Ensayo Científico
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3): 285 - 295, 2016
PROPAGACIÓN in vitro DE SELECCIONES DE GUAYABO (Psidium guajava L.)
In vitro PROPAGATION OF GUAVA SELECTIONS (Psidium guajava L.)
L. Antonio Domínguez-Perales1, José L. Domínguez-Álvarez2,
Serafín Cruz-Izquierdo1, Amalio Santacruz-Varela1, Alejandro Barrientos-Priego2,
J. Saúl Padilla-Ramírez3 y Ma. Alejandra Gutiérrez-Espinosa1*
Campus Montecillo, Colegio de Posgraduados. Km 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Montecillo, Texcoco, Estado de México. 2Universidad
Autónoma Chapingo. Km 38.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Chapingo, Estado de México. 3Campo Experimental Pabellón, Instituto Nacional
de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Km. 32.5 Carretera Aguascalientes-Zacatecas. 20660, Pabellón de Arteaga, Aguascalientes.
1
*Autor de correspondencia (alexge@colpos.mx)
RESUMEN
La propagación in vitro mediante organogénesis directa de brotes de
guayabo (Psidium guajava L.) constituye una alternativa para la rápida
obtención de plantas productivas. El presente trabajo tuvo como objetivo
optimizar un protocolo de regeneración in vitro a partir de ápices y segmentos
nodales de cinco genotipos de guayabo con alto potencial comercial Paluma
12 (PM12), Paluma 6 (PM6), 17-06, Roja Exterior Redonda (RER) y Roja
Chapeada Grande (CHRG). Se evaluó la adición de polivinilpirrolidona (PVPP)
en el medio de cultivo como agente antioxidante. Los genotipos RER y CHRG
presentaron menor número de brotes, con 10 y 0 % de fenolización. En la fase
de multiplicación de propágulos los mejores resultados fueron obtenidos
cuando los brotes se desarrollaron en el medio Murashige y Skoog (MS) con
el suplemento de 0.5 mg L-1 de BAP y con 30 mg L-1 de adenina para los
genotipos PM6 y PM12, mientras que el genotipo 17-06 tuvo mejor desarrollo
con la adición de 15 mg L-1 de sulfato de adenina. La adición de 40 mg L-1 de
sulfato de adenina representó el mejor tratamiento para los genotipos RER y
CHRG. El enraizamiento se indujo satisfactoriamente mediante la incubación
de los brotes durante 24 h en medio MS suplementado con 2.54 mg L-1 de AIA
para el genotipo 17-06, con 1.34 mg L-1 de AIB para los genotipos PM6 y RER,
y con 2.94 de AIB para los genotipos CHRG y PM12.
Palabras clave: Psidium guajava, organogénesis directa, optimización
de protocolo, genotipos.
SUMMARY
In vitro propagation of guava (Psidium guajava L.) shoots by direct
organogenesis is an alternative to quickly obtain productive plants. This
work optimized a protocol for in vitro regeneration from apexes and nodal
segments of five different guava genotypes with high commercial potential
Paluma 12 (PM12), Paluma 6 (PM6), 17-06, Roja Exterior Redonda (RER) and
Roja Chapeada Grande (CHRG). The effect of polyvinylpyrrolidone (PPVP)
was evaluated as an antioxidant. Genotypes RER and CHRG showed low
phenolization problems of 10 y 0 %, respectively. In the multiplication phase,
genotypes PM6 and PM12 showed the best results when their shoots were
grown on Murashige y Skoog medium (MS) supplemented with 0.5 mg L-1 BAP
and 30 mg L-1 adenine; meanwhile var. 17-06 developed better by addition of
15 mg L-1 of adenine sulfate. Addition of 40 mg L-1 of adenine sulfate resulted
in the best treatment for vars. RER and CHRG. Rooting was induced by 24 h
of shoot incubation on MS medium supplemented with 2.54 mg L-1 IAA for
var. 17-06, while IBA at 1.34 mg L-1 induced rooting in cvs. PM6 and RER;
IBA concentration had to be increased to 2.94 mg L-1 for better rooting in var.
CHRG and PM12.
Recibido: 9 de Abril del 2015
Aceptado: 18 de Mayo del 2016
Index words: Psidium guajava, direct organogenesis, protocol
optimization, genotypes.
INTRODUCCIÓN
México es uno de los principales productores y exportadores de guayaba (Psidium guajava L.) y sus derivados en
el mundo. A pesar de esto, en los últimos años la superficie plantada y su producción han venido en decremento,
ya que para 2013 la superficie plantada fue de 21,000 ha,
mientras que para 2007 se reportaron 23,621 ha (SAGARPA, 2014). Esta situación se debe tanto a la alta heterogeneidad de las huertas como a la producción, además de
que comercialmente se cultiva casi exclusivamente la variedad Media China (Padilla et al., 2002).
La generación y distribución de nuevos cultivares, en
especial los que presenten pigmentación en sus frutos o
sean de pulpa roja o rosada es una de las alternativas para
cubrir las nuevas perspectivas en los mercados nacionales
e internacionales, pues en los últimos años se ha incrementado la exigencia para la obtención de cultivares con
altos contenidos de compuestos antioxidantes, como vitamina C, carotenoides y compuestos fenólicos (Carvalho et
al., 2006; Chorilli et al., 2007).
