EVALUACIÓN DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp. PARA EL CONTROL DE Phytophthora palmivora AGENTE CAUSANTE DE LA PUDRICIÓN DEL COGOLLO DE LA PALMA DE ACEITE ALEJANDRA MILENA GARCÍA PINILLA CORPORACIÓN UNIVERSITARIA MINUTO DE DIOS FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA AGROECOLÓGICA BOGOTÁ D.C, COLOMBIA 2017 EVALUACIÓN DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp. PARA EL CONTROL DE Phytophthora palmivora AGENTE CAUSANTE DE LA PUDRICIÓN DEL COGOLLO DE LA PALMA DE ACEITE ALEJANDRA MILENA GARCÍA PINILLA TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERA EN AGROECOLOGÍA DIRECTOR Greicy Andrea Sarria Villa Ingeniera Agrónoma MSc. CO – DIRECTOR Omar Guerrero Guerrero Ingeniero Agrónomo MSc. INVESTIGADORES PARTICIPANTES Gerardo Martínez López PhD. Francia Helena Varón de Agudelo MSc. CORPORACIÓN UNIVERSITARIA MINUTO DE DIOS FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA AGROECOLÓGICA BOGOTÁ D.C, COLOMBIA 2017 NOTA DEDICATORIA  Dedico este trabajo de grado a cada una de las personas que han estado en apoyo constate de principio a fin de forma incondicional durante mi formación profesional y personal.  A mi madre Claudia Milena Pinilla Ballesteros, a mis hermanos Yolby Andrés García Pinilla y Miguel Felipe Angarita Pinilla y mi sobrina Paula Catalina García quienes con su apoyo, amor y acompañamiento en cada uno de los caminos que he recorrido; siendo siempre el resguardo y la bendición en mi vida.  A la luz de mi vida Yolby León García Marconi, por siempre ser mi guía e inspiración en cada uno de mis proyectos y metas. AGRADECIMIENTOS  A Dios, a la Virgen María y a los ángeles celestiales y terrenales por abrirme el camino hacia el desarrollo y culminación de este proyecto de grado, además por cada de una de las enseñanzas y oportunidades que se presentaron durante el trascurso de este trabajo.  A mi directora de tesis Greicy Andrea Sarria Villa por todo su apoyo, colaboración enseñanzas, consejos, tiempo dedicación y cariño en todo el proceso de la investigación.  A Omar Guerrero Guerrero por siempre creer en este proyecto, por su tiempo y cariño que siempre se mantuvo desde el primer día hasta la conclusión de la investigación.  A Yuri Adriana Mestizo Garzón, Investigadora del Laboratorio de Fitopatología en el Campo Experimental Palmar de la Vizcaína, por ser mi compañía y apoyo incondicional durante el tiempo de investigación.  A Cenipalma, Agroindustrias Villa Claudia y Palmeras de Yarima, por el apoyo económico para la elaboración de este proyecto de investigación.  A las plantaciones de Zona Central de donde fue posible obtener los aislamientos nativos evaluados.  A la Dra. Lilliana Hoyos de la Universidad Nacional de Medellín y Bioprotección® por la donación de las cepas del antagonista.  A la Corporación Universitaria Minuto Dios, especialmente a la Facultad de Ingeniera. TABLA DE CONTENIDO RESUMEN ............................................................................................................ 10 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 11 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................. 13 3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 13 4. OBJETIVOS.................................................................................................... 15 5. 4.1 General.................................................................................................................15 4.2 Específicos ...........................................................................................................15 MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 16 5.1 BOTÁNICA DE LA PALMA DE ACEITE ..............................................................16 5.1.1 5.2 Morfología de la palma de aceite ..................................................................16 IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LA PALMA DE ACEITE EN COLOMBIA .......18 5.3 PUDRICIÓN DEL COGOLLO ...................................................................................18 5.3.1 AGENTE CAUSANTE ............................................................................................20 5.3.1.1 Características de Phytophthora palmivora.....................................................21 5.4 CONTROL BIOLÓGICO.......................................................................................23 5.5 Trichoderma spp. .................................................................................................24 5.5.1 Taxonomía y morfología de Trichoderma sp. ...............................................24 5.5.1.1 Características macroscópicas. ....................................................................25 5.5.1.2 Características microscópicas ......................................................................25 5.6 Condiciones de Crecimiento de Trichoderma sp. ................................................26 5.7 Características como controlador biológico .........................................................27 5.7.1 Micoparasitismo. ...........................................................................................28 5.7.2 Competencia .................................................................................................29 5.7.3 Antibiosis .......................................................................................................30 5.8 6. Trichoderma como control biológico del género Phytophthora ............................30 MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................... 32 6.1 Localización..........................................................................................................32 6.2 Aislamientos de Trichoderma spp. .......................................................................32 6.3 Evaluación de la actividad antagónica de Trichoderma .......................................35 6.3.1 Velocidad de crecimiento de P. palmivora y Trichoderma spp. ....................35 6.3.2 Capacidad inhibitoria de Trichoderma spp. frente a P. palmivora agente causante de la PC. ......................................................................................................38 6.3.3 Interacciones micoparasíticas de Trichoderma spp. sobre P. palmivora agente causante de la PC. ......................................................................................................40 6.3.4 Propiedades antibióticas de los aislamientos de Trichoderma spp. frente a P. palmivora agente causante de la PC...........................................................................40 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 43 7.1 Evaluación de la velocidad de crecimiento de aislamientos de Trichoderma spp. y P. palmivora.................................................................................................................43 7.2 Capacidad inhibitoria de Trichoderma spp. frente a P. palmivora agente causante de la PC. ......................................................................................................................49 7.3 Interacciones micoparasíticas de Trichoderma spp. sobre P. palmivora. ........53 7.4 Propiedades antibióticas de los aislamientos de Trichoderma spp. frente a P. palmivora. ....................................................................................................................56 7.4.1 Prueba de Metabolitos no volátiles.....................................................................56 7.4.2 Prueba de metabolitos volátiles..........................................................................58 8. CONCLUSIONES ........................................................................................... 61 9. RECOMENDACIONES ................................................................................... 63 10. ANEXOS ......................................................................................................... 64 11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 70 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Procedencia de aislamientos de Trichoderma spp. ................................ 32 Tabla 2. Descripción de los tratamientos para evaluar la velocidad de crecimiento. .............................................................................................................................. 36 Tabla 3. Escala de clases de Baker y Cook. ......................................................... 38 Tabla 4. Prueba de Tukey (α<0,05). Tasa de Crecimiento de doce aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. ......................................................... 45 Tabla 5. Prueba de Tukey (α<0,05). Tasa de crecimiento radial del aislamiento PCTU095 de P. palmivora en tres medios de cultivo. ........................................... 48 Tabla 6. Interacciones micoparasíticas de aislamientos de Trichoderma spp. sobre P. palmivora. ......................................................................................................... 53 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Morfología de la palma de aceite........................................................... 17 Figura 2. Lesión inicial necrosis al costado de la flecha. . .................................... 19 Figura 3. Estructuras de Phytophthora palmivora................................................. 22 Figura 4. Ciclo de vida Phytophthora palmivora. .................................................. 22 Figura 5.Estructuras de Trichoderma sp. ............................................................. 25 Figura 6. Esquema de siembra y evaluación del crecimiento radial de las colonias. .............................................................................................................................. 36 Figura 7. Esquema de la ubicación de los discos para prueba de capacidad inhibitoria. .............................................................................................................. 38 Figura 8. Esquema de la ubicación de los discos para prueba de propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). ........................................................................ 41 Figura 9. Crecimiento radial diario de aislamientos de Trichoderma spp. en medio de cultivo Agar centeno. ........................................................................................ 43 Figura 10. Crecimiento radial diario de aislamientos de Trichoderma spp. en medio de cultivo Agar jugo V8. ........................................................................................ 44 Figura 11. Crecimiento radial diario de aislamientos de Trichoderma spp. en medio de cultivo Agar zanahoria. ..................................................................................... 45 Figura 12. Crecimiento radial diario del aislamiento PCTU095 de Phytophthora palmivora en tres medios de cultivo (Agar zanahoria, Agar jugo V8, Agar centeno). .............................................................................................................................. 47 Figura 13. Crecimiento radial diario de P. palmivora en cultivo dual con aislamientos de Trichoderma spp. ............................................................................................. 50 Figura 14. Porcentajes de inhibición de crecimiento radial de P. palmivora en cultivos duales con el antagonista Trichoderma spp. ............................................ 51 Figura 15. Crecimiento en cultivo duales entre el antagonista Trichoderma spp. y el patógeno P. palmivora. ......................................................................................... 52 Figura 16. Peso de micelio de P. palmivora en respuesta a metabolitos no volátiles de Trichoderma spp. ............................................................................................. 56 Figura 17. Porcentaje de inhibición de desarrollo de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos no volátiles). ................................................................... 57 Figura 18. Crecimiento radial de P. palmivora en respuesta a metabolitos volátiles de Trichoderma spp. ............................................................................................. 