‫مجم‬ ‫م‬ ‫وهع قاالت‬ ‫م ب طبی‬ ‫ع‬ ‫چهارمین همایش ملی کارربد فناوری هستهای رد علوم کشاورزی و نا ع ی‬ ‫‪ 03-92‬اردتشهبی ‪4021‬‬ ‫برگزار کننده‪:‬‬ ‫ژپوهکدده کشاورزی هستهای‬ ‫حامیان همایش‪:‬‬ ‫سازمان جهاد کشاورزی‬ ‫استان البرز‬ ‫دادکشنه کشاورزی‬ ‫ص‬ ‫دااگشنه نعتی اصفهان‬ ‫محی‬ ‫دادکشنه علوم طی‬ ‫دااگشنه کشاورزی و‬ ‫طب‬ ‫منابع یعی گرگان‬ ‫دادکشنه کشاورزی‬ ‫دااگشنه رتبیت مدرس‬ ‫دبیرخانه همایش‪ :‬استان البرز‪ ،‬کرج‪ ،‬انتهای رجائی شهر‪ ،‬بلوار شهید موذن‪ ،‬بلوار انرژی اتمی‪ ،‬مجتمع پژوهشی البرز‪ ،‬پژوهشکده کشاورزی هستهای‬ ‫صندوق پستی ‪ 58913/8941‬؛ تلفن ‪ ،06159919010‬نمابر‪06159919018 :‬‬ ‫پست الکترونیکی‪Nuclearagriculture@nrcam.org :‬‬ ‫آدرس اینترنتی‪ :‬سایت سازمان انرژی اتمی ایران‪ ،‬کاربرد در کشاورزی ‪http://www.aeoi.org.ir‬‬ )‫امام علی (علیه السالم‬ ‫صی‬ ‫ل‬ »‫«ا علم سلطان؛ من وجده صال و من لم یجده ل علیه‬ ‫ غلبه می یابد‬،‫ هر کس به آن دست یابد‬،‫«علم قدرت است‬ »‫و هر کس به آن دست نیابد زیر سلطه قرار میگیرد‬ Imam Ali (a.s): "Knowledge is power; anybody who has knowledge will be able to dominate those around him. Anybody who fails to gain knowledge will be ruled" ‫م جم‬ ‫وهع مقاالت‬ ‫م ب طبی‬ ‫ع‬ ‫چهارمین همایش ملی کارربد فناوری هسته ای رد علوم کشاورزی و نا ع ی‬ ‫‪ 03-92‬اردتشهبی ‪4021‬‬ ‫برگزار کننده‪:‬‬ ‫ژپوهکدده کشاورزی هستهای‬ ‫حامیان همایش‪:‬‬ ‫سازمان جهاد کشاورزی‬ ‫استان البرز‬ ‫دادکشنه کشاورزی‬ ‫محی‬ ‫دادکشنه علوم طی‬ ‫ص‬ ‫دااگشنه نعتی اصفهان‬ ‫طب‬ ‫دااگشنه کشاورزی و منابع یعی‬ ‫گرگان‬ ‫دادکشنه کشاورزی‬ ‫دااگشنه رتبیت مدرس‬ ‫با همکاری‪:‬‬ ‫استاندا ری البرز‬ ‫تح‬ ‫موسسه قیقات اصالح‬ ‫و تهیه نهال و بذر‬ ‫تح‬ ‫موسسه قیقات‬ ‫خاک و آب‬ ‫شهرداری کرج‬ ‫سازمان حفاظت محیط زیست‬ ‫سازمان حفظ نبااتت کشور‬ ‫دادکشنه کشاورزی‬ ‫دااگشنه رتبیت مدرس‬ ‫تح‬ ‫موسسه قیقات اصالح و تهیه‬ ‫بذر چغندر قند‬ ‫طب‬ ‫رپدیس کشاورزی و منابع یعی‬ ‫تح‬ ‫موسسه قیقات واکسن‬ ‫و سرم سازی رازی‬ ‫دااگشنه تهران‬ ‫تح‬ ‫موسسه قیقات‬ ‫گیاهپزشکی کشور‬ ‫دادکشنه کشاورزی‬ ‫تح‬ ‫موسسه قیقات‬ ‫علوم دام کشور‬ ‫ژپوهکدده بیوتکنولوژِی کشاورزی اریان‬ ‫مرجع ژپوهش اهی‬ ‫کشاورزی اریان (مپ کا)‬ ‫مجتم هش‬ ‫ع ژپو ی‬ ‫البرز‬ ‫پای گاه اطالعاتی‬ ‫مرجع دانش (سیویلی کا)‬ ‫پای گاه استنادی علوم‬ ‫جهان اسالم‬ ‫دبیرخانه همایش‪ :‬استان البرز‪ ،‬کرج‪ ،‬انتهای رجائی شهر‪ ،‬بلوار شهید موذن‪ ،‬بلوار انرژی اتمی‪ ،‬مجتمع پژوهشی البرز‪ ،‬پژوهشکده کشاورزی هستهای‬ ‫صندوق پستی ‪ 58913/8941‬؛ تلفن ‪ ،06159919010‬نمابر‪06159919018 :‬‬ ‫پست الکترونیکی‪Nuclearagriculture@nrcam.org :‬‬ ‫آدرس اینترنتی‪ :‬سایت سازمان انرژی اتمی ایران‪ ،‬کاربرد در کشاورزی ‪http://www.aeoi.org.ir‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫افزایش فعالیت آنزیم های کیتیناز در جدایه های موتانت قارچ ‪ Trichodrma harzianum‬با استفاده از‬ ‫القای موتاسیون با پرتو گاما‬ ‫عبداله بهاروند‪ ،1‬سمیرا شهبازی*‪،2‬حمیده‬ ‫افشارمنش‪ ،2‬محمد علی ابراهیمی‪ ،1‬حامد عسکری‪2‬‬ ‫‪ .1‬گروه بیوتکنولوژی کشاورزی‪ ،‬دانشکده کشاورزی‪ ،‬دانشگاه پیام نور کرج‪ ،‬البرز‬ ‫‪ . 2‬گروه گیاهپزشکی و نگهداری مواد غذایی‪ ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای‪ ،‬پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای‪ ،‬سازمان انرژی اتمی‪.‬‬ ‫نویسنده مسوول‪sshahbazi@nrcam.org :‬‬ ‫چکیده‪:‬جدایه قارچ ‪ T. harzianum‬از خاک ایزوله گردید و سوسپانسیون اسپور آن در دز ‪ 252‬گری پرتو گاما برای القای موتاسیون پرتوتابی شدد‪.‬‬ ‫موتانت های قارچ ‪ T. harzianum‬و جداسازی جدایه های موتانت آن‪ ،‬برای تولید آنزیم های کیتینولیتیک خارج سدلولی بدا اسدتهاده از روخ ترمیدر‬ ‫غوطه ور ی مورد استهاده قرار گرفت‪ .‬کیتین کلوئیدی به عنوان سوبسترای تولید آندزیم و سدن ش فلالیدت آنزیمدی مدورد اسدتهاده قدرار گرفدت‪ .‬جهدت‬ ‫سن ش پروتئین خارج سلولی از روخ بردفورد استهاده گردید‪ .‬همچنین خلوص و ترکیب نمونه های پروتئینی غنی از آنزیم کیتیناز با اسدتهاده از آزمدون‬ ‫‪ SDS-PAGE‬مورد مطالله قرار گرفت‪ .‬باالترین میزان غلظت پروتئین خارج سدلولی بده ترتیدب در نمونده هدای موتاندت ‪ T. h M11‬و ‪T. h M15‬‬ ‫مشاهده شد‪ .‬جدایه های موتانت ‪ T. h M8 ،T. h M11 ،T. h M15‬و ‪ T. h M6‬باالترین میزان فلالیت آنزیم کیتیناز را به خود اختصداص دادندد‪.‬‬ ‫نتایج آزمون ‪ SDS-PAGE‬داللت بدر حودور آندزیم هدای ‪ β-1,4-N acethyl glucoseaminidase‬و ‪ acetyl glucosaminase‬در جدایده‬ ‫های مرتلف داشت‪ .