Mancha de Septoria da Alface: Isolamento, Inoculação e Avaliação
de Cultivares em Condições de Campo e Casa de Vegetação
Cristina S. Sousa1 , Warwick E. Kerr2 , Marlos R. Santos 1 , Alcione S. Arruda1 , Vanessa B. M. G. Spini3 ,
Fernando C. Juliatti1 & Armando Takatsu1
1
Instituto de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Uberlândia, Campus Umuarama, CEP 98400-902, Uberlândia, MG,
e-mail: cristsoares@hotmail.com; 2Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, CEP 69060-000, Cx. Postal 478; 3Departamento
de Genética e Matemática Aplicada à Biologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
(Aceito para publicação em 16/07/2003)
Autor para correspondência: Cristina Soares de Sousa
SOUSA, C.S., KERR, W.E., SANTOS, M.R., ARRUDA, A.S., SPINI, V.B.M.G., JULIATTI, F.C. & TAKATSU, A. Mancha de Septoria da
alface: isolamento, inoculação e avaliação de cultivares em condições de campo e casa de vegetação. Fitopatologia Brasileira 28:555-558. 2003.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo estabelecer metodologias
adequadas para o isolamento e inoculação de Septoria lactucae e
avaliação de nove cultivares de alface (Lactuca sativa), Vitória-de-SantoAntão, Uberlândia 10.000, Maioba, Elba, Aurélia, Black Seeded Simpson,
Grand Rapids, Salad Bowl-Mimosa e Babá de Verão, quanto aos níveis
de resistência à septoriose, em condições de casa de vegetação e campo.
Os melhores resultados obtidos foram: a) para isolamento: transferência
dos cirros de conídios diretamente para o meio de BDA com os
antibióticos estreptomicina, cloranfenicol, ampicilina e rifampicilina;
b) para inoculação: aspersão das plantas no estádio de seis a oito folhas
com a suspensão de inóculo na concentração de 1 x 104 conídios/ml, e
manutenção em câmara úmida por 48 h. Houve diferenças significativas
entre as cultivares testadas em casa de vegetação e em campo. Tanto em
casa de vegetação quanto em teste de campo as cultivares Maioba e
Vitória de Santo Antão foram avaliadas como a mais susceptível e a
mais resistente, respectivamente. Diante desses resultados, a metodologia
de casa de vegetação pode ser considerada como altamente promissora
para a avaliação rápida de grande número de variedades ou materiais
genéticos, nos trabalhos de melhoramento de alface para a resistência
à S. lactucae.
Palavras-chave adicionais: Septoriose, Septoria lactucae,
Lactuca sativa.
ABSTRACT
Lettuce Septoria leaf spot: isolation, inoculation, cultivar
evaluation in field and greenhouse conditions
The objectives of this work were to establish appropriate
methodologies for isolation and inoculation of Septoria lactucae in
order to evaluate resistance. Nine lettuce (Lactuca sativa) cultivars
(Vitória-de-Santo-Antão, Uberlândia 10.000, Maioba, Elba, Aurélia,
Black Seeded Simpson, Grand, Rapids, Salad Bowl-Mimosa and
Babá de Verão) were screened for resistance to this pathogen under
greenhouse and field conditions. The best results obtained were: a)
for isolation: to transfer cirrus of conidia directly to the surface of
Petri dishes with PDA medium plus antibiotics (streptomycin,
chloramphenicol, ampicilim and riphampicin); b) for inoculation:
to spray plants of six to eight leaves with a conidia suspension of
1 x 104 spores/ml and keep them in a moist chamber for 48 h.