La complementación de los métodos convencionales de
propagación con herramientas biotecnológicas como el
cultivo de tejidos constituye una alternativa para la reproducción. En el guayabo se han abordado diferentes métodos de propagación in vitro a través de la organogénesis,
la embriogénesis somática y semilla sintética, desarrollados a partir de explantes de ápices, segmentos nodales y
embriones zigóticos (Biswas et al., 2007; Chandra et al.,
2004; Rai et al., 2007; Rai et al., 2010). No obstante, la propagación se ha caracterizado por una baja eficiencia en
la obtención de plantas debido a la pérdida de explantes
PROPAGACIÓN in vitro DE Psidium guajava L.
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3) 2016
en la etapa inicial del establecimiento provocada principalmente por una alta oxidación fenólica y persistencia de
contaminaciones bacterianas así como por un bajo coeficiente de multiplicación en etapas subsecuentes. Lo anterior ha conducido al desarrollo de protocolos para superar
estas barreras biológicas (Concepción et al., 2005; Mishra
et al., 2007a; Pérez et al., 2002). Recientemente se publicó acerca de la micropropagación del guayabo a partir de
segmentos nodales en el cultivar Media China (Perales et
al., 2016) sin embargo, no todos los genotipos de guayaba
responden de la misma forma a los diferentes protocolos
de micropropagación, por lo que se hace indispensable la
generación de protocolos específicos para cada cultivar o
genotipo de la especie.
que contenía tres gotas de Tween® 80 durante 10 min con
agitación constante.
Los explantes ya desinfectados se colocaron individualmente en tubos de ensayo de 150 mm x 25 mm que contenían medio sólido de establecimiento, constituido por
medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado
con sacarosa 30 g L-1, mio-inositol 100 mg L-1, tiamina 0.1
mg L-1, polivinilpirrolidona (PVPP) 0.5 g L-1 y como agente solidificante se utilizó agar Merck® 6 g L-1. Después de
establecer los explantes en el medio, se colocó la tapa de
polipropileno y se sellaron los tubos e incubaron durante
10 d en condiciones de luz artificial indirecta (evitando el
contacto directo con las lámparas), un fotoperiodo de 16
h luz, una intensidad de 2000 lux y una temperatura de 25
± 2 ºC. La unidad experimental constó de 10 explantes, el
diseño experimental fue completamente al azar con tres
repeticiones, con dos factores a evaluar, genotipo y tipo de
explante.
Con base en lo anterior, la presente investigación tuvo
como objetivo desarrollar un método de micropropagación en cinco diferentes genotipos de guayabo evaluados
en Tabasco y Zacatecas, con alto potencial comercial para
la región de los Cañones del estado mediante la evaluación
del efecto de la polivinilpirrolidona PVPP como antioxidante y el tipo de explante en la fase de establecimiento in vitro,
así como del efecto del uso de la adenina y del sulfato de
adenina en la proliferación de brotes; además con el fin de
promover la rizogénesis se evalúa la adición de auxinas en
el medio de cultivo.
La evaluación se hizo de manera visual a los 10 d después de la siembra de los explantes. Se evaluó supervivencia (%), pérdida por oxidación fenólica (%) y contaminación
por hongos y bacterias. La oxidación fenólica se cuantificó
con base en dos aspectos: la oxidación o necrosamiento
en el explante y la liberación de los fenoles del explante al
medio de cultivo; para ello se usó una calificación de 1 a
3 [1 = baja, 2 = media (50 % del explante necrosado) y 3 =
alta (explante totalmente necrosado)] dependiendo de la
cantidad de fenoles. El nivel tres se consideró como pérdida del explante.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se consideraron cinco genotipos de guayabo: Paluma
12 (PM12), Paluma 6 (PM6), 17-06, Roja Exterior Redonda
(RER) y Roja Chapeada Grande (CHRG). Estos genotipos
fueron seleccionados de parcelas demostrativas en el municipio de Tabasco, Zacatecas. Las características que se
utilizaron para su selección fueron tamaño y forma de fruto, color y grosor de pulpa, así como rendimiento en campo.
Experimento 2. Multiplicación de propágulos
Esta etapa de la propagación constó de dos fases:
Fase 1. Efecto de la bencilaminopurina. La adición de la bencilaminopurina (BAP) al medio de cultivo se evaluó en su
efecto en el desarrollo de nuevos brotes para los genotipos
PM12, PM6 y CHRG (los genotipos RER y 17-06 se evaluaron en una investigación anterior). Se utilizaron brotes
de tres nudos ya establecidos in vitro, los cuales fueron
transferidos a frascos de cultivo que contenían 25 mL de
medio semisólido de multiplicación, constituido por el medio basal MS suplementado con sacarosa 30 g L-1, mioinositol 100 mg L-1 y tiamina 0.1 mg L-1 medio al que se
incorporó BAP en cuatro concentraciones diferentes (0.5,
1.0, 1.5 y 2.0 mg L-1). Los cultivos se incubaron durante 30
d en condiciones de luz artificial por lámparas fluorescentes, un fotoperiodo de 16 h luz, una intensidad de 2000 lux
y una temperatura de 25 ± 2 ºC.
Propagación in vitro de materiales de guayabo
Experimento 1. Establecimiento
Se colectaron dos tipos de explantes de árboles de 2 a
3 años de edad creciendo en condiciones de invernadero,
donde se mantuvieron las plantas en condiciones óptimas
de fertilidad, humedad y sanidad mediante la aplicación
constante de Curamicin® y Bactrimicin®. La colecta se
realizó durante los meses de septiembre a diciembre de
2012 y se utilizaron ápices de aproximadamente 2 cm de
longitud y el primer nudo, los cuales se lavaron con detergente comercial durante 10 min y luego se enjuagaron en
agua corriente. Después del lavado se realizó una desinfección superficial con hipoclorito de calcio (CaCl2O2) a 3 %
La unidad experimental consistió en un frasco con seis
brotes. El diseño experimental fue completamente al azar
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DOMÍNGUEZ-PERALES et al.