‬باالترین فلالیت آنزیمی در جدایه ‪ T. h M15‬مشاهده شد که دارای باالترین مقادیر آنزیم های اندوکیتینازی (‪ 22 ،22/5‬و ‪KDa‬‬ ‫‪ )22‬و آنزیم ‪ )26 KDa( β-(1,4)-N-acetyl glucoaminidase‬بود‪ .‬نتایج این مطالله به روشنی نشان می دهد که القای موتاسیون بدا پرتوگامدا در‬ ‫قارچ تریکودرما من ر به بهبود تولید آنزیم های کیتیناز برای کنترل بیولوژیک بیماری های گیاهی در آن می شود‪.‬‬ ‫واژگان کلیدی‪ :‬فعالیت آنزیمی‪ ،Trichoderma harzianum ،‬کیتیناز‪.SDS-PAGE ،‬‬ ‫‪The enhancement of chitinase enzyme production in Trichoderma harzianum by‬‬ ‫‪induced mutation by γ-irradiation‬‬ ‫‪Baharvand. A1, S. Shahbazi*2, H. Afsharmanesh2, M. A. Ebrahimi1, H. Askari2‬‬ ‫‪1. Biotechnology Department, Faculty of Agricultue, Payam e Noor University, Alborz.‬‬ ‫‪2. Plant Protection Department, Nuclear Agriculture Research School, Nuclear Science and Technology‬‬ ‫‪Research Institute (NSTRI), Atomic Energy Organization of Iran (AEOI), Alborz, Iran.‬‬ ‫‪sshahbazi@nrcam.org‬‬ ‫‪Abstract:The Trichoderma harzianum was isolated from soil and its spore suspensions‬‬ ‫‪were irradiated in dose of γ-radiation 250 Gy for induced mutation. The T. harzianum‬‬ ‫‪mutants were used for chitinolytic enzyme production. Colloidal chitin was used to‬‬ ‫‪chitinase production and enzyme activity assay. The extracellular protein concentration of‬‬ ‫‪T. viride and its mutants were determined by the dye binding method of Bradford. Also,‬‬ ‫‪the purity and composition of enzyme-rich protein samples were evaluated under‬‬ ‫‪denaturing conditions by SDS-PAGE. The highest extracellular protein production was‬‬ ‫‪observed in T. h M15 and T. h M11. Trichoderma mutants of T. h M15, T. h M11, T. h M8‬‬ ‫‪and T. h M6 maintained higher ability to chitinase enzyme activity, respectively. SDS-‬‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪981‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫‪Page analysis of the crud protein indicared the presence of different strain comparison‬‬ ‫‪comprise β-1,4-N acethyl glucoseaminidase, acetyl glucosaminase. The highest chitinase‬‬ ‫‪enzyme production was observed in T. h M15, that containing of large amount of Endo‬‬ ‫‪chitinase (24.5, 26 and 42 KDa) and β-1,4-N acethyl glucoseaminidase (68 KDa). The‬‬ ‫‪study clearly showed the possibility of improving the chitinase production of Trichoderma‬‬ ‫‪for biological control of plant diseases through mutation with γ-radiation.‬‬ ‫‪Keyword: Enzyme activity, Trichoderma harzianum, Chitinase, SDS-PAGE‬‬ ‫مقدمه‬ ‫کیتین پس از سلولز فراوانترین پلی ساکارید درطبیعت می باشد که در اسکلت خارجی سخت پوستان مانند میگو‪ ،‬دیواره‬ ‫سلولی قارچ های واقعی و حشرات یافت می شود (‪ )Kapat et al., 1996‬این پلیمرخطی از واحدهای پیوندی ‪β1-4 N-‬‬ ‫‪ acetylglucosamine‬تشکیل شده است‪ .‬آنزیم های کیتیناز پیوندهای گلیکوزیدی بتا (‪ )9،1‬پلیمر کیتین را به اجرای‬ ‫سازنده اش تجزیه می کنند (‪ .)Cohen-Kupiec & Chet, 1998‬این آنزیمها نقش مهمی درتغذیه و بیماریزایی باکتریها و‬ ‫قارچها و شکل زایی و اتولیز قارچها ایفا می کنند‪ .‬از کیتینازها درصنایع مختلف و همچنین تصفیه بیولوژیک آب دریا و‬ ‫صنایع داروسازی و سایر کاربردهای کلینیکی استفاده می شود‪ .‬تجزیه آنزیمی کیتین موجب تولید مشتقات کیتینی متنوعی‬ ‫مثل استیل گلوکزآمین و دی استیل کتوبیوز می شود که یک دی ساکارید با ارزش اقتصادی و پتانسیل با کاربردهای‬ ‫بیوتکنولوژیکی می باشد (‪ .)Deleon et al., 2004‬در واقع این آنزیم از آنزیم های کلیدی در لیز دیواره سلولی در خالل‬ ‫مایکوپارازیتیسم در مقابل فیتوپاتوژن های قارچی می باشد‪ .‬اگرچه باکتری های آنتاگونیست از اهمیت زیادی در مبارزه‬ ‫بیولوژیک برخوردارند‪ ،‬اما تعدادی از قارچ ها نیز به عنوان عوامل مبارزه بیولوژیک شناخته شده اند (‪.)Weller et al., 2002‬‬ ‫مکانیسم عمومی در کنترل بیولوژیکی به دو نوع تاثیر مستقیم و غیر مستقیم (عامل بیوکنترل بر بیمارگر گیاهی) تقسیم‬ ‫می شود‪ .‬اثرات مستقیم شامل رقابت برای غذا و مکان تولید آنتی بیوتیک ها و آنزیم ها و غیر فغال کردن آنزیم های‬ ‫بیمارگر می باشد‪ .