Manual Analisis de Alimentos

ANLISIS DE ALIMENTOS.
FUNDAMENTOS Y TCNICAS
INTRODUCCIN La qumica y el anlisis de los alimentos son disciplinas muy amplias que se basan en los principios de la fisicoqumica, qumica orgnica, biologa y qumica analtica. Los avances en estas ciencias realizados en los siglos XIX y XX han tenido un efecto importante en la comprensin de muchos aspectos de la ciencia y tecnologa de alimentos y han sido decisivos en el mejoramiento de la cantidad, calidad y disponibilidad del suministro de alimentos a nivel mundial. El anlisis de alimentos es la disciplina que se ocupa del desarrollo, uso y estudio de los procedimientos analticos para evaluar las caractersticas de alimentos y de sus componentes. Esta informacin es crtica para el entendimiento de los factores que determinan las propiedades de los alimentos, as como la habilidad para producir alimentos que sean consistentemente seguros, nutritivos y deseables para el consumidor. Existen un nmero considerable de tcnicas analticas para determinar una propiedad particular del alimento. De ah que es necesario seleccionar la ms apropiada para la aplicacin especfica. La tcnica seleccionada depender de la propiedad que sea medida, del tipo de alimento a analizar y la razn de llevar a cabo el anlisis. Las determinaciones que se realizan ms frecuentemente para conocer la composicin de los alimentos incluyen la determinacin de humedad, cenizas, extracto etreo (grasa cruda), protena total, fibra y carbohidratos asimilables, en un protocolo conocido como Anlisis Proximal. As mismo, dependiendo del objetivo del anlisis, resultan importantes las determinaciones relacionadas con la caracterizacin de algn grupo de nutrientes en particular, tal es el caso del anlisis de carbohidratos en el que se podra considerar la diferenciacin de los que presentan poder reductor, del contenido total. En el mismo sentido se podran analizar las protenas solubles o considerar la caracterizacin de los lpidos extrados de un alimento. El objetivo de este documento es revisar los principios bsicos de los procedimientos comnmente empleados para el anlisis de los alimentos y establecer las principales ventajas y desventajas. Este documento tiene sus inicios para el curso de laboratorio de anlisis de alimentos de la licenciatura en Qumica de Alimentos de la Facultad de Qumica, de la UNAM, con duracin de un semestre, sin embargo ha evolucionado para ser parte fundamental de la nueva asignatura Laboratorio de Alimentos I y pretende ser un apoyo para cualquier asignatura o
actividad que requiera el anlisis de los componentes de los alimentos. Se hace hincapi en la comprensin de los principios qumicos y analticos fundamentales en que se basan las relaciones entre la composicin de los alimentos y algunas de sus propiedades funcionales y nutricionales. Adems se introducen diversas tcnicas de laboratorio que son comunes en la investigacin bsica y aplicada en qumica y anlisis de alimentos. Una vez revisados los conceptos tericos de los procedimientos, en la primera parte del documento, se presentan los procedimientos detallados y por ltimo un condensado con la preparacin de algunas soluciones de importantes para el adecuado desarrollo e las experiencias experimentales. A travs de los aos en que se ha trabajado con este material, muchos estudiantes han efectuado con xito las determinaciones que se describen y continuamente sus resultados son comparados con los obtenidos, para los mismos alimentos, en laboratorios de investigacin con personal capacitado.
Agradecemos a PAPIME EN203504 por el financiamiento para el desarrollo del proyecto
Anlisis de Alimentos. Fundamentos y tcnicas
INDICE
FUNDAMENTOS..............................................................................................................................1 1 DETERMI ACI DE HUMEDAD..................................................................................1 1.1 DEFINICIN DE HUMEDAD .................................................................................................1 1.2 MTODOS DE SECADO .......................................................................................................1 1.2.1 Mtodo por secado de estufa....................................................................................2 1.2.2 Mtodo por secado en estufa de vaco .....................................................................3 1.2.3 Mtodo de secado en termobalanza .........................................................................3 1.2.4 Mtodo de destilacin azeotrpica ..........................................................................3 1.2.5 Mtodo de Karl Fischer. ..........................................................................................4 2 A ALISIS DE MI ERALES ...............................................................................................7 2.1 DEFINICIN DE CENIZAS ....................................................................................................7 2.2 MTODO DE CENIZAS TOTALES..........................................................................................7 2.3 DETERMINACIN DE CENIZAS EN HMEDO. .......................................................................8 2.4 DETERMINACIN DE ELEMENTOS MINERALES ...................................................................9 2.4.1 Determinacin de cloruros (Mtodo de Mohr) ........................................................9 2.4.2 Determinacin de hierro (Mtodo AOAC 944.02).................................................10 2.4.3 Determinacin de calcio (Mtodo AOAC 944.03). ................................................11 2.4.4 Determinacin de calcio (Mtodo OM-187-SSA1/SCFI-2002)...........................11 3 A ALISIS DE LPIDOS .....................................................................................................13 3.1 MTODOS DE EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN ...............................................................13 3.1.1 Mtodo de Soxhlet ..................................................................................................13 3.1.2 Mtodo de Goldfish ................................................................................................14 3.1.3 Mtodo por lotes.....................................................................................................14 3.1.4 Mtodo de Bligh-Dyer ............................................................................................14 3.1.5 Mtodo de Rse-Gottlieb........................................................................................15 3.1.6 Mtodo de Gerber. .................................................................................................15 3.1.7 Mtodo de Mojonnier .............................................................................................15 3.2 CARACTERIZACIN DE LPIDOS............................................................................16 3.2.1 Peso especfico .......................................................................................................16 3.2.2 ndice de refraccin ...............................................................................................16 3.2.3 ndice de saponificacin.........................................................................................16 3.2.4 Material insaponificable ........................................................................................17 3.2.5 Colesterol ...............................................................................................................17 3.2.6 Determinacin de ndice de Yodo. (Mtodo de Wijs y Mtodo de Hanus.) ..........18 3.3 DETERIORO DE LIPIDOS. ..........................................................................................18 3.3.1 Acidez titulable.......................................................................................................18 3.3.2 Determinacin del ndice de Perxidos. (Mtodo volumtrico) ............................18 3.3.3 Determinacin de perxidos. Mtodo volumtrico-Micromtodo .........................19 3.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos (Mtodo colorimtrico) ...........................19
3.3.5 3.3.6 4
ndice de Kreis. ......................................................................................................19 ndice de TBA .........................................................................................................19
PROTE AS.........................................................................................................................20 4.1 DETERMINACIN DE PROTENAS ......................................................................................20 4.1.1 Mtodo de Kjeldahl ................................................................................................20 4.1.2 Absorcin a 280 nm................................................................................................21 4.1.3 Mtodo de Biuret ....................................................................................................22 4.1.4 Mtodo de Lowry....................................................................................................22 4.1.5 Mtodo turbidimtrico............................................................................................23 4.1.6 Unin de colorantes ...............................................................................................23 4.2 EXTRACCIN DE PROTENAS. (MTODO DE OSBORNE Y MENDEL). ..............................25 4.3 PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS .............................................................25 4.3.1 Capacidad de gelificacin......................................................................................25 4.3.2 Capacidad de emulsificacin .................................................................................25 4.3.3 Capacidad de espumado ........................................................................................26 4.3.4 Capacidad de retencin de agua............................................................................26
A ALISIS DE CARBOHIDRATOS..................................................................................28 5.1 CARBOHIDRATOS TOTALES ...................................................................................28 5.1.1 Mtodo de fenol-sulfrico ......................................................................................28 5.2 ANALISIS DE POLISACARIDOS ...............................................................................28 5.2.1 Extraccin selectiva de almidn ............................................................................28 5.2.2 Cuantificacin de almidn .....................................................................................29 5.2.3 Anlisis de pectinas................................................................................................30 5.2.4 Determinacin de Fibra diettica ..........................................................................30 5.3 AZCARES EN SOLUCIN .................................................................................................31 5.3.1 Carbohidratos solubles totales...............................................................................31 5.3.2 Determinacin de carbohidratos reductores .........................................................32
PROCEDIMIE TOS...................................................................................................................34 6 DETERMI ACIO DE HUMEDAD................................................................................34 6.1 6.2 6.3 6.4 7 MTODO POR SECADO EN ESTUFA (NIELSEN, 2003)........................................................34 MTODO POR SECADO EN ESTUFA DE VACO (NIELSEN, 2003).........................................34 MTODO DE SECADO EN TERMOBALANZA (KIRK ET AL, 1996).......................................34 MTODO DE DESTILACIN AZEOTRPICA (NIELSEN, 2003) ............................................34
DETERMI ACIO DE MI ERALES.............................................................................36 7.1 MTODO CENIZAS TOTALES (CALCINACIN) (KIRK ET AL, 1996) ....................................36 7.2 MTODO CENIZAS TOTALES (DIGESTIN HMEDA) (NOM-117-SSA1-1994) .................36 7.3 DETERMINACIN DE MINERALES .....................................................................................36 7.3.1 Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996) ....36 7.3.2 Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr ( ielsen, 2003).......37 7.3.3 Determinacin de Fe en las cenizas ( MX-F-503-1987) ......................................37 7.3.4 Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995) ............................37
A LISIS DE LPIDOS .....................................................................................................38
