudao B. E. Reação positiva para AzulPreto de Anilina. F. Canais secretores separados por células parenquimáticas. G. Fusão parcial dos canais
secretores. H. Epitélio degenerando-se (setas) com lançamento dos restos celulares e secreção no lume do
canal. I. Canal secretor em secção longitudinal. Barras: 20 µm (D, I); 40 µm (H), 50 µm (A-C, E-G).
Na região interna (mesocarpo interno) aparecem camadas de células que apresentam
conteúdo polissacarídico (Fig. 9B), lipídico (Fig. 9C) e fenólico (Fig. 9D). Essa região apresenta
divisões em vários planos (Fig. 6A). O endocarpo é constituído por duas camadas de células, de
parede delgada e núcleo proeminente (Fig. 9A).
85
Figura 9. Mesocarpo interno e endocarpo de Tapirira guianensis Aubl. em secções transversais. A.
Mesocarpo interno contendo idioblastos secretores enfileirados e endocarpo (Ed). B. Reação positiva PAS.
C. Reação positiva Negro de Sudão B. D. Reação positiva Cloreto Férrico. Barras: 20 µm (A), 50 µm (BD).
Estádio III – Nesta fase, no epicarpo, as células apresentam cutícula espessa e perda dos
tricomas (Fig. 10 e 11A). Os testes histoquímicos revelam as mesmas substâncias encontradas
anteriormente (Tabela 3). As células do mesocarpo externo apresentam espessamento pécticocelulósico tornando-se colenquimáticas, sendo as mais espessas próximas ao epicarpo diminuindo
este espessamento à medida que se aproximam do mesocarpo mediano (Fig. 10 e 11A).
No mesocarpo mediano, região onde se concentram os canais secretores, é possível
observar aumento no número de camadas de células parenquimáticas que separam os canais
secretores dos feixes vasculares, agora bem desenvolvidos (Fig. 10 e 11B). No mesocarpo
interno, desta fase, surgem as diferenças mais marcantes. Espaços intercelulares se tornam
bastante conspícuos entre as células parenquimáticas, formando um aerênquima discreto (Fig. 10
e 11C). Nas 3-4 últimas camadas a grande maioria das células do mesocarpo interno se diferencia
formando esclereídes alongadas, nos sentidos longitudinal, transversal e oblíquo (Fig. 11C). As
células que não lignificam permanecem parenquimáticas sem mudanças no formato e muitas
delas contêm cristais do tipo drusa e prismáticos (Fig. 11C-D). No endocarpo, bisseriado, a
camada mais externa se diferencia em esclereíde alongada e a última camada, em contato com o
lóculo, permanece parenquimática (Fig. 11C).
86
Figura 10. Aspecto geral do fruto (Estádio III) de Tapirira guianensis Aubl.
em corte transversal. (Ec = epicarpo; Me = mesocarpo externo; Mm =
mesocarpo mediano; Mi = mesocarpo intern; En = endocarpo). Barra: 100 µm.
87
Figura 11. Aspectos do pericarpo de Tapirira guianensis Aubl. (Estádio III) em secções transversais. A.
Detalhe do epicarpo e do mesocarpo externo (Ct = cutícula; Dr = drusas; Es = Espessamento péctico
celulósico da parede celular. B. Feixe vascular completamente desenvolvido. C. Detalhe do endocarpo e
do mesocarpo interno (Mi = mesocarpo interno; En = endocarpo; Cr = cristais; *: espaços intercelulares
formando aerênquima discreto). D. Cristal em célula do mesocarpo interno. Barras: 10 µm (A, D), 20 µ m
(B-C).
Estádio IV – O aspecto geral do pericarpo nessa fase encontra-se representado na Figura
12. A alteração mais evidente no epicarpo do fruto maduro é o aparecimento de lenticelas (Fig.
13A). No mesocarpo mediano as camadas de células parenquimáticas formadas entre os canais
secretores e os feixes vasculares se dividem e iniciam o alongamento em várias direções (Fig. 12
e 13B). No mesocarpo interno algumas das células que acumulavam compostos fenólicos passam
a apresentar parede esclerificada (Fig. 13C). No endocarpo, a camada em contato com o lóculo
88
agora também se lignifica formando esclereídes (Fig. 13D). No mesocarpo externo as células
acumulam amido (Fig. 13E), bem como, as células do mesocarpo mediano (Fig 13F).
Figura 12. Aspecto geral do fruto (Estádio IV) de Tapirira
guianensis Aubl. em corte transversal. (Ec = epicarpo; Me =
mesocarpo externo; Mm = mesocarpo mediano; Mi = mesocarpo
interno, Em = endocarpo). Barra: 100 µm.
89
Figura 13. Aspectos gerais do pericarpo de Tapirira guianensis Aubl. (Estádio IV) em secções
transversais. A. Detalhe do epicarpo mostrando a lenticela e células colenquimatosas do mesocarpo
externo. B. Células alongadas do mesocarpo mediano (setas: parede celular sinuosa). C. Detalhe do
endocarpo (en) e do mesocarpo interno (mi) (setas = formação de esclereides, *: espaços intercelulares).
