Artículos originales Ligamento Periodontal Humano: comportamiento de sus células en cultivo in-vitro frente a un andamio tisular utilizado para reparar defectos óseos G. Di Fabio de Cosso1; M.C. Nacucchio2; W. Zabala3; A. A.Cosso4 INTRODUCCIÓN En los últimos años, la reconstrucción del hueso perdido se ha convertido en un tema de vital importancia para el éxito del tratamiento regenerativo odontológico. Su uso fue incrementándose desde sus comienzos en el tratamiento periodontal o la cirugía oral, hasta últimamente, en la terapia implantológica.1 Por otra parte la investigación de biomateriales compatibles se ha visto inundada de opciones desde hace un tiempo, sobre todo cuando se habla de reconstrucción de defectos óseos. La controversia en el uso de cada uno, y el soporte más viable para ser utilizado como andamio, son cuestiones que aún quedan por resolver pero reservadas a la discusión entre los odontólogos periodoncistas e implantólogos, especialistas en la materia, ya que escapan al alcance de este trabajo. En tal sentido, se consideró adecuado elegir una de estas propuestas actuales- una sustancia utilizada comúnmente como andamio de defectos óseos- para diseñar el estudio con aplicación de una biotecnología, a fin de observar el comportamiento de un cultivo celular frente al mismo. Para ello se eligió una metodología ampliamen- 1. 2. 3. 4. te descripta en la bibliografía- el cultivo de células2- para estudiar in vitro a la célula protagonista de todo proceso de reparación tisular: el fibroblasto. Estas células son elementos tejido-específicos que normalmente degradan y sintetizan constantemente los diferentes elementos de la matriz extracelular (MEC), pero también remodelan los tejidos en reparación.3 INGENIERÍA TISULAR El término ingeniería tisular fue acuñado por Fung en 1987 para designar a un área en expansión que está asentada en los conocimientos básicos de la histología y tiene por objetivo la construcción de tejidos nuevos, funcionalmente activos, a partir de células procedentes de cultivos y de biomateriales que sirven de soporte. Desde hace sólo veinte años, aproximadamente, se piensa en la construcción de tejidos biológicos artificiales y su utilización terapéutica para restaurar, sustituir o incrementar las actividades funcionales de los propios tejidos orgánicos.5 Farmacéutica. Lic. en Industrias bioquímico- farmacéuticas (UBA). Docente e investigadora de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad J. A. Maza (Mendoza). Doctor en Farmacia. Profesor Asociado Cátedra de Farmacotecnia Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA Odontólogo. Doctor en Medicina. Docente Cátedra de Histología Facultad de Odontología. UNCuyo Odontólogo. Especialista en Periodoncia. Docente Cátedra de Estomatología. Facultad de Odontología. UNCuyo 30 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 Artículos originales Actualmente, la ingeniería tisular se puede llevar a cabo utilizando tres tipos de estrategias diferentes: a. Ingeniería tisular por transferencia celular (terapia celular) En esta estrategia las células son primero aisladas, mantenidas y tratadas in vitro y con posterioridad se inyectan en la circulación sanguínea o implantan en determinadas localizaciones del organismo. para poder de ese modo, suplir la deficiencia estructural o funcional que se hubiera podido producir en este tipo de células. La transferencia de condrocitos autólogos para la reparación o sustitución de cartílago articular o de células madre hematopoyéticas del cordón umbilical y de médula ósea, son algunos ejemplos de la utilización de este tipo de estrategia. b. Ingeniería tisular por conducción La construcción de un nuevo tejido puede llevarse a cabo fomentando la inducción del mismo en el seno de nuestro propio organismo. Para ello existen diversas posibilidades. Una sería utilizando los factores de crecimiento que son capaces de estimular a las células madre pluripotentes o células madre progenitoras existentes en la región en la que se desea crear el nuevo tejido, potenciando su diferenciación, proliferación y distribución en el espacio, lo que puede llevarse a cabo directamente o mediante la transferencia de células capaces de segregar dichos factores. La matriz extracelular, ya sea como material natural o como biomaterial elaborado de modo artificial, también tiene en ciertos casos la propiedad de inducir la formación de nuevos tejidos. Otra posibilidad es la utilización de biomateriales y señales moleculares, donde el primero actuaría como barrera creando un espacio para facilitar el posterior crecimiento expansivo del nuevo tejido; alternativa utilizada para el tratamiento de la enfermedad periodontal bajo el nombre de regeneración tisular guiada. c. Ingeniería tisular por elaboración de constructos Se denomina constructo a la estructura que resulta de la asociación de los tres elementos básicos: células, biomaterial y factores de crecimiento, en un dispositivo llamado biorreactor, utilizado para construir tejido artificial. Para construir este dispositivo es necesario, por lo tanto, aislar las células del organismo y situarlas junto a los factores de crecimiento sobre o dentro del biomaterial más adecuado al órgano o tejido que se desee construir. Se puede utilizar un solo tipo de células y un solo tipo de biomaterial, como ocurre en constructos de piel o mucosa en los que se utilizan fibroblastos y queratinocitos, o constructos de vasos arteriales, en los que las células de elección son las endoteliales y musculares y distintos tipos de biomateriales. El diseño y elaboración de constructos debe intentar conseguir la naturaleza estructural y funcional de los tejidos naturales, los tamaños y formas deseadas, la posibilidad de continuar su desarrollo una vez implantado en el organismo y la posibilidad de integrarse completamente en el huésped. La construcción de tejidos artificiales en general y bucodentales en particular, ha sido objeto de especial interés en los últimos años con el objeto de su utilización en terapéutica; para lograr este fin, debe entendérsela como una nueva interdisciplina donde es fundamental inmiscuirse en cada área de interés para conocer cada detalle de la histología, anatomía y fisiopatología de cada órgano o sistema que se quiere construir o reparar, como así también de las técnicas y protocolos básicos utilizados. La generación de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular requiere, por tanto, aislar y cultivar células en el laboratorio obtenidas de piezas anatómicas no cadavéricas y disponer de biomateriales capaces de sustituir a las matrices extracelulares. Existen muchos tipos celulares que tienen capacidad de proliferación, especialmente las células madres, y que pueden ser mantenidas y cultivadas en el laboratorio para ser utilizadas en ingeniería tisular; para ello se requiere contar con una adecuada fuente de células y elegir correctamente el tejido. Gran parte de células que tienen capacidad de proliferación, especialmente las células madre, pueden ser mantenidas y cultivadas en el laboratorio para ser utilizadas en ingeniería tisular, pero para ello se requiere contar con una adecuada fuente de células. A continuación, se describirá a los cultivos celulares especialmente a los cultivos celulares primarios- por ser la biotecnología desarrollada en este trabajo experimental, a los biomateriales por ser uno de ellos el que se va a probar y al Ligamento Periodontal Humano como fuente de obtención de células vivas, las mismas que en estado fisiológico se enfrentan al biomaterial cuando se quiere reconstruir los tejidos periodontales dañados o perdidos patológicamente. 