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con cuatro repeticiones, y los factores fueron genotipo y
la concentración de BAP. A los 30 d de iniciados los tratamientos se evaluó la longitud del brote inicial (LBI), el número de brotes por explante (NB), longitud de brotes (LB),
el número de nudos del brote (NN), y el coeficiente de multiplicación (CM) que se calculó con la siguiente fórmula:
de 2000 lux y una temperatura de 25 ± 2 ºC. La unidad
experimental consistió en un frasco con seis brotes, con
tres repeticiones por tratamiento. Se evaluó la cinética de
enraizamiento de los genotipos, con conteos diarios de la
aparición de las raíces así como el conteo final del número
y longitud de las raíces a los 25 d después de la inducción.
Cantidad de segmentos y brotes finales
CM = _______________________________________
Análisis estadístico
Cantidad de segmentos iniciales
Fase 2. Efecto de adenina y sulfato de adenina. Debido a los
bajos CM obtenidos en el experimento anterior y con base
en información encontrada para otras especies (Bantawa
et al., 2009; Nandagopal y Kumari, 2006), se optó por utilizar dos precursores de citocininas (adenina y el sulfato de
adenina) para complementar el medio de cultivo. El medio
de cultivo utilizado fue igual al del experimento anterior,
adicionado con 0.5 mg L-1 de BAP (testigo).
Para el procesamiento de datos de los diferentes experimentos se aplicaron pruebas estadísticas para comprobar los supuestos de distribución normal y homogeneidad
de varianzas. Al no cumplirse los supuestos, se aplicó la
transformación de datos por medio de la formula X' = x + 1
(donde X’= valor transformado; x = valor original). Para las
variables presentadas en porcentajes se hizo la trasformación de datos por medio de la formula X' = ARSEN x. Para
desarrollar estos procedimientos se utilizó el paquete estadístico SAS versión 9.0. A los datos transformados y no
transformados se les aplicó análisis de varianza (ANDEVA)
y la prueba de comparación DHS de Tukey, con el paquete
estadístico SAS versión 9.0.
El diseño fue completamente al azar, con arreglo de tratamiento factorial con el factor genotipo en cinco niveles,
el tipo de precursor en dos niveles (adenina y sulfato de
adenina) y el factor concentración de precursor en cinco
niveles (0, 15, 20, 30 y 40 mg L-1). Los cultivos se incubaron
durante 30 d en condiciones similares al experimento anterior. La unidad experimental consistió de un frasco con
seis brotes, con cuatro repeticiones. La evaluación de las
variables se realizó a los 30 d del inicio de los tratamientos
y se consideraron las mismas variables que en el experimento anterior.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Experimento 1. Establecimiento
La fenolización se caracteriza por un necrosamiento del
tejido vegetal, y la emisión de coloraciones al medio de cultivo (Abdelwahd et al., 2008). En todos los tratamientos y
explantes (ápices y nudos) aquí estudiados se mostraron
estos síntomas, pero en diferentes intensidades. De acuerdo al ANDEVA, hubo diferencias significativas entre genotipos para las variables evaluadas (supervivencia %, pérdida
por oxidación % y contaminación por hongos y bacterias),
no así para los tipos de explante. También fue significativa
la interacción genotipo por tipo de explante para las variables pérdida por oxidación y contaminación. Las aportaciones relativas de estos factores fueron de 60 % para el
factor genotipo, 19 % para el tipo de explantes, mientras
que la interacción de los factores tuvo una aportación de
21 % sobre las variables evaluadas.
Experimento 3. Enraizamiento
Aquí se evaluó la respuesta del enraizamiento de brotes
de los cinco genotipos de guayabo con diferentes reguladores de crecimiento de tipo auxínico. Se utilizaron brotes
provenientes de la fase de multiplicación, los cuales fueron
previamente homogeneizados en longitud (1.5 cm). Para
inducir que los brotes formasen raíces adventicias, éstos
se colocaron en frascos con 25 mL de medio semisólido
de enraizamiento durante 24 h, el cual estaba constituido
por el medio basal MS complementado con sacarosa 30 g
L-1, mio-inositol 100 mg L-1 y tiamina 0.1 mg L-1 al que se
agregaron diferentes tipos y concentraciones de auxinas.
Transcurrido el tiempo de inducción los brotes se transfirieron a frascos con medio basal MS mencionado.
En la Figura 1 se muestran los porcentajes de fenolización de los explantes entre los genotipos de guayabo, y
que la presencia de 0.5 g L-1 de PVPP indujo porcentajes
de fenolización del nivel bajo. El genotipo CHRG presentó
la mayor frecuencia de explantes con nivel bajo de oscurecimiento (93 %), seguido del genotipo RER que tuvo 87 %;
estos dos genotipos fueron significativamente mejores que
el resto de genotipos.
El diseño experimental aplicado fue completamente al
azar, con arreglo factorial de tratamientos en donde los
factores fueron el genotipo en cinco niveles; el tipo de auxina en dos niveles (ácido 3-indolacético AIA y ácido 3-indolbutírico AIB) y la concentración de auxina en cuatro niveles (0, 6.6, 14.5 y 29 µmol L-1). Los cultivos se incubaron
durante 25 d en condiciones de luz artificial con lámparas
fluorescentes, un fotoperiodo de 16 h luz, una intensidad
El porcentaje más alto de fenolización se dio en el genotipo PM6 donde 34 % de los explantes mostró alto nivel
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PROPAGACIÓN in vitro DE Psidium guajava L.