D. Detalhe do encocarpo com destaque para a última camada em contato com o lóculo em estágio de
lignificação (Ce = célula esclerificada). E. Reação positiva para Lugol no mesocarpo externo. F. Reação
positiva para Lugol no mesocarpo mediano. Barras: 10 µm (D), 20 µm (A-B), 50 µm (C e E), 100 µm (F).
90
Os testes histoquímicos mostraram algumas diferenças entre as fases de desenvolvimento,
sendo apresentados resumidamente na tabela 3.
Tabela 3. Testes histoquímicos no ovário e nos frutos, em várias fases de desenvolvimento, de
Tapirira guianensis Aubl.:
Testes
Estádio I
Estádio II
Estádio III
ee, cut, id, ba
(++)
id, ba
(++)
ee, id, ba
(++)
(-)
ep, cut, id, ba
(++)
id, ba
(++)
ep, id, ba
(++)
(-)
ep, cut, id, ba
(++)
id, ba
(++)
ep, id, ba
(++)
(-)
Estádio IV
histoquímicos
Negro de Sudão B
ep, cut, id, ba
(++)
Sulfato Azul do Nilo
id, ba
(++)
Cloreto de Ferro III
ep, id, ba
(++)
Lugol
me, mm
(++)
Reagente de Wagner
(-)
(-)
(-)
(-)
Reagente de Schiff
ee, id, pc, ba
ep, id, pc, ba
ep, id, pc, ba
ep, id, pc, ba
(++)
(++)
(++)
(++)
Vermelho de
pc
pc
pc
pc
Rutênio
(++)
(++)
(++)
(++)
Ácido Tânico/
pc
pc
pc
pc
Cloreto de Ferro III
(++)
(++)
(++)
(++)
(++ fortemente positivo, + fracamente positivo, - ausente) Destaque em cinza para os testes que apresentaram
mudanças entre as diferentes fases analisadas. (ee: epiderme exterma; ep: epicarpo; cut: cutícula; ba: bainha dos
canais secretores; id: idioblastos; me: mesocarpo externo; mm: mesocarpo mediano; pc: parede celular).
Aspectos ultraestruturais do endocarpo jovem
O endocarpo do fruto jovem apresenta células alongadas horizontalmente, por vezes
colapsadas (Fig. 14A). A visualização das organelas é difícil, pois o citoplasma está quase que
completamente preenchido por uma substância elétron-densa (Fig. 14A). Em alguns pontos há
presença de material fibrilar no interior do vacúolo (Fig. 14A). Gotículas elétron opacas também
são visualizadas esparsamente pelo citoplasma, sempre localizadas próximas à membrana
plasmática (Fig. 14A). Algumas vesículas são vistas junto à membrana plasmática na primeira
camada de células, voltadas para o lóculo (Fig. 14B).
91
Figura 14. Aspectos ultra-estruturais do
endocarpo do fruto jovem de Tapirira guianensis
Aubl. A. Células contendo substância elétrondensa no vacúolo, alguns com material fibrilar
em seu interior. B. Vesículas junto à membrana
plasmática (Ol = gotas de óleo; Ve = vesículas).
Barras: 2 µm (A-D).
Ontogenia e histoquímica da semente
Baseando-se nas alterações anatômicas que ocorrem durante o desenvolvimento da
semente, os resultados obtidos foram agrupados em três estádios: estádio I – representado pelo
óvulo; estádio II – semente muito jovem, ainda em desenvolvimento; estádio III – semente
completamente desenvolvida (Fig. 16). O tegumento da semente foi dividido em duas regiões:
testa e tégmen.
Figura 16. Óvulo e sementes de
Tapirira guianensis Aubl. Estádio
I – Óvulo (aprox. 3 mm), estádio
II – semente em desenvolvimento
(3-4 mm), estádio III – semente
completamente desenvolvida (5-7
mm). Barra: 1mm.
92
Estádio I – Na espécie estudada, o ovário é unilocular e uniovulado, a placentação é ereta
com óvulo pêndulo (Fig. 17 A). O óvulo é anátropo, bitegumentado e crassinucelado (Fig. 17 B).
O tegumento externo é formado por três a cinco camadas celulares na região calazal e duas
camadas próximas à micrópila (Fig. 17 B-D); a epiderme externa acumula substâncias fenólicas,
exceto junto à micrópila (Fig. 17 B-D).
O tegumento interno tem duas camadas celulares, podendo ter de três a quatro camadas na
região micropilar, a epiderme interna acumula substâncias fenólicas (Fig. 17C), exceto na região
micropilar (Fig. 17 D). A região micropilar é formada pelo exóstoma e pelo endóstoma, sendo a
primeira mais longa provocando o desencontro das duas regiões, formando o que se denomina de
“micrópila em zigue-zague” (Fig. 17 D). O nucelo é bem desenvolvido, com paredes delgadas e
células contendo núcleo evidente (Fig. 17 C). A calaza é extensa e com ampla vascularização,
nessa região ocorre grande acúmulo de substâncias fenólicas, constituindo uma hipóstase
conspícua (Fig. 17 B). O funículo é longo, formado por células parenquimáticas contendo
idioblastos fenólicos dispersos (Fig. 17 A).