1. Cultivos celulares El cultivo de células (o cultivo de tejidos) tiene su origen en el siglo XIX, cuando se comenzaron a estudiar con cierto detalle los tejidos y órganos en vasos de vidrio (tecnología in vitro). La mayoría de los medios utilizados actualmente para el cultivo de células se basan en experiencias iniciales sobre la composición de soluciones que permitían que células obtenidas de tejidos sobreviviesen fuera del organismo donante durante cortos períodos. 6 31 G. DI FABIO DE COSSO y col. Artículos originales La incorporación de modificaciones que dieron lugar a medios más sofisticados ha permitido que estas técnicas hayan alcanzado hasta el presente una gran evolución, ampliando así su campo de aplicación y desarrollo: en la actualidad pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. El objetivo principal de estudiar las propias células para saber cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuándo dejan de crecer derivó a otros fines como la producción de vacunas, el desarrollo de transgénicos, el estudio de: células tumorales y su relación con el ciclo celular, la maravillosa multiplicación a partir un huevo fecundado, los enigmas todavía no descifrados de lo que hace a la diferenciación celular y las perspectivas de creación de órganos y tejidos para trasplante.7 Por otra parte, tanto la tecnología de la fusión celular como los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular que, en cierto modo, han sido diseñadas para sustituir a la metodología in vivo.6 El uso de cultivos primarios para todo tipo de ensayos ha tenido un desarrollo asombroso en los últimos años y se puede consultar en la bibliografía un sinfín de trabajos que lo incluyen como una biotecnología imprescindible para estudiar toxicidades, compatibilidades y estructuras adecuadas para producción y elección de biomateriales en técnicas de regeneración tisular.8-18 Existen dos tipos básicos de cultivos celulares19: los cultivos primarios y las líneas celulares. (Cuadro 1) Cultivo primario es el primer cultivo in vitro de células tomadas directamente del organismo; es el cultivo recién establecido, de vida corta, que generalmente se pierde en los primeros pasajes, pero que durante los mismos permite el estudio de las células en un estado muy semejante al fisiológico. Si el cultivo logra establecerse da origen a una línea celular continua, todavía diploide, que puede mantenerse por un número de pasajes limitado (alrededor de 50). Superada esta etapa, se logra una línea celular continua establecida, que pierde la diploidía inicial y teóricamente, puede mantenerse indefinidamente. Cuando las células son cultivadas como línea celular continua, el fenotipo es diferente del tejido original debido a que diversos factores, algunos desconocidos, que regulan forma, función y crecimiento in vivo, están ausentes in vitro. Esto implica una desdiferenciación que es la pérdida de las propiedades fenotípicas asociadas a la célula madura y que puede darse cuando la célula se maligniza o cuando, como en este caso, crece en cultivo. Los cultivos primarios pueden lograrse a partir de una variedad de tipos celulares (fibroblastos, macrófagos, células epiteliales, linfocitos, etc.), algunos de los cuales 32 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 Cuadro 1. Clasificación de los cultivos de acuerdo a su origen y adhesividad al sustrato C L A S E S D E C U LT I V O S CULTIVOS PRIMARIOS CELULAS QUE CRECEN EN SUSPENSIÓN LINEAS CELULARES PRE ESTABLECIDAS (INMORTALIZADAS) CELULAS QUE CRECEN ADHERIDAS A UN SUSTRATO crecen y se desarrollan adhiriéndose a un sustrato por lo cual se dice que dichas células son adherentes; en nuestro caso, presenta tal condición el fibroblasto. Otras, como los linfocitos y las derivadas de células tumorales, no se adhieren al sustrato y crecen en suspensión.20 Cuando las células de un cultivo primario se ponen en contacto con una superficie de vidrio o plástico, se adhieren firmemente a ese soporte y se aplanan como para ocupar una superficie máxima o monocapa. La población celular de un cultivo primario tiene un crecimiento limitado in vitro, conservando en sus divisiones las características fisiológicas y genéticas del tejido de origen. Las subsiguientes divisiones de las células primarias tienden a la selección de un determinado tipo morfológico y pueden seguir una multiplicación in vitro durante muchas divisiones más manteniendo su característica euploide, aunque variando sus requerimientos fisiológicos. Bajo la mayoría de las condiciones para el crecimiento en cultivo, las células que mejor se multiplican tienen la forma ahusada y la tasa de desarrollo correspondiente a células de tejido conectivo, razón por la cual se las denomina fibroblastos. Sin embargo, se han encontrado condiciones que promueven el crecimiento selectivo de células, epiteliales, por ejemplo. La forma que adoptan las células de una línea determinada depende en muchos casos de los medios de cultivo utilizados para su desarrollo. Para obtener un rendimiento óptimo del cultivo21 debe tenerse en cuenta una serie de requisitos imprescindibles tales como suministrar el medio de crecimiento adecuado y con la composición apropiada, renovándolo convenientemente para asegurar el suministro de nutrientes y la eliminación de los productos tóxicos del metabolismo celular; establecer un equilibrio entre el volumen del medio de cultivo y el espacio aéreo para permitir el intercambio gaseoso entre ambos y determinar distintas variables que favorezcan el desarrollo del Artículos originales cultivo como cantidad de suero del medio, pH, temperatura óptima, cantidad de células sembradas.18 Las técnicas básicas para el cultivo primario de fibroblastos están ampliamente descriptas en la bibliografía aunque con pequeñas diferencias con respecto a cada autor. Las coincidencias encontradas (Cuadro 2) fueron el medio de cultivo para fibroblastos: Medio Esencial Mínimo modificado por Dulbecco (DMEM), la necesidad de suplementar el mismo con Suero Fetal Bovino (SFB), las condiciones de estufa gaseada a temperatura de 37°C y 5% de CO2 y el estricto seguimiento de normas de bioseguridad y uso de campana de flujo laminar en la manipulación de los explantes. Con respecto a las diferencias encontradas, la mismas se refieren a la elección de los antibióticos (Cuadro 3) tanto para preservar el explante desde su extracción hasta su procesamiento como de los utilizados para adicionar al medio de cultivo, como también el medio de transporte dado que en algunos casos se recomienda HANK´S o HBSS y en otros solución fisiológica; además, hasta se describen lavados de la muestra con hipoclorito de sodio al 1%, cosa que en este trabajo se descartó por la posibilidad de toxicidad y muerte celular. En este trabajo se optó por una combinación de Estreptomicina, Anfotericina B y Penicilina G en cuanto a la selección de antibióticos debido a que la cobertura que ofrecen es compatible con la flora bacteriana oral y de HBSS como solución de transporte y lavado por sus características de pH fisiológico, y composición adecuada. 