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de fenolización, en contraste con los genotipos CHRG y
17-06 que tuvieron 0 y 2 % de explantes con alto nivel de
fenolización, respectivamente.
La contaminación microbiana es uno de los factores limitantes más importantes para el inicio del cultivo in vitro
vegetal (Krishna y Singh, 2007), que resulta en la muerte de
los explantes o en retraso de su desarrollo. En la Figura 2
se presentan los porcentajes de supervivencia por tipo de
explante y genotipo, donde los genotipos más afectados
fueron el 17-06 con una supervivencia de 74 % para los
ápices y de 68 % para los nudos, y PM6 con una supervivencia de 57 % para los nudos. El genotipo RER tuvo el porcentaje de supervivencia más alto debido a que no mostró
pérdidas de explantes por contaminación, además de ser
uno de los que menos fenolización presentó, lo que lo hace
un genotipo potencial para su manejo in vitro.
Estos resultados concuerdan parcialmente con los obtenidos por Concepción et al. (2005) quienes reportaron que
la adición de 0.5 % de PVPP como antioxidante en el medio de cultivo fue efectivo para establecer explantes con
niveles más bajos de fenolización en el establecimiento
de yemas de guayabo Enana Roja Cubana. Sin embargo,
este genotipo cubano solo alcanzó 24 % de explantes con
leve fenolización. Estos resultados ratifican el uso de PVPP
como antioxidante que ha sido utilizado en guayaba (Ali et
al., 2003; Concepción et al., 2005; Pérez et al., 2002); adicionalmente Concepción et al. (2005) mencionaron que el
necrosamiento varía de acuerdo con el genotipo y que se
puede revertir con el uso de PVPP.
100.0
Al igual que para el caso de la oxidación, los explantes
tuvieron un comportamiento uniforme. Las diferencias
mostradas fueron atribuidas al genotipo y no al tipo de
a
ab
Explantes (%)
80.0
bc
60.0
c
c
40.0
a
a
20.0
ab sb
a
c
0.0
PM12
PM6
c
Baja
bc
CH.R.G
G 17-06
bc
bc
Media
Alta
RER
Genotipos
Figura 1. Fenolización de explantes en cinco genotipos de guayabo mediante el uso de PVPP como antioxidante, 10 d
después de su establecimiento in vitro. Medias entre genotipos con letras iguales no son estadísticamente diferentes
(Tukey, 0.05).
Supervivencia (%)
100
80
abc abc
a a
ab
abc abc
bc
c
60
bc
40
Ápice
Nudo
20
0
PM12
PM6
CH.R.G
G 17-06
RER
Genotipos
Figura 2. Supervivencia de dos tipos de explantes de cinco genotipos de guayabo a los 10 d después de su establecimiento in vitro. Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey,0.05).
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explante, por lo que se pueden utilizar tanto ápices y nudos
para el establecimiento de los cultivos in vitro. El uso del
hipoclorito de calcio como desinfectante para estos genotipos sustituye al bicloruro de mercurio que es el desinfectante mayormente utilizado para guayabo (Concepción et
al., 2005; Mishra et al., 2007a; Ocampo y Núñez, 2007), los
procesos de oxidación son causados principalmente por el
efecto abrasivo del agente desinfectante (Abdelwahd et al.,
2008; Van Staden et al., 2006).
mayor tamaño a una concentración de 0.5 mg L-1 y pudieron ser separados del brote inicial.
Los resultados indican que cada genotipo respondió de
diferente manera a los reguladores de crecimiento, por lo
cual es importante el establecimiento de protocolos específicos para cada genotipo, lo que confirma lo reportado por
Papadatou et al. (1990) y Ali et al. (2003) en el sentido de
que los niveles de citocininas son los más críticos para la
multiplicación de muchos de los árboles tropicales, entre
las cuales BAP es comúnmente la más usada en la propagación de guayabo.
Experimento 2. Multiplicación
Fase 1. Efecto de bencilaminopurina. En el Cuadro 1 se presentan los valores promedio de las variables en estudio,
para tres genotipos de guayabo. La longitud inicial del brote y número de nudos fueron estadísticamente igual para
todos los tratamientos. Transcurridos 30 d de incubación
la respuesta de los tres genotipos fue diferente para las
concentraciones de BAP, y el genotipo CHRG respondió favorablemente a la concentración de 1.0 mg L-1, tratamiento
en donde se observó la mayor longitud de brotes (de 1.04
a 1.37 mm) con respecto al testigo. El genotipo PM12 presentó una mejor respuesta a la concentración de 0.5 mg L-1
ya que las variables número de brotes y coeficiente de multiplicación tuvieron los mayores valores (2.41 y 2.83, respectivamente). El genotipo PM6 mostró mayor respuesta a
una concentración de 2.0 mg L-1 para la variable número de
brotes (2.17); sin embargo, el coeficiente de multiplicación
tuvo mejor comportamiento con una concentración de 0.5
mg L-1 (2.05), lo que se debió a que los brotes tuvieron un
Una exitosa regeneración in vitro depende del control de
la morfogénesis, la cual se influye por diversos factores
como el tipo de explante, la composición del medio de cultivo, los reguladores de crecimiento y el ambiente durante
la incubación (Rai et al., 2010). El éxito de la micropropagación en especies arbóreas difíciles y recalcitrantes depende
principalmente de la calidad de los explantes, calidad que
está determinada en gran medida por el genotipo, el estado
fisiológico del tejido y la época del año en que se colectaron
(Giri et al., 2004).