Estádio II – Durante o desenvolvimento da semente ocorrem poucas modificações. Como
no óvulo, a semente é anátropa (Fig 18 A). As células que formavam o tegumento externo
passaram por divisões em vários planos, dando origem à testa que está claramente subdividida em
três regiões: exotesta (camada mais externa que acumula substâncias fenólicas), mesotesta
(camada mediana multiestratificada formada por células parenquimáticas separadas por amplos
espaços intercelulares) e endotesta (uma única camada de células epidérmicas situada na porção
interna subjacente ao tégmen) (Fig 18 C).
As células que formavam o tegumento interno do óvulo não passaram por divisões
periclinais, ocorrendo somente divisões anticlinais; estas células dão origem ao tégmen (Fig. 18
C). As camadas celulares que formam o tégmen geralmente estão colapsadas, não sendo possível
distinguir entre exotégmen, mesotégmen e endotégmen. A calaza se expande juntamente com a
hipóstase iniciando a formação da paquicalaza (Fig. 18 A). Nota-se que há um crescimento maior
na região oposta à formação da paquicalaza - região da anti-rafe, originando uma semente
reniforme (Fig. 18 A). Observa-se o início do desenvolvimento do embrião (Fig. 18 A), e início
da degeneração das células do nucelo (Fig. 18 B).
93
Figura 17. Aspectos gerais do óvulo de Tapirira guianensis Aubl. em secções longitudinais.
A. Ovário com placentação ereta e óvulo pêndulo, anátropo (Fu = funículo; Ra = rafe). B.
Detalhe do óvulo bitegumentado e crassinucelado, mostrando as principais regiões (Mi =
micrópila; Te = tegumento externo; Ti = tegumento interno; Se = saco embrionário; Nu =
nucelo; Fv = feixe vascular; Hi = hipóstase; Ca = calaza). C. Detalhe do tegumento externo
(Te) e tegumento interno (Ti), seguido de nucelo (Nu) contendo células de núcleo evidente. D.
Destaque da micrópila em zigue-zague (linha tracejada). Barras: 100 µm (A, B e D), 200 µ m
(C).
94
Figura 18. Aspectos gerais da semente em desenvolvimento de Tapirira guianensis
Aubl. em secções longitudinais. A. Semente reniforme com funículo alongado,
destaque para o início da formação da paquicalaza na região calazal (Ca). (Em =
embrião; Nu = nucelo; En = endosperma). B. Detalhe do envoltório da semente (Es)
seguido de nucelo (Nu) e endosperma (en). C. Detalhe dos tegumentos da semente.
(Ex = exotesta; Me = mesotesta; En = endotesta; Tg = tégmen). Barras: 20 µ m (C),
50 µm (B), 500 µm (A).
95
Estádio III – A semente completamente desenvolvida é mais alongada que na fase
anterior, perdendo o formado reniforme (Fig. 16). O funículo permanece aderido ao envoltório da
semente, sendo considerado vestígio de um arilo funicular (Fig. 16). Na testa as únicas mudanças
que ocorrem são o aparecimento de cristais e esclereídes na mesotesta (Fig. 19A); há grande
colapso das células da mesotesta tornando os espaços intercelulares mais conspícuos (Fig. 19B).
O número de camadas da mesotesta é bastante variável (Fig 19 A-B). Não há mudanças
significativas no tégmen (Fig. 19 A-B). A porção paquicalazal já está bem desenvolvida, no
entanto apenas na região da rafe-calaza, o que permite classificar esta semente como
parcialmente paquicalazal (Fig. 19D). A semente é exalbuminosa e o nucelo é intensamente
consumido, podendo permanecer alguns restos de células nucelares (Fig. 19C). O embrião ocupa
toda a cavidade seminal e nessa fase já é possível observar uma grande quantidade de canais
secretores sendo formados no meristema fundamental (Fig. 19D).
Os testes histoquímicos não passaram por nenhuma variação nos resultados ao longo das
diferentes fases. O funículo reagiu positivamente para o Cloreto Férrico e Negro de Sudão B,
evidenciando a presença de substâncias fenólicas e lipídios, respectivamente (Fig. 20 A-B). A
exotesta e o tégmen e hipóstase mostraram resultados semelhantes (Fig. 20 C-E). Os cotilédones
possuem reservas de amido, evidenciado através do teste com Lugol, e de proteínas, revelado
através do teste com Azul-Preto de Anilina (Fig 20 F-H).
96
Figura 19. Aspectos gerais da semente completamente desenvolvida de Tapirira guianensis Aubl. em
secções longitudinais. A. Envoltório da semente contendo drusas (Dr) e esclereides (Eq) na região da
mesotesta. B. Envoltório da semente com destaque para os espaços intercelulares conspícuos formados a
partir do colapso celular na mesotesta (*). C. Restos nucelares (Nu) localizados entre a região da
paquicalaza (Pq) e o embrião (Em). D. Paquicalaza completamente desenvolvida (Pq) na porção rafecalaza e embrião contendo inúmeros canais secretores (Cs) com secreção evidente. Barras: 40 µ m (A),
100 µm (B-D).