2. Biomateriales Los biomateriales son compuestos de origen natural o sintético que se utilizan con frecuencia en ingeniería tisular para sustituir la matriz extracelular del tejido a reproducir. Por ese motivo, la mayor parte de los biomateriales presenta una estructura que permite un adecuado crecimiento de las células en su interior y/o en su superficie.4 Cuadro 2. Semejanzas y diferencias encontradas entre las distintas propuestas existentes en la bibliografía sobre las condiciones necesarias para el cultivo de fibroblastos humanos SEMEJANZAS PROPUESTAS DIFERENCIAS ENCONTRADAS ■ Medio Esencial Mínimo modifi- ■ Elección de cado por Dulbecco (DMEM) ■ Suero Fetal Bovino ■ 37°C y 5% CO2 ■ Condiciones estrictas de bioseguridad antibióticos La utilización de cualquier tipo de biomaterial en terapéutica ha de estar sometida a una serie de estrictos controles que garanticen el cumplimiento de una serie de indicadores de calidad: ✓ Biocompatibilidad o aceptación del organismo receptor. La biocompatibilidad hace referencia a la capacidad de un material a integrarse al organismo receptor sin causar daños ni efectos secundarios indeseados. ✓ Ausencia de toxicidad o efectos secundarios indeseables. ✓ Ser estable e inerte químicamente. ✓ Cumplir los requerimientos biomecánicos necesarios para llevar a cabo su función en el organismo. ✓ Facilidad de producción y procesamiento. La ingeniería de tejidos buco-dentales artificiales por ingeniería tisular ha sido objeto de especial interés en los últimos años, con el objeto de su utilización en la terapéutica odontológica, aplicándose la ingeniería tisular por inducción para la regeneración del periodoncio y la ingeniería tisular por elaboración de constructos para crear sustitutos de mucosa bucal. Por otra parte, los pacientes suelen presentarse para tratamientos con implantes después que perdieron dientes y sufrieron resorción del reborde alveolar. Estos casos obligan a realizar primero el aumento para reconstruir la pérdida ósea para luego colocar los implantes en una posición guiada por la prótesis rehabilitadora. Las terapias regenerativas tienen como objetivo la anatomía local.22 La utilización de implantes dentales en pacientes desdentados parciales y totales, con maxilares deficientes crea una nueva demanda de reconstrucción de hueso previa o simultánea al tratamiento de implantes, en especial cuando se requiere una estética natural. Es característico que la pérdida ósea periodontal, la extracción dentaria y el uso prolongado de aparatos protéticos removibles por parte de los pacientes odontológicos generen pérdida ósea alveolar que impide la colocación de implantes en la posición prostética óptima.9 Mucho de Cuadro 3. Antibióticos y concentraciones elegidos para suplementar tanto al medio de transporte como al medio de cultivo Estreptomicina Antibiótico aminoglucósido, 100 µl bactericida extracelular Anfotericina B Antibiótico macrólido y antifúngico 50 µl Penicilina Antibiótico bactericida; activo frente a Gram(+) 100 µl ■ Medio de transporte ■ Líquidos para lavados 33 G. DI FABIO DE COSSO y col. Artículos originales lo que se consigue con la cirugía de implantes y las técnicas de aumento de hueso se relacionan de manera directa con los logros y conocimiento de la regeneración ósea guiada. Desde el punto de vista histórico, el aumento o "regeneración" del hueso alveolar perdido por extracciones dentarias, resorción o trauma representó un desafío importante para los odontólogos. A diferencia de otros tejidos, el hueso tiene la capacidad particular de regenerarse del todo. El factor limitante principal es el mantenimiento del espacio para la formación del hueso. Los materiales de injerto óseo se utilizan, entonces, para facilitar la formación de hueso en el seno de un determinado espacio al ocupar ese espacio y permitir el subsecuente crecimiento óseo (y la sustitución del injerto).23 Los mecanismos biológicos que fundamentan el empleo de materiales de injerto óseo son la osteoconducción, la osteoinducción y la osteogénesis.24 La osteoconducción es la formación de hueso por osteoblastos de los bordes de los defectos sobre el material de injerto óseo. Los materiales osteoconductores sirven de andamio al crecimiento óseo, no inhiben la formación de hueso ni inducen formación ósea. Sólo permiten que los osteoblastos formen hueso normal sobre las superficies del material de injerto. Los materiales de injerto óseo osteoconductores facilitan la formación ósea al establecer un puente en el espacio entre el hueso existente y una localización distante que de otro modo el hueso no ocuparía. La osteoinducción es la formación de hueso nuevo por la vía de la estimulación de osteoprogenitores provenientes del defecto (o de los vasos) para diferenciarse en osteoblastos y comenzar a formar hueso nuevo. Esta inducción del mecanismo formador de hueso por células que de otro modo permanecerían inactivas ocurre a través de mediadores celulares que "encienden" estas células formadoras de hueso, siendo a más estudiada, la familia de las proteínas morfogenéticas óseas. La osteogénesis, en cambio, ocurre cuando osteoblastos viables son parte del injerto óseo como un trasplante óseo autógeno. Con irrigación adecuada y viabilidad celular estos osteoblastos trasplantados forman nuevos centros de osificación con el injerto. Así, además de la formación de hueso por los osteoblastos, que ya están presentes en el defecto, los osteoblastos que se agregan como parte del injerto óseo también forman centros de osificación y contribuyen a la capacidad total de formación ósea Se utilizan muchos materiales de injerto como auxiliares en la reconstrucción de defectos óseos. Estos van, de aloinjertos (derivados de la misma especie) a Xenoinjertos (derivados de especies distintas) y 34 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 Cuadro 4. Propiedades Biológicas de Diversos Materiales de Injerto Óseo (Agrupados por clase de fuente) Osteoconductor Osteoinductor Osteógeno Aloplástico Sí No NO Xenoinjerto Sí No No Aloinjerto Sí Sí/NO No Autoinjerto Sí Sí Sí Aloplastos o materiales de Injertos sintéticos. Los materiales de injerto óseo tienen que ser, por lo menos, osteoconductores. El biomaterial que utilizaremos en este estudio- sustancia comúnmente utilizada como andamio en defectos óseos- consiste en una matriz ósea inorgánica de origen bovino, en la cual se han eliminado todos sus componentes orgánicos, de tal manera que la composición química es comparable a la del hueso humano, ya que presenta una micro y macro estructura análoga con poros interconectados y consistencia semejante.25 Esto favorece el crecimiento óseo en la zona implantada, remodelándose gradualmente de forma fisiológica por los osteoclastos y osteoblastos, lo que la convierte en una