58 Figura 19. Crecimiento en cultivo duales de P. palmivora en respuesta a metabolitos volátiles producidos por Trichoderma spp.. ........................................................... 59 Figura 20. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). ................................................... 60 ANEXOS Anexo 1. Análisis de Varianza. Tasa de crecimiento aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. .............................................................................. 64 Anexo 2. Prueba de Tukey (α<0,05). Tasa de crecimiento de aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. ......................................................... 64 Anexo 3. Análisis de Varianza. Velocidad de crecimiento aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. ......................................................... 64 Anexo 4. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial diario aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. ......................................................... 64 Anexo 5. Análisis de Varianza. Crecimiento radial diario de P. palmivora en tres medios de cultivo. .................................................................................................. 65 Anexo 6. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial diario de P. palmivora en tres medios de cultivo. ........................................................................................... 66 Anexo 7. Análisis de Varianza. Crecimiento radial de P. palmivora en cultivo dual. .............................................................................................................................. 66 Anexo 8. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial de P. palmivora en cultivo dual. ...................................................................................................................... 66 Anexo 9. Diferencias en los tiempos de siembra entre P. palmivora y aislamientos de Trichoderma spp. ............................................................................................. 67 Anexo 10. Análisis de varianza. Peso de micelio de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos no volátiles). ................................................................... 67 Anexo 11. Prueba de Tukey (α<0,05). Peso de micelio de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos no volátiles). .............................................. 67 Anexo 12. Análisis de varianza. Crecimiento radial de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). ........................................................................ 68 Anexo 13. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). ................................................... 68 Anexo 14. Resultados de inhibición de P. palmivora para cada uno de los mecanismos de antagonismo de los aislamientos de Trichoderma spp. ............... 69 RESUMEN En Colombia más de 120 mil hectáreas de palma de aceite han sido afectadas por la Pudrición del cogollo (PC), esta enfermedad ha sido considerada la más importante de la palmicultura colombiana. A pesar de las estrategias de manejo empleadas hasta el momento se hace necesario avanzar en la búsqueda de alternativas de disminución de la enfermedad. Por lo cual se planteó este estudio con el objetivo de evaluar la capacidad antagónica in – vitro de aislamientos de Trichoderma sp. sobre Phytophthora palmivora agente causante de la PC. En total se evaluaron doce aislamientos del antagonista, siete de ellos aislados de diferentes plantaciones de Palma de aceite en Zona Central, dos cepas cedidas por la Universidad Nacional de Medellín y tres cepas comerciales donadas por Bioprotección®. Se determinaron las características de Trichoderma como biocontrolador en pruebas de antagonismo, evaluación de velocidad y tasa de crecimiento, competencia por sustrato, interacciones micoparasíticas y propiedades antibióticas por metabolitos de naturaleza volátil o no volátil frente al aislamiento PCTU095 de P. palmivora. La tasa de crecimiento fue más alta para el antagonista (15 mm/día) en comparación con la del patógeno (6,8 mm/día). Para evaluar la competencia por sustrato se hizo uso de la escala de Baker & Cook, adicionalmente se calculó el porcentaje de inhibición de crecimiento, se resaltó la capacidad inhibitoria del aislamiento Tr4, las cepas del antagonista alcanzaron la clase II y III en la escala usada. Las interacciones micoparasíticas de Trichoderma sp. con P. palmivora permitió observar enrollamientos del antagonista, estrangulamientos sobre las hifas y esporulación del patógeno, el aislamiento Tr2 mostró con mayor frecuencia las interacciones. En la evaluación de metabolitos no volátiles el crecimiento de P. palmivora fue limitando, los porcentajes de inhibición oscilaron entre 95,4% y 39,3% la mayor actividad antagonica se presentó en los aislamientos Tr3, Tr10 y Tr9. Con relación al efecto antibiótico (metabolitos volátiles) se observó inhibición de crecimiento radial de P. palmivora, con porcentajes de 14,7% hasta 22,8% destacando el aislamiento Tr6. Palabras clave: Phytophthora palmivora, biocontrol, antagonismo. 1. INTRODUCCIÓN La palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) es una planta de clima cálido, originaria del golfo de Guinea en África occidental (Omoti, 2004). Este cultivo es perenne y su producción puede durar hasta 50 años, sin embargo, su producción máxima se presenta en promedio entre los siete y diez años (Mingorance et al., 2006). La palmicultura ha sido la actividad económica de mayor desarrollo en el país, con un total de 483.734 hectáreas distribuidas en las cuatro zonas palmeras. En la actualidad Colombia ocupa el cuarto lugar a nivel mundial con una producción anual de 1.143.446 toneladas de aceite de palma (Fedepalma - SISPA 2016). El principal limitante de la producción de palma de aceite en Colombia es la enfermedad Pudrición del cogollo (PC), se encuentra en las cuatro zonas palmeras del país y es causada por Phytophthora palmivora (Martínez et al., 2008, Sarria et al., 2008; Torres et al., 2010). Especies de Phytophthora ocasionan las enfermedades más importantes de plantas causadas por patógenos del suelo (Drenth & Guest, 2010). Más de 60 especies de este microorganismo son potenciales destructores de plantas en zonas tropicales, afecta cultivos de importancia económica como tomate, papa, cacao, árboles frutales y forestales, algunos herbáceos y hospederos leñosos en el mundo (Erwin & Ribeiro, 1996). La agresividad de este microorganismo está asociada con la habilidad que tiene de producir estructuras reproductivas como zoosporas y esporangios para su sobrevivencia a corto plazo y su diseminación; mientras que sus oosporas y clamidosporas le permiten su sobrevivencia a largo plazo (Drenth & Sendall, 2001). Adicionalmente, los esporangios pueden ser transportados por el viento, y tienen la capacidad de albergar entre cuatro y 32 zoosporas en condiciones de humedad, que pueden causar múltiples infecciones, ademas las especies de Phytophthora pueden dispersarse en la naturaleza por el aire o transportadas por la actividad de los humanos y algunos invertebrados (Drenth & Sendall, 2001). Los síntomas de la enfermedad comienzan a manifestarse desde vivero, el síntoma inicial es una necrosis en el costado de la flecha, hasta ocasionar la pudrición del tejido afectado (Noreña et al., 2011). Este síntoma anteriormente era conocido como Pudrición de la flecha, pero posteriormente se identificó que realmente estaba asociado a un síntoma inicial de la Pudrición de cogollo (Martínez &Torres, 2007). En Colombia, el primer caso documentado de la PC se presentó a principios de la década de 1960 en la plantación La Arenosa ubicada en Turbo, Antioquia devastando la totalidad de las palmas sembradas, posteriormente se desarrolló una epidemia en la Zona Oriental (De Franqueville, 2001). En el año 1985 es detectada la PC en Tumaco (Corrado citado por Drenth et al., 2013), sin embargo, la enfermedad alcanzó características epidémicas a partir del 2007, afectando más de 35000 hectáreas de Elaeis guineensis. A pesar de los registros iniciales de afectación en flechas de palma de aceite en la Zona Central, solo hasta el 2007, se empezaron a tener registros de casos de Pudrición del cogollo, que fueron alcanzando características epidémicas en el municipio de Puerto Wilches en la Zona Central donde entre el 2009 y el 2010 afectó más de 35000 hectáreas. A la fecha en la Zona Central se han registrado más de 40000 hectáreas afectadas por la Pudrición del cogollo. En la actualidad dentro de las principales medidas de manejo de la enfermedad se encuentran, un correcto manejo agronómico desde la etapa de vivero, el establecimiento y el desarrollo productivo del cultivo. El uso del material híbrido OxG (Elaeis oleífera X Elaeis guineensis), debido a su tolerancia a la enfermedad. La detección temprana y el manejo oportuno, el cual involucra la remoción de tejidos afectados y la aplicación de productos químicos. Sin embargo, la mayor dificultad es que en muchos casos, estas recomendaciones no se realizan de manera rigurosa y puntual, ocasionando un aumento de las áreas afectadas y favoreciendo la dispersión de la enfermedad. Por lo anterior, y teniendo en cuenta que P. palmivora es un habitante natural del suelo, se requiere con urgencia disminuir o regular su población en plantaciones de palma de aceite, buscando alternativas biológicas que contribuyan en la regulación del patógeno y hagan parte de un manejo ambientalmente sostenible del cultivo de la palma de aceite en Colombia. 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La Pudrición del cogollo causada por Phytophthora palmivora es el principal limitante de la palmicultura colombiana. A pesar de los esfuerzos de Cenipalma por frenar la enfermedad y de los buenos resultados obtenidos con la implementación del paquete de manejo de la PC desarrollado por Cenipalma, el cual ha mostrado ser efectivo en plantaciones con incidencias inferiores al 10% y donde es aplicado en su totalidad, acompañado de unas buenas prácticas agronómicas. Es necesario realizar estudios encaminados a la evaluación de estrategias de manejo, que involucren una alternativa biológica que permita contrarrestar la severidad del patógeno y que pueda ser incluida dentro de un manejo integrado de la enfermedad. Por lo anterior, se plantea realizar un trabajo tendiente a identificar posibles agentes capaces de contribuir en la regulación biológica de P. palmivora. Para esto se planea evaluar a nivel in vitro una alternativa de control biológico de tipo fungoso que al final puedan constituirse en una herramienta promisoria para la prevención y manejo de la PC en campo. 