Salud Uninorte
ISSN: 0120-5552
saluduninorte@uninorte.edu.co
Universidad del Norte
Colombia
De la Cruz Rocha, Edwin; Figueredo, Luisa Paola; Gómez, Johana; Jiménez, Idalith; Montes, Ilinka;
Roca, Sergio; Vergel, Gabriela
Comparación del efecto citotóxico de tres agentes quelantes sobre fibroblasto del ligamento
periodontal humano. Estudio in vitro
Salud Uninorte, vol. 28, núm. 3, septiembre-diciembre, 2012, pp. 402-410
Universidad del Norte
Barranquilla, Colombia
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artículo original / ORIGINAL
ARTICLE
Comparación del efecto citotóxico de tres agentes
quelantes sobre fibroblasto del ligamento
periodontal humano. Estudio in vitro
Comparison of the cytotoxic effect of three
chelating agents on human periodontal
ligament fibroblast. In vitro study
Edwin De la Cruz Rocha1, Luisa Paola Figueredo2, Johana Gómez3,
Idalith Jiménez3, Ilinka Montes3, Sergio Roca3, Gabriela Vergel3
Objetivo: Comparar in vitro el efecto citotóxico de tres agentes quelantes sobre fibroblastos del ligamento periodontal humano.
Materiales y métodos: Se utilizaron cultivos de fibroblastos de ligamento periodontal
humano, los cuales fueron colocados en contacto con los agentes quelantes a evaluar (RCPrep, Glyde, EDTA al 17%) a intervalos de 15, 30 y 60 minutos. Se midió la absorbancia
para cada uno de los grupos, para determinar el grado de actividad enzimática, que es
indicador de muerte celular. Previo a la cuantificación de la absorbancia se corroboró microscópicamente la formación de los cristales de formazán, los cuales se forman alrededor
de los fibroblastos, y su presencia es indicador de integridad de la membrana y de la actividad metabólica. Por microscopia se verificó la formación de cristales de formazan, después
de agregar azul de tripán.
Resultados: El Glyde mostró mayor grado de citotoxicidad, con una diferencia estadísticamente significativa, al compararlo con EDTA 17% y el RC-PREP. El EDTA presentó
mayor citotoxicidad que el RC-PREP a los 15minutos, evento que cambió a los 30 y 60
minutos.
Conclusiones: Los agentes quelantes RC-Prep, Glyde y EDTA tienen un efecto citotóxico
a nivel de los fibroblastos del ligamento periodontal, siendo el EDTA el de menor efecto
citotóxico a los 30 y 60 minutos comparado con RC-Prep y Glyde
Palabras clave: Agentes quelantes, fibroblastos, citotoxicidad, ligamento periodontal, MTT.
Odontólogo endodoncista, Coordinador Posgrado de Endodoncia Fundación Universitaria San Martín, Barranquilla (Colombia)
2
Ingeniera Biotecnóloga, coordinadora laboratorio ciencias básicas básicas. Universidad San Martín,
Barranquilla (Colombia)
3
Odontólogo endodoncista, Universidad San Martín, Barranquilla (Colombia).
Correspondencia: Edwin De la Cruz Rocha, Fundación Universitaria San Martín, Km 8, vía Puerto
Colombia, Barranquilla. edwincrr@hotmail.com
Fecha de recepción: 11 de junio de 2012
Fecha de aceptación: 26 de agosto de 2012
Resumen
1
402
Vol. 28, N° 3, 2012
ISSN 0120-5552
Salud Uninorte. Barranquilla (Col.) 2012; 28 (3): 402-410
Comparación del efecto citotóxico de tres agentes quelantes sobre
fibroblasto del ligamento periodontal humano. Estudio in vitro
Abstract
Objectives: To compare in vitro, the cytotoxic effect of three chelating agents on human
periodontal ligament fibroblasts, RC-Prep, Glyde and EDTA.
Methods: Fibroblast cultures of human periodontal ligament were used, which are placed
in contact with chelating agents to evaluate (RC-Prep, Glyde, 17% EDTA) at time intervals of 15,30 and 60 minutes. Absorbance was measured for each group to determine the
degree of enzyme activity, which is an indicator of cell death. Prior to the measurement
of absorbance was confirmed microscopically, the formation of formazan crystals, which
are formed around fibroblasts, and its presence is an indicator of membrane integrity and
metabolic activity. Microscopy verified the formation of formazan crystals, after adding
trypan blue.