8.1 EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS .................................................38 8.1.1 Mtodo de Soxhlet (James, 1999) ..........................................................................38 8.1.2 Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000) ..................................................38 8.1.3 Mtodo por lotes.....................................................................................................39 8.1.4 Mtodo Mojonnier (James, 1999) ..........................................................................39 8.1.5 Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999).....................................................................40 8.2 CARACTERIZACION DE LPIDOS............................................................................41 8.2.1 ndice de saponificacin ( ielsen, 2003)...............................................................41 8.2.2 Material Insaponificable (AOAC Official method 972.28F) .................................41 8.2.3 ndice de yodo (Mtodo de Hanus) ( ielsen, 2003)...............................................41 8.2.4 Peso especfico (Aurand et al, 1987) .....................................................................42 8.2.5 ndice de refraccin (Aurand et al, 1987)..............................................................42 8.2.6 Vitamina A. Mtodo de Carr-Price (Aurand et al, 1987) ......................................42 8.2.7 Colesterol (Kenny, 1952) .......................................................................................43 8.3 DETERIORO DE LPIDOS ...........................................................................................43 8.3.1 Acidez titulable ( ielsen, 2003) .............................................................................43 8.3.2 Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo volumtrico (AOAC Official Method 965.33) ......................................................................................................................43 8.3.3 Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)...................................44 8.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996) 44 8.3.5 ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923) ...........................................................45 9 A LISIS DE PROTE AS ..............................................................................................46 9.1 DETERMINACIN DE PROTENAS..........................................................................46 9.1.1 Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)...........46 9.1.2 Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)................................................48 9.1.3 Mtodo de Biuret (Gornall et al, 1949).................................................................48 9.1.4 Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951)) .................................................................48 9.1.5 Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957) ...................................................................49 9.1.6 Unin a colorantes Mtodo de Bradford ( ielsen, 2003) ................................49 9.2 EXTRACCION DE PROTENAS (OSBORNE Y MENDEL, 1914)...................................49 9.2.1 A. Albminas .........................................................................................................49 9.2.2 B. Globulinas..........................................................................................................50 9.2.3 C. Prolaminas.........................................................................................................50 9.2.4 D. Glutelinas ..........................................................................................................50 9.3 PROPIEDADES FUNCIONALES ................................................................................50 9.3.1 A. Capacidad de gelificacin (Avanza y An, 2001)........................................50 9.3.2 B. Capacidad de emulsificacin (Fennema, 1993) .............................................51 9.3.3 C. Capacidad de espumado (Ahmedna et al, 1999).............................................51 9.3.4 D. Capacidad de retencin de agua (Robertson et al, 2000)..............................51 10 A ALISIS DE CARBOHIDRATOS..............................................................................52 10.1 CARBOHIDRATOS TOTALES ...................................................................................52 10.1.1 Mtodo del fenol-sulfrico (Dubois et al, 1956) ....................................................52 10.2 ANLISIS DE POLISACARIDOS ...............................................................................52 10.2.1 Determinacin de fibra diettica (985.29).............................................................52
10.2.2 ALMID ..............................................................................................................53 10.2.3 A LISIS DE PECTI AS ( ielsen, 1998) ............................................................56 10.3 AZCARES EN SOLUCIN........................................................................................56 10.3.1 Preparacin de la muestra (Southgate, 1991) .......................................................56 10.3.2 Carbohidratos solubles totales...............................................................................57 10.3.3 Determinacin de carbohidratos reductores .........................................................57 10.4 OTRAS DETERMINACIONES ....................................................................................59 10.4.1 Determinacin de densidad calrica .....................................................................59 11 12 BIBLIOGRAFA. .............................................................................................................62 PREPARACIO DE SOLUCIO ES.............................................................................65 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10 12.11 12.12 12.13 12.14 REACTIVO DE HANUS ......................................................................................................65 REACTIVO DE DNS..........................................................................................................65 REACTIVO DE BIURET......................................................................................................65 REACTIVO DE LOWRY .....................................................................................................65 REACTIVO DE FEHLING (JAMES, 1999)............................................................................66 REACTIVO DE YODO (PARA DETERMINACIN CALORIMTRICA DE ALMIDN)..................66 ORTOFENANTROLINA AL 1% ...........................................................................................66 BUFFER DE ACETATOS PARA DETERMINACIN DE FE ......................................................66 ACIDO BRICO CON INDICADORES ...................................................................................66 REACTIVO COLORANTE AZUL BRILLANTE...................................................................66 SOLUCIN DE CARREZ I ..............................................................................................66 SOLUCIN DE CARREZ II .............................................................................................66 SOLUCIN I/KI AL 3%.................................................................................................66 SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO ALCOHLICA ..........................................................66 A EXO .........................................................................................................................................65
Antologa de Fundamentos
FUNDAMENTOS
1 1.1 DETERMINACIN DE HUMEDAD
Definicin de humedad
Todos los alimentos, cualquiera que sea el mtodo de industrializacin a que hayan sido sometidos, contienen agua en mayor o menor proporcin. Las cifras de contenido en agua varan entre un 60 y un 95% en los alimentos naturales. En los tejidos vegetales y animales, puede decirse que existe en dos formas generales: agua libre Y agua ligada. El agua libre o absorbida, que es la forma predominante, se libera con gran facilidad. El agua ligada se halla combinada o absorbida. Se encuentra en los alimentos como agua de cristalizacin (en los hidratos) o ligada a las protenas y a las molculas de sacridos y absorbida sobre la superficie de las partculas coloidales. (Hart, 1991) Existen varias razones por las cuales, la mayora de las industrias de alimentos determinan la humedad, las principales son las siguientes: a) El comprador de materias primas no desea adquirir agua en exceso. b) El agua, si est presente por encima de ciertos niveles, facilita el desarrollo de los microorganismos. c) Para la mantequilla, margarina, leche en polvo y queso est sealado el mximo legal. d) Los materiales pulverulentos se aglomeran en presencia de agua, por ejemplo azcar y sal. e) La humedad de trigo debe ajustarse adecuadamente para facilitar la molienda. f) La cantidad de agua presente puede afectar la textura. g) La determinacin del contenido en agua representa una va sencilla para el control de la concentracin en las distintas etapas de la fabricacin de alimentos. 1.2 Mtodos de secado
Los mtodos de secado son los ms comunes para valorar el contenido de humedad en los alimentos; se calcula el porcentaje en agua por la perdida en peso debida a su eliminacin por calentamiento bajo condiciones normalizadas. Aunque estos mtodos dan buenos resultados que pueden interpretarse sobre bases de comparacin, es preciso tener presente que a) algunas veces es difcil eliminar por secado toda la humedad presente; b) a cierta temperatura el alimento es susceptible de descomponerse, con lo que se volatilizan otras sustancias adems de agua, y c) tambin pueden perderse otras materias voltiles aparte de agua. (Kirk et al, 1996)
1.2.1 Mtodo por secado de estufa La determinacin de secado en estufa se basa en la prdida de peso de la muestra por evaporacin del agua. Para esto se requiere que la muestra sea trmicamente estable y que no contenga una cantidad significativa de compuestos voltiles. El principio operacional del mtodo de determinacin de humedad utilizando estufa y balanza analtica, incluye la preparacin de la muestra, pesado, secado, enfriado y pesado nuevamente de la muestra. (Nollet, 1996). Notas sobre las determinaciones de humedad en estufa. 1. Los productos con un elevado contenido en azcares y las carnes con un contenido alto de grasa deben deshidratarse en estufa de vaco a temperaturas que no excedan de 70C. 2. Los mtodos de deshidratacin en estufa son inadecuados para productos, como las especias, ricas en sustancias voltiles distintas del agua. 3. La eliminacin del agua de una muestra requiere que la presin parcial de agua en la fase de vapor sea inferior a la que alcanza en la muestra; de ah que sea necesario cierto movimiento del aire; en una estufa de aire se logra abriendo parcialmente la ventilacin y en las estufas de vaco dando entrada a una lenta corriente de aire seco. 4. La temperatura no es igual en los distintos puntos de la estufa, de ah la conveniencia de colocar el bulbo del termmetro en las proximidades de la muestra. Las variaciones pueden alcanzar hasta ms de tres grados en los tipos antiguos, en los que el aire se mueve por conveccin. Las estufas ms modernas de este tipo estn equipadas con eficaces sistemas, que la temperatura no varia un grado en las distintas zonas. 5. Muchos productos son, tras su deshidratacin, bastante higroscpicos; es preciso por ello colocar la tapa de manera que ajuste tanto como sea posible inmediatamente despus de abrir la estufa y es necesario tambin pesar la cpsula tan pronto como alcance la temperatura ambiente; para esto puede precisarse hasta una hora si se utiliza un desecador de vidrio. 6. La reaccin de pardeamiento que se produce por interaccin entre los aminocidos y los azcares reductores libera agua durante la deshidratacin y se acelera a temperaturas elevadas. Los alimentos ricos en protenas y azcares reductores deben, por ello, desecarse con precaucin, de preferencia en una estufa de vaco a 60C. (Hart, 1991)
1.2.2 Mtodo por secado en estufa de vaco Se basa en el principio fisicoqumico que relaciona la presin de vapor con la presin del sistema a una temperatura dada. Si se abate la presin del sistema, se abate la presin de vapor y necesariamente se reduce su punto de ebullicin. Si se sustrae aire de una estufa por medio de vaco se incrementa la velocidad del secado. Es necesario que la estufa tenga una salida de aire constante y que la presin no exceda los 100 mm Hg. y 70C, de manera que la muestra no se descomponga y que no se evaporen los compuestos voltiles de la muestra, cuya presin de vapor tambin a sido modificada (Nollet, 1996). 1.2.3 Mtodo de secado en termobalanza Este mtodo se basa en evaporar de manera continua la humedad de la muestra y el registro continuo de la perdida de peso, hasta que la muestra se site a peso constante. El error de pesada en este mtodo se minimiza cuando la muestra no se expone constantemente al ambiente (Nollet, 1996). 1.2.4 Mtodo de destilacin azeotrpica El mtodo se basa en la destilacin simultnea del agua con un lquido inmiscible en proporciones constantes. El agua es destilada en un lquido inmiscible de alto punto de ebullicin, como son tolueno y xileno. El agua destilada y condensada se recolecta en una trampa Bidwell para medir el volumen (ver Fig. 1) (Nollet, 1996).