3. JUSTIFICACIÓN En la actualidad la palmicultura se encuentra dentro de uno de los principales renglones agrícolas del país, alcanzando una participación del 6% en la producción agrícola dentro del 42,4% que representa el agro con respecto al producto interno bruto en Colombia (DANE, 2016). Adicionalmente, genera aproximadamente 146000 empleos totales, de los cuales 58000 son directos y 87000 son indirectos en Colombia, convirtiéndose en uno de los principales motores de empleo y desarrollo social de las cuatro regiones palmeras en Colombia (Fedepalma, 2016) La palmicultura en Colombia se ha visto afectada por la enfermedad Pudrición del cogollo en las últimas tres décadas, alcanzando en total unas 120 mil ha afectadas en estos períodos, lo cual hace de esta enfermedad el principal flagelo para la agroindustria palmera. A pesar de los esfuerzos en el manejo preventivo de la enfermedad basado en las buenas prácticas agronómicas desde el establecimiento del cultivo, la detección temprana y el manejo oportuno de la PC, hasta el momento la principal herramienta de manejo está en la eliminación de tejidos afectados y el uso de productos químicos, los cuales están siendo usados en plantas afectadas y vecinas (Morales et al., 2009). Teniendo en cuenta que el uso masivo de fungicidas para el control de enfermedades en producciones agrícolas podría ser una práctica insostenible en los diferentes cultivos generando impactos negativos dentro del agroecosistema (Altieri, 2004). El sector palmicultor ha planteado la necesidad de investigar en mecanismos que generen diferentes estrategias de manejo para la prevención o reducción de enfermedades. Principalmente, estrategias de control basadas en la conservación, protección de las funciones biológicas, protección de la biodiversidad de los sistemas productivos, manteniendo equilibrio del medio ambiente y de los recursos naturales. Siendo el control biológico de enfermedades una alternativa preventiva económicamente viable y ecológicamente segura en relación a los diversos problemas fitosanitarios presentes en los diferentes sistemas de producción agrícola. Dentro del grupo de microorganismos que han sido registrados como biocontroladores, se tienen los hongos del género Trichoderma que, por sus características de competencia, rápido crecimiento en diferentes sustratos, facilidad de aislamiento y cultivo, capacidad de resistencia y persistencia dentro del ecosistema, además de que han mostrado efectividad en el control preventivo de diferentes patógenos de plantas (Harman, 2000). Siendo éstas, las principales razones por las que en las últimas décadas se ha aumentado la cantidad de estudios encaminados a evaluar su aplicabilidad en diferentes sistemas productivos. Existen distintas especies de Trichoderma que han sido ampliamente calificadas en el control biológico de Phytophthora spp. en diferentes hospederos, dentro de este grupo están las especies de importancia agrícola: P. capsici, P. infestans, P. sojae, P. cactorum, P. parasitica, P. ultimum y P. palmivora en cacao (Ezziyyanni et al., 2007; Hernández et al., 2014; Bae et al., 2016). Por lo anterior, el presente trabajo de investigación tiene como objetivo evaluar la actividad antagónica in vitro de aislamientos de Trichoderma sp. sobre Phytophthora palmivora agente causante de la Pudrición del cogollo, los cuales podrían constituirse como una alternativa en la regulación biológica de este patógeno en el cultivo de la palma de aceite. 4. OBJETIVOS 4.1 General  Evaluar la actividad antagónica de aislamientos de Trichoderma spp. sobre Phytophthora palmivora agente causante de la Pudrición del cogollo. 4.2 Específicos  Evaluar la capacidad inhibitoria de Trichoderma spp. frente al aislamiento PCTU095 de P. palmivora.  Describir las interacciones micoparasíticas de Trichoderma spp. sobre P. palmivora.  Evaluar propiedades antibióticas de los aislamientos de Trichoderma spp. frente a P. palmivora. 5. MARCO TEÓRICO 5.1 BOTÁNICA DE LA PALMA DE ACEITE La palma aceitera se clasifica en el Orden Arecales, Familia Arecaceae, género Elaeis y Especie E. guineensis. Etimológicamente la palabra Elaeis viene del griego ‘elaion’ que significa aceite, y el nombre específico guineensis se debe a que se encontró ejemplares de la palma aceitera en la costa de Guinea. Hay dos tipos de Elaeis reconocidas, Elaeis guineensis (palma africana) y Elaeis oleífera (palma americana) siendo E. guineensis la más utilizada comercialmente (Corley & Tinker, 2009). Esta especie es nativa de las áreas más húmedas de África tropical, naturalmente se encuentra en márgenes de bosques húmedos y lo largo de los cursos de agua en zonas secas. Mientras que la palma americana E. oleífera es originaria de Centroamérica y Suramérica, encontrándose en suelos arcillosos o en las llanuras (Dransfield et al., 2008). El ciclo de vida de la palma de aceite comienza con el desarrollo del embrión, rompimiento de la dormancia y la germinación de la semilla; posteriormente, los cambios entre cada fase involucran variaciones en tamaño, forma del tallo y de las hojas y, finalmente, en la producción de inflorescencias y frutos. 5.1.1 Morfología de la palma de aceite Las características principales de la morfología de la palma de aceite están dadas a un solo punto de crecimiento (meristemo apical) lugar donde se origina una sucesión continua de yemas foliares un único tallo de tipo pleonántico, lo que significa que las inflorescencias aparecen en las axilas de las hojas produciéndose a medida que la planta continua su desarrollo vegetativo (Adam et al., 2005; Dransfield & Uhl, 1998). El estípite es erecto y en el permanecen las bases peciolares de las hojas hasta la etapa adulta (Dransfield et al., 2008). El “cogollo”, “corazón de la palma”; definida por Torres et al., 2014 es el área de la palma comprendida entre la zona superior del área meristemática y la zona de las flechas, en las cuales éstas empiezan su contacto con el exterior (Figura 1), y se caracteriza por el inicio de la pigmentación verdosa. Los tejidos del cogollo son tiernos y carecen de actividad fotosintética. Hoja 1 Flecha 1 Inflorescencia Flecha 2 Flecha 3 Meristemo Cogollo Estípite Figura 1. Morfología de la palma de aceite. Esta especie produce tanto inflorescencias femeninas como masculinas en la misma planta, dependiendo de las condiciones genéticas y ambientales. El desarrollo inicial de una inflorescencia puede tomar de dos a tres años tiempo en el cual esta se encuentra totalmente cubierta por las hojas (Corley & Tinker, 2009). La antesis de la inflorescencia femenina ocurre en las hojas 17 – 20 y el desarrollo del racimo puede llegar a tardarse 4,5 a 6 meses. El racimo maduro puede llegar a medir más de 50 cm de largo y 35 cm de ancho. El fruto es de una drupa sésil con forma esférica, ovoide y elongada. El pericarpio está formado por exocarpio, mesocarpio, y endocarpio, el ultimo rodea la almendra. La apariencia externa del fruto varia en relación a su desarrollo, siendo la coloración más típica violeta oscuro en el ápice y verde – amarillo en la base antes de la maduración. De acuerdo al grosor del cuesco se puede clasificar en dura (grueso), tenera (delgado) y pisífera (sin cuesco) (Corley & Tinker ,2009). 5.2 IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LA PALMA DE ACEITE EN COLOMBIA La producción de palma de aceite ocupa un puesto importante en la economía colombiana, de manera que el área sembrada ha aumentado rápidamente durante los últimos años. Actualmente hay sembradas 483734 hectáreas distribuidas en las cuatro zonas palmeras del país (Fedepalma – SISPA, 2016). La palma de aceite Elaeis sp. es la única especie de la que se pueden extraer dos tipos de aceite con características químicas diferentes: el aceite de palma que resulta de los procesos de extracción en el mesocarpio o pulpa del fruto y el aceite de palmiste que proviene de la almendra de la palma. Los dos aceites están separados por el cuesco de las almendras. Estos aceites o grasas pueden ser separados en sus fracciones sólida y líquida, conocidas como estearinas y oleínas respectivamente (Cala & Bernal, 2008). El rendimiento en la extracción de aceite es el factor más importante de la agroindustria de la palma, el cual depende tanto de la tasa de extracción de aceite (TEA) en la planta como la producción de racimos de fruta fresca (RFF) (Prada & Romero, 2012). El aceite de palma se utiliza actualmente en un alto porcentaje para productos alimenticios debido al aumento en su calidad y disponibilidad en los últimos cincuenta años, además, ha llegado a ser un producto diverso a medida que la refinación, fraccionamiento e hidrogenación se utilizan con mayor amplitud (Corley & Tinker, 2009). 5.3 PUDRICIÓN DEL COGOLLO La Pudrición del cogollo es la principal enfermedad de la palma de aceite en Colombia, asociado a esta enfermedad ha sido registrado Phytophthora palmivora como agente causante (Martínez et al., 2008, Sarria et al., 2008; Torres et al., 2010), a la fecha se han registrado más de 40000 hectáreas afectadas por la Pudrición del cogollo en la Zona Central. La enfermedad inicia como resultado de la infección de los tejidos inmaduros de las flechas y las lesiones producidas por el patógeno que se hace visible tres o cuatro días más tarde como pequeñas lesiones necróticas sobre los costados de la flecha más joven en la medida en que esta crece (Martínez, 2010). Si las condiciones son apropiadas para una nueva infección, particularmente la presencia de lluvias, nuevas y nuevas infecciones van teniendo lugar y la severidad de la enfermedad se incrementa en la medida en que se presentan más lesiones que, finalmente, destruyen las nuevas flechas, que son infectadas por contacto entre los tejidos infectados y los sanos, en el corazón de la palma (Ariza et al., 2008; Martínez et al., 2008). Figura 2. Lesión inicial necrosis al costado de la flecha. (Sarria et al., 2015). Los tejidos afectados son posteriormente colonizados por hongos y bacterias que continúan el proceso de pudrición y eventualmente destruyen todos los nuevos tejidos, conduciendo finalmente a la Pudrición del cogollo (Vélez et al., 2008). El manejo de la Pudrición del cogollo se inicia con la identificación temprana de los síntomas de la enfermedad mediante la escala de severidad desarrollada por Cenipalma (Martínez & Torres, 2007), seguido por la eliminación inmediata del tejido afectado, el tratamiento de la planta afectada y de las vecinas con fungicidas, bactericidas e insecticidas, el mejoramiento del drenaje y los programas de nutrición en las parcelas (Aya & Martínez, 2011; Arias et al., 2010; Sánchez et al., 2010; Morales et al., 2009). Dentro de las 24 horas posteriores al diagnóstico, el tejido enfermo se debe eliminar mediante cirugía, con especial cuidado en asegurarse de que todo el tejido afectado haya sido retirado, siguiendo el procedimiento descrito por (Arias et al., 2010). Después de la cirugía, la herida se desinfecta con un flameo con calor de aproximadamente 3 segundos, posteriormente, debe ser protegida mediante la aplicación de una mezcla fungicida – bactericida - insecticida. Tres días después se realiza una revisión para ver la evolución de la cirugía. Luego semanalmente son monitoreadas con el fin de verificar el estado sanitario de las nuevas emisiones del tejido, y en el caso de que alguna esté enferma, realizar una segunda intervención de manera oportuna. Adicionalmente, las palmas vecinas a la enferma son tratadas con fungicidas de manera preventiva. Una vez que se observan seis hojas nuevas sanas, el programa finaliza (Martínez et al., 2009a; 2009b). Las palmas que no se recuperan del tratamiento deben ser eliminadas (Arias et al.,2010). Aunque este paquete de manejo de la PC, desarrollado por Cenipalma ha mostrado ser eficaz en plantaciones con incidencias bajas (inferiores al 10%), donde es realizado de manera óptima y completa, es necesario continuar con las investigaciones e identificar otros posibles mecanismos de manejo preventivo. 5.3.1 AGENTE CAUSANTE Especies de Phytophthora ocasionan algunas de las enfermedades más importantes de plantas causadas por patógenos del suelo. Más de 60 especies de este microorganismo son potenciales destructores de plantas en zonas tropicales, lo que afecta cultivos de importancia económica como tomate, papa, cacao, árboles frutales y forestales, algunos herbáceos a huéspedes leñosos (Drenth & Guest, 2004; Erwin & Ribeiro, 1996). Dentro de las principales enfermedades que han sido asociadas a este género se tienen la pudrición negra de los frutos de cacao, pudrición en raíces, tallos y frutos en papaya, pudrición de tallos y raíces en cítricos, pudrición del cogollo en palma de aceite, el rayado negro en caucho (Drenth & Sendall, 2001). A partir del año 2008, se encontró que el responsable de la Pudrición del cogollo de la palma de aceite era Phytophthora palmivora. Esté patógeno se encuentra en la siguiente clasificación taxonómica (Thines, 2014): Súper reino: Eucaryota Reino: Cromista Subreino: Chromobiota Infrareino: Heterokonta División: Oomycota Clase: Eumicetes Orden: Peronosporales Familia: Peronosporaceae Género: Phytophthora Nombre científico: Phytophthora palmivora 5.3.1.1 Características de Phytophthora palmivora Phytophthora palmivora se caracteriza por presentar micelio cenocítico (sin septas), ramificado de color blanco, delgado, crecimiento deprimido y consistencia acuosa. El diámetro del micelio se encuentra en 5 - 8 µm, siendo este valor variable y dependiente de las condiciones naturales o químicas de medio de cultivo (Figura 3a). Los esporangios de P. palmivora presentan diferentes formas predominan las ovoides, esféricas y elipsoides; son caducos, papilados y de pedicelo corto; con un diámetro entre 50 y 25 µm de ancho y aproximadamente 62,5 µm de largo. (Erwin & Ribeiro, 1996; Gallegly & Hong, 2008) (Figura 3b). Presentan dos tipos de germinación descrita por Ribeiro (1983), la primera, germinación directa con el desarrollo de un tubo germinativo seguida la formación de micelio. La segunda, germinación indirecta, con diferenciación de citoplasmas en el esporangio dando origen a zoosporas, de gran motilidad. El género Phytophthora produce clamidosporas, las cuales son el órgano de conservación y supervivencia del microorganismo. Generalmente, estas son de forma redondeada con una pared definida de más 2 µm de espesor, son normalmente intercalares, pero se pueden encontrar en el punto terminal de la hifa. Inicialmente estas son hialinas, tornándose a un color amarillo (Figura 3c) (Stamps, 1998). Figura 3. Estructuras de Phytophthora palmivora. a. Hifas. b. Esporangios. c. Clamidospora. P. palmivora tiene un alto potencial de dispersión debido a sus múltiples generaciones al año. Siendo su característica más relevante la formación de esporangios y cantidades abundantes de zoosporas sobre tejidos enfermos. Su diseminación es fácil y rápida debido a que los esporangios son caducos, se desprenden y dispersan fácilmente, diseminados por el agua lluvia, el viento y otros vectores (Drenth & Sendall, 2001) (Figura 4). Figura 4. Ciclo de vida Phytophthora palmivora (Martínez, 2009). 