Significant differences were found among cultivars both in
greenhouse and field tests. Under both conditions the cultivars
Maioba and Vitoria de Santo Antão were found to be, respectively,
the most susceptible and the most resistant cultivars among those
tested. From these results, the greenhouse test methodology is
seen to ge highly promising for the rapid screening of a great
number of genotypes in breeding programs of lettuce resistant to
S. lactucae.
A septoriose causada pelo fungo Septoria lactucae
Passerini é uma das doenças mais importantes que afetam a
cultura da alface (Lactuca sativa L.), muito comum em regiões
de clima ameno e em épocas chuvosas. As condições favoráveis para o desenvolvimento da doença são alta umidade e
temperatura na faixa de 10 a 28 °C. Sua importância deve-se às
lesões necróticas no limbo foliar que prejudicam o valor
comercial do produto. Nos campos de produção de sementes,
a doença causa seca nas folhas devido a coalescência de muitas
manchas, resultando em danos na formação das sementes. O
fungo ataca principalmente as folhas, mas pode afetar também
a haste e os órgãos florais, em campos de produção de
sementes. Os sintomas nas folhas são manchas com contornos
irregulares. O tecido afetado, inicialmente com aspecto
desidratado, torna-se pardacento, com numerosos pontos de
cor escura que são os corpos de frutificação do fungo. Esses
corpos de frutificação são os picnídios, visíveis a olho nu.
Quando em ambiente úmido, verifica-se na parte superior dos
picnídios, uma massa de esporos (cirros) que só é liberada na
presença de filme de água. Não havendo água, os conídios
não germinam e dificilmente são disseminados pelo vento
(Pavan & Kurozawa, 1997). Segundo (Galli, 1980) existe uma
correlação entre o progresso da doença e a ocorrência de
condições ótimas para o desenvolvimento do patógeno, que
se multiplica e se dissemina por meio de reprodução assexual.
Não há cultivares consideradas imunes a esta doença,
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C.S. Sousa et al.
mas em observações de campo pode-se verificar diferenças
nos níveis de resistência horizontal.
O melhoramento das variedades visando o aumento do
nível de resistência é de grande importância para o controle
desta doença, tendo em vista que o uso de materiais mais
resistentes aumenta proporcionalmente a eficiência de outras
medidas aplicadas de maneira integrada. Dispor de metodologia
para distinguir diferenças nos níveis de resistência das
variedades ou nos materiais segregantes é condição fundamental para o trabalho de melhoramento.
Estudos que envolvem o controle deste fitopatógeno,
em especial a avaliação de resistência em condições controladas, exigem grande quantidade de inóculo. Assim, é de
primordial importância o uso de um meio de cultura que
proporcione condições ideais para sua esporulação (Bertagnolli
et al., 1988).
Este trabalho teve como objetivo, estabelecer metodologias adequadas para isolamento e inoculação de S .
lactucae em condições de casa de vegetação para a avaliação
de variedades ou cultivares de alface quanto à resistência ou
suscetibilidade à septoriose.
Os experimentos para otimização do isolamento e
preservação de S. lactucae foram realizados no laboratório de
Fitopatologia da Universidade Federal de Uberlândia.
Para o isolamento do fungo foram utilizadas duas
metodologias, a primeira, de transferência para o meio de cultura
de uma pequena seção de 2 a 3 mm de tecido retirado da região
de transição entre as áreas necrosada e sadia, previamente
tratada com soluções de hipoclorito a 1%, álcool a 70% e água
esterilizada e a outra, de transferência de cirros de conídios
que se formam sobre os picnídios diretamente para o meio de
cultura, com o auxílio de uma lupa e uma agulha esterilizada. O
meio de cultura BDA com os antibióticos sulfato de
estreptomicina e ampicilina a 200 mg/l, cloranfenicol a 50 mg/l
e rifampicilina a 10 mg/l (adicionados após a esterilização) foi
utilizado nas duas metodologias.
O fungo isolado da alface foi preservado pelo método
de dessecação da colônia, adaptado do método de preservação
de bactérias desenvolvido por Takatsu (1994). O fungo foi
cultivado em meio de BDA ou de V8 em placa de Petri por 15 a
20 dias à temperatura ambiente. As colônias selecionadas foram
embebidas com duas a três gotas da solução de gelatina e
dextrose a 5% (cada ingrediente foi esterilizado separadamente
e misturados no momento do uso) e transferidas com espátula
de aço flambada para placas de Petri descartáveis, com
perfurações (12 a 15 furos de 2 mm no fundo da placa) e mantidas
no dessecador com sílica gel durante dez a 15 dias. Para evitar
que as culturas do fungo ficassem aderidas à placa, elas foram
colocadas sobre um suporte de tela de metal recortado de
tamanho adequado para a placa e a colônia do fungo colocada
sobre este suporte.