‬اثرات غیر مستقیم نیز شامل تمامی فعالیت هایی که می تواند سبب تغییرات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی‬ ‫در گیاه میزبان (نظیر تنش های مختلف‪ ،‬حاللیت ترکیبات غیر آلی و هم چنین القای مقاومت سیستمیک) شود ( ‪Viterbo‬‬ ‫‪ .)et al. , 2002‬جنس ‪ Trichoderma spp‬از جمله قارچ های آزادزی هستند که عمدتاً در خاك فعالیت نموده و به عنوان‬ ‫عوامل کنترل بیولوژیک مؤثر علیه دامنه بسیار وسیعی از ارگانیسم های بیمارگر شامل قارچ های بیمارگر گیاهی (اعم از‬ ‫خاکزاد و هوا زاد) باکتری ها‪ ،‬پروتوزوآها‪ ،‬نماتدها و حتی ویروسها شناخته میشوند (‪ .)Howell, 2003‬گونه های‬ ‫تریکودرما به چند شیوه علیه موجودات هدف عمل می کنند‪ .‬سویه های پارازیت کننده قارچ میزبان‪ ،‬اثر خود را از طریق‬ ‫نفوذ مستقیم در هیف میزبان ویا تولید آنزیم های خارج سلولی اعمال می کنند‪ .‬عالوه بر آن‪ ،‬ممکن است آنتی بیوتیک‬ ‫های ضد قارچی تولید نموده و نیز آنزیم های هیدرولیز کننده القاکننده بیماری زایی را در پاتوژن مهار نمایند‪ .‬همچنین‬ ‫ممکن است تجزیه کننده های مواد آلی بوده و به ویژه وقتی که عناصر غذایی‪ ،‬عامل محدود کننده به شمار می آیند‪ ،‬به‬ ‫عنوان رقیب پاتوژن ها ی قارچی در فازهای ساپروبیک عمل کنند‪ .‬گزارش شده است که برخی از سویه ها‪ ،‬فعالیت باکتری‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪911‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫های ساپروبیک و قارچ های مایکوریزا‪ 9‬را افزایش می دهند و بعضی هم به عنوان محرك های رشد گیاهی مطرح بوده و‬ ‫سبب افزایش در اندازه گیاه‪ ،‬سطح و وزن برگ و نیز القای مقاومت در گیاه نسبت به پاتوژن های گیاهی می گردند‪ .‬نقش‬ ‫دوگانه فعالیت آنتاگونیستی علیه بیمارگرهای گیاهی و بهبود حاصلخیزی خاك‪ ،‬باعث می شود سویه های تریکودرما‬ ‫جانشین خوبی برای قارچ کش ها و مواد ضدعفونی کننده تدخینی باشند‪ .‬بسیاری از سویه های تریکودرما که دارای‬ ‫پتانسیل کنترل بیماری ها هستند‪ ،‬معرفی شده اند (‪ .)Monte, 2001‬با مشخص شدن عوامل ژنتیکی دخیل در القای‬ ‫مقاومت‪ ،‬امکان ایجاد موتان های جدید با قابلیت های برتر برای اجرای کنترل بیولوژیکی مورد بررسی قرار گرفته است‪.‬‬ ‫دانشمندان با ایجاد تغییرات ژنتیکی در آنتاگونیست ها سعی می کنند تا کیفیت عمل آنها را به عنوان عوامل کنترل‬ ‫بیولوژیکی ارتقا دهند‪ .‬یکی از روشهای بکار گرفته شده برای افزایش توانایی آنتاگونیست‪ ،‬القای موتاسیون تصادفی با‬ ‫بکارگیری موتاژن های فیزیکی نظیر امواج الکترومغناطیس ‪ ،X ،UV‬گاما و یا استفاده از موتاژن های شیمیایی مانند اتیل‬ ‫متان سولفانات می باشد (‪ .)Gohel et al., 2004‬در این پژوهش قارچ ‪ Trichoderma harzianum‬از خاك جداسازی‬ ‫گردیده و با استفاده از پرتوتابی گاما القای موتاسیون در آن صورت گرفته است و جدایه های موتانت آن از نظر میزان تولید‬ ‫پروتئین خارج سلولی و الگوی الکتروفورتیک آن و تغییرات فعالیت آنزیم کیتیناز مورد مطالعه قرار گرفته است‪.‬‬ ‫مواد و روش ها‬ ‫تولید کیتین کلوئیدی‬ ‫کیتین کلوئیدی به عنوان منبع کربن برای تولید آنزیم های کیتیناز و سنجش فعالیت آنزیم کیتیناز مورد استفاده قرار‬ ‫می گیرد‪ ،‬چراکه القا کننده آنزیم کیتیناز می باشد‪ .‬ک یتین کلوئیدی بوسیله پیش تیمار کیتین پوست میگو در اسید‬ ‫ارتوفسفریک ‪ )w/v( % 88‬برای مدت ‪ 41‬ساعت در ‪ 1 ˚C‬انجام گرفت تا خاصیت کلوئیدی در کیتین افزایش پیدا کند به‬ ‫نحوی که به آسانی توسط آنزیم مورد استفاده قرار گیرد‪ .‬بعد از پیش تیمار با اسید‪ ،‬مواد جامد با استفاده از یک فیلتر‬ ‫پارچه ای صاف شد و چندین مرتبه با آب مقطر شستشو گردید تا ‪ pH‬ماده جامد به حدود ‪ 8‬برسد‪ .‬سپس کیتین کلوئیدی‬ ‫در دمای ‪ -01 ˚C‬برای مدت ‪ 41‬ساعت منجمد گردید و با استفاده از خشک کن انجمادی برای مدت ‪ 18‬ساعت خشک‬ ‫گردید و تا اندازه مش ‪ 85-948‬میکرون آسیاب شد‪.‬‬ ‫تولید آنزیم کیتیناز‬ ‫جدایه های قارچ ‪( T. harzianum‬موتانت و وحشی‪ -‬کلکسیون گروه پژوهشی گیاه پزشکی و نگهداری مواد غذایی‬ ‫پژوهشکده کشاورزی هسته ای) بر روی محیط کشت ‪ MYG agar‬حاوی ‪ 8 g.L-1‬عصاره مالت‪ 4/8 g.L-1 ،‬عصاره مخمر‪،‬‬ ‫‪ 91 g.L-1‬گلوکز و ‪ 41 g.L-1‬آگار کشت داده شدند و در دمای ‪ 48 ˚C‬گرمخانه گذاری گردیدند‪ .‬با استفاده از محلول‬ ‫سیلین از پلیت های هفت روزه حاوی اسپور‪ ،‬سوسپانسیون اسپوری با جمعیت ‪ 910-918 spore.ml-1‬تهیه گردید‪ .‬کشت‬ ‫اولیه سوسپانسیون اسپوری در محیط ‪ )TCM( Trichoderma complete medium‬حاوی ‪9‬گرم در لیتر باکتوپپتون‪1/5 ،‬‬ ‫گرم در لیتر اوره‪ 4 ،‬گرم در لیتر ‪ 9/1 ،KH2PO4‬گرم در لیتر ‪ 1/5 ،(NH4)2SO4‬گرم در لیتر ‪ 1/5 ،MgSO4.7H2O‬گرم در‬ ‫‪Mychorhiza‬‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫‪1‬‬ ‫صفحه ‪919‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫لیتر ‪ 1/118 ،CaCl2.6H2O‬گرم در لیتر ‪ 1/114 ،FeSO4.7H2O‬گرم در لیتر ‪ 1/114 ،MnSO4‬گرم در لیتر ‪ ZnSO4‬و‬ ‫‪ 1/114‬گرم در لیتر ‪ CoSO4.7H2O‬و ‪ 4‬میلی لیتر در لیتر توئین انجام گرفت‪ pH .