5.4 CONTROL BIOLÓGICO El control biológico es una práctica agrícola, definida como la reducción del inóculo o de la actividad de un patógeno a través de la acción natural de otros microorganismos mediante el manejo del ambiente, hospedero, antagonistas, o por la introducción masiva al ecosistema de microorganismos con características antagonistas (Tovar, 2008), integrando un conocimiento completo del agroecosistema de cultivo, epidemiología, ecología y dinámica de poblaciones y a su vez la interacción de todas las variables (Adams ,1990; Deacon ,1991). Está basado en la utilización de los diferentes procesos ecológicos del ecosistema y radicando su importancia en la conservación del medio ambiente (Nighann & Mukerji, 1988); llegar a controlar por medio de agentes biológicos, constituye un punto importante dentro de la sostenibilidad del sistema productivo (Miranda et al., 1996). De acuerdo con Martínez (citado por Cholango 2009), los factores de importancia en el momento de elegir un buen controlador biológico son:  Elevado grado de reproducción para proliferar, superior a la velocidad de reproducción del patógeno.  Alta capacidad de operación efectiva contra el patógeno, es decir, sin interferir con miembros de su misma especie.  Debe actuar en las diferentes condiciones ambientales en las cuales se piensa liberar.  Baja sensibilidad a la competencia con otros enemigos naturales del patógeno que puedan ser liberados o que estén presentes de forma natural en el ecosistema. El control biológico microbiano ha crecido en los últimos años, conociéndose más de 1.500 especies de microorganismos que incluyen hongos, bacterias y virus. Los géneros de microorganismos de naturaleza fúngica de más amplio uso en la agricultura actual sobresalen Beauveria, Lecanicillium, Pochonia, Purpureocillium, Metharhizium, Bacillus y Trichoderma spp. siendo los más destacados T. harzianum, T. viride, T. virens, T. pseudokoningii (Claro, 2006). 5.5 Trichoderma spp. Trichoderma spp. es un habitante natural del suelo, es un hongo de tipo anaerobio facultativo, caracterizado por un comportamiento saprofito o parasito, características que benefician su capacidad antagónica (Camargo, 2005). Las características generales de Trichoderma sp. en su acción antagónica están relacionadas con su estabilidad genética, capacidad de utilizar diferentes fuentes de nutrición, supervivencia en condiciones adversas del ambiente, efectividad en el control de una amplia gama de patógenos, factibilidad ecológica, resistencia a fungicidas y compatibilidad con otras estrategias de control (Benítez et al., 2004). Adicionalmente, el género Trichoderma se caracteriza por no poseer un estado sexual determinado. Son haploides y su pared celular está compuesta por quitina y glucanos. Se les reconoce fácilmente por su rápido crecimiento. Las colonias en medio de cultivo son de rápido crecimiento, algodonosas, de tonalidad blanco – verde (Humeres, 2004). 5.5.1 Taxonomía y morfología de Trichoderma sp. Trichoderma sp. actualmente se encuentra en la siguiente clasificación taxonómica (Jaklitsch & Voglmayr, 2014): Reino: Fungi División: Eumycota Subdivisión: Ascomycotina Clase: Euascomycetes Orden: Hypocreales Familia: Hypocraceae Género: Trichoderma Especie: Trichoderma sp. 5.5.1.1 Características macroscópicas. Las colonias de Trichoderma son de rápido crecimiento, inicialmente el micelio es sumergido, algodonoso y no presenta color dependiendo de la cepa y el medio de cultivo, puede llegar a presentar en su desarrollo varios tonos marrones, amarillos, rojizo o verde; la esporulación se presenta de forma plana o abultada formando pústulas compactas, de color blanco hasta el color verde (Gams & Bisett, 1998). 5.5.1.2 Características microscópicas El género Trichoderma en general se caracteriza por presentar hifas septadas (Figura 5a), conidióforos hialinos erectos o arrastrados altamente ramificados, fiálides (Figura 5b), conidias (Figura 5c) y clamidosporas (Figura 5). Figura 5.Estructuras de Trichoderma spp. a. Hifas septadas. b. Fiálides. c. Conidias. Hifas: Las hifas pueden ser delgadas y flexibles, dependiendo de la especie pueden ser rugosas; hialinas (sin color), septadas y ramificadas, donde se desarrollan los conidióforos (Samson et al., 2004), suelen ser de un ancho aproximado de 5 – 10 µm (Harman, 2001). Conidióforos: Presenta conidióforos altamente ramificados, tienen forma piramidal o cónica. El conidióforo es el lugar donde se forman las fiálides. Su tamaño oscila entre 18 – 25 µm (Samson et al., 2004). Fiálides: Las células fiálides esporíferas son producidas individualmente, por parejas o ya sea por grupos, son hialinas, pueden presentarse de forma ovalada o en forma de frasco unidas al conidióforo (Cobos, 2011; Humeres, 2004), sus dimensiones son de aproximadamente 5-15 µm de altura por 3-4 µm de ancho, surgen alternadamente o en pares y con frecuencia forman un ángulo recto con respecto al conidióforo (Warham et al., 1997). A partir de las fiálides se desprenden las conidias (Samson et al., 2004). Conidias (espora): Las conidias son las estructuras viables del microorganismo usado en control biológico, se caracterizan por poseer una pared gruesa exterior, está constituida por tres capas (endospora, epispora y perispora) que tienen la función de proteger la parte más interna de la espora (protoplasto). La pared celular de la espora le permite que sobreviva a condiciones adversas, manteniéndola en estado de dominancia hasta el momento que las condiciones sean propicias para la germinación. Las conidias son las semillas que usa el hongo para sobrevivir en los diferentes medios y es la principal forma de comercialización de Trichoderma sp. (Elad et al., 1993), Pueden presentar diferentes formas desde globosas, subglobosas, elipsoides y ovoides (Gams & Bisett, 1998). Las conidias tienen de diámetro aproximadamente 3µm (Cobos, 2011; Humeres, 2004). La superficie de las conidias es lisa en la mayoría de las especies, algunas pueden llegar a presentar superficies rugosas, ásperas y con estructuras adicionales. La tonalidad puede variar desde cuerpos verdes hasta café, en colonias maduras suelen ser de color verde y otras pueden ser pálidas (Gams & Bisett, 1998). Clamidosporas: Comúnmente forma clamidosporas, intercaladas o poco común terminales (Humeres, 2004). Tienden a ser en forma de globo o de elipse, son de color amarillo alcanzando tonalidades de verde, su diámetro es de 6 – 15 µm en la mayoría de las especies (Gams & Bisett,1998). 5.6 Condiciones de Crecimiento de Trichoderma sp. Es un microorganismo que habita en un número importante de suelos agrícolas en diferentes zonas de vida, su desarrollo es óptimo en temperaturas que oscilan entre 20°C y 28°C; dentro de un rango de pH de 2,5 a 9,5, prefiriendo de un pH neutro a acido de 5,5; su resistencia a inhibidores microbianos le permite colonizar casi todos los tipos de suelo (Benítez & González, 2003). Los factores físicos, ambientales y nutricionales que afectan el crecimiento de Trichoderma son: Fototofria: La mayoría de especies del genero Trichoderma son fotosensibles, debido a que presentan una mayor esporulación cuando son expuestos a la luz. Sin embargo, la colonización de diferentes sustratos sólidos es favorecida cuando se someten a periodos alternados de luz y oscuridad (Domsch et al., 2007). Esporulación: Trichoderma esporula fácilmente en diferentes sustratos naturales y artificiales en respuesta a la alteración de luz u oscuridad. La exposición de la colonia a la luz durante 20 – 30 segundos induce a la conidiogénesis (Astudillo et al., 1999). Humedad: La humedad optima que favorece el crecimiento del hongo esta alrededor del 70 – 80% (Wakelin et al., 1999). Requisitos nutricionales: Este género es capaz de degradar sustratos muy complejos, como el almidón, pectina, celulosa, entre otros; empleándolos en su desarrollo gracias al complejo enzimático que posee (enzimas hidrolíticas como amilasas, pectinasas y celulosas); Trichoderma asimila diferentes elementos y compuestos como fuente nutricional, en este grupo se encuentra el nitrogeno, amoniaco, nitritos y diferentes aminoácidos. (Moore, 1996). 5.7 Características como controlador biológico Especies del genero Trichoderma presentan capacidades para interactuar simbiótica y parasíticamente con diferentes microorganismos, además Trichoderma puede utilizar una amplia variedad de fuentes de nutrientes; son uno de los microorganismos más resistentes a las toxinas y productos químicos naturales y artificiales (hidrocarburos, polisacáridos, plaguicidas y fungicidas), siendo capaces de degradar de forma eficaz la mayoría de ellos (Harman & Kubicek, 1998). La mayoría de las especies de Trichoderma son invasores oportunistas, de crecimiento rápido, alta esporulación y capaces de producir potentes antibióticos, características que hacen que estos hongos sean de importancia ecológica, a su vez se han encontrado en la mayoría de los ecosistemas en praderas nativas, suelos agrícolas, zonas de bosque, desierto en pantano, en aguas, material vegetal, en raíces de plantas y semillas (Monte, 2001). En la agricultura, Trichoderma es ampliamente utilizando como biocontrolador, bioprotector, biofertilizante y bioestimulante en una amplia variedad de sistemas productivos, debido a que este microorganismo secreta diferentes enzimas capaces de inhibir el desarrollo de fitopatógenos, además de estimular el crecimiento en las plantas, e inducir a la resistencia de las plantas a las enfermedades (Harman & Kubicek, 1998). Trichoderma cuenta con diferentes enzimas (quitinasas, glucanasas, peroxidasas y fitoalexinas) (Yedidia et al.,1999; Yedidia et al., 2000), relacionadas con el control de patógenos que son atribuidas en los cambios estructurales a nivel celular tales como la desintegración del citoplasma y lisis celular (Papavizas, citado por Agamez et al., 2008), además con la inducción de resistencia sistémica en las plantas, siendo este el mecanismo por el cual este microorganismo protege las plantas (Benítez, 2004; Harman et al., 2004). El modo de acción de especies del genero Trichoderma sp. como controlador biológico está dada por el uso de diferentes mecanismos, acentuándose entre éstos la competencia por el espacio y nutrientes, el micoparasitismo directo, la producción de compuestos inhibidores ya sean de naturaleza volátil o no volátil, la inactivación de enzimas del patógeno y la inducción a resistencia biológica (Harman et al., 2004). 