Fig. 1. Diagrama de destilacin azeotrpica
Notas sobre los procedimientos de destilacin con disolvente. 1. Se recomienda emplear los siguientes disolventes: Disolventes Tetracloruro de carbono Benceno Metil ciclohexano Tolueno Tetracloroetileno Xileno P. ebullicin (C) 77 80 100 111 121 137-140
2. La Asociacin Americana de Comercio Especias, en sus mtodos oficiales analticos, recomienda el uso de benceno en lugar de tolueno, con productos tales como pimientos rojos, cebollas deshidratadas, ajos deshidratados, etc., que son ricos en azcares y otras sustancias que pueden descomponerse, liberando agua, a la temperatura de ebullicin de tolueno. 3. Es preciso limpiar la totalidad del aparato, cada vez que se utilice, con cido sulfrico-dicromato, enjuagarlo primero con agua y luego con alcohol y, finalmente, secarlo. 4. Debe calibrarse el colector por sucesivas destilaciones con tolueno de cantidades de agua medidas con precisin. Las lecturas deben aproximarse en centsimas de mililitro. 5. La eleccin del colector depende del volumen de agua que se espera recoger, del grado de precisin requerido y de la facilidad con que el disolvente refluya. (Hart, 1991) 1.2.5 Mtodo de Karl Fischer. Es el nico mtodo qumico comnmente usado para la determinacin de agua en alimentos que precisamente se basa en su reactivo. Este reactivo fue descubierto en 1936 y consta de yodo, dixido de azufre, una amina (originalmente se empleaba piridina sin embargo por cuestiones de seguridad y toxicidad se est reemplazando por imidazol) en un alcohol (ejemplo metanol).
Inicialmente, el dixido de azufre reacciona con el metanol para formar el ster el cual es neutralizado por la base (1). El ster es oxidado por el yodo a metil sulfato en una reaccin que involucra al agua (2). Las reacciones son las siguientes: (James, 1999) CH3OH + SO2 + RN [RNH]SO3CH3 H2O + I2 + [RNH]SO3CH3 +2RN [RNH] (SO4)CH3 + 2[RNH]I (1) (2)
Habitualmente se utiliza un exceso de dixido de azufre, piridina y metanol de manera que la fuerza del reactivo venga determinada por la concentracin de yodo. Este reactivo es un poderoso deshidratante, por lo que tanto la muestra como el reactivo deben protegerse contra la humedad del aire, cualquiera que sea la tcnica usada. Se hace por titulacin y estas pueden ser visuales o potenciomtricas. En su forma mas simple el mismo reactivo funciona como indicados. La disolucin muestra mantiene un color amarillo canario mientras haya agua, que cambia luego a amarillo cromato y despus a pardo en el momento del vire. En su forma mas simple el mtodo potenciomtrico consta de una fuente de corriente directa, un restato, un galvanmetro o microampermetro y electrodos de platino, dos cosas son necesarias para la determinacin: una diferencia de potencial que nos de una corriente y el contacto del titulante con el analito. (Hart, 1991) Este mtodo se aplica a alimentos con bajo contenido de humedad por ejemplo frutas y vegetales deshidratados, aceite y caf tostado, no es recomendable para alimentos con alto contenido de humedad. (James, 1999)
Tabla 1. Comparacin entre los mtodos para determinar humedad Mtodo Ventajas Desventajas
Es un mtodo convencional Es conveniente Es rpido y preciso Se pueden acomodar varias muestras Se llega a la temperatura deseada mas rpidamente La temperatura va fluctuar debido al tamao de la partcula, peso de la muestra, posicin de la muestra en el horno, etc. Prdida de sustancias voltiles durante el secado Descomposicin de la muestra, ejemplo: azcar. La eficiencia es baja para alimentos con alta humedad
Secado en estufa
Secado en estufa de vaco
Destilacin azeotrpica
Se calienta a baja temperatura y por lo tanto se previene la descomposicin de la muestra Es recomendable para muestras que contengan compuestos voltiles orgnicos Calentamiento y evaporacin constante y uniforme Determina el agua directamente y no por prdida de peso El dispositivo es sencillo de manejar Toma poco tiempo Se previene la oxidacin de la muestra No se afecta la humedad del ambiente
Secado en termobalanza
Es un mtodo semiautomtico y automtico La muestra no es removida por lo tanto el error de pesada es mnimo Es un mtodo estndar para ensayos de humedad Precisin y exactitud ms altos que otros mtodos Es til para determinar agua en grasas y aceites previniendo que la muestra se oxide Una vez que el dispositivo se monta la determinacin toma pocos minutos
Baja precisin del dispositivo para medir volumen de agua Los disolventes inmiscibles como tolueno son inflamables Se puede registrar altos residuos debido a la destilacin de componentes solubles en agua, como glicerol y alcohol Cualquier impureza puede generar resultados errneos Es excelente para investigacin pero no es prctico
Karl Fischer
Los reactivos deben ser RA para preparar el reactivo de Fischer El punto de equivalencia de titulacin puede ser difcil de determinar El reactivo de Fischer es inestable y debe estandarizarse in situ. El dispositivo de la titulacin debe protegerse de la humedad atmosfrica debido a la excesiva sensibilidad del reactivo a la humedad. El uso de la piridina que es muy reactiva.
(Nollet, 1996)
2 2.1 Definicin de cenizas
ANALISIS DE MINERALES
Las cenizas de un alimento son un trmino analtico equivalente al residuo inorgnico que queda despus de calcinar la materia orgnica. Las cenizas normalmente, no son las mismas sustancias inorgnicas presentes en el alimento original, debido a las perdidas por volatilizacin o a las interacciones qumicas entre los constituyentes. El valor principal de la determinacin de cenizas (y tambin de las cenizas solubles en agua, la alcalinidad de las cenizas y las cenizas insolubles en cido) es que supone un mtodo sencillo para determinar la calidad de ciertos alimentos, por ejemplo en las especias y en la gelatina es un inconveniente un alto contenido en cenizas. Las cenizas de los alimentos debern estar comprendidas entre ciertos valores, lo cual facilitar en parte su identificacin. (Kirk et al, 1996) En los vegetales predominan los derivados de potasio y en las cenizas animales los del sodio. El carbonato potsico se volatiliza apreciablemente a 700C y se pierde casi por completo a 900C. El carbonato sdico permanece inalterado a 700C, pero sufre prdidas considerables a 900C. Los fosfatos y carbonatos reaccionan adems entre s. (Hart, 1991) Notas: a) Los productos que contienen mucha agua se secan primero sobre un plato elctrico caliente o al bao Mara. b) La consideracin principal es que el producto no desprenda humos. c) En general, la temperatura adecuada de la mufla son 500C. Sin embargo, los cloruros, pueden volatilizarse a esta temperatura. d) Las cenizas se utilizan muchas veces para la determinacin de constituyentes individuales, por ejemplo cloruros, fosfatos, calcio y hierro. (Kirk et al, 1996) Para la determinacin de cenizas se siguen principalmente 2 mtodos, en seco y va hmeda. 2.2 Mtodo de cenizas totales La determinacin en seco es el mtodo ms comn para cuantificar la totalidad de minerales en alimentos y se basa en la descomposicin de la materia orgnica quedando solamente materia inorgnica en la muestra, es eficiente ya que determina tanto cenizas solubles en agua, insolubles y solubles en medio cido.
En este mtodo toda la materia orgnica se oxida en ausencia de flama a una temperatura que flucta entre los 550 -600C; el material inorgnico que no se volatiliza a esta temperatura se conoce como ceniza. (Nollet, 1996) 2.3 Determinacin de cenizas en hmedo.
La determinacin hmeda se basa en la descomposicin de la materia orgnica en medio cido por lo que la materia inorgnica puede ser determinada por gravimetra de las sales que precipiten, y tambin por algn otro mtodo analtico para las sales que permanezcan en disolucin acuosa o cida. Para la determinacin hmeda se dan cenizas alcalinas, cidas y neutras y esto se basa en el tipo de anin o catin ya sea metlico o complejo de tal forma hay minerales como tartratos, citratos que producirn cenizas con un carcter alcalino. Es necesario tomar en cuenta que tambin un ndice de alcalinidad de cenizas es muestra del contenido de carbonatos en disolucin acuosa. Las ventajas y desventajas de estos mtodos se muestran en la tabla 2. (Nollet, 1996) Tabla2. Comparacin entre mtodos para determinar cenizas totales Ventaja Desventaja Mtodo
1. Simple 2. No se requiere atencin durante la generacin de cenizas 3. No se requieren reactivos 4. Se pueden manejar muchas muestras 5. Es un mtodo estndar para la determinacin de cenizas 6. Se puede determinar cualquier tipo de materia inorgnica 1. Se requiere alta temperatura 2. El equipo es caro 3. Hay prdidas por volatilizacin 4. Hay interacciones entre minerales y recipientes. 5. Hay absorcin de elementos traza por recipientes de porcelana o slice 6. Poca utilidad para anlisis de Hg, As, P y Se 7. Calentamiento excesivo puede hacer ciertos componentes insolubles. 8. Hay una dificultad de manejo de cenizas por ser higroscpicas, sensibles a la luz, etc.