Results: Glyde showed greater cytotoxicity with a statistically significant difference when
compared with 17% EDTA and RC-PREPchelants. The EDTA showed higher cytotoxicity
than the RC-PREP to 15min, and that event changed at 30 and 60 minutes.
Conclusion: It was shown experimentally that the chelating agents RC-Prep, EDTA and
Glyde have a cytotoxic effect at the periodontal ligament fibroblasts. EDTA has a lowest
cytotoxic effect at 30 and 60 minutes compared to RC-Prep and Glyde.
Keywords: Chelating agents, fibroblasts, cytotoxicity, periodontal ligament, MTT.
INTRODUCCIÓN
Los materiales usados en endodoncia frecuentemente son colocados en contacto íntimo con el tejido duro y blando del periodonto. Esto es particularmente cierto para
las sustancias usadas como material de preparación, desinfección e irrigación de conductos y cementos selladores. Por lo tanto,
es esencial que un material sea biocompatible con los tejidos circundantes (1).
Dentro de estos materiales se encuentran los
quelantes, sustancias que juegan un papel
importante en el debridamiento de conductos, ya que cumplen la función de facilitar
la preparación biomecánica, al desintegrar
tanto el barrillo dentinal (smear-layer) como
el componente calcificado y mineralizado
de las paredes dentinales. (2,3).
Los agentes quelantes son moléculas que
se basan en el ácido etilen-diamino tetracético (EDTA) (4). El mejoramiento de las
materiales dentales le ha permitido al ácido
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etilendiaminotetracético ser combinado con
sustancias como el peróxido de hidrógeno,
el cual confiere actividad efervescente al
ser mezclado con el hipoclorito de sodio, lo
cual facilita la eliminación de detritus remanentes de la instrumentación (4-6).
La sustancia quelante reacciona con los iones metálicos en los cristales de hidroxiapatita, para producir un quelato metálico,
el cual reacciona con las terminaciones del
agente quelante al remover los iones de
calcio de la dentina, formando un anillo, la
dentina se reblandece, cambiando las características de solubilidad y permeabilidad
del tejido, especialmente la dentina peritubular, rica en hidroxiapatita, incrementando el diámetro de los túbulos dentinales
expuestos. El quelante también tiene una
gran afinidad por los álcalis ferrosos de la
estructura dental (7,8).
Un material quelante adecuado debe poseer
diversas propiedades, entre las cuales se
destaca el ser solvente de tejidos y detritos,
403
Edwin De la Cruz Rocha, Luisa Paola Figueredo, Johana Gómez,
Idalith Jiménez, Ilinka Montes, Sergio Roca, Gabriela Vergel
tener baja toxicidad, baja tensión superficial
y un mecanismo de dosificación simple.
selección y tiempo de uso de las sustancias
quelantes como EDTA, RC-Prep y Glyde.
Durante la instrumentación y conformación
del conducto radicular, el uso de agentes
quelantes es constante, entrando en contacto con el ligamento periodontal, que es un
tejido conectivo blando, muy vascularizado, inervado y con alto contenido celular.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los agentes quelantes como sustancias
coadyuvantes en el tratamiento endodóntico son de amplia comercialización; se encuentra el EDTA en solución acuosa al 17%,
RC-Prep y Glyde. Sin embargo, una revisión de la literatura científica acerca de los
posibles efectos citotóxicos de estos a nivel
de los fibroblastos del ligamento periodontal mostró pocos estudios relacionados con
los efectos citotóxicos de dichas sustancias.
Para este estudio se utilizaron fibroblastos
de ligamento periodontal humano pertenecientes al grupo de investigación ReGentech S.A. (Bogotá, Colombia), los cuales se
encontraban criopreservados (tubos de cuello inclinado de poliestireno).
Este trabajo tiene como objetivo comparar
el efecto citotóxico del RC-Prep, Glyde y
EDTA sobre cultivos de fibroblastos del ligamento periodontal a 15, 30 y 60 minutos de
exposición, con el fin de brindar a la comunidad odontológica la posibilidad de usar
estos agentes con fines terapéuticos y la menor citotoxicidad, es decir, mejor seguridad
para el paciente.