5.7.1 Micoparasitismo. Se define como una interacción antagónica entre microorganismos, en este proceso se encuentran involucradas enzimas tales como quitinasas y celulasas capaces de degradar la composición y estructura de las paredes celulares de algunos microorganismos (Díaz, 1994). Trichoderma sp. durante el proceso de micoparasitismo van creciendo hacia el hospedante, adhiriéndose a las hifas del mismo, enrollándose a ellas, penetrándolas en ocasiones. La degradación de las paredes celulares del hospedante se observa en los estados tardíos del proceso de parasitismo, lo que conlleva al debilitamiento casi total del patógeno (Carsolio et al., 1999). Las interacciones micoparasíticas de Trichoderma se describen como un proceso complejo que para su estudio se ha separado en cuatro etapas, el desarrollo de cada una de las etapas depende de los microorganismos involucrados (antagonista y patógeno) y de las condiciones ambientales. Las etapas de acuerdo a Chet & Benhamou ,1998; son las siguientes:  Crecimiento quimiotrófico: Es el crecimiento directo de las hifas Trichoderma en dirección al patógeno como respuesta a un estímulo químico.  Reconocimiento: El reconocimiento del antagonista y el hospedante se realiza a través de interacciones lectinas – carbohidratos, las lectinas son proteína enlazadas a azucares las cuales juntan células y están involucradas en las interacciones entre los componentes de la superficie de las células y su ambiente extracelular.  Adhesión y enrollamiento: Cuando la respuesta de reconocimiento es positiva, las hifas de Trichoderma se adhieren al hospedante, enrollándose alrededor de las hifas del último, lo anterior esta mediado por procesos enzimáticos.  Actividad lítica: Esta etapa está asociada a la producción de enzimas líticas extracelulares principalmente quitinasas, glucanasas y proteasas, capaces de degradar las paredes celulares del hospedante, posibilitando la penetración de las hifas del antagonista. 5.7.2 Competencia Esta definida por el comportamiento desigual de dos o más organismos ante un mismo requisito (espacio, sustrato, nutrientes), con la particularidad de que uno de los organismos reduzca la cantidad o espacio disponible para los demás (Ahmad & Baker, 1987). Trichoderma sp. se caracteriza por su plasticidad ecológica y habilidad como competidor por espacio, sustrato y nutrientes (Samuels, 1996); esta biológicamente adaptado para colonizar sustratos y en condiciones adversas sobrevivir, debido a su alta velocidad de crecimiento, abundante esporulación y la colonización de una amplia gama de sustratos (Hjeljord & Tronsmo ,1998). 5.7.3 Antibiosis Se define como la inhibición o destrucción de un organismo por la producción metabólica de otro, incluyendo enzimas hidrolíticas, metabolitos secundarios volátiles y moléculas toxicas (Benhamou & Chet, 1997). La antibiosis ocurre durante la producción de metabolitos volátiles o no volátiles de bajo peso molecular que impiden la colonización de los microorganismos antagonizados (Tovar, 2008). Entre estos metabolitos se encuentran el ácido harzianico, alameticinas, tricholinas, antibióticos, peptaiboiles 6-pentil-α-pirona, ácido heptéldico, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperonas (Howell,1998). 5.8 Trichoderma como control biológico del género Phytophthora Las especies del género Trichoderma sp. son efectivas como agentes de control biológico en especies de Phytophthora como Phytophthora cactorum, Phytophthora parasítica y Phytophthora ultimum. Trichoderma sp. como controlador biológico de Phytophthora palmivora actúa por medio del parasitismo, parasitando la hifa mediante enrollamientos y cuerpos del apresorio penetrando la pared celular del patógeno por la acción de diferentes enzimas (Harman et al., 2004; Arnold et al., 2003; Bailey et al., 2006). A su vez se ha demostrado que Trichoderma sp. produce metabolitos antibióticos volátiles o no volátiles que inhiben el desarrollo de P. palmivora (Sid Ahmed et al., 2000). Del mecanismo de Trichoderma en la planta se tiene:  Colonización del suelo en la rizosfera ayudando a la planta en su proceso de nutrición,y a la transformación de nutrientes disponibles en el suelo para la planta.  Brinda una protección de alta duración debido a que su crecimiento se da con las raíces durante todo el ciclo de vida de las plantas.  Protege a la planta de un alto espectro de patógenos y plagas, como por ejemplo de bacterias, hongos e insectos.  Ayuda a la formación del sistema radicular debido a que las raíces se desarrollan más rápido y son raíces más grandes. 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Localización. El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Fitopatología de Cenipalma en el campo experimental Palmar de la Vizcaína en la Zona Central, ubicado en la vereda Peroles, del municipio de Barrancabermeja, Santander a una latitud de 6°58´57´´ N, una longitud de 73°4´43´´O y 110 msnm, en el kilómetro 132 sobre la troncal del Magdalena Medio en la vía Lizama - Puerto Araujo. Cuenta con una temperatura promedio de 28ºC, precipitación anual de 2860 mm y un rango de humedad relativa de 72 - 77%, condiciones agroecológicas correspondientes a la zona de vida bosque húmedo tropical. 6.2 Aislamientos de Trichoderma spp. En total se evaluaron doce aislamientos del género Trichoderma, siete de ellos aislados de diferentes áreas de palma de aceite de la Zona Central (Tr1, Tr4, Tr5, Tr9, Tr10, Tr11, Tr12), dos cepas donadas por la Dra. Lilliana Hoyos de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín (Tr2, Tr3), y tres cepas comerciales (Tr6, Tr7, Tr8), cedidas por la empresa Bioprotección®. Tabla 1. Procedencia de aislamientos de Trichoderma spp. Código Procedencia Trichoderma aislado del Campo Experimental Palmar de la Vizcaína Tr1 ubicado en la vereda Peroles, del municipio Santander. de Barrancabermeja, Características Macroscópicas Trichoderma asperelloides donado Tr2 por la Universidad Nacional de Colombia , Sede Medellín Trichoderma asperelloides donado Tr3 por la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Trichoderma aislado de Palmas de Tr4 Monterrey del municipio de Puerto Wilches, Santander. Trichoderma aislado del Campo Experimental Palmar de la Vizcaína Tr5 ubicado en la vereda Peroles, del municipio Santander. de Barrancabermeja, Tr6 Trichoderma harzianum - cepa comercial donada por Bioprotección®. Trichoderma harzianum - cepa Tr7 comercial donada por Bioprotección®. Tr8 Trichoderma spp. - cepa comercial donada por Bioprotección®. Trichoderma Tr9 aislado de la plantación Pravia S.A, ubicada en el corregimiento Papayal, municipio de Rionegro, Santander. Trichoderma aislado de Indupalma Tr10 S.A, plantación ubicada en el municipio de San Alberto, Cesar. Trichoderma aislado del Campo Experimental Palmar de la Vizcaína Tr11 ubicado en la vereda Peroles, del municipio de Barrancabermeja, Santander. Trichoderma aislado del Campo Experimental Palmar de la Vizcaína Tr12 ubicado en la vereda Peroles, del municipio de Barrancabermeja, Santander. 6.3 Evaluación de la actividad antagónica de Trichoderma 6.3.1 Velocidad de crecimiento de P. palmivora y Trichoderma spp. En este trabajo se utilizó el aislamiento PCTU095 de P. palmivora aislado de plantas afectadas con la Pudrición del cogollo y doce aislamientos de Trichoderma sp. los cuales fueron sembrados en tres medios de cultivo Agar zanahoria AZ (120 g de zanahoria + 16 g de agar/l de agua), Agar jugo V8 AV8 (80 ml de jugo V8 + 16 g de agar/l de agua y Agar centeno AC (60 g de centeno, 16 g de agar y 20 g de sacarosa /l de agua) empleados para el crecimiento de P. palmivora. En ambos casos para realizar la siembra se emplearon cultivos de 7 días de crecimiento a partir de los cuales se tomaron discos de 5mm de diámetro del borde de la colonia; cada disco se ubicó en el borde de la caja Petri, a partir de la cual se realizaron mediciones diarias del crecimiento radial (Figura 2). Figura 6. Esquema de siembra y evaluación del crecimiento radial de las colonias. Una vez sembradas las cajas Petri fueron mantenidas en condiciones de laboratorio entre 26-28ºC. Se usó un diseño completamente al azar, con 39 tratamientos, 6 repeticiones, la unidad muestral en este caso estuvo compuesta por cada caja Petri con medio de cultivo (Agar zanahoria, agar jugo V8, agar centeno) con el disco de crecimiento, la variable de respuesta fue el crecimiento radial. Tabla 2. Descripción de los tratamientos para evaluar la velocidad de crecimiento. Tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Descripción AZ + P. palmivora AZ + Trichoderma sp. 1 AZ + Trichoderma sp. 2 AZ + Trichoderma sp. 3 AZ + Trichoderma sp. 4 AZ + Trichoderma sp. 5 AZ + Trichoderma sp. 6 AZ + Trichoderma sp. 7 AZ + Trichoderma sp. 8 AZ + Trichoderma sp. 9 AZ + Trichoderma sp. 10 AZ + Trichoderma sp. 11 AZ + Trichoderma sp. 12 AV8 + P. palmivora AV8 + Trichoderma sp. 1 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 AV8 + Trichoderma sp. 2 AV8 + Trichoderma sp. 3 AV8 + Trichoderma sp. 4 AV8 + Trichoderma sp. 5 AV8 +Trichoderma sp. 6 AV8 +Trichoderma sp. 7 AV8 +Trichoderma sp. 8 AV8 +Trichoderma sp. 9 AV8 +Trichoderma sp. 10 AV8 +Trichoderma sp. 11 AV8 +Trichoderma sp. 12 AC + P. palmivora AC + Trichoderma sp. 1 AC + Trichoderma sp. 2 AC + Trichoderma sp. 3 AC + Trichoderma sp. 4 AC + Trichoderma sp. 5 AC + Trichoderma sp. 6 AC + Trichoderma sp. 7 AC + Trichoderma sp .8 AC + Trichoderma sp. 9 AC + Trichoderma sp. 10 AC + Trichoderma sp. 11 AC + Trichoderma sp. 12 El calculó para hallar la tasa de crecimiento de los tratamientos evaluados, se realizó teniendo como referencia el crecimiento (radio) y el tiempo de colonización del medio de cultivo en la caja Petri de los aislamientos del antagonista y del patógeno; mediante la siguiente formula: Tasa de Crecimiento = (Radio Final – Radio Inicial) / (Tiempo de colonización – Tiempo Inicial) Análisis estadístico Los datos de crecimiento radial diario de los aislamientos de Trichoderma spp. y del aislamiento PCTU095 de P. palmivora se sometieron a un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de Tukey (α<0,05). 6.3.2 Capacidad inhibitoria de Trichoderma spp. frente a P. palmivora agente causante de la PC. Con los resultados obtenidos de la prueba previa de velocidad de crecimiento tanto para P. palmivora como para Trichoderma spp. en los tres medios de cultivo evaluados. Se procedió a evaluar la capacidad inhibitoria in vitro de Trichoderma sp. sobre P. palmivora, la cual se realizó, colocando en cada caja Petri un disco de crecimiento de 5mm del aislamiento P. palmivora en un extremo y en el otro extremo se colocó un disco de Trichoderma spp. (Cultivo dual – Figura 3); el tiempo de diferencia en la siembra de cada una de las cepas de Trichoderma evaluadas, respecto de la siembra de P. palmivora, dependió de las diferencias obtenidas en la prueba de velocidad de crecimiento. Figura 7. Esquema de la ubicación de los discos para prueba de capacidad inhibitoria. Una vez sembrados los cultivos duales, las cajas Petri fueron mantenidas en condiciones de laboratorio entre 26-28ºC, y se realizaron mediciones diarias del crecimiento radial durante un periodo 5 a 7 días, utilizando la escala de medición para el análisis de Baker y Cook (citada por Cholango, 2009) (Tabla 2), con el fin de evaluar la competencia por sustrato. Tabla 3. Escala de clases de Baker y Cook. Clase 1 Clase 2 Trichoderma sp. crece completamente sobre la colonia del patógeno y cubre la superficie del medio de cultivo Trichoderma sp. crece al menos sobre las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo Clase 3 Clase 4 Clase 5 Trichoderma sp. y el patógeno cubren aproximadamente la mitad de la superficie del medio de cultivo El patógeno crece al menos en las dos terceras partes del medio de cultivo limitando el crecimiento de Trichoderma sp. El patógeno crece sobre la colonia de Trichoderma sp. Ocupando toda la superficie del medio de cultivo. Igualmente se midió el porcentaje de inhibición del crecimiento (PIC), teniendo como referencia el tiempo empleado por los controles donde estaba el patógeno solo; al final cuando la caja Petri estaba totalmente colonizada, se calculó la diferencia mediante la fórmula utilizada por Skidmore y Dickinson (citado por Calvo et al., 2012) dónde: PIC= [(C1-C2) /C1]*100 C1= Crecimiento radial del testigo (Fitopatógeno sin antagonista). C2= Crecimiento radial del fitopatógeno en los tratamientos en cultivo dual. Se utilizó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por tratamiento y un testigo absoluto de P. palmivora. La unidad experimental correspondió a una caja Petri con el cultivo dual sembrado en medio de cultivo de Agar zanahoria. Posteriormente, se evaluó el comportamiento del antagonista frente P. palmivora durante un periodo 5 a 7 días. El ensayo fue mantenido en condiciones de laboratorio entre 26-28ºC. Análisis estadístico Al valor de crecimiento radial final del aislamiento PCTU095 en cultivo duales con las diferentes cepas del antagonista, se le realizó un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de Tukey (α<0,05). 