‬محیط کشت ‪ TCM‬بر روی ‪ 8/8‬تنظیم‬ ‫گردید و به آن ‪ )w/v( % 1/5‬گلوکز افزوده شد‪ .‬انجام عمل تخمیر در محیط کشت ‪ TCM‬در ارلن مایر ‪ 481 ml‬حاوی ‪ml‬‬ ‫‪ 81‬محیط ‪ TCM‬در دمای ‪ 48 ˚C‬به مدت ‪ 41‬ساعت و ‪ 981 rpm‬انجام گرفت و بعد از مدت زمان فوق اسپورها تبدیل به‬ ‫حالت رویشی میسلیوم گردیدند‪ .‬با استفاده از سانتریفوژ کردن در ‪ 1811 rpm‬به مدت ‪ 0‬دقیقه میسلیوم ها از محیط‬ ‫‪ TCM‬جداسازی شدند و جهت القای تولید آنزیم های هیدرولیتیک میسلیوم های شسته شده با سیلین به ارلن مایر ‪ml‬‬ ‫‪ 811‬حاوی ‪ 81 ml‬محیط ‪()TFM( Trichoderma fermentation medium‬مشابه ترکیبات محیط ‪ ،TCM‬اما بدون‬ ‫باکتوپپتون و گلوکز) انتقال داده شد‪ .‬این محیط در ‪ 8/8 pH‬تنظیم شده بود و برای القای قارچ به تولید آنزیم های کیتیناز‬ ‫به آن مقدار ‪ )w/v( 1/8 %‬کیتین کلوئیدی اضافه شده بود‪ .‬شرایط رشد مشابه شرایط قبل در ‪ 981 rpm‬و دمای ‪ 48 ˚C‬به‬ ‫مدت ‪ 18‬ساعت انجام شد‪ .‬بعد از مدت زمان فوق میسلیوم های قارچ توسط سانتریفیوژ کردن در ‪ 1811 rpm‬به مدت ‪0‬‬ ‫دقیقه خارج گردید و مایع فوقانی برای اندازه گیری پروتئین خارج سلولی و فعالیت آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت‪.‬‬ ‫اندازه گیری غلظت پروتئین خارج سلولی تولیدی در محیط ‪TFM‬‬ ‫اندازه گیری پروتئین در مایع فوقانی محیط ‪ TFM‬با استفاده از روش بردفورد انجام گرفت‪ .‬مقدار ‪ 5‬میلی لیتر از معرف‬ ‫بردفورد در داخل لوله آزمایش ریخته شد و به آن ‪ 981‬مایکرولیتر از مایع فوقانی ‪ TFM‬تخمیر شده اضافه شد‪ .‬ازمایع‬ ‫فوقانی ‪ TFM‬استریل ب ه عنوان نمونه شاهد استفاده گردید‪ .‬جذب نمونه ها در طول موج ‪ 818‬نانومتر با استفاده از‬ ‫اسپکتروفتومتر قرائت گردید و با استفاده از نمودار استاندارد ترسیم شده با پروتئین خالص ‪Bovine serum albumin‬‬ ‫(‪ ،)BSA‬مقدار پروتئین بر حسب میلی گرم در میلی لیتر (‪ )mg.ml-1‬در مایع فوقانی محیط تخمیر ‪ TFM‬محاسبه گردید‪.‬‬ ‫تعیین فعالیت آنزیم های کیتیناز‬ ‫مخلوط واکنش آنزیمی شامل ‪ 411‬میکرولیتر مایع فوقانی محیط تخمیر ‪ TFM‬حاوی آنزیم کیتیناز ‪411 ،‬میکرولیتر‬ ‫بافر استات پتاسیم ‪ 98‬میلی موالر (‪ )pH 8/8‬که حاوی ‪ 1/8‬گرم در لیتر کیتین کلوئیدی می باشد‪ ،‬تهیه و در حمام آبگرم‬ ‫دمای ‪ 50‬سانتی گراد به مدت یک ساعت انکوبه شدند‪ .‬برای توقف واکنش آنزیمی از افزودن یک میلی لیتر ‪ NaOH‬یک‬ ‫درصد و سانتریفیوژ متعاقب انجام شد‪ 911 .‬میکرولیتر بافر پتاسیم تترابورات ‪ 1/8‬موالر با (‪ )PH 8/1‬افزوده و به مدت ‪5‬‬ ‫دقیقه در آب جوش قرار گرفت‪ 5 .‬میلی لیتر معرف ‪ 91( DMAB‬گرم در ‪ 911‬میلی لیتر مخلوط ‪ ٪94/8‬اسید استیک‬ ‫گالسیال و‪ ٪80/8‬اسیدکلریدریک ‪ 91‬نرمال) به محلول فوق افزوده شد و در آب جوش به مدت ‪ 8‬دقیقه قرار داده و سپس‬ ‫در آب سرد قرار دادیم و بالفاصله جذب نوری محلول در طول موج ‪ 811‬نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر قرائت‬ ‫شد‪.‬‬ ‫الکتروفورز و تعیین وزن مولکولی آنزیم های تولیدی در جدایه های موتانت‬ ‫آزمون الکتروفورز با استفاده از روش ‪ )9101( Laemmli‬با استفاده از ژل متراکم کننده ‪ % 1‬و ژل تفکیک کننده ‪94/8‬‬ ‫‪ %‬انجام شد‪ .‬جهت آماده سازی نمونه پروتئینی حاوی کمپلکس های آنزیمی‪ ،‬ابتدا مقدار ‪ ml 8‬از مایع فوقانی محیط‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪914‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫تخمیر ‪ TFM‬از هر یک از نمونه های حاصل از تخمیر های تولید آنزیم (سلوالز‪ ،‬کیتیناز و گلوکاناز) با مقدار ‪ ml 8‬از استون‬ ‫سرد (‪ )-41 °C‬مخلوط شد و رسوب پروتئینی آن با استفاده از سانتریفیوژ کردن در ‪ 1811 rpm‬به مدت ‪ 0‬دقیقه جمع‬ ‫آوری شد‪ .‬بعد از خروج استون از نمونه ها‪ ،‬مقدار ‪ 911 µl‬آب مقطر دوبار تقطیر به آنها اضافه شد و به خوبی مخلوط‬ ‫گردید‪ .‬سپس ‪ 911 µl‬از بافر نمونه به آنها اضافه شد و به مدت ‪ 8‬دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد و به مقدار ‪µl‬‬ ‫‪ 41‬از نمونه ها در هر چاهک تزریق شد‪ .‬آزمون الکتروفورز در آمپر ثابت ‪ 41 mA‬انجام شد و ژل الکتروفورز با استفاده از‬ ‫کوماسی بریلیانت گرین ‪ R-250‬رنگ آمیزی گردید و با استفاده از رنگبر حاوی متانول‪:‬اسید استیک‪:‬آب به نسبت های‬ ‫‪ 8:9:9‬رنگبری گردید‪.‬‬ ‫آنالیز آماری‬ ‫کلیه نتایج آزمایشات با استفاده از آنالیز واریانس (‪ )ANOVA‬و مقایسه میانگین ها به روش دانکن در سطح آمای‬ ‫‪ P> 1/18‬انجام گرفت‪ .‬آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار ‪( SPPS‬ویرایش ‪ )95‬انجام گرفت و کلیه آزمایشات در سه تکرار‬ ‫انجام شد‪.