excelente alternativa cuando el empleo de hueso autógeno no está indicado o disponible. Esta matriz es de uso profesional exclusivo y se presenta en forma de gránulos o bloques en el caso de que la procedencia sea hueso esponjoso, o en gránulos solamente en el caso de que proceda de hueso cortical. En este trabajo se eligió la forma granular procedente de hueso esponjoso. Procedencia de hueso Esponjoso: Gránulos: Granulometría 0,25-1,0 mm y 1-2 mm en viales estériles para único uso. Bloques: de 1x1x2 cm / 1x1x3 cm. Procedencia de hueso Cortical: Gránulos: Granulometría 0,5-1,0 mm en viales estériles para único uso. 3. Ligamento Periodontal Humano El Ligamento Periodontal Humano es una delgada capa de tejido conectivo fibroso, queune por medio de sus fibras el elemento dentario al hueso alveolar que lo aloja. Sus fibras principales se insertan por un lado, en el cemento y por el otro, en la lámina cribosa del hueso alveolar. Artículos originales Las funciones primordiales del ligamento periodontal son: ✓ mantener al diente suspendido en su alvéolo. ✓ soportar y resistir las fuerzas empleadas durante la masticación. ✓ actuar como receptor sensorial propioceptivo, función necesaria para lograr el control posicional de la mandíbula y una correcta oclusión. Tiene diferentes denominaciones: periodonto, gonfosis, membrana periodontal, ligamento alvéolo dental o desmodonto y se ubica en el espacio periodontal, que como se indica anteriormente, está localizado entre la porción radicular del elemento dentario y la compacta periodóntica del hueso alveolar, siendo sus límites a nivel del ápice dentario el tejido conectivo pulpar, mientras que en la parte superior se relaciona con el corion gingival. Además de fijar el diente al hueso alveolar, el Ligamento Periodontal tiene la función de soportar las fuerzas de la masticación. Por este motivo, las fibras que lo forman (colágenas) se parecen mucho a una cuerda retorcida, en la cual las hebras individuales pueden ser remodeladas de modo continuo sin que la fibra en sí pierda su arquitectura y función. Estas fibras por lo general, se disponen oblicuamente entre el hueso y el cemento. El cemento, el ligamento periodontal y el hueso alveolar constituyen el aparato de sostén o periodoncio de inserción. Toda esta estructura está protegida por el denominado periodoncio de protección que comprende dos regiones: ✓ La encía que rodea al cuello dentario. ✓ La unión dento-gingival que une la encía a la pieza dentaria. Estas estructuras aíslan al periodoncio de inserción del medio séptico bucal. El Ligamento, al continuarse con el tejido pulpar y con el tejido conectivo de la encía y el de la unión dento-gingival, forma un conjunto estructural y funcional y, por tanto, un solo sistema biológico. Clínicamente, esta relación es muy importante pues las infecciones que se producen aisladamente en cualquier lugar, pueden conectarse entre sí y extenderse a otras zonas, lo que constituye las lesiones denominadas endo-periodónticas. El Ligamento periodontal varía notablemente de un individuo a otro, entre los distintos elementos dentarios, y aún en las diferentes zonas de un mismo diente. Se acepta que su espesor oscila entre los 0,10 y 0,38 mm. Espesor: Disminuye con la edad (ancho promedio de 0,20mm en individuos jóvenes y de 0,15mm en personas > 50 años) Aumenta con la función masticatoria: más ancho en dientes funcionales y más delgado en dientes disfuncionales o retenidos. Ancho: Mayor en el extremo apical y cervical y menor en la parte central. Presenta una alta densidad celular, de las cuales los fibroblastos representan el 20% del total. Los componentes estructurales del Ligamento periodontal, como todo tejido conectivo denso, son las células, las fibras y la sustancia fundamental amorfa. Además posee vasos y nervios. Los fibroblastos son las células del tejido conectivo que secretan la mayoría de los componentes de la matriz extracelular como proteoglicanos, glicosaminoglicanos, fibras de adhesión y fibras de soporte, principalmente colágeno fibrilar. Son células muy versátiles, que tienen la capacidad de diferenciarse en otras células del tejido conectivo en respuesta a un daño o estímulos adecuados. Existen evidencias de que los fibroblastos son células tejido específicas, es decir, que presentan diferencias, dependiendo del tejido al que pertenecen.27 Los fibroblastos secretan colagenasa y otras metaloproteasas24, 26, 27 que permiten la renovación y reorganización constante del tejido conectivo normal en el adulto.9 Cuadro 5: Componentes principales del ligamento periodontal humano CÉLULAS FIBRAS Formadoras: Osteoblastos Fibroblastos Cementoblastos Colágenas De Oxitalán Resortivas: Osteoclastos Cementoclastos Defensivas: Macrófagos Mastocitos Eosinófilos Restos epiteliales de Malassez Células Madres Mesenquimáticas 35 G. DI FABIO DE COSSO y col. Artículos originales La importancia de este tipo celular en el Ligamento Periodontal, además de su elevado porcentaje, se debe al alto grado de recambio que experimenta el tejido periodontal, pues los haces de colágeno que lo forman, son remodelados, removidos y reemplazados de modo constante. A diferencia de los que ocurre en el tejido óseo, la síntesis y la degradación del colágeno en el ligamento es llevada a cabo por un solo tipo celular que se podría denominar fibroblasto o fibroclasto, según el momento funcional en que se encuentre. A veces, estas dos funciones se realizan de manera simultánea. La síntesis implica la participación del RER y el complejo de Golgi en la producción y liberación de moléculas de tropocolágeno, las cuales se polimerizan extra-celularmente para formar las microfibrillas y luego las fibras de colágeno. Algunos autores indican que el fibroblasto participaría en la configuración extracelular de las fibras de colágeno, lo que sería de especial importancia en el ligamento periodontal. La degradación involucra dos fases: 1) la síntesis y posterior liberación de la colagenasa, (enzima que digiere el colágeno y lo fragmenta en pequeñas porciones) 2) La fagocitosis por parte de los fibroblastos de los restos de colágeno degradados que son digeridos por medio de sus lisosomas. El remodelado de las fibras no se limita a una zona media (plexo intermedio) como se interpretaba anteriormente, sino que puede ocurrir en todo el ancho del ligamento periodontal Se ha comprobado que existe un equilibrio fisiológico entre la elaboración y degradación de los componentes para conservar la estructura normal del ligamento periodontal. Este equilibrio suele alterarse con la edad, aunque el fibroblasto conserva un alto grado de actividad aún en individuos adultos Los fibroblastos del ligamento periodontal son, básicamente, similares a los del resto del organismo. Al MO (microscopio óptico) un fibroblasto aparece fusiforme, con extensiones citoplasmáticas ligeramente eosinófilas. El núcleo, elíptico, grande, presenta cromatina laxa y dos o cuatro nucléolos evidentes. A: Cómo se vería un fibroblasto al microscopio óptico, con núcleo grande, ovalado y citoplasma ahusado con prolongaciones. 