6.3.3 Interacciones micoparasíticas de Trichoderma spp. sobre P. palmivora agente causante de la PC. La interacción de las relaciones micoparasíticas se determinó mediante la evaluación en microcultivo de la presencia o ausencia de enrollamientos, colapso de micelio, penetración de hifas y esporulación. Para los microcultivos, se tomaron cajas Petri en cuya base se colocó un pedazo de papel toalla del mismo diámetro, seguido se colocaron dos palillos de madera para servir de base a una lámina portaobjetos y una lámina cubreobjetos, luego se colocó la tapa de la caja Petri, finalmente se envolvieron con papel para la esterilización en autoclave a 120 °C y 15 libras de presión durante 15 minutos. Una vez fueron esterilizadas las cajas Petri, en condiciones de cámara de flujo laminar se tomó un trozo de medio de cultivo Agar zanahoria de 1cm x 2 cm, se colocó en la lámina portaobjeto, seguido se procedió a colocar en un extremo del medio de cultivo a P. palmivora y en el otro extremo a Trichoderma spp., finalmente se colocó la lámina cubre objetos sobre el medio. En ambos casos para la inoculación se usaron aislamientos con siete días de crecimiento. Los microcultivos fueron incubados a 25 °C por 4 a 5 días. Para este ensayo, se realizó un diseño completamente al azar con 6 repeticiones y la unidad experimental correspondió a una caja Petri con un microcultivo. Se contó con 6 microcultivos por tratamiento, se evaluó cinco campos por microcultivo, para un total de 30 evaluaciones por tratamiento. En cada campo se contó el número de hifas presentes y el tipo de interacción entre las hifas, número de esporangios y número de esporangios colonizados por el biocontrolador. 6.3.4 Propiedades antibióticas de los aislamientos de Trichoderma spp. frente a P. palmivora agente causante de la PC. Para medir las propiedades antibióticas de Trichoderma sp. mediante la evaluación de metabolitos no volátiles, se tomaron cajas Petri con siete días de crecimiento, de las cuales se tomaron cinco discos de crecimiento de 5 mm de diámetro del antagonista (Trichoderma sp.) y se colocaron en 100 ml de caldo papa dextrosa, pH 5,5 a 28°C durante 8 días. Posteriormente, se procedió a filtrar con la ayuda de una bomba de vacío con filtro miliporo de 0,1 µm, luego 100 mL del medio filtrado fueron vertidos en Erlenmeyer previamente esterilizados, seguido se colocaron 5 discos de crecimiento de 5mm de diámetro de P. palmivora en el medio líquido durante un periodo de 8 días a 100 rpm y 26°C en una incubadora agitadora. En este ensayo se utilizó un diseño completamente al azar, con seis repeticiones por tratamiento, la variable de respuesta fue la biomasa de P. palmivora. Análisis estadístico Los datos del peso de micelio del aislamiento PCTU095 de P. palmivora en respuesta a los metabolitos volátiles del antagonista, se sometieron a un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de Tukey (α<0,05). En el caso de los metabolitos volátiles, se realizó una prueba sembrando el antagonista y P. palmivora en cultivo dual, utilizando cajas Petri divididas en la base pero que permitían el flujo del metabolito volátil dentro la caja Petri. Una vez sembradas las cajas se incubaron a 26°C. Se realizaron mediciones diarias del crecimiento individual, con el fin de verificar la posible acción de metabolitos volátiles del antagonista sobre el desarrollo del patógeno. Para cada este ensayo se usó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones y la unidad muestral correspondió a la caja Petri. Figura 8. Esquema de la ubicación de los discos para prueba de propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). Análisis estadístico Al valor de crecimiento radial final del aislamiento PCTU095 en respuesta los metabolitos no volátiles de las diferentes cepas del antagonista, se le realizó un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de Tukey (α<0,05). 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Evaluación de la velocidad de crecimiento de aislamientos de Trichoderma spp. y P. palmivora. La morfología y el desarrollo de los aislamientos de Trichoderma presentó diferencias en relación a los diferentes medios de cultivo evaluados. En el Agar centeno se presentaron las mayores tasas de crecimiento con un promedio de crecimiento diario de 16,43 mm. (Anexo 1 y 2), El aislamiento Tr4 registro un crecimiento diario 20,83 mm, mientras que el Tr7 obtuvo la menor tasa de desarrollo (13,59 mm/día) con respecto a los demás tratamientos (Figura 5). Las diferentes cepas evaluadas presentaron durante su crecimiento un micelio sumergido de color blanco, y baja esporulación en comparación con los demás medios de cultivo evaluados. Tr 1 Tr 2 Crecimiento radial diario (mm) Tr 3 Tr 4 Tr 5 Tr 6 Tr 7 Tr 8 Tr 9 Tr 10 Tr 11 Tr 12 Día después de la siembra Figura 9. Crecimiento radial diario de aislamientos de Trichoderma spp. en medio de cultivo Agar centeno. En el medio de cultivo Agar V8 el promedio de crecimiento diario de los aislamientos de Trichoderma fue de 15,43 mm. Los aislamientos Tr10 y Tr4 registraron un crecimiento diario 25,09 y 20,94 mm/día, mientras que el Tr7 obtuvo el menor crecimiento (11,43mm/día) con respecto a los demás tratamientos, que oscilaron en un rango entre 13,67 y 14,94 mm/día (Figura 6). Igual que en el medio Agar centeno las cepas presentaron un micelio sumergido de color blanco, pero con una mayor esporulación. Tr 1 Tr 2 Crecimiento radial diario (mm) Tr 3 Tr 4 Tr 5 Tr 6 Tr 7 Tr 8 Tr 9 Tr 10 Tr 11 Tr 12 Día después de la siembra Figura 10. Crecimiento radial diario de aislamientos de Trichoderma spp. en medio de cultivo Agar jugo V8. El crecimiento de los aislamientos de Trichoderma en el medio de cultivo Agar zanahoria fue en promedio de 13,95 mm/día. Las tasas de desarrollo más altas se evidenciaron en las cepas Tr4, Tr5, Tr9 y Tr10 con un crecimiento promedio de 16,6 mm diarios, por el contrario, los aislamientos Tr2, Tr7 y Tr8 mostraron valores entre 9,69 y 10,99 mm/día (Figura 7). Dentro de las características sobresalientes en el desarrollo de las cepas de Trichoderma en este medio se observaron en estados iniciales colonias de crecimiento deprimido, que se tornaron algodonosas al finalizar la evaluación y alta esporulación en comparación con los demás medios de cultivo. Tr1 Tr2 Creimiento radial diario (mm) Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Día después de la siembra Figura 11. Crecimiento radial diario de aislamientos de Trichoderma spp. en medio de cultivo Agar zanahoria. El promedio de crecimiento diario de los aislamientos de Trichoderma se observa en la Tabla 4. El análisis de varianza indico diferencias significativas entre el crecimiento de las cepas y los medios de cultivo evaluados (p<0,05). La comparación de medias permitió detectar las diferencias en los valores de crecimiento radial diario (Anexo 3 y 4). El aislamiento Tr4 en los tres medios de cultivos, y las cepas Tr2 y Tr3 en Agar centeno; Tr10 y Tr8 en Agar V8 y los aislamientos Tr5 y Tr9 en medio de cultivo Agar zanahoria presentan las tasas de crecimiento más altas estando en un rango de crecimiento que va desde 25,09 a 14,94 mm/día. Tabla 4. Prueba de Tukey (α<0,05). Tasa de Crecimiento de doce aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. Tasa de Crecimiento Trichoderma spp. (mm/día) Agar Centeno Aislamiento Tasa de Crecimiento Tr4 20,83 Agar Jugo V8 Agrupación Aislamiento A B Tr10 Tasa de Crecimiento 25,09 Agar Zanahoria Agrupación Aislamiento A Tr4 Tasa de Crecimiento Agrupación 17,42 B Tr3 17,58 M N O P Tr4 22,19 C Tr5 16,66 F G H I J Tr2 17,43 I J K L M N Tr8 14,94 Q Tr9 16,35 F G H I J Tr10 17,12 E F G H I Tr1 14,19 O P Q Tr10 16,32 D E Tr1 17,1 K L M N O P Tr2 14,02 E F G H Tr12 16,29 G H I J K Tr11 16,56 G H I J K L Tr3 14,02 O P Q Tr11 14,37 Q Tr5 16,3 E F Tr5 14 O P Q Tr1 13,65 K L M N O P Tr9 16,29 G H I J Tr9 13,95 P Q Tr3 13,48 N O P Q Tr12 15,75 E F G Tr6 13,94 J K L M N O Tr6 11,2 G H I J K Tr6 14,75 K L M N O P Tr12 13,73 Q Tr2 10,99 G H I J K Tr8 13,96 K L M N O P Tr11 13,67 P Q Tr7 10,98 C D Tr7 13,59 H I J K L M Tr7 11,43 L M N O P Tr8 9,69 E F G *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. La colonización de la totalidad de la caja Petri en la mayoría de los tratamientos fue al cuarto día después de la siembra, datos similares se encuentran en el estudio realizado por Valencia, 2004; los aislamientos de Trichoderma cuentan con radios que están en un rango de 59,6 a 90,00 mm al cuarto día de evaluación, en condiciones de temperatura y luminosidad similares a las usadas en este ensayo. En los medios de cultivo AV8 y AZ los aislamientos Trichoderma presentaron un crecimiento típico de la colonia descrito por Druzhinina et al.,2006 & Sánchez 2009, con formación de anillos concéntricos de color verde en los sitios de esporulación, las tonalidades varían de acuerdo a cada aislamiento que van desde coloraciones amarillas hasta verde. Las características morfológicas a nivel microscópico se observan, hifas hialinas con septos, conidióforos, fiálides y conidias de forma redonda y en algunos casos subglobosas (Gams & Bisett, 1998). En cuanto al desarrollo del patógeno en los tres medios de cultivo, se encontró que la mayor velocidad de crecimiento fue en el medio Agar centeno, colonizando completamente la caja Petri en el día 11 con una tasa de crecimiento diario de 8,18 mm. En este medio en los estados iniciales del desarrollo de P. palmivora se observaron hifas hialinas de crecimiento deprimido, que al avanzar se tornaron de color blanco con apariencia algodonosa, con baja esporulación en comparación con los demás medio de cultivo evaluados. En el medio de cultivo agar zanahoria AZ, la colonización completa de la caja Petri se dio al día 11 presentando un crecimiento diario de 6,28 mm. El desarrollo de P. palmivora en este medio en sus estados iniciales fue de crecimiento del micelio deprimido, hifas hialinas, que en su desarrollo se tornó de color blanco con apariencia algodonosa, con un patrón de crecimiento en forma de estrella similar a lo descrito por Machado et al., 2008; a diferencia de los otros medios de cultivo, el medio AZ presentó la esporulación más alta. La tasa de crecimiento más baja para el aislamiento PCTU095 de P. palmivora se registró en el medio de cultivo AV8, con un crecimiento diario de 5,97 mm, colonizando la totalidad de la caja Petri pasados 13 días después de la siembra. Durante el desarrollo de P. palmivora en este medio de cultivo se observó en sus estados iniciales hifas hialinas de crecimiento deprimido, que al paso de los días Crecimiento radial diario (mm). tomaron un color blanco, apariencia acuosa y alta esporulación. Agar zanahoria Agar Jugo V8 Agar Centeno Día después de la siembra Figura 12. Crecimiento radial diario del aislamiento PCTU095 de Phytophthora palmivora en tres medios de cultivo (Agar zanahoria, Agar jugo V8, Agar centeno). El promedio de crecimiento diario del aislamiento PCTU095 de P. palmivora. se observa en la Tabla 5. El análisis de varianza indico diferencias significativas entre el crecimiento del patógeno y los medios de cultivo evaluados (p<0,05). La comparación de medias permitió detectar las diferencias en los valores de crecimiento radial diario. Los promedios de crecimiento oscilaron entre 5,97 y 8,18 mm/día; el medio de cultivo AZ y AV8 cuentan con un crecimiento estadísticamente similar (Anexo 5 y 6). Tabla 5. Prueba de Tukey (α<0,05). Tasa de crecimiento radial del aislamiento PCTU095 de P. palmivora en tres medios de cultivo. Velocidad de crecimiento (mm / día) Aislamiento PCTU095 Medio de cultivo AZ AV8 AC 6,28 A 5,97 A 8,18 B Resultados similares son reportados por Páez, 1993; donde P. palmivora registró un crecimiento radial diario de 6,57 mm, con características morfológicas de la colonia similares a las observadas en este ensayo, en medio de cultivo AV8 la tasa de desarrollo fue de 5,11 mm/diarios. De igual manera en la evaluación de los tres medios de cultivo (AZ, AV8 y AC), Pérez et al., 2010, observaron el crecimiento típico de la colonia, micelio aéreo, con patrones de crecimiento radiales o ligeramente estrellado, los bordes de la colonia son de forma redondeada. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el aspecto morfológico y el desarrollo de aislamientos de P. palmivora está condicionado además del medio de cultivo, por la temperatura y la luminosidad (Erwin, 1983). En cuanto a las diferencias entre la velocidad del crecimiento de Phytophthora comparadas con los aislamientos de Trichoderma, coinciden con diferentes trabajos (Widmer & Shishkoff, 2017; Sriwati et al.,2015; Ezziyyani, 2004; Guigón & González, 2003;). Adicionalmente, la velocidad de crecimiento de Trichoderma en comparación con la de P. palmivora, permite identificar una de las principales características que hacen de Trichoderma un buen antagonista para el control de enfermedades en plantas, gracias a que cuenta con una alta velocidad de crecimiento, abundante esporulación y gama amplia de sustratos donde puede desarrollarse en comparación con otros microorganismos (Samuels, 1996), las anteriores son características determinantes en el modo de acción Trichoderma para la regulación biológica de diferentes fitopatógenos (Pérez, 2009). 7.2 Capacidad inhibitoria de Trichoderma sp. frente a P. palmivora agente causante de la PC. En la evaluación de la capacidad inhibitoria de Trichoderma sobre el desarrollo de P. palmivora en cada uno de los cultivos duales fue posible determinar la competencia por nutrientes y espacio de los dos microorganismos, evidenciándose el rápido crecimiento del antagonista en comparación con el patógeno, que se manifiesta en la inhibición del crecimiento de P. palmivora. El radio del patógeno en cultivos duales osciló entre 34,54 y 39,90 mm, en cuanto el testigo (patógeno sin antagonista) el radio fue de 42,5 mm al cuarto día después de la siembra (Figura 9). Las cepas Tr4 y Tr10 presentaron un efecto inhibitorio sobre el patógeno que al final de la evaluación registró un radio de 34,54 mm y 36,70 mm, respectivamente, mientras que los aislamientos Tr6, Tr8, Tr9, Tr7 y Tr11 mostraron la menor actividad antagónica. El análisis de varianza indico diferencias significativas para el crecimiento final del patógeno en cultivo dual con el antagonista (p<0,05). La comparación de medias permitió detectar las diferencias en los valores del crecimiento final de la colonia de P. palmivora en cada uno de los tratamientos evaluados y el testigo. Los tratamientos tuvieron un crecimiento similar estadísticamente, con excepción del aislamiento Tr4, siendo esta la cepa que presento mayor actividad inhibitoria sobre el patógeno; los tratamientos evaluados son significativamente diferentes al crecimiento del testigo. (Anexo 7 y 8). Sin embargo, es importante tener en cuenta, que, a pesar de observarse diferencias estadísticas significativas en esta prueba, el porcentaje de inhibición del crecimiento en cultivos duales registró valores inferiores al 20% de inhibición del desarrollo de P. palmivora. Crecimiento radial diario P.palmivora (mm) Testigo Tr 1 Tr 2 Tr 3 Tr 4 Tr 5 Tr 6 Tr 7 Tr 8 Tr 9 Tr 10 Tr 11 Día después de la siembra Tr 12 Figura 13. Crecimiento radial diario de P. palmivora en cultivo dual con aislamientos de Trichoderma spp. Aunque no se presentaron altos porcentajes de inhibición del crecimiento de P. palmivora, se observó una limitación en su desarrollo, encontrándose en presencia de los aislamientos de Trichoderma Tr4, Tr10 y Tr5 porcentajes de inhibición del patógeno de 18,7, 13,6 y 13,2% respectivamente, por el contrario, los valores más bajos de inhibición se observaron en los cultivos duales de P. palmivora con las cepas Tr6, Tr8, Tr9 con porcentajes de 6,1%, 7,1% y 7,7% respectivamente (Figura 10). Lo anterior, podría ser atribuido a la diferencia de tiempo en la siembra del patógeno vs el antagonista, donde se trató de equiparar las diferencias entre las velocidades de crecimiento diario de éstos (Anexo 9). Sin embargo los resultados obtenidos, coinciden con los estudios realizados por Sriwati et al., 2015; donde se encontró que Trichoderma no cuenta con alta capacidad inhibitoria sobre aislamientos Phytophthora en cultivos duales, para el caso de P. tropicalis la inhibición de crecimiento no cuenta con porcentajes superiores a 22,7% y para P. palmivora ninguna de las cepas del antagonista reduce significativamente el radio de la colonia. Figura 14. Porcentajes de inhibición de crecimiento radial de P. palmivora en cultivos duales con el antagonista Trichoderma spp. En el caso de la escala de clasificación Baker y Cook, el aislamiento Tr4 se ubicó en la clase II, se observa que el crecimiento del antagonista en las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo lo que indica una alta capacidad antagónica. Por el contrario, los aislamientos Tr1, Tr2, Tr3, Tr4, Tr5, Tr9, Tr10, Tr11, Tr12 se ubicaron en la clase III, el antagonista y el patógeno cubren aproximadamente la mitad de la superficie del medio de cultivo (Figura 11). En la evaluación del comportamiento del antagonista frente a P. palmivora, es posible observar una variación de coloración en el punto de contacto de los aislamientos Tr4 y Tr9 con P. palmivora indicando incompatibilidad entre los dos microorganismos, debido a que en este punto se estaría dando un parasitismo directo, es decir que Trichoderma usa las hifas de Phytophthora como sustrato, como ha sido reportado por Hernández et al., 2011, mientras que en los demás tratamientos fue posible observar a Trichoderma crecer sobre la colonia de P. palmivora. Figura 15. Crecimiento en cultivo duales entre el antagonista Trichoderma spp. y el patógeno P. palmivora. a. Testigo (P. palmivora sin antagonista), b. P. palmivora – Tr1, c. P. palmivora – Tr2, d. P. palmivora – Tr3, e. P. palmivora – Tr4, f. P. palmivora – Tr5, g, P. palmivora – Tr6, h. P. palmivora – Tr7, i. P. palmivora – Tr8, j. P. palmivora – Tr9, k. P. palmivora – Tr10, l. P. palmivora – Tr11, m. P. palmivora – Tr12. Los aislamientos de Trichoderma frecuentemente presentan resultados satisfactorios en las pruebas de competencia por nutrientes y espacio, atribuido a sus características biológicas, en cultivos duales se registran dos tipos de interacciones entre patógeno y antagonista, una de ellas es el deterioro de las hifas del patógeno y con menor crecimiento en relación al antagonista, no solo por compartir el mismo sustrato sino también por la acción de antibióticos volátiles o no volátiles liberados por el biocontrolador (Sid Ahmed et al., 2000; Herrera et al., 1999; Lorito et al., 1993; Papavizas & Lumsden, 1980), la segunda consiste en el enrollamiento de el antagonista sobre el patógeno, utilizando las hifas del microorganismo como sustrato (Lo et al. ,1998). 7.3 Interacciones micoparasíticas de Trichoderma spp. sobre P. palmivora. Pasadas 48 horas, momento en que el antagonista y el patógeno se pusieron en contacto y que el último se sobrepusiera sobre el otro en la placa de medio de cultivo, fue posible observar enrollamientos o “collings” y estrangulamientos del antagonista sobre P. palmivora (Arnold et al., 2003; Harman et al., 2004; Bailey et al., 2006). Con el aislamiento Tr2 se encontró una mayor interacción sobre hifas y esporangios del patógeno, registrando porcentajes de parasitismo de 55 % y 63% respectivamente. La menor actividad micoparasítica se evidenció en los aislamientos Tr5 y Tr7 en cuanto a las hifas el parasitismo fue de 3% y 4% y en esporangios fue de 1,9 y 1,2% respectivamente (Tabla 6). Investigaciones sobre interacciones micoparasíticas de diferentes especies de Trichoderma, han demostrado una efectividad sobre patógenos específicos lo que conllevó a pensar que el reconocimiento molecular entre antagonista y el hospedante es el evento esencial que precede al proceso antagónico (Infante et al., 2009; Chet & Benhamou, 1998), lo que explica las diferencias de las interacciones de P. palmivora con los aislamientos del antagonista evaluados. Tabla 6. Interacciones micoparasíticas de aislamientos de Trichoderma spp. sobre P. palmivora. Tratamiento Interacciones micoparasíticas (enrollamientos o “collings” y estrangulamientos) Porcentaje hifas con enrrollam. Porcentaje esporangios parasitados P. palmivora Tr2 55% 63% P. palmivora Tr3 20% 4% P. palmivora Tr8 18,6% 2,7% P. palmivora Tr11 17% 10,5% P. palmivora Tr10 13,2% 3,6% 13% 1% P. palmivora Tr4 12% 8,4% P. palmivora Tr9 12% 6,9% P. palmivora Tr1 P. palmivora Tr6 7,7% 0% P. palmivora Tr7 4,6% 1,2% 3,4% 4,8% 3,2% 1,9% P. palmivora Tr12 P. palmivora Tr5 El proceso de las interacciones, se dio de acuerdo a lo descrito por Chet & Benhamou,1998; donde se observó el crecimiento directo de las hifas del antagonista en dirección a P. palmivora, seguido al reconocimiento entre Trichoderma y el patógeno a través de las interacciones de lectinas – carbohidratos, las lectinas están involucradas en las interacciones entre los componentes de la superficie de las células y su ambiente extracelular. Siendo la respuesta de reconocimiento positiva las hifas de Trichoderma se enrollan sobre las hifas y esporangios de P. palmivora. El proceso termina con la producción de enzimas (quitinasas, glucanasas y proteasas), capaces de degradar las paredes celulares, posibilitando la penetración del antagonista sobre el hospedante. 7.4 Propiedades antibióticas de los aislamientos de Trichoderma spp. frente a P. palmivora. 7.4.1 Prueba de Metabolitos no volátiles En esta prueba el crecimiento de P. palmivora fue limitado, el peso del micelio no obtuvo valores superiores a 6,24 g; en cuanto al testigo el peso fue de 10,32 g al octavo día de incubación. La mayor actividad inhibitoria la presentaron los aislamientos Tr3, Tr10 y Tr9, el peso de micelio fue de 0,46; 0,59; 0,76 g respectivamente, por el contrario, el aislamiento Tr4 presentó menor efecto antagónico en el desarrollo del patógeno registrando peso de 6,24 g (Figura 12). Testigo Peso micelio P.palmivora Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tratamiento Figura 16. Peso de micelio de P. palmivora en respuesta a metabolitos no volátiles de Trichoderma spp. El análisis de varianza indico diferencias significativas entre tratamientos (p<0,05). La comparación de medias permitió detectar las diferencias en los pesos de micelio de P. palmivora en respuesta a los metabolitos no volátiles de los aislamientos del antagonista evaluados y el testigo. Los tratamientos registraron un peso final similar estadísticamente, exceptuando los aislamientos Tr4 y Tr8 siendo las cepas con menor efecto antagónico; los tratamientos cuentan con diferencias estadísticamente significativas con el crecimiento radial del testigo (Anexo 10 y 11). Tr12 La actividad antagónica atribuida a la producción de metabolitos no volátiles es efectiva en microorganismos del genero Phytophthora (Vargas et al.,2014 & Bae et al.,2016), debido a que estos compuestos tienen la capacidad de inactivar la enzima β-glucano responsable de la formación de la pared celular de P. palmivora, en combinación con las diferentes enzimas (glucanasas y celulasas) secretadas por Trichoderma las cuales son capaces de degradar las células del patógeno de acuerdo a lo registrado por Lorito et al., 1996 & Schirmbock et al.,1994. En esta evaluación, los porcentajes de inhibición PIC del patógeno se encuentran en un rango que va desde un 39,3% a 95,4%, los porcentajes más altos se presentaron en los aislamientos Tr3, Tr10, Tr9 con un PIC de 95,4; 94,2 y 92,6% respectivamente y los valores más bajos se evidenciaron en las cepas Tr4 y Tr8, con un PIC de 39,3 y 55,8 respectivamente (Figura 13). Resultados similares son reportados por Bae et al., 2016; donde se encontró que el desarrollo de P. capsici y P. nicotiane fue inhibido en un 80 y 64% respectivamente, además el crecimiento de P. melonis, P. cactorum y P. infentans se inhibió en más de un 50%, en respuesta a los filtrados de Trichoderma. Figura 17. Porcentaje de inhibición de desarrollo de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos no volátiles). 