Fase 2. Efecto de la adenina y el sulfato de adenina. En el Cuadro
2 se observan los valores promedio de las variables evaluadas para cinco genotipos de guayabo. Las diferencias estadísticas encontradas dependen en gran medida de la respuesta de los genotipos a los diferentes tratamientos. Para
el genotipo PM6 su comportamiento promedio fue mejor
Cuadro 1. Efecto promedio de la concentración de bencilaminopurina en la multiplicación in vitro de brotes de guayabo de
los cvs. Chapeada Roja Grande, PM12 y PM6, a los 30 d después de aplicados los tratamientos.
Tratamiento (genotipo-mg L-1)
LBI (mm)
NN
NB
CHRG – 0.5 (T)
14.3 a
2.46 a
1.04 c
4.4 c
1.29 ab
CHRG – 1.0
16.7 a
2.83 a
1.37 bc
4.9 abc
1.29 ab
CHRG – 1.5
15.7 a
2.95 a
1.37 bc
5.2 abc
1.21 b
CHRG – 2.0
15.2 a
2.83 a
1.08 c
3.4 c
1.12 b
PM12 + 0.5 (T)
14.1 a
3.00 a
2.41 a
9.7 ab
2.83 a
PM12 + 1.0
16.0 a
2.87 a
2.16 ab
8.6 abc
2.21 ab
PM12 + 1.5
15.0 a
2.66 a
1.87 abc
10.4 a
2.33 ab
PM12 + 2.0
16.0 a
3.00 a
2.08 ab
8.1 abc
2.08 ab
PM6 + 0.5 (T)
14.0 a
2.61 a
1.61 abc
9.4 ab
2.05 ab
PM6 + 1.0
14.3 a
2.77 a
1.94 abc
6.3 abc
1.89 ab
PM6 + 1.5
13.2 a
2.44 a
1.94 abc
5.6 abc
1.22 b
PM6 + 2.0
15.1 a
2.72 a
C.V.
12.00
8.18
2.17 ab
21.34
LB (mm)
5.2 abc
34.76
CM
1.61 ab
35.64
T : testigo; LBI: longitud del explante inicial; NN: número de nudos; NB: número de brotes; LB: longitud de brotes; CM: coeficiente de multiplicación;
C.V.: coeficiente de variación. Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).
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PROPAGACIÓN in vitro DE Psidium guajava L.
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cuando se desarrolló en medio de cultivo enriquecido con
30 mg L-1 de adenina, ya que el número de brotes aumentó
de 1.61 a 3.54 con respecto al testigo, e igualmente el coeficiente de multiplicación aumentó de 2.02 a 3.5. El genotipo PM12 también se comportó mejor en presencia de la
misma concentración de adenina, pues la longitud de los
brotes aumentó de 97 a 180 mm con respecto al testigo, y
el coeficiente de multiplicación aumentó de 2.83 a 4.31. El
genotipo 17-06 presentó una mayor respuesta al sulfato
de adenina como precursor de citocininas.
reportaron que el uso en combinación de citocininas como
BAP y kinetina (Kin) aumentan la proliferación de brotes
axilares a partir de segmentos nodales de guayabo, lo cual
se debe al sinergismo de las citocininas; de igual manera,
reportaron que el número de brotes por explante aumentó
significativamente cuando el medio de multiplicación fue
enriquecido con sulfato de adenina; así mismo mencionan
que la adición de 0.1 mg L-1 de BAP, Kin y sulfato de adenina
produjo en promedio 6.33 brotes de 3.23 cm de longitud, lo
que representa seis veces más brotes que con el uso de
las citocininas de manera individual.
Con una concentración de 20 mg L-1 la variable número
de brotes aumentó de 1.83 a 2.54 con respecto al testigo,
mientras que la mayor longitud de brotes se obtuvo con
una concentración de 15 mg L-1 de sulfato de adenina, y el
coeficiente de multiplicación está altamente influenciado
por las otras variables. El genotipo CHRG se vio afectado
en el número de brotes cuando se añadió una concentración de 40 mg L-1 de adenina con valores por debajo del
testigo, mientras que con una concentración de 15 mg L-1
de adenina se aumentó la longitud de los brotes de 44 a
92 mm y su coeficiente de multiplicación se elevó a 2.71.
Por otro lado, el genotipo RER mostró un mejor comportamiento promedio al desarrollarse en medio adicionado con
sulfato de adenina 40 mg L-1, donde las variables NB, LB y
el CM tuvieron los valores más altos (2.15, 105 mm y 3.40,
respectivamente).
Por otro lado, Singh et al. (2002) cultivaron brotes en
medio adicionado con 0.2 mg L-1 de BAP y 10 mg L-1 de
sulfato de adenina, para aumentar el número de brotes de
guayabo cv. Allahabad Safeda. Sus resultados coinciden
con lo observado en los cinco genotipos aquí evaluados,
que con la adición de adenina y sulfato de adenina aumentaron significativamente tanto el número como la longitud
de los brotes. El uso de sulfato de adenina por sí solo fue
reportado por Bantawa et al. (2009) en Picrorhiza scrophulariiflora Pennel, en donde se mostró una tasa de multiplicación de 3 hasta 18 brotes por explante con 25 a 100
mg L-1; sin embargo, la respuesta no cambió al usar bajas
(25 mg L-1) o altas concentraciones (400 mg L-1), sino que
fue el sinergismo con otras citocininas lo que condujo a
una respuesta favorable. Altas concentraciones de BAP y
en general de citocininas (>100 mg L-1) provocan que en
los nuevos órganos que se forman ocurran anormalidades
como la generación de callo o el necrosamiento de los tejidos (Singh et al., 2002).