En atención a lo descrito y teniendo en
cuenta la necesidad que asiste a toda la comunidad de endodoncistas por construir
conocimientos relacionados con su objeto
de trabajo y estudio, el tratamiento endodóntico, y ante los pocos estudios científicos que permitan demostrar el potencial
efecto citotóxico de las sustancias EDTA
10%, RC-Prep y Glyde como quelantes, se
justificó la realización de esta investigación,
cuyos resultados contribuirán a la toma de
decisión de los endodoncistas en cuanto a la
404
A partir de un modelo cuantitativo y cualitativo se realizó un tipo de investigación
explicativo, con un diseño experimental in
vitro desde las ciencias básicas.
Para su descongelación, los tubos de criopreservación fueron sumergidos al baño
María, a 20 grados centígrados, por cinco
minutos.
Luego se agregó tripsina al cultivo, para
lograr la desagregación y desprendimiento de las células adheridas a la superficie.
Los fibroblastos fueron resuspendidos en
un medio de cultivo denominado DMEM e
incubados a 37°C y 5% de CO2.
Por medio de una técnica de calibración se
obtuvieron subcultivos de 30 000 células, en
cajas de cultivos Corning, las cuales tienen
una capacidad de 96 pozuelos y un área de
25 cm2.
Después de 24 horas de establecido el cultivo, el medio fue cambiado para agregar
cada agente quelante a evaluar por la sustancia denominada tritón X-100, la cual fue
utilizada como control positivo. Se utilizó
una réplica sin estímulo considerada como
control negativo.
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Comparación del efecto citotóxico de tres agentes quelantes sobre
fibroblasto del ligamento periodontal humano. Estudio in vitro
Cada agente quelante (EDTA, RC-Prep y
Glyde) fue evaluado a un intervalo de 1530-60 minutos y una cantidad de 10UL (microlitros).
Una vez cumplido el tiempo para cada
agente quelante, estos fueron reemplazados
en el cultivo por MTT (tinta de tetrazolium)
disuelto en DMEM fresco, a una concentración de 0.5 mg/ml y se incubó a una temperatura de 37°C, atmósfera húmeda y 5%
de CO2 por un tiempo de 2 horas. Posteriormente fueron sometidos a la cuantificación
de la absorbancia, por espectrofotometría,
a temperatura ambiente y a una longitud
de 570 nm, sustracción del ruido de fondo
a 630 nm en el lector de Elisa (Star Fox 2100,
awareness).
Previo a la cuantificación de la absorbancia
se corroboró microscópicamente la formación de los cristales de formazán, los cuales
se forman alrededor de los fibroblastos y su
presencia es indicador de integridad de la
membrana y de la actividad metabólica (ver
figura A). Estos cristales de formazán fueron disueltos por dimetilsulfóxido (DMSO).
Una vez obtenida la absorbancia de cada
uno de los grupos estudiados, se procedió a
realizar tinciones con azul de tripán y su observación microscópica. Este procedimiento
de tinción se realiza aplicando el azul de tripán diluido en DMEM.
Para el caso de la evaluación con azul de
tripán, las células que no presentan daño o
alteraciones estructurales no se tiñen, mientras que las que presentan daño estructural
presentan una tinción a nivel citoplasmático y nuclear, lo cual demuestra la pérdida
de integridad (ver figura B).
El análisis estadístico se realizó con el programa STATGRAFIC PLUS utilizando indicadores descriptivos y de asociación. Para
comparar nuestros datos y complementarlo
con un análisis de varianza (ANOVA) con
un nivel de significancia menor o igual a
0.05. (ver tabla 1).
Fuente: Propiedad de los autores.
Figura A
Figura B
Formación de cristales de formazán en fibroblastos tratados con Glyde al
10% durante 15 minutos (figura A) y blanco (figura B).
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Tabla 1. Quelantes vs. absorbancia y viabilidad celular
Fuente: Datos tabulados por autores.
RESULTADOS
Glyde
Lo observado durante la exposición de los
fibroblastos al Glyde es que es un agente
nocivo a una concentración de 10% y de
manera diferencial durante tiempos distintos (15, 30 y 60 min). Con este agente se
observó una muerte celular rápida desde
los primeros tiempos de evaluación, siendo
respaldado tanto por azul de tripán como
por la prueba de MTT.