97
Figura 20. Testes histoquímicos em seções longitudinais da semente de Tapirira guinanensis
Aubl. A. Reação positiva para Cloreto Férrico no funículo. B. Reação positiva para Negro de
Sudão no funículo. C. Testa e hipóstase reagindo positivamente para o Cloreto Férrico. D.
Testa e tégmen reagindo positivamente para o Cloreto Férrico. E. Testa e hipóstase reagindo
positivamente para o Negro de Sudão B. F. Embrião corado com Azul de Toluidina. G.
Embrião corado com Lugol, evidenciando a presença de amido. H. Cotilédone corado com
Azul-Preto de Anilina, evidenciando a presença de proteínas. Barras: 50 µm (D), 100 µm (A-C
e E), 200 µm (F-H).
98
Discussão
Barroso et al. (2007) e Barroso et al. (1999) enquadram morfologicamente o fruto de
espécies de Anacardiaceae como nucóides ou drupóides, apesar de existirem algumas
divergências na estrutura interna dos frutos do gênero Astronium Jacq., sendo mais
adequadamente classificados como bagas. Além disso, pode-se observar a existência de frutos do
tipo sâmara, como na espécie Schinopsis balansae Engl. (González & Vesprini 2010) e
Smodingium argutum E. Mey. ex Sond. (Von-Teichman 1998). A nomenclatura dos diferentes
tipos de frutos gera confusão na hora da classificação morfológica dos mesmos, variando
conforme cada autor, assim, neste trabalho adotou-se a terminologia proposta por Spjut (1994),
que reconhece para Anacardiaceae os tipos cipsela, drupa, pseudosâmara e sâmara. Segundo o
mesmo, autor a drupa é um fruto que apresenta pericarpo carnoso com um ou mais pirênios,
sendo o pirênio uma “concha” que abrange uma ou mais sementes, assim como observado nos
frutos de Tapirira guinensis, originando-se de uma única flor com gineceu sincárpico (Wannan &
Quinn 1990, Barroso et al. 2007, Souza & Lorenzi 2008, Gonzalez & Vesprini 2010).
Segundo Roth (1977) ainda há muitos conflitos na classificação dos frutos, sendo
necessário o estudo ontogenético para correta classificação dos mesmos. Ainda segundo a mesma
autora o epicarpo ou endocarpo pode ser formado por uma única camada derivados
respectivamente da epiderme externa e interna ovariana, sendo neste caso, denominados de
epicarpo e endocarpo sensu stricto. Quando o epicarpo ou endocarpo também incluem camadas
derivadas do mesocarpo são denominados de epicarpo e endocarpo sensu lato.
O presente estudo ontogenético confirma que o epicarpo do fruto completamente
desenvolvido é formado pela camada externa derivada da epiderme externa ovariana, o epicarpo
propriamente dito, e por várias camadas de células colenquimatosas formadas a partir do
mesocarpo externo, sendo denominado de epicarpo sensu lato. Nesse caso o mesocarpo externo
foi considerado como parte do epicarpo pelo seu aspecto funcional, pois segundo Roth (1977) o
epicarpo é camada protetora do fruto, nas drupas pode ocorrer uma hipoderme colenquimatosa,
com células de paredes espessas e alongadas tangencialmente, assim como acontece em T.
guianensis. Há um contraste acentuado quando se compara as características do epicarpo dos
representantes da tribo Spondiadeae, a qual pertence T. guianensis, com espécies da tribo Rhoeae,
como Lithraea brasiliensis Marchand (Piennar & Von-Teichman 1998), Schinus terebinthifolius
99
Raddi (Carmello-Guerreiro & Paoli 2002) e L. molleoides Engl. (Carmello-Guerreiro & Paoli
2005) em que o epicarpo é esclerificado.
Segundo a organização do endocarpo, Wannan e Quinn (1990) propuseram uma
classificação em dois tipos de pericarpo para a família Anacardiaceae: o tipo Spondias, com
endocarpo composto por uma massa de esclerênquima de orientação irregular e o tipo
Anacardium caracterizado por apresentar o endocarpo composto por camadas com uma epiderme
externa lignificada, com parênquima arranjado em estratos, incluindo esclereides em paliçada. As
características do fruto de T. guianensis estão de acordo com o tipo Spondias; Von-Teichman
(1990) estudou a estrutura do fruto maduro de T. guianensis e verificou que o endocarpo não é
massivo, e sim relativamente fino se comparado com outras espécies da mesma tribo, como em
Lannea discolor Engl. (Von-Teichman 1987), aspecto confirmado neste trabalho. Além disso,
outras diferenças em relação às espécies da mesma tribo são citadas pelo autor, como reserva de
amido, contrastando com as reservas de proteína normalmente encontradas e ausência de
opérculo. O endocarpo de T. guianensis é considerado sensu lato, uma vez que o fruto
completamente desenvolvido inclui as camadas esclerificadas derivadas do mesocarpo interno.