La adenina exhibe actividad similar a las citocininas
sobre el desarrollo de brotes axilares, como lo describe
Wróblewska (2012) en esquejes de Fuchsia hybrida; sin
embargo, no muestra los efectos inhibitorios del enraizamiento típicos de las citocininas. Resultados similares se
encontraron en la etapa de multiplicación in vitro de brotes
de guayabo, pues al adicionar adenina o sulfato de adenina
los brotes emitieron raíces y el desarrollo de los brotes no
fue significativo.
Nandagopal y Kumari (2006) en Chichorium intybus L.
cv. Focus también reportaron que al adicionar sulfato de
adenina en la etapa de multiplicación favoreció el aumento
en la longitud de los brotes, al pasar de 2.66 y 3.50 cm a
una longitud de 5.5 y 5.9 cm respectivamente en presencia
de ese compuesto. De igual manera encontraron que para
esta especie el mayor porcentaje de brotes se produjo con
la adición de 1.5 mg L-1 de BAP + 0.5 mg L-1 de AIA y 0.25
mg L-1 de sulfato de adenina. Por otro lado, para guayabo
Biswas et al. (2007) y Singh et al. (2002) recomiendan la
combinación de citocininas para mejorar la inducción de
mayor brotación y aumentar su longitud.
La superioridad de BAP en la inducción de brotes se atribuye a la capacidad de los tejidos vegetales para responder
a esta citocinina más rápidamente que a otros reguladores
sintéticos, o de inducir la producción de hormonas naturales como la zeatina dentro del tejido (Malik et al., 2005). El
control hormonal del crecimiento y desarrollo vegetal ha
sido atribuido no sólo a la concentración sino a la sensibilidad propia de los tejidos en el sitio de acción (Gaspar et al.,
2003). Otros aditivos del medio de cultivo que sirven para
mejorar el crecimiento incluyen la sacarosa y el sulfato de
adenina (Singh et al., 2002), que tienen efecto significativo
en la multiplicación y elongación de brotes.
Experimento 3. Enraizamiento
Se encontraron diferencias altamente significativas para
los diferentes genotipos con una aportación relativa de 72
% para la variable longitud de raíces, mientras que para el
tipo de auxina se encontró diferencia significativa en las
variables número de raíces con una aportación relativa de
38 % en porcentaje de enraizamiento. Por otro lado la concentración de auxina influyó significativamente solamente
Aunque en la mayoría de los protocolos de propagación
in vitro de guayabo los materiales vegetales muestran una
mejor proliferación con el uso de BAP, Biswas et al. (2007)
290
DOMÍNGUEZ-PERALES et al.
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3) 2016
Cuadro 2. Efecto promedio de la concentración de adenina (A) y sulfato de adenina (S) en la multiplicación in vitro de brotes de guayabo de los cvs. PM6, PM12, 17-06, CHRG y RER, a los 30 d después de aplicados los tratamientos.
Tratamiento (genotipo-precursor-mg L-1)
LBI (mm)
NN
PM6 Test.
14.0 i
2.61 ij
1.61 efghijk
9.4
2.05 fgh
A 15
28.2
3.77
3.02
11.0
3.31
A 20
26.8
3.45
2.88
9.3
3.22
A 30
25.3
3.48
3.54 a
9.3
3.51
A 40
28.0
3.28
2.57
7.8
2.88
S 15
30.2
3.68
3.14
6.9
2.20
S 20
33.5 a
4.26
1.76
6.1
2.46
S 30
32.4 a
4.34 a
3.05
5.8 fgh
2.65
S 40
30.4 abc
4.07
2.08
8.8
2.65
PM12 Test.
14.1 i
3.00 ghij
2.41
9.7
2.83
A 15
29.6
3.68
1.88
12.6
2.71
A 20
26.9
3.91 abcd
2.51
14.3
3.25
A 30
29.9 abcd
3.85
3.17
18.0 a
4.31 a
A 40
26.9
3.72
2.96
14.8
3.72
S 15
27.9
3.91 abcd
2.25
13.9
3.25
S 20
25.5
3.60
3.45 ab
14.3
4.22
S 30
26.5
3.88
2.79
14.1
3.74
S 40
26.9
3.77
3.25
15.8
4.14
17-06 Test.
16.0 ghi
2.83 hij
1.83
4.1 gh
1.83 gh
A 15
22.7
3.54
2.40
9.9
2.88
A 20
22.6
3.74
1.99
8.4
2.42
A 30
23.2
3.54
2.00
8.1
2.31
A 40
26.7
3.51
2.00
10.6
2.80
S 15
25.5
3.54
2.17
11.8
2.68
S 20
26.6
3.71
2.54
5.9
2.08
S 30
25.6
3.75
2.10
8.3
2.28
S 40
27.2
3.77
2.28
6.2
2.02
CHRG Test.
14.3 hi
2.46 j
1.04
4.4
1.29 h
A 15
25.9
3.00
1.40
9.2
2.71
A 20
28.0
3.12
1.12
9.2
2.56
A 30
25.2
3.04
1.40
8.0
2.56
A 40
29.6
3.16
0.64 k
4.1 gh
2.36
S 15
27.7
3.31
1.29
8.8
2.58
S 20
27.5
3.04
1.28
7.5
2.68
S 30
28.6
3.12
1.12
7.3
2.40
S 40
31.5 ab
3.32
1.28
9.1
2.76
RER Test.
19.8 fghi
3.46
1.26 hijk
3.1 h
2.26 efgh
A 15
22.1
3.30
1.40
5.5
2.35
A 20
20.2
3.05
1.95
8.5
2.85
A 30
23.0
3.10
1.35
9.3
3.10
291
NB
LB (mm)
CM
PROPAGACIÓN in vitro DE Psidium guajava L.
