Vectores Lambda

Tema 8: Vectores de clonacion basados en el fago
El fago
El fago es un fago de E. coli que tiene estructura icosadrica y cuenta con cabeza, cola y fibras en la cola. A las 12-24 h de una infeccin, veremos placas de lisis, con unos 106-7 viriones por placa de lisis. Dentro de la cabeza de , se encuentran unas 50Kb de dsDNA superempaquetado.El DNA en el virin es lineal; pero al entrar a la bacteria se recirculariza gracias a la complementariedad de sus extremos cos ,y una ligasa sella el nick. Para que el fago infeste a una bactera esta debe tener receptores de maltosa en su membrana externa. El receptor de maltosa (OmpM o LamB) es inducible, por ello para infectar una bacteria es necesario que el medio de cultivo contenga maltosa. es un fago atemperado, es decir, puede llevar a cabo ciclo ltico o lisognico. Su regin central es la encargada de la lisogenia y puede sustituirse por genes de nuestro inters. A la derecha estn los genes de la cabeza y la cola, que junto con los genes de sntesis de DNA y los de lisis del husped son indispensables. El fago puede autoensamblarse para dar lugar a un virin completo (encapsidacin in vitro). En ingeniera gentica, usaremos slo el ciclo ltico del fago. En su ciclo lisognico, el fago se integra en el cromosoma bacteriano por recombinacin homloga de los sitios att, y permanece en el cromosoma bacteriano como profago o fago lisognico, dando lugar a una cepa de E. coli denominada lisgeno.
Existen dos fases en la replicacin del fago : a) Una fase temprana de replicacin en Theta. b) Una fase tarda con replicacin en crculo rodante. En esta fase se obtienen concatmeros, o molculas grandes de ADN formadas por repeticiones del genoma del fago unidas entre s por los extremos cos.
En la cabeza de lambda de introduce el fragmento de genoma que va entre dos sitios cos, siempre y cuando tenga entre 38 o 52 Kb. Esto se llama capacidad de empaquetamiento. Si reducimos el genoma de lambda de50 hasta 38Kb, podremos introducirle 14Kb de DNA exgeno.
Genoma de Lambda
Los genes de la zona derecha son los encargados de la lisis, mientras que los de la parte izquierda se ocupan de la lisogenia. Dentro del genoma del fago lambda existen varias zonas interesantes: -att: regin nde integracin por recombinacin especfica de sitio. -cos: extremos cohesivos, cuya utilidad es la recirculacin del genoma fgico. -CI: Protena que permite en ciclo lisognico. -cro: protena que permite el ciclo ltico. Adems, existen 3 terminadores de la transcripcin. La protena N es un antiterminador que se une a uno de los tres terminadores y hace que la transcripcin contine.
Regin promotora-operadora derecha:

La regin promotora-operadora derecha, consta de dos promotores, el promotor del gen cro y el promotor del gen CI. Adems cuenta de tres sitios de unin a protenas o represores. Cuando el fago lambda infecta una clula, la RNA polimerasa de E. coli se une al sitio 1 y comienza a transcribirse el gen cro. La protena cro se une en primer lugar al sitio 3, impidiendo la transcripcin de CI. Estamos ante el ciclo ltico. Si los niveles de cro son muy altos, a continuacin se unir al sitio 2 y al sitio 1, impidiendo su propia transcripcin. La ausencia de cro har que se transcriba CI. CI se unir al sitio 1, impidiendo que se produzca la protena cro e iniciando la lisogenia. Si los niveles son muy altos, a continuacin se unir a los sitios 2 y 3. Nosotros trabajaremos en cepas sin alta frecuencia de lisogenia (Hfl), en las que se producir cro, pero no CI.
Introduccin de DNA del fago en E. coli