36 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 Ultraestructuralmente, contiene todos los organoides relacionados con la síntesis de proteína para exportación (RER que alcanza el 5% del volumen celular, aparato de Golgi, mitocondrias, vesículas secretoras, etc.). Presenta también en su citoplasma un sistema de microtúbulos y microfilamentos, muy desarrollados. Webb, ha descrito en los fibroblastos del ligamento periodontal pero no en los del conectivo gingival, la coexpresión de vimentina (típico de células de origen mesenquimático y en vía de maduración) y citoqueratina durante la fase de erupción dental. Después de la erupción, desaparece la expresión de citoqueratina. Los fibroblastos se disponen paralelos a los haces de fibras y en apariencia, sus prolongaciones envuelven a las mismas. Su adherencia a las fibras se debe a la presencia de una glicoproteína: la fibronectina. Esta disposición permite que durante los movimientos fisiológicos del diente u ortodóncicos, los fibroblastos remodelen los haces de fibras colágenas del ligamento. Entre los fibroblastos del ligamento periodontal, además de contactos de membrana sin ninguna especialización, se observan uniones comunicantes y algunos desmosomas muy simples. Estos sistemas de unión solo se observan en fibroblastos de tejido conectivo fetal, en cultivos y en los miofibroblastos de las heridas. Se ha tratado de explicar a través de estos contactos la coordinación de los fibroblastos del ligamento en la erupción y en el rápido proceso de renovación del colágeno que tiene lugar en este tejido. El fibroblasto del ligamento periodontal presenta entre otros, dos receptores de superficie muy característicos: el EGF (factor de crecimiento epidérmico) y IL-1 (interleuquina 1). El incremento de este último estimula la actividad sintética del fibroblasto que entre otros productos produce colagenasa e IL-6 (interleuquina 6). Esta última sustancia estimula de forma significativa la actividad osteoclástica. Los fibroblastos del ligamento periodontal elaboran más IL-6 que los del tejido conectivo gingival. Esta relación entre la producción de IL-1 e IL-6 puede ser importante en la respuesta del tejido a las cargas orto- B: Cómo se vería un fibroblasto al microscopio electrónico, con numerosas mitocondrias, vesículas y un gran aparato de Golgi y Retículo Endoplásmico Rugoso (RER). Artículos originales dóncicas. Estudios recientes indican que los fibroblastos del ligamento periodontal elaboran y segregan in vivo e in vitro la proteína ligadora del calcio S100-A4. Dicha proteína es uno de los componentes responsables de inhibir la mineralización en el espacio extracelular del ligamento periodontal. El ciclo de renovación del ligamento periodontal es de 45 días y la tasa promedio de fibroblastos que se renuevan por día es del 2%. Otros tipos de células formadoras presentes en el Ligamento Periodontal son los Osteoblastos que se encuentran cubriendo la superficie periodontal del hueso alveolar (zona osteógena). Funcionalmente existen dos tipos de osteoblastos, los activos que sintetizan continuamente laminillas óseas y los inactivos o de reserva. Las células en reposo de la zona osteógena son activadas por distintos estímulos como, por ejemplo, las fuerzas tensionales ortodóncicas. Los cementoblastos son células que se distribuyen sobre el cemento, en especial sobre la zona cementógena. Dentro de las células resortivas consideraremos a los osteoclastos, cuya presencia en el tejido normal se debe a que permanentemente hay procesos de resorción y aposición, para permitir los movimientos funcionales de posición de los elementos dentarios y los cementoclastos (u odontoclastos dado que también pueden resorber dentina): son células que solo aparecen en ciertos procesos patológicos o durante la rizoclasia fisiólogica de los dientes temporales. Entre las células defensivas, los mastocitos o células cebadas son células que se hallan cerca de los vasos sanguíneos y que contienen gránulos densos de heparina, histamina y enzimas proteolíticas. En ciertas condiciones patológicas estas células presentan degranulaciones debido a lesiones tisulares, aunque su función en el tejido periodontal es aún discutida. Los macrófagos son células provistas de abundantes lisosomas que desempeñan una función de desintoxicación y defensa del huésped, principalmente por su capacidad para ingerir, destruir y digerir microorganismos y sustancias extrañas que podrían alterar el ligamento periodontal. La riqueza en lisosomas y la presencia de microvellosidades facilita el diagnóstico diferencial con el fibroblasto. Representan el 4% de la población celular del ligamento periodontal. La distribución de los macrófagos en el ligamento periodontal es heterogénea, encontrándose variaciones regionales de densidad. Las células o restos epiteliales de Malassez son posibles de hallar con frecuencia, en el ligamento periodontal, hacia el lado de la superficie cementaria, como nidos o acúmulos celulares de naturaleza epitelial. Estas células son restos desorganizados de la vaina epitelial de Hertwig y su frecuencia y distribución cambia con la edad, siendo más frecuentes en niños que en adultos y hasta la segunda década de la vida se encuentran más comúnmente en la región apical, pero con posterioridad se localizan en la proximidad gingival, al lado de la cresta alveolar. En esta región cervical, distintos autores sugieren que algunas células epiteliales de Malassez derivan, presumiblemente, del epitelio gingival y del epitelio de unión. La morfología de las células epiteliales de Malassez puede variar de acuerdo al plano de sección. En cortes longitudinales o transversales se pueden observar al microscopio óptico como cordones macizos de acúmulos celulares. En un corte tangencial, casi paralelo a la superficie radicular, aparecen formando una red, cuya malla se haya atravesada por fascículos de fibras colágenas cortadas de través. Estas células pueden ser escamosas (pavimentosas) o cilíndricas, con un núcleo prominente de cromatina densa. Al MET los grupos celulares están aislados del tejido conectivo que los rodea por una lámina basal similar a la que poseen las células epiteliales de otras partes del organismo Las células ectomesenquimáticas indiferenciadas son células que se encuentran en gran cantidad en el tejido conectivo periodontal. Son células pluripotenciales que se sitúan alrededor de los vasos sanguíneos en una extensión de aproximadamente 10µm.Tras la división de estas células, una célula hija permanece en la zona perivascular y otra se diferencia hacia fibroblasto, cementoblasto u osteoblasto. Gould ha indicado que esta célula madre posee en su citoplasma abundante RER y que en ella comienza a sintetizarse el tropocolágeno. La interacción entre el estrés mecánico y el sistema EGF/EGFr (factor de crecimiento epidérmico/receptores del factor de crecimiento epidérmico), existente a nivel de estas células, incide en el proceso de diferenciación celular de esta población, regulando la función del ligamento periodontal como fuente de osteoblastos y cementoblasto En el Ligamento Periodontal se encuentran distintos tipos de fibras: colágenas, reticulares, elásticas, oxitalánicas y de la elaunina. Las fibras colágenas representan la