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3) 2016
Cuadro 2. Continua.
Tratamiento (genotipo-precursor-mg L-1)
LBI (mm)
NN
NB
LB (mm)
CM
A 40
23.0
3.20
1.45
8.5
3.00
S 15
20.1
3.05 ghij
1.45
10.3
2.85
S 20
23.5
3.30
1.50
7.1
3.20
S 30
23.2
3.25
1.85
8.2
3.20
S 40
21.5
3.20
2.15
10.5
3.40
C.V.
13.21
9.05
26.27
31.86
19.29
Test: testigo; LBI: longitud del explante inicial; NN: número de nudos; NB: número de brotes; LB: longitud de brotes; CM: coeficiente de multiplicación;
C.V.: coeficiente de variación. Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).
sobre la variable porcentaje de enraizamiento con una
aportación relativa de 43 %, mientras que la interacción de
los factores genotipo y concentración de auxina tuvo una
aportación de 14 %.
28 a 30 d, sin considerar la especie o la longitud de las raíces; pero esto puede ocasionar daños durante el trasplante e incrementar el estrés, y dificulta la aclimatación (Thomas y Schiefelbein, 2001). Por ello es importante conocer
el tiempo óptimo cuando se obtiene el mayor porcentaje
de enraizamiento y los explantes han producido el número
y longitud de raíces que faciliten su manejo sin afectar su
supervivencia in vivo.
Para cualquier protocolo de micropropagación, un enraizamiento exitoso de brotes es un requisito para facilitar
su aclimatación ex vitro (Pati et al., 2006). En guayabo la
iniciación de las raíces ha sido estimulada por la incorporación de AIB sólo o en combinación con ácido 1-naftalenacético (ANA), aunque también se ha logrado la inducción
en medio MS sólo (Rai et al., 2010). El tipo y la concentración de los reguladores de crecimiento empleados durante
el establecimiento y multiplicación in vitro, así como las
condiciones de desarrollo de los brotes y el genotipo son
factores que influyen en los requerimientos de auxinas en
el enraizamiento de guayabo (Ali et al., 2003).
El tiempo requerido para enraizamiento difirió entre
genotipos, y también se vio influido por el tipo y la concentración de la auxina. En el genotipo 17-06 las raíces
empezaron a emerger a partir de los 3 d en presencia
de AIB en una concentración de 5.9 mg L-1, sin alcanzar
100 % de brotes enraizados; en cambio con el uso de
AIA la respuesta fue a los 6 d y con la concentración de
3 mg L-1 se alcanzó 100 % de brotes enraizados en 12 d.
Para el genotipo PM6 la respuesta de la inducción empezó entre los 6 y 7 d con el tratamiento de 1.3 mg L-1
de AIB, dónde se consiguió 100 % de brotes enraizados
a los 11 d (Figura 4).
Los diferentes genotipos respondieron de manera diferente al tipo y concentración de la auxina. En la Figura 3
se muestra que en ausencia de auxinas (testigo) se obtuvieron altos porcentajes de enraizamiento entre 72 y 92
%, excepto para el cv. CHRG que fue de alrededor de 35 %.
Estos resultados difieren de los obtenidos por Mishra et
al. (2007b) quienes reportaron que para el cv. Allahabab
Safeda no se logró inducir enraizamiento en ausencia de
auxinas. El desarrollo de raíces en ausencia de reguladores
de crecimiento puede ser debido a la síntesis de auxinas
endógenas en cantidades necesarias para su desarrollo;
estas concentraciones de auxina varían de acuerdo con el
genotipo (Ali et al., 2003; Ocampo y Núñez, 2007).
En el genotipo CHRG los brotes empezaron a enraizar a
los 5 d en una concentración de 2.5 mg L-1 de AIA y con el
tratamiento de 3 mg L-1 de AIB se logró el 100 % de brotes
enraizados a los 14 d después de la inducción (Figura 5).
El desarrollo de raíces en los brotes del genotipo PM12 se
dio entre 7 y 8 d para los diferentes tratamientos; pero en
ninguno de los tratamientos alcanzó 100 % de brotes enraizados, ya que el valor más alto fue de 90 % que se logró
en presencia de 3 mg L-1 de AIB a los 12 d. El genotipo
RER fue el que más tardó en responder a la rizogénesis al
haber iniciado entre los 9 y 10 d. El tratamiento de 1.3 mg
L-1 de AIB fue con el que se obtuvo un mayor porcentaje de
brotes formando raíces adventicias (90 %) a los 14 d de
iniciados los tratamientos.
El porcentaje de enraizamiento, además de ser influido
por el genotipo, también es afectado por las condiciones
del cultivo (Couprie et al., 2000). Para el guayabo cv. Pant
Prabhart, Mishra et al. (2007a) obtuvieron 85 % de brotes
enraizados mediante el uso de una combinación de 0.4 mg
L-1 de AIB y 0.2 mg L-1 de ANA.