7.4.2 Prueba de metabolitos volátiles El efecto directo de los metabolitos volátiles de los aislamientos de Trichoderma se expresaron en la inhibición del crecimiento micelial de Phytophthora palmivora, provocando reducción del tamaño de la colonia en comparación con el testigo. El radio de P. palmivora en presencia de los diferentes aislamientos de Trichoderma osciló entre 32,3 y 35,8 mm; en cuanto al testigo (patógeno sin antagonista) el radio fue de 42,5 mm al cuarto día después de la siembra. La mayor actividad inhibitoria se observó en presencia de los aislamientos Tr6, Tr8 con un crecimiento del patógeno de 32,3 y 32,8 mm respectivamente; por el contrario P. palmivora en presencia del aislamiento Tr3, alcanzó el mayor radio de crecimiento (35,82mm) (Figura 14). Resultados similares los reporta Stefanova, 1999; quien reporta que el desarrollo de P. nicotiane se ve afectado por los metabolitos volátiles emanados por Trichoderma, el crecimiento del patógeno en presencia del antagonista fue 36,9 mm al finalizar la evaluación. 45 Testigo Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tr7 Tr8 Tr9 Tr10 Tr11 Tr12 Crecimiento radial diario P.palmivora (mm) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 Día después de la siembra Figura 18. Crecimiento radial de P. palmivora en respuesta a metabolitos volátiles de Trichoderma spp. Figura 19. Crecimiento en cultivo duales de P. palmivora en respuesta a metabolitos volátiles producidos por Trichoderma spp. a. Testigo (P. palmivora sin antagonista), b. P. palmivora – Tr1, c. P. palmivora – Tr2, d. P. palmivora – Tr3, e. P. palmivora – Tr4, f. P. palmivora – Tr5, g, P. palmivora – Tr6, h. P. palmivora – Tr7, i. P. palmivora – Tr8, j. P. palmivora – Tr9, k. P. palmivora – Tr10, l. P. palmivora – Tr11, m. P. palmivora – Tr12. El análisis de varianza indico diferencias significativas para el radio al final de la evaluación de P. palmivora (p<0,05) en respuesta a los metabolitos volátiles del antagonista. La comparación de medias permitió detectar diferencias en los valores del crecimiento final del patógeno entre los tratamientos evaluados con el testigo. Los tratamientos registraron un crecimiento similar estadísticamente, sin embargo, presentan diferencias significativas con el crecimiento radial del testigo. (Anexo 12 y 13). El porcentaje de inhibición de crecimiento radial PICR de P. palmivora inducida por el efecto de los metabolitos volátiles producidos por las cepas de Trichoderma se encuentra en un rango que va desde un 14,7 % hasta 22,9%, los porcentajes de inhibición más altos se presentaron en los aislamientos Tr6, Tr8, Tr5 y Tr9 con un PICR de 22,8; 21,7; 20,7 y 20,1% respectivamente y los valores más bajos se evidenciaron en las cepas Tr3, Tr2, Tr12 y Tr1 con PICR de 14,7; 16,9; 17,0 y 17,1% (Figura 16). A pesar de que en este estudio se encontraron diferencias significativas de los tratamientos respecto al testigo, los porcentajes de inhibición del crecimiento de P. palmivora con los diferentes aislamientos de Trichoderma fueron menores al 23%. Figura 20. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). 8. CONCLUSIONES  No todas las cepas de Trichoderma son capaces de inhibir el desarrollo de P. palmivora. La capacidad antagónica, varia debido a que cada especie cuenta con diferentes mecanismos de acción, capacidad esporulación y rápido crecimiento.  El aislamiento Tr4 aislado de la plantación Palmeras de Monterrey, mostro la mayor capacidad de competencia por sustrato, resaltando la creación del halo de inhibición y disminución del crecimiento radial de P. palmivora en cultivo dual, ubicándose en la clase II en la escala de evaluación usada.  Las diferentes cepas evaluadas del antagonista presentan actividad micoparasítica sobre P. palmivora, observando enrollamientos sobre hifas y esporulación del patógeno, resaltando la actividad del aislamiento Tr2 de Trichoderma asperelloides observando con mayor frecuencia la interacción parasítica con Phytophthora palmivora.  Los aislamientos Tr3 de Trichoderma asperelloides , Tr10 aislado de la plantación Indupalma, Tr9 aislado de la plantación Pravia S.A, presentaron el mayor porcentaje de inhibición sobre P. palmivora, mediante la acción de metabolitos no volátiles, con porcentajes de inhibición superiores al 92,5%.  Para los antibióticos volátiles producidos por Trichoderma el porcentaje de inhibición más alto sobre el crecimiento de la colonia de P. palmivora fue de 22,9%, atribuido del efecto fungistático del aislamiento Tr6 de Trichoderma harzianum.  Los aislamientos del antagonista Tr2 y Tr3 de Trichoderma asperelloides y las cepas nativas Tr9 aislado de la plantación Pravia S.A y Tr10 aislado de la plantación Indupalma y redujeron significativamente el desarrollo del patógeno a nivel in vitro, estas cepas cuentan con potencial para la regulación de P. palmivora dentro del cultivo de la palma de aceite, pueden ser incluidas dentro del plan de manejo integrado de la enfermedad Pudrición del cogollo.  Este estudio, permite demostrar que los aislamientos nativos del antagonista provenientes del agroecosistema de la Palma de aceite, funciona como reserva biológica con potencial para el biocontrol de diferentes fitopatógenos. 9. RECOMENDACIONES  Realizar evaluaciones del efecto de los aislamientos Tr9, Tr10, Tr2 y Tr3 en cultivos comerciales de palma de aceite, los cuales presentaron el mayor grado de antagonismo a Phytophthora palmivora a nivel in vitro.  Es importante continuar con investigaciones que permitan un mayor conocimiento en relación a la introducción de estrategias de control biológico para enfermedades en Palma de aceite, el cual se presenta como una alternativa sostenible para el sector palmicultor.  Realizar ensayos con nuevos aislamientos de Trichoderma sp., con el fin de ampliar el banco de cepas antagonistas de P. palmivora para su multiplicación y aplicación en plantaciones de Palma de aceite. 10. ANEXOS Anexo 1. Análisis de Varianza. Tasa de crecimiento aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. Fuente SC MC Ajust. Ajust. Valor F Valor p 2 37,6 18,799 2,11 0,137 33 293,34 8,889 35 330,94 GL Factor Error Total Anexo 2. Prueba de Tukey (α<0,05). Tasa de crecimiento de aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. Factor AC AV8 AZ Media 16,438 15,43 13,95 Agrupación A A A *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. Anexo 3. Análisis de Varianza. Crecimiento radial diario aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. Fuente Factor Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 35 24588,3 702,523 158,34 0,00 170 754,3 4,437 205 25342,6 Anexo 4. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial diario aislamientos de Trichoderma spp. en tres medios de cultivo. Factor T22 T28 T4 T16 Medio Aislamiento de Cultivo Tr10 AV8 Tr4 AC Tr4 AZ Tr4 AV8 Media 85,00 A 82,34 A B 78,51 B 68,103 C Agrupación T7 T10 T29 T8 T36 T14 T34 T9 T5 T33 T6 T2 T12 T35 T31 T25 T26 T18 T30 T32 T1 T19 T27 T3 T15 T13 T17 T23 T21 T24 T20 T11 Tr7 Tr10 Tr5 Tr8 Tr12 Tr2 Tr10 Tr9 Tr5 Tr9 Tr6 Tr2 Tr12 Tr11 Tr7 Tr1 Tr2 Tr6 Tr6 Tr8 Tr1 Tr7 Tr3 Tr3 Tr3 Tr1 Tr5 Tr11 Tr9 Tr12 Tr8 Tr11 AZ AZ AC AZ AC AV8 AC AZ AZ AC AZ AZ AZ AC AC AC AC AV8 AC AC AZ AV8 AC AZ AV8 AV8 AV8 AV8 AV8 AV8 AV8 AZ 63,73 58,85 57,37 55,748 54,95 54,84 54,54 52,877 52,618 52,228 51,577 51,577 51,183 50,874 50,192 49,81 49,723 48,12 47,382 47,312 46,842 45,922 45,69 45,174 44,264 43,858 43,542 43,25 42,514 40,428 40,273 40,228 C D D E E E E E E F F F F F F F G G G G G G G G G G G H H H H H H H H H H I I I I I I I I I I I J J J J J J J J J J J K K K K K K K K K K K L L L L L L L L L M M M M M M M M M N N N N N N N N N *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. Anexo 5. Análisis de Varianza. Crecimiento radial diario de P. palmivora en tres medios de cultivo. Fuente Factor Error GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 2 2601,42 1300,71 209,10 0,000 15 93,31 6,22 O O O O O O O O O O P P P P P P P P P P P Q Q Q Q Q Q Q Q Q Total 17 2694,73 Anexo 6. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial diario de P. palmivora en tres medios de cultivo. Medio de Cultivo Factor T3 T1 T2 Media AC AZ AV8 Agrupación 76,59 A 76,09 A 50,843 B *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. Anexo 7. Análisis de Varianza. Crecimiento radial de P. palmivora en cultivo dual. Fuente Factor Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. 12 104 116 419,9 Valor F Valor P 34,988 1,341 139,4 26,1 0,00 559,3 Anexo 8. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial de P. palmivora en cultivo dual. Factor Testigo Tr6 Tr8 Tr9 Tr7 Tr11 Tr12 Tr2 Tr1 Tr3 Tr5 Tr10 Tr4 Media 42,5 39,909 39,46 39,224 39,153 38,598 37,814 37,81 37,511 36,956 36,85 36,704 34,546 Agrupación A B B B B B C C C C C C C D D D D D D E E E E E E F *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. Anexo 9. Diferencias en los tiempos de siembra entre P. palmivora y aislamientos de Trichoderma spp. Diferencia Diferencia de Tiempo de Tiempo Velocidad PCTU095 – PCTU095 – Crecimiento Crecimiento Tiempo Tiempo de Aislamiento Inicial (mm) Final (mm) Inicial Final Crecimiento Trichoderma Trichodema spp. spp. (mm/día) (horas) (días) PcTu095 5 85,0 0 11 7,3 Tr1 5,0 85,0 0 6 13,3 1,94 46,5 Tr2 5,0 85,0 0 7 11,4 1,5 36 Tr3 5,0 85,0 0 6 13,3 1,94 46,5 Tr4 5,0 85,0 0 4 20,0 2,4 57,6 Tr5 5,0 85,0 0 5 16,0 2,33 55,9 Tr6 5,0 85,0 0 6 13,3 1,94 46,5 Tr7 5,0 85,0 0 6 13,3 1,94 46,5 Tr8 5,0 85,0 0 7 11,4 1,5 36 Tr9 5,0 85,0 0 5 16,0 2,33 55,9 Tr10 5,0 85,0 0 5 16,0 2,33 55,9 Tr11 5,0 85,0 0 6 13,3 1,94 46,5 Tr12 5,0 85,0 0 5 16,0 2,33 55,9 Anexo 10. Análisis de varianza. Peso de micelio de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos no volátiles). Fuente Factor Error Total GL 12 64 76 SC. Ajust. 608,99 15,98 624,97 MC Ajust. Valor F Valor p 50,7494 203,25 0,000 0,2497 Anexo 11. Prueba de Tukey (α<0,05). Peso de micelio de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos no volátiles). Factor Testigo Tr4 Tr8 Tr6 Tr7 Media Agrupación 10,302 A 6,245 B 4,547 C 1,827 D 1,652 D E Tr12 Tr11 Tr1 Tr2 Tr5 Tr9 Tr10 Tr3 1,3528 1,2308 1,038 0,8307 0,77000 0,7633 0,5949 0,4641 D E F D E F E F E F E F E F F F *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. Anexo 12. Análisis de varianza. Crecimiento radial de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). Fuente Factor Error Total GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 12 728,8 60,731 27,96 0,00 112 243,2 2,172 124 972 Anexo 13. Prueba de Tukey (α<0,05). Crecimiento radial de P. palmivora. Propiedades antibióticas (metabolitos volátiles). Factor Testigo Tr3 Tr2 Tr12 Tr1 Tr4 Tr7 Tr10 Tr11 Tr9 Tr5 Tr8 Tr6 Media Agrupación 42,5 A 35,82 B 34,875 B C 34,852 B C 34,804 B C 34,801 B C D 34,547 B C D 34,520 B C D 34,290 B C D 33,538 C D 33,295 C D 32,863 C D 32,392 D *Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. Anexo 14. Resultados de inhibición de P. palmivora para cada uno de los mecanismos de antagonismo de los aislamientos de Trichoderma spp. Competencia por sustrato Interacciones micoparasiticas Metabolitos no volatiles Metabolitos volatiles Porcentaje Porcentaje % hifas Aislamiento PICR esporangios Aislamiento Aislamiento Aislamiento Inhibición parasitadas PICR parasitados Trichoderma Trichoderma P. Trichoderma Trichoderma Peso de P.palmivora spp. de spp. spp. spp. palmivora P.palmivora P. P. palmivora palmivora Tr4 18,7% Tr 2 55,0% 63,0% Tr3 95,5% Tr6 22,9% Tr10 13,6% Tr 3 20,0% 4,0% Tr10 94,2% Tr8 21,8% Tr5 13,3% Tr8 18,7% 2,8% Tr9 92,6% Tr5 20,7% Tr3 13,0% Tr 11 17,0% 10,5% Tr5 92,5% Tr9 20,1% Tr1 11,7% Tr10 13,2% 3,6% Tr2 91,9% Tr11 18,4% Tr2 11,0% Tr1 13,0% 1,0% Tr1 89,9% Tr10 17,8% Tr12 11,0% Tr 4 12,2% 8,4% Tr11 88,1% Tr7 17,7% Tr11 9,2% Tr9 12,1% 6,9% Tr12 86,9% Tr4 17,1% Tr7 7,9% Tr6 7,7% 0,0% Tr7 84,0% Tr1 17,1% Tr9 7,7% Tr7 4,6% 1,2% Tr6 82,3% Tr12 17,0% Tr8 7,2% Tr12 3,4% 4,8% Tr8 55,9% Tr2 17,0% Tr6 6,1% Tr5 3,2% 1,9% Tr4 39,4% Tr3 14,7% 11. BIBLIOGRAFÍA Adam, H., Jouannic, S., Escoute, J., Duval, Y., Verdeil, J. & Tregear, J. W. 2005. Reproductive developmental complexity in the African oil palm (Elaeis guineensis, Arecaceae). American Journal of Botany. Vol. 92(11): 1836-1852 p. Adams, P. 1990. The potential of mycoparasites for biological control of plants diseases. Revista Phytopathol. Vol. 28:59-72 p. 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