Nas espécies da tribo Spondiadeae estudadas por Wannan e Quinn (1990), foram
elencadas características comuns ao grupo como epicarpo não lignificado, mesocarpo contendo
feixes vasculares associados com canais secretores, com mesocarpo consistindo de uma mistura
de esclerênquima e parênquima, com exceção dos gêneros Dracontomelon Blume que não possui
esclerênquima e Spondias L. em que o esclerênquima está restrito à região dos canais secretores.
Segundo os autores o endocarpo é esclerificado, com esclereides de orientação irregular, como
também foi observado na espécie estudada neste trabalho, e pode conter alguns cristais.
Em T. guianensis a maioria desses caracteres foram observados, no entanto o mesocarpo
não contém esclerênquima, a exemplo do gênero Dracontomelon, sendo que a única região
esclerificada em T. guianensis é o endocarpo com poucos esclereídes dispersos na região interna
do mesocarpo. Wannan e Quinn (1990) avaliaram 10 gêneros de um total de 17 da tribo
Spondiadeae e afirmaram que os frutos dessa tribo são bastante diversos e poucas características
anatômicas do pericarpo revelam alguma afinidade entre os gêneros.
No pericarpo encontram-se canais secretores amplamente distribuídos na região mediana
do mesocarpo. Na família Anacardiaceae diversos trabalhos citam a presença de canais
100
resiníferos em frutos, sempre associados aos feixes vasculares e localizados na região mediana do
mesocarpo (Joel & Fahn 1980, Von-Teichman 1987, Von-Teichman & Van-Wyk 1993, VonTeichman & Van-Wyk 1994, Von-Teichman & Van-Wyk 1996, Piennar & Von-Teichman 1998,
Von-Teichman 1998, Carmello-Guerreiro & Paoli 2000, Machado & Carmello-Guerreiro 2001,
Carmello-Guerreiro & Paoli 2005, Lacchia & Carmello-Guerreiro 2009, González & Vesprini
2010). Esta é uma característica constante para as espécies da família, independentemente da
tribo a qual pertencem.
Lacchia & Carmello-Guerreiro (2009) estudaram detalhadamente a formação desses
canais no fruto de T. guianensis, bem como, o modo de secreção dos mesmos, através de
microscopia eletrônica de transmissão. As autoras concluíram que a formação dos canais se dá
pelo processo esquizógeno e o modo de liberação da secreção é écrino. Esses canais possuem
uma secreção de natureza mista, sendo encontrados lipídios, polissacarídeos, proteínas e
substâncias fenólicas.
Essa heterogeneidade das substâncias produzidas nos canais do pericarpo de T. guianensis
também é relatada nos trabalhos de Joel e Fahn (1980), que estudaram a secreção produzida nos
canais de Mangifera indica L., bem como no trabalho de Lacchia e Carmello-Guerreiro (2009),
que estudaram os canais secretores de T. guianensis, Spondias dulcis G. Forst. e Anacardium
humile A. St. Hil. Esses autores denominaram a substância produzida nos canais de resina, sendo
uma substância comum para a família, tanto em órgãos vegetativos quanto reprodutivos
(Metcalfe & Chalk 1950). Langenheim (2003) define resina vegetal como uma mistura
lipossolúvel de terpenóides voláteis e não voláteis ou compostos fenólicos que são geralmente
secretados em estruturas especializadas localizadas internamente ou na superfície da planta. No
entanto, como também foram detectadas substâncias de natureza hidrofílica, optou-se por
denominar esta secreção de goma-resina, que é uma mistura natural entre os componentes
lipofílicos das resinas acompanhados de certas quantidades de polissacarídeos e mucilagens
(Langenheim 2003, Lacchia 2006).
A bainha dos canais parece ser a responsável na manutenção do epitélio secretor, uma vez
que elas armazenam as mesmas substâncias detectadas no epitélio e no lume dos canais, além
disso, é possível verificar a ruptura das células epiteliais e consequentemente o extravasamento
da secreção para o interior do lume dos canais juntamente com os restos celulares, com reposição
101
contínua do epitélio pela atividade meristemática da bainha, o que caracteriza o modo de secreção
holócrina. A ocorrência de uma bainha parenquimática que circunda estas glândulas produzindo
novas células epiteliais é relatada em diversos trabalhos (Monteiro et al. 1995, Monteiro et al.
1999, Machado & Carmello-Guerreiro 2001, Bennici & Tani 2004, Rodrigues et al. 2011a,
Rodrigues et al. 2011b).