‬‬ ‫نتایج و بحث‬ ‫با توجه به نتایج بدست آمده در مطالعات قبلی (‪ ،)Mohamadi et al., 2014‬دز پرتوتابی ‪ 481 Gy‬به عنوان دز مناسب‬ ‫برای القای موتاسیون در اسپورهای قارچ تریکودرما تشخیص داده شد‪ ،‬زیرا باعث کاهش حدود ‪ % 81‬در قدرت جوانه زنی‬ ‫اسپور شده بود‪ .‬بر این اساس سوسپانسیون اسپور از قارچ ‪ T. harzianum‬با جمعیت ‪ 9×916 spore/ml‬تهیه گردید و در‬ ‫دز ‪ 481 Gy‬پرتوتابی شد و بعد از تهیه سریال رقت و کشت آنها بر روی محیط کشت ‪ ،PDA‬جداسازی تک اسپورها‬ ‫صورت گرفت و به محیط کشت تازه انتقال داده شدند و جهت کامل شدن رشد قارچ‪ ،‬کلیه پلیت ها به مدت ‪ 04‬ساعت در‬ ‫داخل گرمخانه ‪ 48 °C‬قرار داده شدند و کشت های متوا لی از هر پلیت در طول فواصل زمانی مختلف گرفته شده تا‬ ‫خصوصیات جدایه های موتانت تثبیت گردد‪ .‬از کلیه جدایه های قارچ مورد آزمون کشت تازه بر روی محیط ‪ PDA‬تهیه‬ ‫گردید و جهت تولید اسپور بر روی محیط ‪ MYG agar‬کشت داده شدند‪ .‬از محیط های ‪ 8-0‬روزه آنها با استفاده از محلول‬ ‫سیلین سوسپانسیون اسپور تهیه گردید و جمعیت آنها در ‪ 910 spore.ml-1‬تنظیم گردید‪ .‬بعد از تلقیح اسپورها در محیط‬ ‫‪ TCM‬و گرمخانه گذاری آنها در ‪ 48 °C‬برای مدت ‪ 41‬ساعت در ‪ ،981 rpm‬میسلیوم های تولید شده بعد از سانتریفیوژ‬ ‫کردن در ‪ 1811 rpm‬به مدت ‪ 0‬دقیقه و جداسازی محیط ‪ TCM‬از آنها با استفاده از محلول سیلین شستشو داده شدند و‬ ‫به محیط تخمیر ‪ TFM‬منتقل شدند و به مدت ‪ 18‬ساعت در همان شرایط قبل گرمخانه گذاری شدند‪ .‬سپس نمونه ها بعد‬ ‫از زمان فوق سانتریفیوژ شدند و مایع فوقانی آنها برای اندازه گیری غلظت پروتئین خارج سلولی و اندازه گیری فعالیت‬ ‫آنزیم های کیتیناز مورد استفاده قرار گرفتند‪.‬‬ ‫مقایسه تولید پروتئین خارج سلولی و تعیین فعالیت آنزیمی‬ ‫شکل ‪ ،9‬مقایسه میانگین غلظت پروتئین (‪ )mg/ml‬و فعالیت آنزیم کیتیناز (‪ )U/ml‬در مایع فوقانی محیط تخمیر‬ ‫‪ TFM‬حاوی کیتین کلوئیدی برای قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬و جدایه های موتانت آنرا نشان می دهد‪ .‬کلیه نتایج در‬ ‫سطح آماری ‪ 1/18‬دارای اختالف معنی دار آماری بودند‪ .‬نتایج نشان داد که باالترین میزان غلظت پروتئین خارج سلولی به‬ ‫ترتیب در نمونه های موتانت ‪ Th M12 ،Th M10 ،Th M15 ،Th M11‬و ‪ Th M4‬مشاهده می شود‪ .‬میزان تولید پروتئین‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪915‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫خارج سلولی از مقدار ‪ 1/151‬الی ‪ 1/911 mg/ml‬متغیر بود‪ .‬پایین ترین میزان تولید پروتئین خارج سلولی در جدایه‬ ‫موتانت ‪ Th M19‬مشاهده گردید‪ .‬باالترین فعالیت آنزیم کیتیناز به ترتیب در جدایه های موتانت ‪Th ،Th M11 ،Th M15‬‬ ‫‪ M8‬و ‪ Th M6‬مشاهده گردید‪ .‬میزان فعالیت آنزیم کیتیناز در قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬و جدایه های موتانت آن از‬ ‫‪ 1/18‬الی ‪ 5/05 U/ml‬متغیر بود‪ .‬پایین ترین میزان فعالیت آنزیم کیتیناز در جدایه موتانت ‪ Tv M7‬مشاهده گردید‪.‬‬ ‫شکل‪ .1‬مقایسه غلظت پروتئین خارج سلولی و فعالیت آنزیم کیتیناز در مایع فوقانی محیط تخمیر ‪ TFM‬حاوی کیتین کلوئیدی در‬ ‫قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬و جدایه های موتانت آن‬ ‫بررسی پروفایل پروتئینی آنزیم های کیتیناز در قارچ ‪ T. harzainum‬و جدایه های موتانت آن‬ ‫شکل ‪ ،)a( -4‬پروفایل پروتئین آنزیم های کیتیناز در قارچ ‪ T. harzianum‬و جدایه های موتانت آن ( ‪ Th M1‬الی‬ ‫‪ ) M5‬را نشان می دهد‪ .‬کلیه نمونه های مورد مطالعه در این پروفایل پروتئینی باند های متعددی را در محدوده وزن‬ ‫مولکولی ‪ 91/8-908 KDa‬را نشان می دهند‪ .‬کلیه نمونه ها دارای باند پروتئینی شارپی در وزن مولکولی ‪ 60 KDa‬بودند‬ ‫که بیانگر آنزیم ‪-N‬استیل گلو کوآمینیداز می باشد‪ .‬بیان این آنزیم به ترتیب در جدایه های موتانت ‪Th ،Th M4 ،Th M1‬‬ ‫‪ Th M3 ،M2‬و ‪ Th M5‬نسبت به نمونه قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬باالتر بود‪ .‬باند آنزیمی شارپ دیگری در وزن مولکولی‬ ‫‪ 14 KDa‬مشاهده گردید که بیانگر حضور آنزیم اندوکیتیناز (‪ )Chit 42‬می باشد‪ .‬بیان این آنزیم در این پروفایل پروتئینی‬ ‫در جدایه های موتانت ‪ Th M4‬و ‪ Th M1‬نسبت به دیگر جدایه ها باالتر بود‪ .‬همچنین باند ضعیفی از این آنزیم در جدایه‬ ‫های موتانت ‪ Th M2‬و ‪ Th M3‬مشاهده گردید‪ .‬با این حال گونه وحشی قارچ ‪ T. harzianum‬و جدایه موتانت ‪Th M5‬‬ ‫دارای باند آنزیمی ضعیفی از این پروتئینی در پروفایل خود بود‪ .‬در جدایه ‪ Th M4‬باند پروتئینی شارپی در وزن مولکولی‬ ‫‪ 59 KDa‬مشاهده شد که ناشی از حضور آنزیم اندوکیتیناز (‪ )Chit 31‬بود‪ .‬همچنین باند آنزیمی با وزن مولکولی ‪56 KDa‬‬ ‫مربوط به آنزیم اندوکیتیناز در این جدایه موتانت قابل مشاهده بود‪ .