Seco
Hmedo
1. Relativamente no se requiere alta temperatura 2. El dispositivo es simple 3. La oxidacin es rpida 4. Se mantiene la disolucin acuosa lo cual es bueno para anlisis mineral. 5. El equipo no es caro 6. No hay volatilizacin de minerales
1. Se requieren altas cantidades de materiales corrosivos. 2. Se requieren cidos explosivos 3. Se requiere estandarizar los reactivos 4. Las reacciones son fumantes 5. Manejar sistemticamente varias muestras no es sencillo 6. El procedimiento es tedioso y gasta mucho tiempo.
2.4
Determinacin de elementos minerales
El trmino elementos minerales es poco preciso porque en los minerales se encuentran elementos orgnicos como carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno y azufre. Sirve para agrupar a aquellos elementos, en su mayora metlicos, que se presentan en cantidades minoritarias en los alimentos, y que suelen determinarse como elementos ms que como compuestos especficos o grupos de compuestos. El nmero de estos elementos que se encuentran en los alimentos es muy considerable incluyndose en el: silicio, calcio, magnesio, sodio, potasio, fsforo, azufre, cloro, hierro, aluminio, manganeso, flor, arsnico, cobalto, cobre, mercurio, molibdeno, plomo, selenio, estroncio, zinc, yodo, mercurio y boro. En algunos casos estos elementos son naturales en los alimentos mientras que en otros casos son producto de la contaminacin. Los mtodos de determinacin ms comunes se basan en la titulacin complejomtrica con EDTA o algn otro quelante y por gravimetra (para cationes metlicos). Hay variantes para elementos con sodio y potasio que no se pueden titular con EDTA, este mtodo es el mtodo de cloroplatinato de Lindo-Gladding. Este mtodo se basa en la insolubilidad del perclorato en alcohol y en otros disolventes orgnicos. Si la determinacin es cuidadosa el mtodo de cloroplatinato rinde resultados muy precisos pero en la actualidad tienen a sustituirse por mtodos basados en el descubrimiento reciente de la insolubilidad del tetrafenilborato de potasio o en la fotometra de llama. Para la determinacin de fsforo se realiza su conversin a fosfomolibdato. Separado por filtracin el fosfomolibdato amnico puede disolverse en un exceso de lcali patrn que es luego titulado por retroceso con cido o en un exceso de amoniaco para precipitar luego el fsforo como fosfato amnico magnsico, que se incinera y se pesa como pirofosfato magnsico. Cuando se trata de trazas de fsforo se puede reducir el fosfomolibdato a azul de molibdeno y determinar colorimtricamente. Para determinar azufre libre se necesita su oxidacin antes de la incineracin con objeto de determinar azufre como sulfato de bario y para ello se utiliza comnmente perxido de sodio, nitrato de magnesio y cido perclrico (Hart, 1991). 2.4.1 Determinacin de cloruros (Mtodo de Mohr) El mtodo se utiliza para determinar iones cloruro y bromuro de metales alcalinos, magnesio y amonio. La valoracin se hace con solucin patrn de nitrato de plata.
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El mtodo se basa en la formacin de un precipitado ladrillo proveniente del cromato de plata formado a partir del precipitado de cloruro de plata, una vez que todo el Cl- haya reaccionado con el nitrato de plata. (Nielsen, 1998) Cl-+ Ag+ 2 Ag+ +CrO4= AgCl (Precipitado blanco) AgCrO4 (Precipitado rojo ladrillo)
La solucin debe tener un pH neutro o cercano a la neutralidad. Un pH de 8.3 es adecuado para la determinacin. 2.4.2 Determinacin de hierro (Mtodo AOAC 944.02) La ortofenantrolina reacciona con el Fe 2+, originando un complejo de color rojo caracterstico (ferrona) que absorbe notablemente en las regiones del espectro visible de alrededor de 505 nm. El Fe 3+ no presenta absorcin a esa longitud de onda y debe ser reducido a Fe 2+ mediante un agente reductor apropiado, como la hidroxilamina, (en forma de clorato para incrementar su solubilidad). (Boumans et al, 1997) La reduccin cuantitativa de Fe 3+ a Fe 2+ ocurre en pocos minutos en un medio cido (pH 3-4) de acuerdo a la siguiente ecuacin: 4 Fe 3+ + 2 NH2OH 4 Fe 2+ +N2O + 4 H+ + H2O Despus de la reduccin del Fe 3+ a Fe 2+, se da la formacin de un complejo con la adicin de ortofenantrolina. En un medio acido la ortofenantrolina se encuentra en su forma protonada como ion 1,10-fenantrolin (FenH+). La reaccin de complejacin puede ser descrita por la siguiente ecuacin: (La estructura qumica del complejo se muestra en la figura 2) Fe 2+ + 3 FenH+ Fe(Fen)3 3+ + 3 H+
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Fig. 2. Estructura qumica de la ferrona. Consiste en 3 molculas de OP (ortofenantrolina) alrededor de un tomo central de Fe. Los tomos de carbono de la ferrona estn representados con sombras grises. Los tomos de N estn representados en blanco
2.4.3 Determinacin de calcio (Mtodo AOAC 944.03). Titulacin con permanganato El Calcio se precipita a pH 4 como oxalato (si hay fosfato presente se puede eliminar con cido actico), posteriormente el oxalato se disuelve en cido sulfrico liberando cido oxlico el cual se titula con una solucin valorada de permanganato de potasio. (James, 1999) Las reacciones involucradas son: 1. Precipitacin del Calcio con Oxalato de Amonio. CaCl2 + (NH4)2C2O4 2NH4Cl + CaC2O4 2. Liberacin del cido oxlico por la accin del cido sulfrico sobre el oxalato de calcio CaC2O4 + H2SO4 CaSO4 + H2C2O4 3. Titulacin del cido oxlico con permanganato de potasio 5H2C2O4 + 2KmnO4 + 3H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 10CO2 2.4.4 Determinacin de calcio (Mtodo NOM-187-SSA1/SCFI-2002). Formacin de complejo con EDTA. Cuando se aade a una muestra conteniendo Calcio (o Magnesio), cido etilendiaminotetractico (EDTA) o su sal, los iones se combinan con el EDTA. Se puede determinar Calcio en forma directa, aadiendo NaOH para elevar el pH de la muestra
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entre 12 y 13 unidades, para que el magnesio precipite como hidrxido y no interfiera, se usa adems, un indicador que se combine solamente con el calcio (azul de hidroxinaftol). En el anlisis de Calcio la muestra es tratada con NaOH 4N para obtener un pH de entre 12 y 13, lo que produce la precipitacin del magnesio en forma de Mg(OH)2. Enseguida se agrega el indicador azul de hidroxinaftol que forma un complejo de color rosa con el ion calcio y se procede a titular con solucin de EDTA hasta la aparicin de un complejo color prpura: Reacciones : Ca+2 + Mg+2 + NaOH (4N) --------->Mg (OH)2 + Ca+2 Ca+2 + Indicador (azul hidroxinaftol) ------> [azul hidroxinaftol- Ca++] (color rosa) [azul hidroxinaftol - Ca++] + EDTA --------> [ EDTA - Ca+2 ] + azul hidroxinaftol (color prpura)
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3 ANALISIS DE LPIDOS Los lpidos, junto con las protenas y carbohidratos, constituyen los principales componentes estructurales de los alimentos. (Nielsen, 1998). Los lpidos se definen como un grupo heterogneo de compuestos que son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgnicos tales como ter, cloroformo, benceno o acetona. Todos los lpidos contienen carbn, hidrgeno y oxigeno, y algunos tambin contienen fsforo y nitrgeno (Aurand et al, 1987). Los lpidos comprenden un grupo de sustancias que tienen propiedades comunes y similitudes en la composicin, sin embargo algunos, tales como los triacilgliceroles son muy hidrofbicos. Otros, tales como los di y monoacilgliceroles tienen movilidad hidrofbica e hidroflica en su molcula por lo que pueden ser solubles en disolventes relativamente polares (Nielsen, 1998) 3.1 Mtodos de extraccin y cuantificacin
El contenido total de lpidos se determina comnmente por mtodos de extraccin con disolventes orgnicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish, Mojonnier), sin embargo tambin puede cuantificarse por mtodos de extraccin que no incluyen disolventes (por ejemplo, Babcock, Gerber) y por mtodos instrumentales que se basan en propiedades fsicas o qumicas de los lpidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorcin es rayos X) (Nielsen, 2003). 3.1.1 Mtodo de Soxhlet
Es una extraccin semicontinua con un disolvente orgnico. En este mtodo el disolvente se calienta, se volatiliza y condensa goteando sobre la muestra la cual queda sumergida en el disolvente. Posteriormente ste es sifoneado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo el proceso. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso (Nielsen, 2003)
Fig. 3. Esquema de extraccin Soxhlet.