A grande quantidade de substâncias fenólicas encontrada no fruto de T. guianensis,
armazenadas nos canais, no epicarpo e nos idioblastos do mesocarpo interno, também é
encontrada em outras espécies da família sob a denominação de substâncias taníferas (VonTeichman 1987, Von-Teichman & Van-Wik 1993, Von-Teichman & Van-Wyk 1994, VonTeichman & Van-Wyk 1996, Piennar & Von-Teichman 1998, González & Vesprini 2010). As
substâncias fenólicas em geral constituem-se em um grande grupo de metabólitos secundários
que contém o grupo fenol (uma ou mais hidroxilas) ligado a um ou mais anéis aromáticos e
podem ter várias denominações que variam de acordo com o arranjo da cadeia carbônica: fenóis
simples, taninos, taninos condensados, flavonóides, biflavonóides, entre outros (Castro &
Demarco 2008). Assim, a denominação de substâncias taníferas mencionadas pelos autores
supracitados corresponde às substâncias fenólicas, no entanto, é necessário um teste mais
específico a fim de detectar qual a substância fenólica que está presente nas secreções produzidas,
teste este não realizado por nenhum dos autores em questão.
Várias são as funções atribuídas às substâncias fenólicas, dentre elas podemos citar a
defesa química contra patógenos, proteção contra herbivoria, proteção contra a radiação
ultravioleta devido ao seu poder antioxidante, auxílio na dispersão por pássaros, induzindo a
regurgitação e absorção de luz ultravioleta formando os guias florais (Roshchina & Roshchina
1993, Von-Teichman & Van-Wyk 1993, Von-Teichman & Van-Wyk 1994, Aguilar-Ortigoza &
Sosa 2004, Castro & Demarco 2008).
Na microscopia eletrônica de transmissão foi possível observar grande quantidade de
material elétron-denso preenchendo quase que a totalidade da célula e pequenas gotículas de
material elétron-opaco indicando que o endocarpo produz e armazena substâncias lipofílicas,
sendo estas características comuns em células que secretam estas substâncias (Fahn 1979). As
mucilagens anteriormente citadas no trabalho de Lacchia (2006) não tiveram sua presença
comprovada neste trabalho, no entanto, a autora já havia relatado a secreção das substâncias
102
lipídicas. O endocarpo secretor é descrito pela primeira vez em frutos no trabalho da autora,
sendo confirmada sua atividade secretora neste trabalho.
Drusas contendo cristais também ocorrem nos frutos de algumas espécies de
Anacardiaceae, principalmente no mesocarpo (Von-Teichman & Van-Wyk 1993, Von-Teichman
& Van-Wyk 1996, González & Vesprini 2010). Os autores não atribuíram nenhuma função à
presença desses cristais, no entanto geralmente eles estão relacionados com a proteção contra
herbivoria, neutralização de ácido oxálico nocivo à planta e regulação dos níveis de cálcio
teciduais (Molano-Flores 2001, Volk et al. 2002, Xiang & Chen 2004, Larcher & Boeger 2006,
Korth et al. 2006).
Os resultados aqui descritos sugerem que o fruto de T. guianensis possui várias
características que estão relacionadas com a proteção da semente contra patógenos e predadores
como: presença de canais que secretam goma-resina, idioblastos contendo substâncias fenólicas,
drusas amplamente distribuídas no mesocarpo e endocarpo lignificado. O fruto também exibe
uma característica anatômica adaptativa ao ambiente em que se encontra, T. guianensis ocorre
principalmente em regiões úmidas ou alagadas (Lenza & Oliveira 2005, Santana et al. 2009) e a
formação de espaços intercelulares conspícuos no mesocarpo interno permite a flutuação do fruto
em ambientes alagados (Roth 1977, Chiarini e Barboza 2009). A formação de aerênquima no
mesocarpo interno não foi descrita do trabalho de Von-Teichan (1990), sendo relatada pela
primeira vez nesta espécie.
T. guianensis é uma drupa de mesocarpo suculento e adocicado dispersada por aves
(Guimarães 2003). Os frutos facilitam a dispersão de sementes fornecendo recompensa para os
dispersores (Van der Pijl 1982), drupas representam um tipo de fruto divido em duas partes muito
especializadas: um mesocarpo carnoso, frequentemente comestível e, portanto, usado para
dispersão, e um endocarpo rígido que protege a semente (Roth 1977). Nos testes histoquímicos
realizados neste trabalho foram detectados grãos de amido em grande quantidade no mesocarpo,
provavelmente utilizado pelo metabolismo da planta para produção de substâncias adocicadas
durante a maturação dos frutos, substâncias estas bastante procuradas pelos agentes dispersores
(Van der Pijl 1982).
Os componentes detectados nos testes histoquímicos, como amido, são direcionados aos
agentes dispersores, enquanto que os tóxicos (goma-resina) são direcionados principalmente para
103
os organismos que destroem as sementes, permanecendo não tóxicos para os organismos
dispersores (Cipollini & Levey 1997). Em estudos com representantes da família Solanaceae foi
comprovado que os níveis elevados de nutrientes compensam os efeitos dissuasores dos
metabólitos secundários (Cipollini & Levey 1997). Os metabólitos secundários em frutos
maduros são dirigidos principalmente a pragas de insetos e microrganismos, e qualquer efeito
negativo que estes produtos químicos têm sobre dispersores de sementes deve ser de alguma
forma compensado pelos benefícios obtidos através da redução microbiana e ataque de insetos
(Tewksbury 2002). Além disso, existe uma congruência entre o tipo de fruto ingerido e a
fisiologia digestiva de frugivoros particulares (Cipollini & Levey 1997).