mayor parte del componente fibrilar. Las fibras están constituidas por colágeno tipo I (la más abundante), tipo III y tipo V. Al margen de las fibras, en el Ligamento Periodontal se ha detectado también colágeno tipoIV en las membranas basales que rodean a las terminaciones nerviosas, los vasos y los restos de Malassez y colágeno tipo VI en la matriz extracelular. El colágeno tipo XII, que se describe en los tejidos conjuntivos densos- ricos en colágeno tipo I- ha sido identificado también en el ligamento periodontal después de la erupción dentaria. La interacción entre la colágena tipo XII y los proteoglicanos parecen jugar un papel importante en la organización final de este tipo de tejidos Las moléculas de colágeno ("tropocolágeno") que forman las fibras se agregan entre sí apenas son secretadas constituyendo las microfibrillas del colágeno que poseen 41 G. DI FABIO DE COSSO y col. Artículos originales La sustancia fundamental o Matriz amorfa del Ligamento periodontal presenta, al igual que otros tejidos conectivos, una elevada proporción de proteoglicanos, sustancia compuesta por distintas cadenas de polisacáridos (glicosaminoglicanos -GAG-) unidas a proteínas. una estriación transversal característica (con una periodicidad de 64 nm) Las microfibrillas se agrupan en fibras, las cuales en el ligamento periodontal se disponen en haces definidos y presentan diferente orientación según las zonas del Ligamento Periodontal. Cada fibra se parece a una cuerda retorcida y sigue un recorrido ondulado (la fibra es flexible aunque muy resistente a la tracción). Ello permite cierto grado de movimiento al diente, pero a la vez, por su gran resistencia a la tensión, oponer una firme resistencia a movimientos de mayor intensidad. Las microfibrillas individuales pueden ser remodeladas de forma continua, en cualquier trecho de su recorrido, mientras que la fibra mantiene su arquitectura y función intactas. De esta manera los haces se adaptan a las continuas fuerzas que se aplican sobre ellos A estos grupos de fibras con dirección definida se los denomina fibras principales. Existen también fibras secundarias, dispuestas desordenadamente entre las principales. Las fibras oxitalánicas y de elaunina se ponen de manifiesto con la técnica de Halmi con ácido paracético y fucsina aldehídica. Son consideradas fibras elásticas inmaduras. Las fibras de oxitalán ocupan el 3% del Ligamento periodontal humano y siguen una dirección característica axial al diente con un extremo incluido en el cemento o en el hueso y el otro, generalmente en la pared de un vaso sanguíneo o en el tejido conectivo que rodea a las estructuras neurovasculares. Son más abundantes en la zona del ápice y se cree que podrían tener la función de sostener los vasos del Ligamento Periodontal y participar directa o indirectamente en el sistema mecanoreceptor del Ligamento Periodontal. Por tener propiedades semejantes a la fibronectina, algunos autores consideran que las fibras de oxitalán pueden ser importantes en la emigración de los fibroblastos en el Ligamento Periodontal. Con la edad, las fibras de oxitalán se hacen más tortuosas y pierden parte de su elasticidad original. Fibras reticulares y elásticas: son escasas. Por lo general se hallan formando parte de las paredes de los vasos que irrigan el Periodoncio. Materiales y Métodos Se llevó a cabo un estudio de tipo experimental en el laboratorio de Investigación de la Universidad J. A. Maza con el fin de observar la influencia de una sustancia comúnmente usada como andamio tisular en defectos óseos sobre el comportamiento de las células del tejido conectivo, y dentro de ellas su principal componente, el fibroblasto, cuando se lo cultiva in vitro. A partir de una muestra de ligamento periodontal consistente en un explante obtenido de una pieza dentaria avulsionada por un profesional odontólogo con estricta indicación de extracción por cuestiones ortodóncicas se practican las técnicas básicas de cultivos celulares primarios para lograr un cultivo celular estandarizado y cuando se logra la confluencia adecuada, luego del primer pase, se confronta con la sustancia comúnmente usada como relleno en los defectos óseos 1. Obtención y transporte de muestras clínicas Se tomaron 23 muestras de 11 pacientes jóvenes sistémica y periodontalmente sanos en los cuales se requería de exodoncia de premolares o terceros molares por motivos ortodóncicos. Previamente se les hizo firmar un formulario de consentimiento en el cual se informó de las razones, propósitos y metodología a usar en este proyecto. (Anexo 1). Previo a la exodoncia se les indicó a los pacientes la remoción de la carga bacteriana sobre la superficie dentaria por los métodos mecánicos (cepillo e interdental) juntamente con un enjuague enérgico con un elemento antiséptico catiónico como es la Clorhexidina al 0,12% asociado a Cetil-piridinio en forma de solución; esto sin detrimento de la consideración de que el ligamento periodontal es un tejido no expuesto a la flora METODOLOGÍA PARA CULTIVO DE FIBROBLASTOS GINGIVALES DESDE EXPLANTES → TRANSPORTE EN S1 → RASPADO CON CURETA → CENTRIFUGAR → 10`A 600 g DESCARTAR SOBRENADANTE → RESUSPENDER EN S2 → EXPLANTE (MOLAR O PREMOLAR) → INCUBACIÓN 4 HS 37º C RESUSPENDER EN 53 → → S1: HANK’S + ATB# (Penicilina 100 Ul/Ml; Estreptomicina 100 µg/ml; Anfotericina B 25 µg/ml. S2: HANK’S + Tripsina-EDTA (0,25% - 0,5 mM) S3: DMEM + SFB 15% l-glutamina + ATB# 42 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 → CULTIVAR EN ESTUFA 37º C 5% CO2 53 DESCARTAR SOBRENADANTE → OBSERVAR AL MICROSCOPIO RENOVAR EL MEDIO 53 CADA TRES DIAS O SEGÚN NECESIDAD CENTRIFUGAR 10’ 750 g Artículos originales indígena de la cavidad oral, en el caso de la elección de las piezas dentarias para su exodoncia por motivos ortodóncicos. La cirugía extractiva consistió en realizar una sindesmotomía que es una técnica quirúrgica que consiste en liberar al diente, a nivel del cuello y en todo su contorno, de las inserciones ligamentosas que unen éste a la encía. Se consigue introduciendo el sindesmótomo en el surco gíngivo-dentario y recorriéndolo en todo su entorno. El instrumento se introduce en el surco gingival para separar o cortar las fibras que se insertan al margen gingival en el cuello del diente y las fibras transeptales que pasan de un diente al siguiente. Si esto se hace en forma correcta, el diente solo queda unido al hueso por el ligamento periodontal. Los dientes inmediatamente extraídos se sometieron a un proceso de desinfección y transporte en un medio HBSS (Gibco) con antibióticos: 100 µl penicilina, 100µl estreptomicina y 50 µl anfotericina (S1) con el fin de disminuir y evitar la presencia de microorganismos y conservar los especímenes durante el tiempo transcurrido entre la exodoncia de éstos y su utilización para la obtención de las monocapas celulares. Se mantuvieron refrigerados entre 4 y 8 °C y por un período no mayor a 4 horas. (Fig. 1) El reclutamiento, evaluación y selección de los pacientes estuvo a cargo de un odontólogo especialista en Ortodoncia, el examen periodontal, a cargo de un odontólogo especialista en Periodoncia y las cirugías de extracción de las piezas dentarias, de una odontóloga cirujana máxilo-facial. 