En la prueba de viabilidad de MTT, todos
los valores de evaluación resultaron muy
similares a los valores del control con TritonX100, de lo cual se deduce que la viabilidad fue muy baja para este tratamiento. Estos datos fueron corroborados con las fotografías de formación de cristales de formazán antes de ser disueltos por DMSO, donde
no se observó ninguna clase de cristal en el
tratamiento en comparación con el control
blanco, donde fue totalmente evidente la
formación de los mismos.
La evaluación por azul de tripán presentó
los mismos resultados, donde existe tinción
406
masiva de células en todos los tiempos evaluados, mostrando así que el quelante indujo daños severos en la membrana de las células, produciendo baja viabilidad celular.
EDTA
Con esta sustancia se observó un incremento de muerte a través del tiempo, pero con
bajas tasas de viabilidad desde el principio,
siendo respaldado tanto por azul de tripán
como por la prueba de MTT.
En la prueba de viabilidad de MTT, todos
los valores de evaluación son parecidos a
los del control con TritonX100, pero con
una tendencia a acercarse más a este a través del tiempo, de lo cual se deduce, para
este tratamiento, que supera a lo obtenido
por Glyde; pero aun así son muy bajos los
valores de viabilidad para determinar que
es el más efectivo. Estos datos fueron corroborados con las fotografías de formación de
cristales de formazán antes de ser disueltos por DMSO, donde se observó una baja
formación de cristales en el tratamiento en
comparación con el control blanco, donde
fue abundante la formación de los mismos.
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Comparación del efecto citotóxico de tres agentes quelantes sobre
fibroblasto del ligamento periodontal humano. Estudio in vitro
La evaluación por azul tripán reflejó los
mismos resultados, donde existe tinción
masiva de células en todos los tiempos evaluados, mostrando así que el quelante indujo daños severos en la membrana de las células, produciendo baja viabilidad celular.
RC – Prep
tos por DMSO, donde se observó una baja
formación de cristales en el tratamiento en
comparación con el control blanco, donde
fue abundante la formación de los mismos,
mientras que los dos tiempos restantes presentan, así como en el EDTA, una tendencia
a decrecer conforme el tiempo avanza.
El tercer y último tratamiento por analizar
fue RC-Prep. Con este agente se observó la
menor mortalidad de los tres materiales en
el primer tiempo de evaluación, sugiriendo
que es el quelante menos dañino en un periodo de tiempo corto (15min), siendo respaldado tanto por azul de tripán como por
la prueba de MTT.
La evaluación por azul de tripán refleja los
mismos resultados, y se observó tinción
masiva de células en los tiempos de 30 y 60
minutos. A diferencia de lo observado en el
primer tiempo de evaluación, el cual mostró una baja tinción de células, mostrando
así que el quelante indujo daños severos en
la membrana en periodos de tiempos posteriores a los de 15 minutos.
En la prueba de viabilidad de MTT para este
tratamiento, el valor inicial (15 minutos) fue
el mejor resultado entre los diferentes tiempos de tratamiento; estos datos fueron corroborados con las fotografías de formación
de cristales de formazán antes de ser disuel-
En este estudio se demostró de manera experimental que los agentes quelantes más
comunes en el mercado, el RC-Prep, Glyde
y EDTA, tienen un efecto citotóxico a nivel
de los fibroblastos del ligamento periodontal (ver gráfica 1).
Absorbancia
Comparacion de tratamientos
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
15 MINS
30 MINS
60 MINS
Glyde
EDTA
Rcprep
triton
blanco
Tratamientos
Fuente: Elaborado por los autores.
Gráfica 1. Comparación de materiales vs. absorbancia y tiempo
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Idalith Jiménez, Ilinka Montes, Sergio Roca, Gabriela Vergel
DISCUSIÓN
Variadas investigaciones han estudiado citotoxicidad de los diferentes materiales que
se usan en los tratamientos odontológicos.
Vasudev y cols. (9), utilizando la prueba de
MTT, demostraron los efectos citotóxicos del
EDTA sobre una línea celular de fibroblastos
(V79) al ser comparado con ácido maleico.
Este estudio corrobora la citotoxicidad del
ácido etilendiamino tetracético como componente fundamental de todos los agentes
quelantes.
Existen diversos métodos empleados en
estudios de evaluación de la citotoxicidad,
entre los cuales hay muchos que no ofrecen
respuestas satisfactorias, ya sea porque no
son análogos con la clínica o por limitaciones intrínsecas de la prueba (10-11).