Queremos aislar el DNA del fago, para ello hay que tratar con proteasas para eliminar la cpsida e introduje el DNA en E. Coli. Existen dos mtodos: -Transfeccin -Encapsidacin in vitro
a)Transfeccin:
Transformacin usando DNA del fago. Se necesitan clulas competentes capaces de tomar DNA exgeno, tratadas con CaCl2. No necesitan tratarse con maltosa. Se observarn placas de lisis. Es poco eficiente: 104-105 ufp/g DNA.
b)Encapsidacin in vitro:
Tomamos DNA del fago, cabezas, cola y fibras de la cola y las encapsidamos in vitro. A continuacin podremos infectar clulas no competentes, en un medio con maltosa, ya que se necesitan receptores LamB para la infeccin. Los fagos sern estables y tendrn una eficiencia de infeccin de 108-109 ufp/g DNA. Cuando tenemos una suspensin de fagos, podremos mantenerla indefinidamente en solucin acuosa siempre y cuando se le aadan unas gotitas de cloroformo. Para la encapsidacin in vitro se necesita disponer de cabezas preformadas (protena E), protena que introduce DNA en la cpsida (protena D),protena que corta los concatmeros (protena A),colas preformadas y DNA con sitios cos cada 38-52KB, ya que menos de 38Kb producen inestabilidad y ms de 52Kb no caben en la cpsida. En la actualidad usamos dos lisgenos de E.coli, que llevan integrado en su genoma un profago defectivo de lambda, por lo que no pueden producir lisis: BDH 2688:Cepa de colas. Produce colas, y protenas A y D. No produce E. BDH 2690: Cepa de cabezas. Produce colas, protenas A y E. No produce D.
Se crecen ambas cepas y se lisan. Se aaden unos microgramos de cada extracto celular al DNA del fago que queramos encapsidar. Obtendremos fagos funcionales e infectivos. No todos los fagos realizan la encapsidacin in vitro.
Reduccin del genoma del fago:

El fago lambda silvestre tiene 50Kb,por lo que slo podramos agregar 3 kb de DNA exgeno. Queremos reducir su genoma para poder aadir ms cantidad de DNA exgeno.Existen dos formas de conseguirlo: a) Obtencin de mutantes de lambda con delecciones en genes dispensables
b)Manipulacin de los sitios de restriccin
a)Obtencin de mutantes de lambda con delecciones en genes dispensables:

Se tiende a eliminar los genes implicados el lisogenia. Se puede eliminar la zona con genes de integracin (int), excicin /xis) y recombinacin (gam).Se obtuvieron usando medios de cultivo con agentes quelantes (EDTA, pirofosfato), ya que se necesita Mg2+ para mantener la integridad de la cabeza. Se seleccionaron los fagos que seguan infectando.
b)Manipulacin de los sitios de restriccin:

Lambda tiene 5 sitios EcoR1 se intentan reducir a uno o dos como mucho. Para ello infectamos con lambda una cepa de E.coli con sistema de modificacin restriccin EcoR1. El pequeo porcentaje de fagos que escape a la degradacin habrn perdido algn sitio de corte. Repetimos el proceso para eliminar cada vez ms sitios de corte.
Vectores basados en el fago lambda

En principio, estos vectores eran denominados Charon. Hay dos tipos de vectores: a) De insercin: un solo sitio de corte b) De sustitucin: Se sustituye una regin stuffer por el DNA de inters.
a)Lambda gt10
Es un vector de insercin. Tiene un gen CI dentro del cual contiene un solo sitio de corte. Ha perdido 6 Kb en el proceso de incubacin con piropfosfato. El vector sin inserto produce placas turbias ya que el represor CI induce a la lisogenia. Si introducimos un inserto, el gen CI se inactiva, se produce la lisis y las placas son claras. Se usan cepar hfl(alta frecuencia de lisogenia), que no necesitan ningn marcado.
b)Lambda gt11 o ZAP

Vector de insercin que tiene el gen LacZ con sitios de corte nico para diversas enzimas de restriccin. Sin DNA exgeno el gen de la -galactosidasa est intacto y las placas de lisis toman color azul al aadir X-gal. Con inserto, se interrumpe lacZ y no se produce coloracin azul.
c)Lambda EMBL4
Vector de sustitucin usado para hacer genotecas. Cuenta con: -Brazo izquierdo:20 Kb -Brazo derecho:9 kb -Stuffer:14 kb
Puede reemplazarse el stuffer por un fragmento de 20-23 Kb. Para la seleccin de clones recombinantes se usa el fenmeno de interferencia fgica. Infectamos con el fago una cepa de E.coli lisgeno del fago P2. a) El fago completo lleva en el stuffer genes de interferencia con P2, llamados red y gam es spi+, por lo que no podr infectar el lisgeno P2. b) El fago con DNA exgeno en lugar de stuffe es spi-, por lo que infectar el lisgeno P2 sin problema. c) El fago sin stuffer ni inserto es demasiado pequeo para encapsidarse. En resumen, el lisgeno P2 slo ser infectada por los fagos que hayan sustitudo su stuffer por un inserto de DNA , y por tanto, sean Spi-.

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Introduccin de DNA del fago en E. coli

Reduccin del genoma del fago:

b)Manipulacin de los sitios de restriccin

a)Obtencin de mutantes de lambda con delecciones en genes dispensables:

b)Manipulacin de los sitios de restriccin:

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b)Lambda gt11 o ZAP

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