As colônias dessecadas foram transferidas para
envelopes de papel e alumínio e mantidas na geladeira dentro
de vidro de boca larga e tampa de pressão, contendo sílica gel.
Para a recuperação do fungo, foram retiradas, com pinça
ou alicate de unha flambados, pequenas lascas das colônias
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dessecadas e transferidas para o meio de cultura.
No experimento em casa de vegetação, a inoculação foi
utilizada por aspersão da suspensão de inóculo na
concentração de 1 x 104 conídios por ml, em plantas cultivadas
em vasos, no estádio de seis a oito folhas, A escolha desta
concentração foi baseada nos dados obtidos por Malnati et
al. (1990) e Marchi et al. (2001) com Septoria lycopersici em
tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) e Dias (1990) com
Septoria passiflorae em maracujazeiro (Passiflora edulis Sims
f. flavicarpa Deg). A testemunha foi pulverizada apenas com
água e as plantas assim tratadas foram mantidas em condições
de câmara úmida (cobertas com sacos plásticos) por 48 h e
depois, esta condição foi mantida somente à noite até o
aparecimento de sintomas.
Foram utilizados vasos com capacidade para 1,5 l
preenchidos com uma mistura de solo com areia na proporção
de 2:1 e adubo orgânico. Esta mistura foi tratada com brometo
de metila na dosagem de 40 cm3/m3 de solo.
Foram avaliadas nove cultivares (Vitória de Santo
Antão, Uberlândia 10.000, Maioba, Elba, Aurélia, Black Seeded
Simpson, Gram Rapids, Salad Bowl-Mimosa e Babá de Verão),
em um delineamento de parcelas inteiramente casualizadas,
com quatro repetições. As avaliações foram feitas pela
contagem do número de folhas com sintomas no 11o dia após a
inoculação e pelo nível de severidade aos 11, 13, 15 e 17 dias
após a inoculação, utilizando-se uma escala de notas de 1 a 4
em função do grau de severidade visual das folhas, sendo
nota 1= 1 a 25% da folha com sintoma, nota 2= 26 a 50%, nota
3=51 a 75%, nota 4= 76 a 100%).
Foram efetuados os testes de normalidade (Shapiro-Wilk)
e homogeneidade (Bartlett). Posteriormente, fez-se análise da
variância com teste de Tukey mediante a utilização dos valores
obtidos a partir das observações da severidade da doença.
O experimento em condições de campo foi desenvolvido na área experimental do Instituto de Ciências Agrárias
da Universidade Federal de Uberlândia.
A temperatura mínima variou de 18 a 20 ºC, e a máxima
de 28 a 34 ºC, durante o período de realização do experimento;
a umidade relativa variou de 77 a 96%, e a precipitação de 4 a
96,5 mm.
As cultivares de alface foram as mesmas avaliadas em
condições de casa de vegetação. As mudas produzidas em
bandejas de 200 células foram transplantadas aos 20 dias,
quando apresentavam quatro a seis folhas definitivas, para
canteiros adubados com esterco de curral e superfosfato
simples. Foram efetuadas três adubações com uréia (10 g/m2)
aos dez, 20 e 30 dias.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos
casualizados, com nove tratamentos e três repetições. As
parcelas foram constituídas pelas cultivares plantadas no
espaçamento de 0,30 x 0,25 m, totalizando seis plantas.
A inoculação foi realizada 13 dias após o transplante
das mudas para o canteiro. O inóculo foi obtido a partir de
folhas com sintomas da doença, coletadas na Escola
Agrotécnica Federal de Uberlândia, as quais foram trituradas
com água em liquidificador, e a suspensão aplicada nas plantas.
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As avaliações foram feitas pelo nível de severidade
aos 11, 13, 19 e 23 dias após a inoculação, utilizando-se uma
escala de notas de 1 a 4 em função do grau de severidade
visual das folhas, sendo nota 1= 1 a 25% da folha com sintoma;
nota 2= 26 a 50%; nota 3= 51 a 75% e nota 4=76 a 100%, e pelo
cálculo da área abaixo da curva de progresso da doença.