El ensayo de MTT se basa en la reducción
metabólica del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo) -2,5-difeniltatrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato
deshidrogenasa en un compuesto coloreado de azul (formazán), permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de
las células tratadas.
La prueba de MTT es una técnica muy utilizada para medir la citotoxicidad de algunos materiales dentales, por poseer ventajas
como simplicidad, rapidez y repetitividad;
además es una técnica que permite evaluar
el efecto de determinada molécula sobre el
número de células y sobre su actividad metabólica (12). En este estudio, para evaluar
la efectividad de la técnica de MTT se tomó
un cultivo como control positivo, al cual se
le agregó tritón, que es un agente citotóxico
comprobado. De igual forma, se corrobora-
408
ron los hallazgos espectrofotométricos con
los microscópicos, evidenciados con la tinción a base de azul de tripán(13).
Diversas líneas de fibroblastos de ligamento periodontal humano han sido utilizadas
para evaluar la citotoxicidad de diversos
materiales endodónticos (14,15).
La permanencia de residuos de agentes
quelantes tendría un efecto citotóxico prolongado sobre las células del ligamento periodontal.
El Glyde como agente quelante presentó
una diferencia estadísticamente significativa
en comparación con el EDTA al 17% y el RCPrep, mostrando mayor citotoxicidad, independientemente del intervalo de tiempo, y
no se encontró referencia literaria de estos
hallazgos con respecto a la composición química de cada uno de los agentes estudiados.
No se encontró reporte literario sobre la
cantidad de agente quelante utilizado y su
relación con la citotoxicidad.
Se encontró que a los 15 minutos, el RCPREP resultó ser el quelante con mejor
comportamiento, comparado con el EDTA
y Glyde, sin embargo, el EDTA tiene menor
efecto citotóxico a los 30 y 60 minutos comparado con RC-Prep y Glyde.
El Glyde tuvo un comportamiento agresivo,
comparado con el TRITON, desde el inicio
del experimento, con un detrimento de la
absorbancia comparado con los quelantes
EDTA y RC-PREP.
La viscosidad de cada uno de los agentes
quelantes podría ser una variable incidente
en los resultados del estudio, teniendo en
cuenta que de los tres agentes quelantes uti-
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Comparación del efecto citotóxico de tres agentes quelantes sobre
fibroblasto del ligamento periodontal humano. Estudio in vitro
lizados el que menor viscosidad presenta es
el EDTA al 17% en solución acuosa. Siendo
este el primer agente en entrar en alcanzar
el tercio apical comparado con los otros dos
agentes quelantes estudiados. Variable que
también incide en la eliminación del mismo,
haciéndose más difícil de eliminar el Glyde
y el RC-PREP, presentándose una mayor adhesión de estos agentes quelantes a las paredes del conducto radicular, manteniendo
una actividad prolongada, como también el
efecto citotóxico sostenido.
La importancia de conservar una longitud
de trabajo constante durante la instrumentación endodóntica como la integridad de la
constricción apical es un factor determinante para disminuir el contacto de los agentes
quelantes con los tejidos periapicales.
CONCLUSIÓN
El uso de agentes quelantes es indispensable
para eliminación del Smear Layer durante la terapia endodóntica. Los tres agentes
quelantes evaluados en este estudio presentaron cierto grado de citotoxicidad, siendo
el más citotóxico el Glyde, en los diferentes
intervalos de tiempo. El EDTA, por su baja
viscosidad, puede ser utilizado al final de
la preparación químico-mecánica, debido
a que su eliminación del conducto radicular es más fácil que los otros dos agentes
quelantes utilizados, logrando el efecto de
eliminación de Smear Layer y un daño mínimo a los tejidos periapicales.
un mayor número de pruebas, teniendo en
cuenta las variables anteriormente mencionadas. Principio del formulario.
Financiación: Universidad San Martín (Colombia).
Conflicto de interés: Ninguno.
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Esta investigación fue realizada en condiciones de laboratorio, sin tener en cuenta las
condiciones clínicas como tensión superficial, viscosidad y pH, por lo que se sugiere
continuar con esta investigación realizando
(9) VasuvetBallal N, Kundabala M, Seetharama
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of EDTA and maleic acid: Root canal irrigants. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
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