‬این باند آنزیمی در دیگر جدایه های موتانت و قارچ‬ ‫وحشی ‪ T. harzianum‬دارای بیان ضعیفی بود‪ .‬شکل‪ )b( -4‬پروفایل پروتئینی آنزیم های کیتیناز در قارچ وحشی ‪T.‬‬ ‫‪Th‬‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪911‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫‪ harzianum‬و جدایه های موتانت آن (‪ Th M6‬الی ‪ )Th M10‬را نشان می دهد‪ .‬کلیه نمونه های مورد آزمون دارای باندهای‬ ‫پروتئینی متفاوتی در محدوده وزن مولکولی ‪ 91/8-908 KDa‬بودند‪ .‬کلیه نمونه های مورد آزمون دارای باند های پروتئینی‬ ‫متفاوتی در محدوده وزن مولکولی ‪ 91/8-908 KDa‬بودند و دارای باند پروتئینی شارپی در وزن مولکولی ‪ 68 KDa‬بودند‬ ‫که مربوط به آنزیم ‪-N‬استیل گلوکوآمینیداز می باشد‪.‬‬ ‫)‪(b‬‬ ‫)‪(a‬‬ ‫)‪(d‬‬ ‫)‪(c‬‬ ‫شکل ‪ .2‬مقایسه پروفایل پروتئینی آنزیم های کیتیناز در قارچ وحشی ‪ T. harzainum‬و جدایه های موتانت آن‬ ‫(‪ :)a‬به ترتیب (‪ :)9‬قارچ وحشی ‪ Th M5 )6( ،Th M4 )8( ،Th M3 :)1( ،Th M2 :)5( ،Th M1 :)4( ،T. harzianum‬و ‪ :M‬مارکر پروتئین)‬ ‫(‪ :)b‬به ترتیب (‪ :)9‬قارچ وحشی ‪ Th M10 )6( ،Th M9 )8( ،Th M8 :)1( ،Th M7 :)5( ،Th M6 :)4( ،T. harzianum‬و ‪ :M‬مارکر پروتئین)‬ ‫(‪ :)c‬به ترتیب (‪ :)9‬قارچ وحشی ‪ Th M15 )6( ،Th M14 )8( ،Th M13 :)1( ،Th M12 :)5( ،Th M11 :)4( ،T. harzianum‬و ‪ :M‬مارکر‬ ‫پروتئین)‬ ‫(‪ :)d‬به ترتیب (‪ :)9‬قارچ وحشی ‪ Th M20 )6( ،Th M19 )8( ،Th M18 :)1( ،Th M17 :)5( ،Th M16 :)4( ،T. harzianum‬و ‪ :M‬مارکر‬ ‫پروتئین)‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪918‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫بیان این آنزیم در جدایه ‪ Th M10‬نسبت به دیگر جدایه ها باالترین مقدار را داشت و کمترین میزان بیان این آنزیم در‬ ‫جدایه ‪ Th M9‬مشاهده گردید‪ .‬د یگر جدایه های موتانت در این پروفایل پروتئینی شامل ‪ Th M7 ،Th M8‬و ‪ Th M6‬نیز‬ ‫دارای بیان باالتری نسبت به قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬بودند‪ .‬پروفایل پروتئین آنزیم ‪ Th M6‬مشابه با پروفایل پروتئین‬ ‫قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬بود و باند های آنزیمی ‪-N‬استیل گلوکوآمینیداز با وزن های مولکولی باالتر از ‪ 05 KDa‬شامل‬ ‫باند آنزیمی ‪ 88 KDa‬و ‪ 914 KDa‬در آن قابل مشاهده بود‪ .‬باالترین بیان آنزیم اندوکیتیناز با وزن مولکولی ‪ 14 KDa‬در‬ ‫جدایه موتانت ‪ Th M10‬مشاهده گردید‪ .‬بیان این آنزیم در دیگر جدایه های موتانت و قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬به‬ ‫صورت جزئی قابل مشاهده بود‪ .‬باالترین بیان آنزیم اندوکیتیناز ‪ 55 KDa‬در جدایه های موتانت ‪ Th M9‬و ‪ Th M8‬مشاهده‬ ‫گردید‪ .‬دیگر جدایه های موتانت در این پروفایل پروتئینی دارای باند پروتئینی ضعیفی از این آنزیم بودند‪ .‬باند پروتئینی‬ ‫دیگری در وزن مولکولی ‪ 56 KDa‬قابل مشاهده بود که باالترین بیان این آنزیم اندوکیتینازی (‪ )Chit 36‬در جدایه های‬ ‫موتانت ‪ Th M9 ،Th M10 ،Th M8‬و ‪ Th M7‬مشاهده گردید‪ .‬جدایه موتانت ‪ Th M6‬فاقد این باند آنزیمی بود‪ .‬در جدایه‬ ‫موتانت ‪ Th M10‬دو باند آنزیمی شارپ دیگر نیز قابل مشاهده بود‪ .‬یکی با وزن مولکولی ‪ 59 KDa‬که بیانگر آنزیم‬ ‫اندوکیتیناز (‪ ) Chit 31‬بود و همچنین احتمال دارد نوعی آلکالین پروتئاز باشد و همچنین آنزیم دیگری با وزن مولکولی‬ ‫‪ 90 KDa‬در جدایه موتانت ‪ Th M10‬مشاهده شد که احتماالً به دلیل تولید باالی آنزیم کیتیناز در این جدایه موتانت و‬ ‫اتولیز دیواره سلولی قارچ منجر به تحریک این جدایه به تولید آنزیم ‪-)9-5(-β‬اندوگلوکاناز شده باشد‪ .‬شکل ‪ )c( -4‬پروفایل‬ ‫پروتئین آنزیم های کیتیناز در قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬و جدایه های موتانت آن (‪ Th M11‬الی ‪ )Th M15‬را نشان می‬ ‫دهد‪ .‬کلیه نمونه های مورد آزمون دارای باند های آنزیمی متفاوتی در محدوده وزن مولکولی ‪ 91/8-908 KDa‬بودند‪ .‬آنزیم‬ ‫‪-N‬استیل گلوکوآمینیداز با وزن مولکولی ‪ 68 KDa‬در کلیه نمونه های مورد مطالعه در این پروفایل پروتئینی قابل مشاهده‬ ‫بودند‪ .‬باالترین بیان این آنزیم در جدایه موتانت ‪ Th M13‬و ‪ Th M14‬مشاهده گردید‪ .‬با این حال کلیه جدایه های موتانت‬ ‫دارای بیان آنزیمی باالتری نسبت به قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬بودند‪ .‬آنزیم اندوکیتیناز با وزن مولکولی ‪ 14 KDa‬باند‬ ‫پروتئینی شارپی در جدایه ‪ Th M11‬و ‪ Th M15‬ایجاد نمود‪ .‬دیگر جدایه های موتانت دارای باند آنزیمی ضعیف تری نسبت‬ ‫به این دو جدایه بودند‪ .‬همچنین قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬باند آنزیمی ضعیفی در وزن مولکولی ‪ 14 KDa‬که بیانگر‬ ‫آنزیم اندوکیتیناز می باشد را ایجاد نمود‪ .