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3.1.2 Mtodo de Goldfish Es una extraccin continua con un disolvente orgnico. ste se calienta, volatiliza para posteriormente condensarse sobre la muestra. El disolvente gotea continuamente a travs de la muestra para extraer la grasa. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso entre la muestra o la grasa removida (Nielsen, 2003)
Fig. 4. Equipo de extraccin Goldfish
3.1.3 Mtodo por lotes Este mtodo hace uso de la solubilidad intrnseca de la sustancia a separar; es claro que un compuesto no polar es soluble en un disolvente no polar (Hoffman, 1989). La extraccin se realiza en fro para evitar el dao del material lipdico y por lotes para incrementar la eficiencia. 3.1.4 Mtodo de Bligh-Dyer El mtodo de Bligh-Dyer as como su modificacin por Hanson y Olley proporciona un mtodo rpido para la extraccin de lpidos de tejidos y productos alimenticios que contienen una cantidad significativa de agua. El mtodo se basa en la homogenizacin
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de la muestra con cloroformo, metanol y agua en proporciones tales que se forme una sola fase miscible con el agua de la muestra. Al aadir alcuotas de cloroformo y agua se logra la separacin de fases. El material lipdico se encuentra en la fase no acuosa, mientras que el material no lipdico se encuentra en la fase acuosa. Los lpidos se pueden extraer de dos gramos de muestra seca hasta veinte gramos de muestra hmeda. El contenido de agua de la muestra se ajusta a diecisis mililitros para conservar la proporcin de cloroformo, metanol y agua la cual es esencial si se pretende una separacin de fases y una extraccin cuantitativa de lpidos. La ventaja de este procedimiento es que las etapas de filtrado y lavado son eliminadas. Sin embargo no es un mtodo muy cuantitativo y tiene un elevado margen de error para muestras secas de cereales (Rossell y Pritchard, 1991) 3.1.5 Mtodo de Rse-Gottlieb. De acuerdo a este mtodo, la separacin de la grasa es lograda por amoniaco y etanol con un posterior efecto de deshidratacin sobre los fosfolpidos. La grasa es disuelta en ter recin destilado y se aade algo de petrleo de tal suerte que se separen algunos compuestos no lipdicos que se puedan encontrar en la fase etrea. Esta mezcla es completamente inmiscible en agua de manera que mediante una extraccin adecuada es simple dejar la grasa en la fase etrea y el residuo graso es pesado. Este mtodo es particular para leche fresca que no contiene cidos grasos libres, los cuales en disolucin alcalina forman sales de amonio y esto es insoluble en ter. Esta es la razn por la cual esto no se aplica a quesos, los cuales si tienen cidos grasos libres. (Boekenoogen, 1964) 3.1.6 Mtodo de Gerber. ste, as como los dems mtodos volumtricos presentan un carcter un tanto cuanto emprico ya que varios factores afectan la gravedad especfica de la grasa separada, variaciones propias de la grasa, cidos grasos presentes, solubilidad de la grasa en los disolventes, etc. Con estos mtodos volumtricos la muestra se sita en un butirmetro y se descompone utilizando cidos o lcalis de manera que la grasa es liberada, esta se separa por mtodos mecnicos (centrifuga) y se colecta en el cuello calibrado. (Boekenoogen, 1964) 3.1.7 Mtodo de Mojonnier La grasa es extrada con una mezcla de ter etlico y ter de petrleo en un matraz de Mojonnier, la grasa extrada se pone a peso constante y es expresada en porcentaje de grasa por peso. La prueba de Mojonnier es un ejemplo de extraccin discontinua con
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disolvente. Esta extraccin no requiere remover previamente la humedad de la muestra. (Nielsen, 1998)
Fig. 5. Matraz de extraccin Mojonnier
3.2
CARACTERIZACIN DE LPIDOS 3.2.1 Peso especfico
Es una determinacin gravimtrica en donde un picnmetro se llena con la muestra de aceite y permanece en un bao a 25C por 30 min, se seca y pesa. Se expresa el peso especifico como la relacin del peso del aceite con respecto al agua (g de aceite/g agua). (Aurand et al, 1987) 3.2.2 ndice de refraccin Se define como la relacin de la velocidad de la luz en el aire (tcnicamente un vaco) con respecto a la velocidad de la luz en el aceite. Se obtiene midiendo directamente en un refractmetro a 20-25C para los aceites y a 40C para las grasas. (Nielsen, 1998) 3.2.3 ndice de saponificacin El ndice de saponificacin denota el peso de hidrxido potsico en mg que se requieren para saponificar un gramo del aceite o grasa. El aceite se saponifica calentndolo con un exceso de lcali custico alcohlico. La cantidad de lcali consumida se calcula valorando por retroceso con cido clorhdrico. El ndice de saponificacin es inversamente proporcional a la medida de los pesos moleculares de los cidos grasos de los glicridos presentes en el aceite o grasa. Como muchos aceites dan ndices similares, el ndice de saponificacin es menos valioso que el
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ndice de yodo cuando se trata de identificar un aceite desconocido. Notables excepciones son los altos ndices del aceite de coco y el aceite de almendra de palma (ambos utilizados en la margarina) y de la grasa de mantequilla. (Pearson, 1993) CH2-OOC-R - CH-OOC-R - CH2-OOC-R + 3 KOH CH2-OH -CH-OH - CH2-OH (glicerol) + 3 R-CO2-K 3.2.4 Material insaponificable La materia insaponificable consta de aquellas sustancias contenidas en los aceites comerciales y grasas (diferentes a las de bajo p. de ebullicin a los cidos libres y a la materia mineral) que, despus de saponificar y extraer con ter dietlico, quedan sin volatilizarse luego de secar a 80C. Incluyen hidrocarburos y alcoholes de alto peso molecular. L/a mayora de los aceites y grasas contienen una pequea parte de materia insaponificable (normalmente menos del 2 %). (Pearson, 1993) 3.2.5 Colesterol El mtodo qumico de Liebermann-Burchard para la determinacin de colesterol en una muestra lipdica se basa en el desarrollo de una coloracin verde en presencia de anhdrido actico y cido sulfrico concentrado con temperatura, despus de 30 min de reaccin (Nollet, 1996). La intensidad de la coloracin es medida por absorcin en el espectrofotmetro a 620 nm. La intensidad tiene una relacin lineal con la concentracin de colesterol entre 100 y 600g, se debe realizar una solucin control de colesterol de diferentes concentraciones para realizar una comparacin ( Kenny, 1952)
Fig. 6. Mecanismo de reaccin del colesterol con anhdrido actico en medio cido (Reaccin LiebermannBurchard). El compuesto formado absorbe de 600-620 nm (Burke et al, 1974)
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3.2.6 Determinacin de ndice de Yodo. (Mtodo de Wijs y Mtodo de Hanus.) El ndice de yodo de los lpidos depende de su grado de instauracin. La grasa disuelta se hace reaccionar con monobromuro de yodo en exceso. La cantidad de monobromuro de yodo que no se adiciona a los dobles enlaces oxida una disolucin de yoduro a yodo, y ste se determina por valoracin con una disolucin de tiosulfato de sodio. La reaccin de adicin se lleva a cabo en oscuridad para evitar que se produzcan reacciones laterales de radicales inducidos por la luz (y con ello un gasto aparente de halgeno mayor). Dado que el reactivo halogenante va preparado en actico glacial y es de concentracin aproximada y variable deber hacerse siempre un ensayo en blanco para calcular su equivalencia en yodo (Nielsen, 2003). Se expresa convencionalmente por el peso de yodo absorbido por cien partes en peso de materia grasa. La diferencia entre ambos mtodos es el agente halogenado, en el Mtodo de Hanus el agente es IBr, preparado de la mezcla de I2 con Br2 en cido actico y en el Mtodo de Wijs el agente es ICl preparado de la mezcla de ICl3 con I2 en medio de cido actico. (Pearson, 1993)
3.3
DETERIORO DE LIPIDOS.
3.3.1 Acidez titulable La acidez titulable es una medida del contenido de cidos grasos libres en una muestra. Su clculo se basa en la masa molar de un cido graso o una mezcla de cidos grasos. Normalmente se mide por titulacin directa en la disolucin y con indicador visual. (Boekenoogen, 1964) R-COOH + KOH R-COOK + H2O 3.3.2 Determinacin del ndice de Perxidos. (Mtodo volumtrico) Se define como los miliequivalentes (mEq) de perxido por kilogramo de grasa. Es una determinacin volumtrica de la cantidad de grupos perxidos e hidroperxidos. La cuantificacin se basa en la reaccin del yoduro de potasio con los perxidos para liberar yodo, el cual es titulado con tiosulfato de sodio, empleando almidn como indicador (Nielsen, 1998).
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Las reacciones que se llevan a cabo son: ROOH + KI (exceso) ROH + KOH + I2 I2 + almidn + Na2S2O3 2NaI + almidn + Na2S4O6 (azul) (incoloro) 3.3.3 Determinacin de perxidos. Mtodo volumtrico-Micromtodo Tiene el mismo principio que el mtodo volumtrico descrito en el AOAC, es propuesto por Crowe y White en 2001, donde demuestran que tiene una relacin lineal (r2= 0.998) adems de sensibilidad y precisin adecuadas empleando solo el 10% de los reactivos qumicos necesarios para el mtodo oficial. 3.3.4 Determinacin de ndice de Perxidos (Mtodo colorimtrico) Este es un mtodo colorimtrico indirecto. Se basa en que a una muestra que contenga perxidos se adiciona un reactivo de hierro (II); en la muestra se llevar a cabo la oxidacin electroqumica de hierro (II) a hierro (III) (Jiang et al, 1992)y ste ltimo ser cuantificado por su reaccin de complejacin con tiocianato mostrando un color rojo caracterstico. (Kirk, 1991). Fe2+ + ROOH + Fe3+ 3+ + SCN- -----> [FeSCN]2+ Fe 3.3.5 ndice de Kreis. La floroglucina reacciona en medio cido con las grasas oxidadas, dando una coloracin roja, cuya intensidad aumenta con el deterioro, debido probablemente a la presencia de de aldehdo malnico o de aldehdo epihidrnico. (Aurand et al, 1987)) 3.3.6 ndice de TBA El cido tiobarbitrico (TBA por sus siglas en ingls) reacciona con productos de oxidacin secundaria de los lpidos. El malonaldehdo reacciona con TBA para producir un compuesto colorido se puede medir espectofotomtricamente. Debido a que no es especfica para el malonaldehdo algunas veces el resultado se reporta como sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS).