Foram efetuados os testes de normalidade (ShapiroWilk) e homogeneidade (Bartlett). Posteriormente, fez-se
análise da variância com teste de Tukey mediante a utilização
dos valores obtidos a partir das observações da severidade da
doença, e dos valores obtidos por meio do cálculo da área
abaixo da curva de progresso da doença.
Para o isolamento de S. lactucae, somente o método de
transferência de cirros apresentou resultado satisfatório, sem
a contaminação com outros fungos. A utilização dos quatro
antibióticos não inibiu o crescimento do patógeno e permitiu o
isolamento livre de contaminação com bactérias.
O fungo recuperado de colônias preservadas por
dessecação não apresentou nenhuma variação durante todo o
período em que foi utilizado. O método é simples, prático mas
exige boa assepsia, sendo necessário o uso da câmara de fluxo
laminar.
A concentração de inóculo de 1 x 104 conídios/ml
utilizado neste experimento, com base nos dados de Marchi et
al. (2001), Malnati et al. (1992) e Dias (1990) foi também eficiente
para avaliar os níveis de tolerância das cultivares de alface
estudadas.
No experimento em casa de vegetação, o método de
contagem do número de folhas com sintomas não revelou
diferenças significativas entre as cultivares (Tukey a 1%). Porém
pelo nível de severidade foi possível distinguir diferenças entre
as cultivares na leitura efetuada aos 13 dias após a inoculação
(Tabela 1).
Nas avaliações feitas em condições de campo pelo nível
de severidade foi possível distinguir as diferenças entre as
cultivares na leitura efetuada no 23º dia após a inoculação,
com teste de Tukey a 5% (Tabela 1). Utilizando-se os valores
da área abaixo da curva de progresso da doença, pôde-se
observar diferenças significativas na evolução da doença entre
as cultivares avaliadas (Tabela 2).
Tanto em condições de casa-de-vegetação quanto em
condições de campo a cultivar Maioba, considerada como uma
cultivar com alta susceptibilidade em condições de campo
(Santos, 1996), apresentou a maior média, enquanto a cultivar
Vitória-de-Santo-Antão, foi, nas condições climáticas de
Uberlândia, a mais resistente nas três análises feitas, havendo
diferença significativa entre estas duas cultivares, tanto para
avaliação da severidade quanto para a área abaixo da curva de
progresso da doença. A cultivar Uberlândia 10.000 não diferiu
significativamente da cultivar Maioba nas análises feitas em
casa de vegetação, utilizando o nível de severidade da doença
e em campo utilizando o cálculo da área abaixo da curva de
progresso da doença. Quando analisado o nível de severidade
da doença, em campo, essa cultivar diferiu significativamente
da cultivar Maioba e das cultivares com menor média (Vitória
de Santo Antão, Babá e Mimosa). Visto que a cultivar Uberlândia
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TABELA 1 - Notas médias de severidade da septoriose em cultivares
de alface (Lactuca sativa), nos 13o e 23o dias após a inoculação em
condições de casa de vegetação e no campo, respectivamente
W
ß
ß
*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si em nível de 5%,
segundo o teste de Tukey. Dmáx: estatística do teste de Kolmogorov;
ß: estat ística do teste de Bartlett; W: estatística do teste de ShapiroWilk.
TABELA 2 - Médias obtidas pelo cálculo da área abaixo da curva de
progresso da septoriose das cultivares de alface (Lactuca sativa)
avaliadas
ß
*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si em nível de 5%,
segundo teste de Tukey. W: estatística do teste de Shapiro-Wilk; ß:
estat ística do teste de Bartlett.
10.000 é de grande interesse, devido ao seu alto teor de vitamina
A (10.200 U.I./100 g de folha), pode-se sugerir que seja feito um
retrocruzamento com o seu parental feminino (Vitória de Santo
Antão), visando aumentar sua resistência à septoriose.
Pelos resultados obtidos, a metodologia de avaliação,
em casa de vegetação, pode ser considerada como altamente
promissora para a avaliação rápida de grande número de
cultivares, nos trabalhos de melhoramento de alface para
resistência à septoriose.
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