‬دو جدایه موتانت ‪ Th M13‬و ‪ Th M14‬دارای باند آنزیمی شارپی در وزن مولکولی‬ ‫‪ 41/8 KDa‬و ‪ 46 KDa‬بودند که احتماالً متعلق به خانواده اندوکیتیناز ها می باشند‪ .‬این باند های آنزیمی در پروفایل‬ ‫پروتئینی قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬و دیگر جدایه های موتانت مشاهده نگردید‪ .‬شکل ‪ )d( -4‬پروفایل پروتئینی آنزیم‬ ‫های کیتیناز در قارچ وحشی ‪( T. harzianum‬چاهک شماره ‪ ) 9‬و جدایه های موتانت آن را نشان می دهد‪ .‬کلیه نمونه های‬ ‫مورد آزمون دارای باند پروتئینی متفاوتی در محدوده وزن مولکولی ‪ 91/8-908 KDa‬بودند‪ .‬کلیه نمونه های مورد مطالعه‬ ‫در این پروفایل پروتئینی دارای باند آنزیمی ‪-N‬استیل گلوکوآمینیداز با وزن مولکولی ‪ 60 KDa‬بودند‪ .‬جدایه های موتانت‬ ‫‪ Th M19 ،Th M17 ،Th M16‬و ‪ Th M20‬دارای بیان آنزیمی باالتری نسبت به جدایه ‪ Th M18‬بودند‪ .‬باند آنزمی شارپ‬ ‫دیگری در وزن مولکولی ‪ 14 KDa‬مربوط به آنزیم اندوکیتیناز مشاهده گردید که باالترین بیان این آنزیم در جدایه موتانت‬ ‫‪ Th M17‬و بعد از آن در جدایه های موتانت ‪ Th M19 ،Th M20‬و ‪ Th M16‬صورت گرفت‪ .‬این جدایه های موتانت دارای‬ ‫بیان آنزیمی اندوکیتیناز باالتری نسبت به قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬بودند‪ .‬همچنین آنزیم اندوکیتیناز با وزن مولکولی‬ ‫‪ 55 ،59‬و ‪ 56 KDa‬در جدایه موتانت ‪ Th M17‬قابل مشاهده بود‪ .‬در این جدایه باند شارپی با وزن مولکولی ‪91 KDa‬‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪916‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ ‫(‪ 03-92‬اردیبهشت‪ ،4021 ،‬پژوهشکده کشاورزی هسته ای)‬ ‫& ‪The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural‬‬ ‫)‪Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School‬‬ ‫مشاهده گردید که این باند آنزیمی در جدایه ‪ Th M19‬و ‪ Th M20‬نیز قابل مشاهده بود که احتماالً نوعی از آنزیم ‪-5(-β‬‬ ‫‪-)9‬اندوگلوکاناز می باشد‪.‬‬ ‫نتیجه گیری‬ ‫گونه های مختلف جنس تریکودرما آنزیم های تجزیه کننده کیتین (کیتیناز) ترشح می کنند که می توانند دیواره‬ ‫سلولی آسکومیست ها و بازدیومیست ها را تجزیه کنند‪ .‬آنزیم های کیتیناز تولید شده توسط گونه های تریکودرما‪ ،‬مورد‬ ‫توجه زیادی قرار گرفته اند‪ ،‬زیرا کیتین یکی از ترکیبات اصلی ساختار دیواره سلولی بسیاری از قارچ های پاتوژن خاکزاد‬ ‫گیاهی می باشد و به همین دلیل‪ ،‬کیتینازها در کنترل تعداد زیادی از عوامل بیماریزای گیاهی نقش مهمی دارند‪ .‬با توجه‬ ‫به نتایج بدست آمده از اندازه گیری فعالیت آنزیم کیتیناز‪ ،‬در میان جدایه های قارچ ‪ ،T. harzianum‬جدایه های موتانت‬ ‫‪ Th M8 ،Th M11 ،Th M15‬و ‪ Th M6‬دارای باالترین میزان فعالیت آنزیمی نسبت به نمونه قارچ وحشی و دیگر جدایه‬ ‫های موتانت بودند‪ .‬همانطور که در جدول ‪ 4‬نشان داده شده است جدایه موتانت ‪ Th M15‬دارای باالترین شدت باند‬ ‫آنزیمی اندوکیتیناز با وزن های مولکولی ‪ 14 KDa‬و ‪ 41/8‬و ‪ 46 KDa‬و همچنین آنزیم ‪β-(1,4)-N-acetyl‬‬ ‫‪ glucoaminidase‬با وزن مولکولی ‪ 68 KDa‬است‪ .‬اثرات سینرژیستی این آنزیم ها بر سوبسترای کیتین کلوئیدی و تولید‬ ‫بیشتر این آنزیم ها در این جدایه موتانت موجب برتری آن در بین جدایه های موتانت قارچ ‪ T. harzianum‬شده است‪.‬‬ ‫پروفایل پروتئینی جدایه موتانت ‪ Th M15‬مشابه با پروفایل پروتئین جدایه موتانت ‪ Th M11‬بود و تفاوت عمده این دو‬ ‫قارچ با دیگر جدایه ها در داشتن باند های آنزیمی با وزن مولکولی ‪ 41/8‬و ‪ 46 KDa‬بود‪ .‬جدایه موتانت ‪ Th M8‬نیز دارای‬ ‫باندهای آنزیمی شاپی در وزن های مولکولی ‪ 56 ،55‬و ‪ 68 KDa‬بود‪ .‬غلظت باند آنزیمی ‪β-(1,4)-N-acetyl‬‬ ‫‪ glucoaminidase‬با وزن مولکولی ‪ 68 KDa‬در این جدایه قابل توجه بود‪ .‬همچنین جدایه ‪ Th M6‬دارای پروفایل پروتئینی‬ ‫مشابه ای با نمونه قارچ وحشی ‪ T. harzianum‬بود و تنها تفاوت آن‪ ،‬عدم حضور آنزیم های اندوکیتیناز ‪ 56‬و ‪ 59 KDa‬در‬ ‫جدایه موتانت ‪ Th M6‬بود‪ .‬بر اساس نتایج بدست آمده تفاوت هایی در فعالیت آنزیم کیتیناز و الگوی باند های حاصل از‬ ‫پروتئین های خارج سلولی در جدایه های جهش یافته در مقایسه با جدایه های والد (وحشی) مشاهده گردید‪ .‬استفاده از‬ ‫روش القای موتاسیون با پرتو تابی گاما توانایی تولید آنزیم های کیتیناز و متعاقباً کنترل بیولوژیکی در قارچ تریکودرما را به‬ ‫صورت کامال معنی داری افزایش می دهد‪.‬‬ ‫منابع‪:‬‬ ‫‪[1]. Adams, G.C. 1988. Thanatephorus cucumeris (Rhizoctonia solani), a species of wide host range. In‬‬ ‫‪Advances in Plant pathology: Genetics of Plant pathogenic Fungi (eds. D.S. Ingram & P.H. William), pp.