2. Obtención de los explantes Se lavaron y desinfectaron tres veces en HBSS más antibióticos los dientes de los cuales se obtendrían las muestras colocadas en cápsula de Petri estéril de 10 cm2 bajo campana de flujo laminar (Cabina de seguridad biológica Clase II/A. B3 SABELLA). Este líquido de lavado se cargó en una jeringa estéril de 10 cc sin aguja, extrayéndose el líquido de lavado con pipeta estéril del mismo volumen luego de uno o dos minutos de contacto, favoreciéndose el mismo con movimientos giratorios de la cápsula de Petri. Luego se raspó el tercio medio radicular de la pieza dentaria extraída con curetas de Gracey esterilizada- instrumento utilizado en Periodoncia para el raspado y alisado radicular, (procedimiento quirúrgico básico en la terapia periodontal)-, que consta de una sola hoja de filo que es la que da al diente, y roma la que mira al tejido blando en el ámbito de la bolsa periodontal, o con hoja de bisturí N° 15 estéril, recogiéndose el material obtenido con micropipeta de 1000µl en un tubo eppendorf que se llevó a centrifugación entre 600 y 750 rpm durante 10 minutos. (Centrífuga Gelec G142). Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el contenido celular en la solución de disgregación (SED2): Hank´s + Tripsina-EDTA (0,25%-0,5 mM)(0,1% Trypsin-EDTA 10x 15400 Gibco), llevándose a incubación a 37°C durante 4 horas, agitándose cada 20 minutos en vórtex. (Fig. 2) 3. Obtención de los cultivos primarios Completada la disgregación con EDTA-Tripsina, se centrifugó nuevamente durante 10 minutos a 750-1000 rpm, se descartó el sobrenadante y se tomó una alícuota para hacer el recuento de células, previa tinción con azul tripán al 0,4% en PBS, en cámara de Neubauer para ajuste de la suspensión a un número de células aproximadamente de 106 cél/ml A estas suspensiones ajustadas se las colocó en cápsula de Petri de 5 cm2 y se les añadió inmediatamente el medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB BioNos) y Antibióticos (Penicilina G 100 µl, Estreptomicina 100µl y Anfotericina B 50 µl) (MP Biomedicals) con una micropipeta calibrada en una cantidad aproximada de 1500 a 2000 µl, llevándose a estufa de incubación a 37°C con 5% de CO2 (Thermo Electron Corporation. Forma. Series 11 Water Jacketed CO2 Incubator HEPA Class 100). Las cajas se observaron bajo microscopio invertido a las 24 horas después de haber realizado el procedimiento, observando el comportamiento del cultivo, su potencial de crecimiento y capacidad de metabolizar el medio. Se siguió observando periódicamente, aproximadamente cada 3 días y de acuerdo al resultado de estas observaciones se cambiaron los medios de cultivo tantas veces como se consideró necesario retirándose el medio metabolizado y volviéndose a colocar medio fresco con una pipeta Pasteur o micropipeta calibrada, previo lavado del cultivo con HBSS más antibióticos, llevando un control riguroso del cultivo con la utilización de un microscopio invertido, hasta obtención de la monocapa. Este pasaje se realizó como se describe en la bibliografía: se retiró el medio de cultivo mediante una pipeta estéril y se colocó EDTA-Tripsina 10X, cultivándose a 37°C durante 10-15 minutos, al cabo de los cuales se colocó SFB para inactivar a la enzima y se dejó actuar 5 minutos más. Posteriormente se centrifugó a 700rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y el contenido celular se resuspendió en medio de cultivo suplementado con SFB y antibióticos. 4. Confrontación con andamio Se agitó con Vórtex para homogeneizar y el volumen obtenido se dividió en dos pozuelos: uno conteniendo sólo los fibroblastos y el otro conteniendo además el andamio, sustancia utilizada comúnmente como relleno óseo, homogéneamente distribuído en el fondo. (Fig. 3, 4, 5). Estos procedimientos se repitieron con las últimas 11 muestras recolectadas según protocolo. Dado que no se podía identificar a los fibroblastos por medio de anticuerpos específicos por medios inmunohistoquímicos por razones económicas, se procedió a iden43 G. DI FABIO DE COSSO y col. Artículos originales tificarlos por métodos tradicionales de tinción con Hematoxilina-Eosina. Para ello, cuando se consideraba que ya había transcurrido un tiempo adecuado y previendo la declinación del cultivo por senescencia (aproximadamente 60 días) se procedió a la recuperación de las células por el procedimiento enzimático descripto precedentemente (Tripsina-EDTA con incubación). Una vez levantadas las células del sustrato que en este caso de células adherentes es el pocillo de cultivo, se recuperó el contenido del pocillo por aspiración con pipeta. Se observó con lupa cómo las células perdían su adhesión a la superficie, se redondeaban y parecían unirse entre sí. Se centrifugaron en tubos cónicos y descartándose el sobrenadante, se lavaron con Hank´s + antibióticos. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces. Finalmente, el contenido celular depositado se recogió con ansa de platino estéril y se realizó el frotis para hacer el teñido con Hematoxilina-Eosina, coloración estructural, clásica, utilizada corrientemente tanto para el estudio histológico como en el patológico. Consiste en la aplicación de la Hematoxilina de Harris o de Mayer para colorear los núcleos de azul (este colorante tiene carácter básico y el núcleo tiene carácter ácido por la presencia de los ácidos nucleicos) y la Eosina que es un colorante ácido tiñe el citoplasma y las fibras colágenas que tienen carácter básico de color levemente rosa. RESULTADOS Hemos observado que con la técnica propuesta por los trabajos descriptos en la bibliografía se puede obtener crecimiento y proliferación celular a partir de explantes; las células obtenidas de ligamento periodontal humano crecen y proliferan con buena adherencia en el medio de cultivo D(MEM) como lo demuestran las imágenes tomadas mediante microscopía con cámara fotográfica (Olympus Stylus SCU840: zoom máximo por aproximación al objetivo). Se consideró que el cultivo registró aumento celular coincidiendo con el aumento de la birrefringencia observada. Imagen ampliada de un campo observado a 40X en MO Olympus donde puede visualizarse a las células como abultamientos refringentes un poco más claros. También se ven haces de colágeno como cordones que atraviesan el campo. (Fig. 6, 7, 8, 9) Cuando se cultivan fibroblastos en presencia de una sustancia ajena al medio de cultivo como lo es un biomaterial- en este caso, la matriz anorgánica proveniente de hueso bovino desmineralizado-, éstos continúan su crecimiento y proliferación normal, sin evidenciar signos o síntomas de toxicidad. En las imágenes de la derecha se puede observar a los fibroblastos distribuidos uniformemente entre los gránu44 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 Resumen de la actividad desarrollada: muestras, fechas de obtención y procesamiento, dientes de los cuales se obtuvieron las mismas y resultados obtenidos. MUESTRA FECHA EDAD DIENTE RESULTADOS 1 2y3 28/10/2010 8/11/2010 31 22 44 18 y 28 4y5 8/11/2010 14 14 y 24 6y7 16/5/2011 18 14 y 24 8 27/6/2011 25 3° molar retenido 9,10, 11 y 12 1/8/2011 23 28, 18, 38 y 48 13 y 