Em T. guinanensis o óvulo é anátropo, bitegumentado, crassinucelado, de placentação
apical-lateral e funículo longo. Corner (1976) descreveu o óvulo das espécies de Anacardiaceae
como óvulos solitários, anátropos, com placentação apical, basal ou lateral, com rafe dorsal ou
ventral, geralmente bitegumentados, mais raramente unitegumentados, crassinucelados e com
funículo geralmente longo.
Essas características são observadas em muitas espécies de
Anacardiaceae, sendo relatadas por alguns autores (Von-Teichman & Van-Wyk 1988, VonTeichman 1991, Von-Teichman & Van-Wyk 1991, Carmello-Guerreiro & Paoli 1999a,
Carmello-Guerreiro & Paoli 1999b, Carmello-Guerreiro & Paoli 2000, Carmello-Guerreiro &
Paoli 2005). O tegumento externo do óvulo é maior que o interno, característica comum na
família (Carmello-Guerreiro & Paoli 1999b), e o crescimento do funículo em direção à micrópila
pode funcionar como obturador, possuindo a função de guiar o crescimento do tubo polínico
(Bouman 1984, Carmello-Guerreiro & Paoli 1999b, Carmello-Guerreiro & Paoli 2005).
A estrutura da semente de T. guianensis corresponde à descrição das características gerais
das Anacardiaceae feita por Corner (1976), com tegumentos com pouca ou nenhuma
especialização, eventualmente comprimidos; e o endocarpo quase sempre desempenha a função
protetora da testa ou do tégmen. A análise anatômica revelou que o envoltório da semente é
indiferenciado, não possuindo camada mecânica, confirmando as observações realizadas no
trabalho de Von-Teichman (1990) para a mesma espécie. O autor ainda afirma que o envoltório
da semente de todos os membros de Spondiadeae é considerado indiferenciado, devido a ausência
de camada mecânica definida.
104
O envoltório da semente madura é constituído por duas regiões distintas, uma tegumentar
e uma parcialmente paquicalazal. As sementes parcialmente paquicalazais são bastante comuns
na família Anacardiaceae, característica amplamente discutida na literatura (Corner 1976, VonTeichman & Van-Wyk 1988, Von-Teichman 1990, Von-Teichman 1991, Von-Teichman & VanWyk 1991, Piennar & Von-Teichman 1988, Von-Teichman & Van-Wyk 1994,
Carmello-
Guerreiro & Paoli 1999a, Carmello-Guerreiro & Paoli 1999b, Carmello-Guerreiro & Paoli 2000,
Carmello-Guerreiro & Paoli 2005). Nas sementes paquicalazais a calaza se amplia formando
grande parte do envoltório seminal (Werker 1997), essas sementes estão geralmente associadas a
óvulos bitegumentados, crassinucelados, embriões grandes, ausência de endosperma ou
endosperma nuclear, hábito arbóreo e hábitat tropical (Corner 1976, Von-Teichman & Van-Wyk
1991). A paquicalaza constitui-se numa importante adaptação funcional atuando na transferência
mais eficiente dos nutrientes, gases e hormônios para o embrião (Von-Teichman & Van-Wyk
1994, Carmello-Guerreiro & Paoli 1999b).
O desenvolvimento da paquicalaza também é uma característica distintiva entre as tribos
de Anacardiaceae; na tribo Spondieae a paquicalaza é relativamente grande e o envoltório da
semente é bastante diversificado, podendo ocorrer camada mecânica na exo-, meso- ou endotesta,
bem como no tégmen; em contrapartida, a tribo Anacardieae mostra uma paquicalaza pouco
desenvolvida quando comparada à tribo Spondieae e envoltório da semente com poucas
variações, geralmente com epiderme interna do tégmen lignificada (Von-Teichman & Van-Wyk
1991).
A formação de amplos espaços intercelulares na mesotesta juntamente com o surgimento
de esclereídes, da mesma forma que no mesocarpo interno, podem estar diretamente relacionadas
à adaptação da espécie ao ambiente úmido e alagadiço em que se encontra, permitindo a
flutuação da semente quando eventualmente ela possa se depositar em um solo encharcado ou em
cursos de água; além de permitir da flutuação da semente, essa característica anatômica também
permite uma maior eficiência na oxigenação dos tecidos (Evert 2006). A semente completamente
desenvolvida ainda apresenta restos do funículo aderidos ao envoltório, a presença de funículo
bem desenvolvido é uma característica peculiar em muitas sementes e devido a este fator, quando
os mesmos permanecem, são considerados arilos vestigiais (Corner 1976, Carmello-Guerreiro &
Paoli 1999b).