‬‬ ‫‪353-552. Academic Press: London, UK.‬‬ ‫‪[2]. Agrios, G.N., 2000. Significance of plant disease. Plant Pathology. ed., Agrios, G.N. academic Press.‬‬ ‫‪London. pp: 25-37.‬‬ ‫‪[3]. Cohen-Kupiec, R. Chet, I. 1998, The molecular biology of chitin digestion. Current Opinion in‬‬ ‫‪Biotechnology 9, 270-277 .‬‬ ‫‪[4]. Deleon ,A. Jimenez-las ,H. Gonzalez-Cuevas ,M. and Paulina ,B.A. 2004, Analysis of the expression of‬‬ ‫‪the Trichoderma harzianum ech42 gene in two isogenic clones of Escherichia coli by surface response‬‬ ‫‪methodology. process Biochemistry. Vol. 39 ,pp. 2173-2178.‬‬ ‫محور همایش‪ :‬کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬ ‫صفحه ‪910‬‬ ‫مجموعه مقاالت‬ ‫چهارمین همایش ملی کاربرد فناوری هستهای در علوم کشاورزی و منابع طبیعی‬ )‫ پژوهشکده کشاورزی هسته ای‬،4021 ،‫ اردیبهشت‬03-92( The 4th National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural & Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Nuclear Agriculture Research School) [5]. Gohel.,V. Megha.,C. Vyas.,P. and Chhatpar.,H.S. 2004, Strain improvement of chitinolytic enzyme producing isolate Pantoea dispersa for enhancing its biocontrol potential against fungal plant pathogens. Annals of Microbiology, Vol. 54(4), pp. 503-515. [6]. Grosch, F.F., Lottmann, J. and Berg, G., 2005. Effectiveness of threeantagonistic bacterial isolates to suppress Rhizoctonia solani Kuhn onlettuce and potato, Canadian Journal of Microbiology 51:345353. [7]. Howell, C. R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plantdiseases: The History and evolution of current concepts. Plant Dis.: 87, 4-10. [8]. Kapat.,A. Rakshit.,S.K. and Panda.,T. 1996, Optimazation of carbon and nitrogen sources in the medium and environmental factors for enhanced production of chitinase by T.harzianum . Bioproc Eng, pp(5):13-20. [9]. Kiewnick, S., Jacobsen, B.J., Braun-Kiewnick, A., Eckhoff, J.L. and Bermann, J.W. 2001. Integrated control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet with fungicides and antagonistic bacteria. Plant Disease 85:719-722. [10]. Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. [11]. Mohamadi, A. S., Shahbazi, S., Askari, H. 2014. Investigation of γ-radiation on morphological characteristics and antagonist potential of Trichoderma viride against Rhizoctonia solani. International Research Journal of Applied and Basic Sciences. 8 (3): 329-336. [12]. Monte, E. 2001, Understanding Trichoderma, between biotechnology and microbial ecology. Int Microbiol 4:1-4. [13]. Ogoshi, A. 1996. Introduction – the genus Rhizoctonia solani. In: Sneh, B., Jabaji-Hare, S., Neate, S.M., Dijst, G. (eds), Rhizoctonia species, Taxonomy, Molecular Biology, Ecology; Pathology and Disease Control. Kluwer, Dordrecht, pp. 1–9. [14]. Raut, J.G. and B.B. Bhombe, 1984. Longevity of M. phaseolina in sunflower seeds. Indian Phytopathology, 37(2): 333-334. [15]. Viterbo, A. Ramot, O. Chernin, L. and Chet, I. 2002, Significance of lytic enzymes from Trichoderma spp.in the biocontrol of fungal plant pathogens. 81: 549–556. [16]. Weller, D. M., J. M. Raaijmakers, et al. (2002). "Microbial Populations Responsible for Specific Soil Suppressiveness to Plant Pathogens 1." Annual Review of PhytOPAthology 40(1): 309-348. 918 ‫صفحه‬ ‫ کاربرد فناوری هسته ای در زیست فناوری کشاورزی‬:‫محور همایش‬ Proceeding of The 4rd National Congress on Nuclear Technology Application in Agricultural & Natural Resource Sciences (19-20 May, 2015, Karaj-Iran) ،‫ پژوهشکدهها‬،‫ دانشگاهها‬،‫با همکاری برخی سازمانها‬ ‫موسسات تحقیقاتی و مراکز مختلف اجرایی عرصه‬ ‫کشاورزی و منابع طبیعی استان البرز و کشور‬ Organizer: Nuclear Science & Technology Research School (NSTRI) Nuclear Agriculture School .‫ پژوهشکده کشاورزی هستهای‬،‫ مجتمع پژوهشی کرج‬،‫ بلوار انرژی اتمی‬،‫ بلوار شهید موذن‬،‫ انتهای رجائی شهر‬،‫ کرج‬،‫ استان البرز‬:‫دبیرخانه همایش‬ 06159919018 :‫ نمابر‬،06159919010 ‫ ؛ تلفن‬58913/8941 ‫صندوق پستی‬ Email: Nuclearagriculture@nrcam.org ‫ و‬Nuclearagriculture1393@gmail.com http://www.aeoi.org.ir View publication stats