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4 4.1 Determinacin de protenas
PROTENAS
4.1.1 Mtodo de Kjeldahl En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuentemente la protena total que las protenas o aminocidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no protenas como las protenas verdaderas (Aurand et al, 1987) El mtodo se basa en la determinacin de la cantidad de Nitrgeno orgnico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos: a) La descomposicin de la materia orgnica bajo calentamiento en presencia de cido sulfrico concentrado. b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra Durante el proceso de descomposicin ocurre la deshidratacin y carbonizacin de la materia orgnica combinada con la oxidacin de carbono a dixido de carbono. El nitrgeno orgnico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolucin como sulfato de amonio. La recuperacin del nitrgeno y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de descomposicin (sulfato de potasio) o por la adicin de oxidantes (perxido de hidrgeno, tetracloruro, persulfatos o cido crmico) y por la adicin de un catalizador. (Nollet, 1996) El mtodo de Kjeldahl consta de las siguientes etapas: a) Digestin b) Destilacin
(recibiendo en HCl) (recibiendo en H3BO3)
Protena + H2SO4 CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + NH3 + H2O NH3 + H3BO3 NH4H2BO3
c) Titulacin
(si se recibi en HCl) (si se recibi en H3BO3)
NH4Cl + HCl + NaOH NH4Cl + NaCl + H2O NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl
En la mezcla de digestin se incluye sulfato sdico para aumentar el punto de ebullicin y un catalizador para acelerar la reaccin, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el
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destilado se retiene o bien por un cido normalizado y se valora por retroceso, o en cido brico y valora directamente. El mtodo Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrgeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993) Para convertir el nitrgeno a protena se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la consideracin de que la mayora de las protenas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrgeno.
factor = 100 g Pr otena = 6.25 16 g itrgeno
Tabla 3. Factores de conversin de nitrgeno a protena para algunos alimentos Alimento % N en protena Factor Huevo o carne 16.0 6.25 Leche 15.7 6.38 Trigo 18.76 5.33 Maz 17.70 5.65 Avena 18.66 5.36 Soya 18.12 5.52 Arroz 19.34 5.17 (Nielsen, 1998) 4.1.2 Absorcin a 280 nm. La mayora de las protenas muestran una absorcin a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenlico de la tirosina y al grupo indlico del triptofano. La cuantificacin de protenas basada en la absorcin en la regin de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daa o destruye durante la determinacin. Se toma en cuenta la absorcin del disolvente, ya que este puede absorber en la misma regin. Este mtodo sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparacin con una protena estndar, de la que se debe conocer su composicin. (Nollet, 1996)
Fig. 6. Estructura qumica de los aminocidos aromticos
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4.1.3 Mtodo de Biuret El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta caracterstico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de nitrgeno del pptido (Ver Figura 7). Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco. (Nollet, 1996)
N O
2+
N O
R H O N
Cu
N H
Fig. 7. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos
4.1.4 Mtodo de Lowry El mtodo de Lowry et al, 1951 combina la reaccin de Biuret con la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico) por la oxidacin de tirosina, triptofano, cistena, cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen, 1988). El proceso de oxido-reduccin se acompaa de la formacin de un color azul caracterstico. Los quelatos de cobre en la estructura del pptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromforo cido. Este mtodo es til para determinar pequeas cantidades de protena en una disolucin. El desarrollo de color es
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dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996)
Fig. 8. Esquema general de las reacciones que se llevan a cabo en el mtodo de Lowry 4.1.5 Mtodo turbidimtrico La turbidez producida cuando una protena se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (cido tricloroactico 3-10%, cido sulfosaliclico y ferrocianuro de potasio en cido actico) para protenas en bajas concentraciones se puede utilizar como un ndice de la concentracin de protenas. Las tcnicas turbidimtricas son rpidas y convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las protenas difieren en la velocidad de precipitacin as como no permiten diferenciar entre protenas y compuestos insolubles en cidos tales como cidos nucleicos. (Layne, 1957) 4.1.6 Unin de colorantes Controlando el pH y la fuerza inica del medio los grupos funcionales cidos y bsicos de las protenas pueden interactuar con grupos orgnicos de carga opuesta. Al realizarse la unin se presenta coloracin o bien un cambio de sta. Comnmente se usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH cido con el grupo -amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un nmero limitado de -amino terminales. (Nollet, 1996)
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Tabla 4. Comparacin entre los mtodos usados para determinacin de protenas

Mtodo Ventajas Es apropiado para varios tipos de productos Su alta confiabilidad y disponibilidad Esta incluido en los mtodos aprobados por las organizaciones internacionales Desventajas Llega haber interferencia de compuestos nitrogenados no proteicos Durante la digestin se produce demasiado humo Uso de catalizadores caros o txicos Baja sensibilidad Tarda demasiado tiempo La interferencia de otros compuestos que absorban en UV Se necesita usar muestras limpias y lmparas relativamente nuevas
Kjeldahl
Absorcin a 280nm
Biuret
Rpida y no destructiva No se necesitan reactivos Alta sensibilidad Baja dependencia de la respuesta de la seal a la composicin del aminocido Baja interferencia de cidos nucleicos y nucletidos No hay interferencia de aminocidos libres Pequea influencia de la composicin del aminocido en el desarrollo de color La operacin es simple y se puede manejar nmero grande de muestras Alta sensibilidad Fcil de operar Fcil de manejar un gran numero de muestras
Interferencia de amoniaco, buffer, detergentes Baja sensibilidad
Lowry
Dependencia del color con la composicin del aminocido Interfieren un buen nmero de compuestos Inestabilidad del reactivo Folin-Ciocalteau a pH alcalino La curva estndar no es lineal para altas concentraciones de protenas por lo tanto es necesario diluir mucho antes de medir
(Nollet, 1996)
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4.2
Extraccin de protenas. (Mtodo de Osborne y Mendel).
El mtodo se fundamenta en la relacin estructura-solubilidad de las protenas. Por ejemplo, se sabe que la zena que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgnicas. Las glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y bastante soluble en sosa y potasa. Es importante notar que la mayora de nitrgeno proveniente de protenas es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albminas y prolinas son solubles en disoluciones alcalinas diluidas. (Osborne, 1914)
4.3
Propiedades funcionales de las protenas
4.3.1 Capacidad de gelificacin Cuando las protenas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteica ordenada, al proceso se le denomina gelificacin. La gelificacin es una propiedad funcional muy importante de algunas protenas, se utiliza, no slo para formar geles slidos viscoelsticos, sino tambin para mejorar la absorcin de agua, los efectos espesantes, la fijacin de partculas (adhesin) y pata estabilizar emulsiones y espumas. Los mecanismos y las interacciones responsables de la formacin de las redes tridimensionales proteicas son el despliegue y se desnaturaliza antes de la interaccin y agregacin ordenada protena-protena. La formacin de las redes proteicas se considera el resultado de un balance entre las interacciones protena-protena y protenadisolvente (agua) y entre las fuerzas atractivas y repulsivas entre cadenas polipeptdicas adyacentes. Entre las fuerzas atractivas implicadas se encuentran las interacciones hidrofbicas (potenciadas por las temperaturas elevadas) electrostticas (como los puentes de calcio (II) y otros cationes divalentes), los puentes de hidrgeno (potenciados por el enfriamiento) y los enlaces disulfuro. (Fennema, 1993) 4.3.2 Capacidad de emulsificacin La Capacidad de emulsificacin es el volumen de aceite que puede ser emulsificado por cada gramo de protena, antes de que se produzca la inversin de fases. Las caractersticas de una emulsin y los resultados obtenidos en los dos tipos de ensayos mencionados se ven influidos por mltiples factores: tipo y geometra del equipo utilizado, intensidad del input de energa, velocidad de adicin del aceite,
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volumen de la fase grasa, temperatura, pH, fuerza inica, presencia de azcares y agentes de superficie de bajo peso molecular, exposicin al oxgeno, tipo de grasa, concentracin de las protenas solubles. (Fennema, 1993) 4.3.3 Capacidad de espumado Las espumas suelen ser dispersiones de burbujas de gas en una fase continua, lquida o semislida, que contiene un agente con actividad de superficie, soluble. En muchos casos, el gas es aire (y en ocasiones dixido de carbono) y la fase continua una disolucin o suspensin acuosa de protenas. Se puede producir espuma batiendo o agitando una disolucin proteica en presencia de abundante fase gaseosa. La formacin de espuma requiere la difusin de las protenas solubles hacia la interfase aire/ agua, donde deben desplegarse, concentrarse y extenderse rpidamente, para rebajar la tensin interfasial. El desplegamiento previo de las protenas globulares, a travs de un calentamiento moderado, la exposicin a agentes desnaturalizantes, como sustancias reductoras de los grupos disulfuro, o la proteolisis parcial, mejoran la orientacin en la interfase y proporcionan a las protenas una mayor capacidad de formacin de espuma. Para estabilizar una espuma es preciso formar una pelcula proteica, impermeable al aire, gruesa, elstica, cohesiva y continua en torno a cada burbuja. La capacidad de espumado se define como los mililitros de espuma por mililitro de lquido. (Fennema, 1993) 4.3.4 Capacidad de retencin de agua Se determina la cantidad de agua necesaria para lograr un estado de saturacin de la protena (cantidad mxima de agua retenida, medida por centrifugacin). En este mtodo se mide tanto el agua ligada (agua de hidratacin, no congelable) como el agua capilar, retenida fsicamente entre las molculas proteicas. La concentracin proteica, el pH, la temperatura, el tiempo, la fuerza inica y la presencia de otros componentes afectan a las fuerzas que toman parte en las interacciones protena-protena y protena-agua. La absorcin total de agua aumenta con la concentracin proteica. Los cambios de pH, a travs de su influencia sobre la ionizacin y la magnitud de la carga neta de la molcula proteica, alteran las fuerzas interactivas, atractivas o repulsivas, de la protena y modifican su aptitud para asociarse con el agua.