105
As substâncias fenólicas encontradas na hipóstase, exotesta, endotégmen e funículo atuam
na proteção da semente contra herbívoros e patógenos, podendo ainda tornar os tegumentos mais
duros e impermeáveis; funcionam também como inibidores da germinação e conferem a cor
amarronzada às sementes (Werker 1997). Nos testes histoquímicos foram detectadas as
substâncias de reserva do embrião, amido e proteínas, estas últimas não foram relatadas no
trabalho de Von-Teichman (1990). A reserva de lipídios e proteínas é considerada uma
característica derivada da família (Von-Teichman 1990, Von-Teichman 1991, Von-Teichman &
Van-Wyk 1991, Von-Teichman 1994, Von-Teichman & Van-Wyk 1994), e a presença de amido
pode ser uma característica de transição dentro do grupo.
A semente apresenta características típicas da família, ratificando o que já foi descrito por
Corner (1976) e Von-Teichman (1990). A constância de caracteres estruturais de óvulos e
sementes é esperada, tendo em vista que dentre os órgãos reprodutivos estes são os que exibem
menor variação entre os táxons (Von-Teichman & Van-Wyk 1991, Souto & Oliveira 2008).
As pragas e os patógenos devem ser considerados agentes importantes na interação
planta-dispersor, pois os frutos e sementes da espécie estudada produzem substâncias bastante
diversas, fator que pode ser amplamente discutido em trabalhos futuros. As espécies da família
Anacardiaceae ocorrentes na América do Sul são pouco estudadas do ponto de vista anatômico,
particularmente no que diz respeito à anatomia de frutos e sementes, tendo destaque para alguns
trabalhos (Roth 1974, Von-Teichman & Robbertse 1986, Von-Teichman 1987, Von-Teichman &
Van-Wyk 1988, Von-Teichman 1990; Von-Teichman 1991, Von-Teichman & Van-Wyk 1991,
Von-Teichman & Van-Wyk 1993, Von-Teichman & Van-Wyk 1994, Von-Teichman & VanWyk 1996, Piennar & Von-Teichman 1998, Li et al. 1999, Carmello-Guerreiro & Paoli 1999a,
Carmello-Guerreiro & Paoli 1999b, Carmello-Guerreiro & Paoli 2000; Carmello-Guerreiro &
Paoli 2002; Carmello-Guerreiro & Paoli 2005, González & Vesprini 2010), havendo um vasto
campo de pesquisa em busca de características anatômicas que revelem afinidades entre espécies
da mesma tribo, bem como do mesmo gênero, estabelecendo um paralelo com as características
anatômicas de frutos e sementes já descritas para espécies ocorrentes em outros continentes.
106
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113
Considerações finais
Analisando-se todos os resultados obtidos pode-se concluir que o disco glandular
floral presente em Tapirira guianensis Aubl. é uma glândula de secreção mista, tendo em sua
composição néctar com predominância de sacarose, lipídios e susbtâncias fenólicas, sendo
considerado nectário sensu lato. Esta glândula atua na atração de polinizadores ao mesmo
tempo em que repele herbívoros e agentes patogênicos.
As análises ultraestruturais e histoquímicas trouxeram grande contibuição com relação
ao conhecimento da organização e funcionamento da glândula, do mecanismo de liberação da
secreção, principais componentes da secreção e puderam elucidar quais as mudanças
ocorridas ao longo das diferentes fases de existência da flor. O primeiro capítulo contribuiu
para o conhecimento detalhado do funcionamento da glândula floral presente em T.
guianensis, trazendo resultados inéditos para a família Anacardiaceae.
No segundo capítulo a análise ontogenética do fruto e da semente mostrou-se de
grande utilidade para a correta classificação dos tecidos presentes nos órgãos completamente
desenvolvidos. Foram encontradas várias características comuns na família, e mais
especificamente na tribo Spondieae, como presença de canais secretores e endocarpo
lignificado de orientação irregular no fruto, e ausência de camada mecânica e formação de
paquicalaza na semente. As substâncias de reserva encontradas nos cotilédones foram o amido
e proteínas, o que pode indicar que esta espécie possui características tansitórias dentro do
grupo, pois é mais comum nesta família reservas lipídicas e protéicas.
Os frutos e sementes desta espécie possuem grande quantidade de substâncias úteis na
proteção do embrião, uma vez que inibem o ataque de herbívoros e patógenos em geral.
Algumas características anatômicas ainda são úteis na dispersão, pois apesar de ser uma
espécie dispersa por pássaros, está inserida em ambientes alagados e a formação de
aerênquima é característica útil para permitir a flutuação do diásporo até que seja encontrado
ambiente propício para germinação.
Propõe-se em trabalhos futuros realizar-se um estudo mais abrangente, com espécies
tanto da tribo Spondieae quanto da tribo Anacardieae, a fim de se verificar semelhanças e
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diferenças do funcionamento das glândulas florais, bem como ampliar os estudos relativos à
ontogenia de frutos e sementes. Acredita-se que a continuação deste trabalho possa trazer
resultados relevantes para o entendimento da família como um todo, principalmente no que
diz respeito ao estudo das estruturas secretoras. Os dados poderão ser utilizados em futuros
estudos filogenéticos ou de dispersão.
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