14 28/9/2011 28 34 y 44 15 y 16 18/11/2011 10 14 y 24 17 y 18 18/11/2011 25 18 y 28 19 y 20 24/5/2012 14 14 y 24 21,22 y 23 24/5/2012 18 28,18, 38 y 48 Contaminación Muestra congelada. Insuficiente cantidad de células Células de imágenes compatibles con fibroblastos. Se mantuvieron en cultivo durante 11 días en estufa sin CO2 Muestra congelada. Insuficiente cantidad de células Buena densidad celular. A los 5 días se pudo realizar el 1° pase. Células de imágenes compatibles con fibroblastos. Se mantuvieron en cultivo 60 días. Buen crecimiento 1° y 2° pase. Confrontados con andamio Buen crecimiento 1° y 2° pase. Confrontados con andamio Buen crecimiento 1° y 2° pase. Confrontados con andamio Buen crecimiento 1° y 2° pase. Confrontados con andamio Buen crecimiento 1° y 2° pase. Confrontados con andamio los de andamio conformando una suerte de red que coincide con los hallazgos clínicos histológicos en animales de experimentación.1 (Fig. 10, 11, 12, 13, 14,15, 16,17) Por otra parte, las cubetas que contenían andamio en la placa de 6 pozuelos que se muestra a continuación (imagen I: pozuelos A´, B´ y C´), presentaron una distri- Artículos originales Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 6. 45 G. DI FABIO DE COSSO y col. Artículos originales bución homogénea y fija de andamio, que no se modificaba con el movimiento de la placa, lo que puede significar que los fibroblastos como células adherentes, fijan a los gránulos de matriz ósea bovina para formar tal enrejado, ya que en las cubetas que contenían andamio sólo (Imagen II: cubetas sin letras de la hilera inferior), éste se desplazaba al ritmo del movimiento del fluido (en este caso, el medio de cultivo). (Fig. 18, 19, 20) El análisis histológico de las células, que se realizó por la tinción Hematoxilina-Eosina arrojó las siguientes imágenes donde puede observarse a los núcleos teñidos de azul y los citoplasmas en rosa pálido con forma ahusada. DISCUSIÓN Con este trabajo experimental cualitativo se logró desarrollar y establecer una técnica de cultivo de células de ligamento periodontal humano in-vitro óptima para su crecimiento y mantenimiento que permitieron probar la ausencia de toxicidad de un material utilizado en la práctica clínica para la regeneración ósea, ya que las imágenes del cultivo en presencia del andamio muestran un desarrollo celular normal con buen crecimiento y proliferación. Los cultivos se pudieron mantener viables durante 2 pasajes más (alrededor de 60 días). Las observaciones recogidas del seguimiento diario permitieron corregir errores de las técnicas propuestas tanto para la ejecución de las tareas propiamente dichas específicas de cultivo como para las accesorias referidas a la preparación de las soluciones, manejo de instrumental y muestras. Cabe destacar que aunque en la Universidad J. A. Maza hay grupos de investigación que trabajan con cultivos celulares- lo que permitió que se contara con la infraestructura necesaria- ninguno de ellos lo hace con cultivos primarios sino con líneas establecidas, por lo que la conformación de un nuevo grupo insumió un tiempo precioso dentro del plazo acordado por la beca otorgada por la Secretaría de Ciencia y Técnica de la universidad mencionada. Por otra parte, la coordinación del trabajo de laboratorio con la clínica es una tarea, sino ardua, por lo menos compleja, ya que el reclutamiento de los pacientes debe coincidir con su buen estado de salud y la cirugía se debe realizar en un horario conveniente para que se pueda procesar la muestra en tiempo y forma. 46 FUNDACIÓN JUAN JOSÉ CARRARO | Nº 36 | SEPTIEMBRE - OCTUBRE 2012 Quedan como tareas pendientes mejorar la captura de imágenes ya que no se pudo medios inmunohistoquímicos porque no se pudo adquirir el kit de anticuerpos para identificar fibroblastos. ✒ Nota: esta publicación fue editada del trabajo original, especialmente para odontólogos y sólo refleja aspectos de interés para los mismos. Para mayor información, pueden comunicarse con: gracieladifabio@umaza.edu.ar AGRADECIMIENTOS A los Profesores Dr. Marcelo Carlos Nacucchio y Dr.Walther Zavala, directores de este trabajo, que con su dedicación y sabios consejos acompañaron este estudio interdisciplinario biotecnológico que relaciona a la Farmacología, la Odontología en su especialidad de Periodontología y la Biología Celular. A la Dra. Galia Rossi, médica y cirujana máxilo-facial y al Dr. Daniel Ferri por su aporte en el material de experimentación. Al Hospital J. N. Lencinas en las personas: Dra. Mariela Amprimo, Jefa del Laboratorio de Anatomía Patológica y su colaboradora Srta. Ana Monge y Sra. Susana del Laboratorio de Bacteriología. A la Universidad Juan Agustín Maza por habernos elegido como grupo de investigación para la Convocatoria del año 2010 y habernos confiado sus instalaciones, personal y patrimonio. Especialmente a la Sra Decano de la Facultad de Farmacia y Bioquímica Farm María Gabriela Giornelli, a la Ingeniera Amanda Di Fabio, a la Jefa del Laboratorio Central Farm Stella Galfré y su cordial y atento grupo de colaboradores, quienes de manera incondicional y solícita supieron acompañar y allanar todas las dificultades. Al laboratorio Pharmatrix por facilitarnos el producto farmacéutico que se ha utilizado en este trabajo. A los Profesores y técnicos del Laboratorio de Cultivos Celulares del Departamento de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires: Dra Nélida Candurra, Juan Claus, Silvia Coronato, Celia Coto,Viviana Castilla, Andrea Barquero, Carlos Pujol y Luis Scolaro. Al Dr. Adolfo Aragonés, quien con su entusiasmo permanente supo alentarme para seguir adelante siempre. Muchas gracias a todos. Artículos originales Cultivadas solo con medio de cultivo Cultivadas en presencia de andamio MUESTRA N° 21 2° pase Figura 10 Figura 11 MUESTRA N° 22 2° pase Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 MUESTRA N° 23 2° pase Figura 16. Foto de un cultivo en 2° pase con andamio visto en MO 40X. Nótese que no aparecen imágenes compatibles con cordones o haces de colágeno y que pareciera que los fibroblastos se insertan en el mismo gránulo conformando un continuo de células adheridas al sustrato que en este caso se trata del fondo del well tapizado con andamio Figura 18 Figura 17. Foto de un cultivo en 2° pase con andamio. Nótese la distribución de las células aún sobre el gránulo de andamio. Figura 19 BIBLIOGRAFÍA 1. CARIDE, F.; LAGUENS, M.; CARIDE, E. Estudio histomorfológico del comportamiento de un relleno óseo, proveniente de hueso bovino desproteinizado de origen nacional. Estudio de experimentación en ratas. Trabajo presentado en la XXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Periodontología 2. POLLARD, J.; WALKER, J. Basic Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology. 2º Ed 3. LEAL, L.; PERDOMO, S.; SPINEL,C.Aislamiento y cultivo de fibroblastos endoneurales. Acta Biológica Colombiana, Vol 9 Nº2, 2004-57 4. GOMEZ de FERRARIS, Mª E.; CAMPOS MUÑOZ,A. Histología, Embriología e Ingeniería Tisular Bucodental. Ed. Panamericana. 3ªEd. 2010. Figura 20 Para consultar la bibliografía completa ver nuestra página web: www.fundacioncarraro.org 47 G. DI FABIO DE COSSO y col.