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La fijacin de agua por las protenas desciende generalmente a medida que se eleva la temperatura, debido a la disminucin de los puentes de hidrgeno. El calentamiento provoca la desnaturalizacin y la agregacin, pudiendo esta ltima reducir el rea superficial y el nmero de grupos amino polares disponibles para fijar agua. Por otro lado, cuando se calientan protenas con una estructura muy compacta, la disociacin y el desplegamiento ocasionados pueden exponer enlaces peptdicos y cadenas laterales polares previamente ocultos, lo que aumenta la fijacin. El tipo y la concentracin de iones ejercen un considerable efecto sobre la absorcin de agua. Generalmente, se establece una competencia en la interaccin entre el agua, la sal y las cadenas laterales de los aminocidos. (Fennema, 1993)
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5 5.1
ANALISIS DE CARBOHIDRATOS
CARBOHIDRATOS TOTALES
5.1.1 Mtodo de fenol-sulfrico Este mtodo propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensible a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida producen monosacridos. La forma en que procede la reaccin no es estequiomtrica y depende de la estructura del azcar, por lo tanto se realiza una curva patrn. (Nielsen, 1998)
5.2
ANALISIS DE POLISACARIDOS
5.2.1 Extraccin selectiva de almidn Los dos tipos de molculas que se pueden encontrar en el almidn difieren apreciablemente en sus solubilidades en disolventes acuosos, por ejemplo, la extraccin en agua caliente remover una parte considerable de amilosa y dextrinas, dejando una parte de amilopectina. (Southgate, 1991) 5.2.1.1 Con cloruro de calcio La extraccin con cloruro de calcio ha sido utilizada ampliamente en el anlisis de almidones en cereales por mtodos polarimetritos, dando resultados reproducibles. Otros polisacridos son solubles en este reactivo y es necesario tener cuidado en la aplicacin de este mtodo a otros tipos de alimentos. (Southgate, 1991) 5.2.1.2 Con cido perclrico El almidn se extrae de una muestra seca con cido perclrico y se precipita como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el almidn. (Southgate, 1991)
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5.2.1.3 Con etanol y cido perclrico El mtodo se diseo originalmente para cereales y envuelve la extraccin de azucares libres con etanol acuoso y la extraccin del almidn con cido perclrico del residuo, con mtodos como el de antrona. (Southgate, 1991) 5.2.1.4 Con dimetil sulfxido (DMSO) El almidn se dispersa en DMSO y luego se convierte cuantitativamente en D-glucosa con -amilasa termoestable, llevando a cabo la polimerizacin y de polimerizacin del almidn. Una glucoamilasa completa la accin de la -amilasa para determinar la D-glucosa usando un reactivo contiene una parte incolora que se oxida a un compuesto colorido por medio del peroxido de hidrogeno proveniente de la glucosa. (Nielsen, 1998)
5.2.2 Cuantificacin de almidn 5.2.2.1 Por hidrlisis cida directa La hidrlisis cida del almidn da un rendimiento casi terico de glucosa y este proceso ha sido el principio de varios mtodos analticos. La fuerza del cido utilizado para la hidrlisis puede variar pero se sabe que una disolucin 0.2 M de cido sulfrico por 4 horas en reflujo convierte el almidn en glucosa de tal suerte que el uso de cidos ms fuertes es innecesario. La limitante del proceso es el contenido de protenas y cidos grasos en el alimento ya que dan productos de condensacin en estas condiciones. (Southgate, 1991) 5.2.2.2 Por reaccin colorida con yodo La configuracin de la molcula de almidn parece ser helicoidal con un ncleo relativamente largo. La molcula tiene dos tipos de molculas: amilosa y amilopectina, las amilosas son molculas lineales, en las cuales la glucosa esta unida por enlaces -1,4, la amilosa se dispersa rpidamente en agua pero las cadenas se recombinan y sufren un proceso de retrogradacin. La amilosa forma complejos con el yodo y es responsable del color azul caracterstico del complejo almidn-yodo. El complejo con yodo es del tipo de inclusin. La molcula de amilopectina ha dado evidencia de no formar complejos estables con yodo pero dan un color rojo plido en su presencia. La proporcin de amilosa y
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amilopectina en el almidn tiene efectos importantes en las propiedades fsicas del almidn. La determinacin de amilosa en el almidn normalmente envuelve la formacin de complejos con yodo y la titulacin potenciomtrica de yoduro. (Southgate, 1991)
Fig. 9. Complejo de inclusin del yodo con la amilosa 5.2.2.3 Por precipitacin de complejos con yodo El almidn se extrae de una muestra seca con cido perclrico y se precipita como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el almidn. (Southgate, 1991). 5.2.3 Anlisis de pectinas Las soluciones pcticas son solubles en agua con una alta proporcin de galacturonanos o galacturonorhamnanos, aunque tambin arabinanos, galactanos y arabinogalactanos han sido aislados de la fraccin pctica de varias plantas. Las soluciones pcticas incluyen polisacridos que pueden ser extrados con agua caliente. Es usual aadir un agente quelante como EDTA u oxalato de amonio al medio de extraccin para liberar aquellas pectinas que estn presentes como sales de calcio. (Southgate, 1991)
5.2.4 Determinacin de Fibra diettica La fibra diettica se define como los polisacridos y lignina que no son digeridos por enzimas humanas (Lee y Prosky, 1995). Los mtodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se fundamentan en aislar la fraccin del inters con la precipitacin selectiva y despus determinar su peso. Una muestra
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gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimticamente con alfaamilasa, amiloglucosidasa y proteasa para hidrolizar al almidn y la protena. El contenido total de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solucin para precipitar toda la fibra. La solucin entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985) Alternativamente, los componentes solubles e insolubles en agua de la fibra pueden ser determinados filtrando la muestra enzimtico-digerida (Mtodo 991.43, Horwitz, 2005). La fibra soluble se encuentra en la solucin del lquido filtrado, y la fibra insoluble en el residuo. El componente insoluble se recoge del filtro, se seca y se pesa. El componente soluble es precipitado de la solucin agregando el alcohol del 95% al lquido filtrado, y entonces recuperado por la filtracin, secado y pesado. Ambas metodologas se corrigen determinando protena y de ceniza de las fracciones. Estos mtodos han sido reportados oficialmente por el AOAC y son ampliamente utilizados en la industria alimentaria para determinar el contenido de la fibra de una variedad de alimentos. Su desventaja principal es que tiende a sobrestimar el contenido de la fibra de los alimentos que contienen altas concentraciones de azcares simples, por ejemplo, frutas deshidratadas, posiblemente porque estos carbohidratos son atrapados en los precipitados formados cuando se agrega el etanol 5.3 Azcares en solucin
Se requiere que al tratar estas muestras se remuevan sustancias que puedan interferir. Los pigmentos y otras sustancias coloridas interfieren con procedimientos colorimtricos y otros mtodos, particularmente con los mtodos de reduccin. Para decolorar se han utilizado una gran variedad de mtodos como el uso carbn activado y tratamientos con sales de plomo. Cuando se usan sales de plomo se debe de evitar el uso de acetato de plomo bsico para medidas polarimtricas, en cuyo caso se prefiere acetato de plomo neutro, este se usa con una solucin acuosa saturada y el exceso se elimina con oxalato de plomo u oxalato de sodio. (Southgate, 1991)
5.3.1 Carbohidratos solubles totales 5.3.1.1 ndice de refraccin Cuando la radiacin electromagntica pasa de un medio a otro, cambia de direccin, se dobla o se refracta. La relacin entre el ngulo de incidencia al seno del ngulo de refraccin se llama ndice de refraccin (RI).