La emisión de raíces para los genotipos fue entre 6 y 8
d en promedio con los diferentes tratamientos, con excepción de RER, que fue entre 9 y 11 d. Estos resultados no
concuerdan con los obtenidos por Mishra et al. (2007b)
Generalmente el tiempo que se recomienda para hacer
el trasplante a suelo de las plantas micropropagadas es de
292
ab
abcd
abcde
abcde
abcde
abcde
abcd
ab
ab
ab
abcd
ab
a
abcde
abcde
abcde
abcde
abcd
ab
abcde
a
0.0 μmol L-1
0.0 AlA
14.5 AlA
25.0 AlA
6.6 AlB
14.5 AlB
25.0 AlB
cde
60.0
a
abcde
abcde
70.0
a
bcde
50.0
40.0
de
Enraizamiento (%)
80.0
abcde
bcde
90.0
a
abcde
abc
100.0
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3) 2016
ab
DOMÍNGUEZ-PERALES et al.
e
30.0
20.0
10.0
0.0
G 17-06
PM6
PM12
CH.R.G
Genotipo
RER
Figura 3. Efecto de la concentración (0, 6.6, 14.5 y 25.0 µmol L-1) y tipo de auxina (AIA y AIB) sobre el enraizamiento in vitro
de cinco genotipos de guayabo, a los 30 d después del inicio de los tratamientos. Barra con letras distintas, las medias
que difieren significativamente según ANOVA y prueba de Tukey, con α = 0.05.
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
1
3 5
7
Edad (d)
3 5
7
1
3 5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25
PM 6 (AlB)
Enraizamiento (%)
0.0 μmol L
6.6
14.5
29
9 11 13 15 17 19 21 23 25
Edad (d)
B)
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
Edad (d)
-1
1
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
C)
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
17-06 (AlB)
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
9 11 13 15 17 19 21 23 25
PM 6 (AlA)
Enraizamiento (%)
A)
Enraizamiento (%)
Enraizamiento (%)
17-06 (AlA)
D)
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
1
3 5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25
Edad (d)
Figura 4. Efecto del tipo y concentración de auxina sobre la cinética de enraizamiento de brotes de guayabo de los genotipos 17-06 (A y B) y PM6 (C y D).
293
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3) 2016
A)
CH.R.G. (AlA)
100
90
80
70
60
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
30
20
10
0
1
3
5
9
7
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
90
50
40
11
13 15
17
19
21
23 25
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
3
5
7
9
PM 12 (AlA)
80
70
60
50
40
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
RER (AlA)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
3
5
7
3
5
7
23 25
D)
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
RER (AlB)
100
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
80
70
60
50
40
30
20
10
0
F)
0.0 μmol L
6.6
14.5
29
-1
90
Enraizamiento (%)
Enraizamiento (%)
30
20
10
0
1
E)
0.0 μmol L
6.6
14.5
29
80
70
60
50
40
21
Edad (d)
-1
90
19
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
90
Edad (d)
100
13 15 17
PM 12 (AlB)
100
Enraizamiento (%)
Enraizamiento (%)
90
30
20
10
0
C)
0.0 μmol L-1
6.6
14.5
29
11
Edad (d)
Edad (d)
100
B)
CH.R.G. (AlB)
100
Enraizamiento (%)
Enraizamiento (%)
PROPAGACIÓN in vitro DE Psidium guajava L.
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
Edad (d)
Edad (d)
Figura 5. Efecto del tipo y concentración de auxina sobre la cinética de enraizamiento de brotes de guayabo de los genotipos CHRG (A y B), PM12 (C y D) y RER (E y F).
en donde el desarrollo de las raíces para el cv. Allahabab
Safed se dio a los 17 d en una concentración de 10 mg L-1
(49.2 µmol L-1) de AIB y a los 30 d con una concentración
de 25 mg L-1 (123 µmol L-1), lo que confirma la importancia
del factor genotipo.
emergencia de raíces mayores de 30 d.
CONCLUSIONES
El uso de polivinilpirrolidona en una concentración de
500 mg L-1 como antioxidante limitó la pérdida de explantes de guayabo, con un valor máximo de 30 % de explantes
con alta fenolización para el genotipo PM6, independientemente del tipo de explante utilizado.
La respuesta que tuvieron los genotipos en presencia
de AIA y AIB sugiere que el tiempo de inducción de 24 h
fue suficiente para conseguir buenos resultados, ya que
el desarrollo de las raíces se vio afectado por altas concentraciones de auxinas en el medio de cultivo y porque
las raíces estuvieron en contacto por tiempo prolongado,
como lo reportaron Mishra et al. (2007b) con tiempos de
Los genotipos tuvieron un comportamiento diferente en
las tres fases de su propagación in vitro evaluadas y su desarrollo varió con el medio de cultivo y con los reguladores
294
DOMÍNGUEZ-PERALES et al.
Rev. Fitotec. Mex. Vol. 39 (3) 2016
de crecimiento utilizados. Durante la fase de multiplicación, la adición de 0.5 mg L-1 de bencilaminopurina generó
mayores coeficientes de multiplicación para los genotipos
Chapeada redonda grande, Paluma12 y Paluma 6.
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La adición de precursores de citocininas favoreció el crecimiento y desarrollo de los brotes de los cinco genotipos.
La adenina en una concentración de 30 mg L-1 promovió
un mayor coeficiente de multiplicación para los genotipos
PM6 y PM12, mientras que el genotipo 17-06 tuvo una mejor respuesta en 15 mg L-1. La adición de sulfato de adenina en una concentración de 40 mg L-1 aumentó los coeficientes de multiplicación de los genotipos CHRG y RER.
La inducción del enraizamiento se logró de manera eficaz con la adición de AIA y AIB durante 24 h. La cinética de
enraizamiento mostró que el desarrollo de las raíces fue
más rápido con 1.3 mg L-1 de AIB para los genotipos PM6
y RER, mientras que para el cv.17-06 la respuesta fue más
rápida con 2.5 mg L-1 de AIA, y para los genotipos CHRG
y PM12 la concentración de 3 mg L-1 de AIB indujo mayor
respuesta.
Los resultados obtenidos resaltan la importancia de generar un protocolo de micropropagación para cada genotipo sobresaliente.
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