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El RI vara con la naturaleza del compuesto, la temperatura, la longitud de onda de la luz y la concentracin del compuesto. Si las tres primeras variables se hacen constantes la concentracin del compuesto se puede determinar midiendo el RI, de tal forma que el RI se utiliza para determinar slidos totales en disolucin. El uso del RI para determinar concentraciones es preciso solamente para sacarosa pura u otras disoluciones puras, tambin se utiliza para obtener concentraciones aproximadas de azucares para productos lquidos en cuyo caso la solucin debe ser clara. Los refractmetros pueden leer directamente en unidades de sacarosa. (Nielsen, 1998)
5.3.2 Determinacin de carbohidratos reductores 5.3.2.1 Mtodo cido dinitrosaliclico (D S) En disolucin alcalina el azcar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el producto monoamino correspondiente. Esta reaccin da un producto colorido en solucin alcalina. El original procedimiento de Dahlquist ha sido modificado en un proceso automatizado para anlisis de azucares totales producidos por la hidrlisis de polisacridos que no contengan almidn. Para este se requiere tener estndares similares a la muestra. (Southgate, 1991) La reaccin que se lleva acabo es la siguiente:
CHO H OH
OH
COO-Na+
3 HO
H H
H OH OH
+
O2N NO2
+
sodium 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoate
3 OH-
CH2OH 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal
COOH OH H OH OH CH2OH O2N
COO-Na+
OH
3 HO
H H
NH2
sodium 3-amino-2-hydroxy-5-nitrobenzoate
(Nielsen, 1998)
5.3.2.2 Mtodo de Fehling Cuando un azcar reductor se calienta en condiciones bsicas se degrada y algunos de los productos de degradacin reducen los iones cpricos para formar oxido cuproso. (Pomeranz y Meloan, 2000)
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Una amplia variedad de mtodos se han utilizado para determinar azucares reductores, todos estos han sido variaciones del mtodo de Fehling. Estas variaciones han sido para cada tipo de alimento, en cualquier caso el principal logro de modificaciones ha sido mejorar la precisin de reduccin y eliminar cualquier factor que interfiera con la produccin de oxido de cobre, de los factores estudiados, la alcalinidad del reactivo, la proporcin, el tiempo de calentamiento, la concentracin del azcar, parecen ser los mas importantes. A partir de esto, diferentes tcnicas han sido utilizadas para determinar el oxido cuproso que se forma y se han obtenido datos de calibracin; de estos mtodos los mas usados son el mtodo de Lane-Eynon y el mtodo Munson y Walker. En el mtodo Lane-Eynon se titula con el reactivo de Fehling caliente en dos etapas, primero se aade una cantidad de reactivo de Fehling tal que se lleve a cabo la total reduccin y despus se determina el punto final con azul de metileno por goteo, es necesario un control de la temperatura y se sugieren dos titulaciones. (Pomeranz y Meloan 2000)
Tcnicas de anlisis de alimentos
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PROCEDIMIENTOS
DETERMINACION DE HUMEDAD
6.1 Mtodo por secado en estufa (Nielsen, 2003) Pesar de 2 a 3 g de muestra en un pesafiltro con tapa (previamente pesado despus de tenerlo a peso constante 2 hrs. a 130C aprox.). Secar la muestra en la estufa 2 hrs. a 100110C. Retirar de la estufa, tapar, dejar enfriar en el desecador y pesar tan pronto como se equilibre con la temperatura ambiente. Repetir hasta peso constante. Calcular el porcentaje de humedad, reportndolo como prdida por secado a 100-110C. 6.2 Mtodo por secado en estufa de vaco (Nielsen, 2003) Pesar de 2 a 3 g de muestra en un pesafiltro con tapa (previamente pesado despus de tenerlo a peso constante 2 hrs. a 130C aprox.). Secar la muestra al menos por 24 hrs. en la estufa conectada a vaco a una temperatura de 70C como mximo. Retirar de la estufa, tapar, dejar enfriar en desecador y pesar tan pronto como se equilibre con la temperatura ambiente. Repetir la operacin hasta peso constante. Calcular el porcentaje de humedad, reportndolo como prdida por secado en estufa de vaco a 701C. 6.3 Mtodo de secado en Termobalanza (Kirk et al, 1996) Pesar de 8 a 10 g de muestra y colocarlos en una charola de aluminio formando una capa lo ms homognea posible. Colocar la charola con muestra en el espacio destinado para ello en la termobalanza y encender el equipo. Registrar la prdida de peso o en su caso, el porcentaje de humedad (segn el equipo) despus de 10-15 min o bien cuando ya no haya variacin en la lectura. Calcular el porcentaje de humedad. Nota: Dependiendo del equipo, es necesario regular la intensidad de la lmpara para evitar que la muestra se queme y el resultado sea errneo. 6.4 Mtodo de destilacin azeotrpica (Nielsen, 2003) Pesar 10-25 g de muestra en un matraz bola de 500 mL con junta esmerilada. Cubrir la muestra con tolueno (100 mL aprox.). Acople al matraz un colector para destilacin azeotrpica y un refrigerante a este ltimo en posicin de reflujo conectado al flujo de agua. Llene el vstago graduado del colector con el mismo solvente desde la parte
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superior del refrigerante. Destile lentamente al principio e incrementando la velocidad hasta que toda el agua haya sido destilada. Poco antes del final de la destilacin, lave el refrigerante con un poco de solvente desde la parte superior. Contine la destilacin hasta que ya no vare la cantidad de agua destilada en el tubo colector. Lea el volumen directamente del tubo colector y calcule el porcentaje de humedad considerando la densidad del agua.
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7
7.1
DETERMINACION DE MINERALES
Mtodo cenizas totales (calcinacin) (Kirk et al, 1996)
Colocar a peso constante un crisol 2 hrs. aproximadamente en la mufla a 600C. Pesar de 3 a 5 g de muestra en el crisol (la muestra no debe sobrepasar la mitad del crisol) previamente pesado. Calcinar la muestra, primeramente con un mechero en la campana hasta que no se desprendan humos y posteriormente meter a la mufla 2 hrs. cuidando que la temperatura no pase de 550C. Repetir la operacin anterior si es necesario, hasta conseguir unas cenizas blancas o ligeramente grises, homogneas. Enfriar en desecador y pesar. NOTA. No colocar los crisoles calientes en la mesa de la mufla. Calcular el porcentaje de cenizas.
7.2 Mtodo cenizas totales (digestin hmeda) (NOM-117-SSA1-1994)
Pesar 5 g de muestra en un vaso de precipitados, adicionar 10 mL de cido ntrico concentrado, calentar durante una hora hasta la obtencin de color traslcido, enfriar, recuperar, filtrar en matraz aforado de 100 mL, aforar con agua. Tomar una alcuota de 10 mL y colocarlo en un vaso de precipitados de 250 mL a peso constante, evaporar a sequedad, colocar en estufa hasta peso constante. Calcular por diferencia de peso la cantidad de minerales en la alcuota y relacionarlo con el aforo total.
7.3 Determinacin de minerales
7.3.1
Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996)
Medir 10 mL de una solucin al 1% de su muestra en un matraz Erlenmeyer de 150 mL, adicionar 15 mL de agua destilada y 1 mL de cromato de potasio al 5%, posteriormente titular con una solucin patrn de nitrato de plata 0.1N hasta que aparezca un precipitado seguido de un color rojo ladrillo que permanezca por lo menos 30 segundos. NOTA. En caso de que la solucin problema presente slidos en suspensin filtre antes de realizar la determinacin.
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7.3.2
Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr (Nielsen, 2003)
Obtener por calcinacin a 500-550C las cenizas. En un matraz cnico o en crisol de porcelana blanca lavar las cenizas con un mnimo de agua. Agregar 1 mL de solucin de cromato de potasio al 5% y titular con solucin 0.1M de nitrato de plata hasta que aparezca un color naranja. Calcular el porcentaje de cloruros en las cenizas
7.3.3
Determinacin de Fe en las cenizas (NMX-F-503-1987)
Dilucin de las cenizas: Al crisol fro aadir con pipeta y en la campana 2mL de HCl concentrado para disolver las cenizas. Evaporar en la campana, enfriar aadir 1 mL de HCl conc. y 3.5 mL de agua destilada, con un agitador de vidrio tratar de disolver las cenizas en su totalidad. Pasar cuantitativamente el lquido en un matraz aforado de 50 mL. Volver a lavar el crisol con agua por dos o tres veces ms, pasando los lquidos de lavado al matraz y despus aforar. Cuantificacin de hierro: Filtrar la solucin de cenizas y tomar alcuotas de 10 mL. Desarrollar el color aadiendo en el siguiente orden: 1 mL de solucin clorhidrato de hidroxilamina (al 10%) y agitar, 5 mL de buffer de acetatos y agitar y 1 mL ortofenantrolina al 1% y agitar. Dejar en reposo entre 10 y 15 min. Leer a 530 nm frente a un blanco preparado con agua tratada de la misma manera. Es muy importante aadir los reactivos en el orden descrito. La concentracin de hierro se obtiene interpolando en una curva patrn preparada a partir de una solucin de sulfato ferroso amoniacal tratada de la misma forma, en concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/mL de hierro.
7.3.4
Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995)
A 50 mL de muestra se aaden 2 mL de solucin de hidrxido de sodio 1N o un volumen suficiente para obtener un pH de 12-13 y una punta de esptula de indicador, y se valora con solucin de EDTA 0,01M hasta viraje de rosa a prpura.
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8 8.1
8.1.1
ANLISIS DE LPIDOS
EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS

Mtodo de Soxhlet (James, 1999)
Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullicin en la estufa a 100C, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodn (No apretar el algodn contra la muestra) y colocar el cartucho en el extractor. Conectar el matraz al extractor, en el que se debe encontrar el cartucho con la muestra, y posteriormente conectar ste al refrigerante. (No poner grasa en las juntas). Agregar dos cargas del disolvente (generalmente ter etlico) por el refrigerante y calentar el matraz con parrilla a ebullicin suave. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Una vez extrada toda la grasa, quitar el cartucho con la muestra desengrasada, seguir calentando hasta la casi total eliminacin del disolvente, recuperndolo antes de que se descargue. Quitar el matraz y secar el extracto en la estufa a 100C por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.2
Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000)
Colocar un vaso para Goldfish en la estufa a 100C hasta peso constante, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodn. Situar el cartucho en un recipiente con el fondo perforado y colocarlo en el sostenedor del equipo. Adicionar en el vaso para Goldfish aproximadamente 40 mL del disolvente ter etlico) y colocarlo en el equipo mediante un anillo de hierro con empaque de hule. Subir la parrilla girando hacia un lado y al contrario. Calentar hasta la extraccin completa de la grasa. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa
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Al finalizar, cambiar el sostenedor del cartucho por un recipiente sin perforacin y calentar de nuevo para recuperar el disolvente del vaso. Quitar el vaso del equipo y secar el extracto en una estufa a 100C por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.3 Mtodo por lotes
Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullicin en la estufa a 100C, aproximadamente 2 hrs. Pesar de 5 a 10 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 40 mL de disolvente. Agitar durante 10 min, dejar sedimentar y filtrar la parte superior sobre el matraz bola. Recuperar el residuo y adicionarle 40 mL del disolvente, agitar, dejar sedimentar y filtrar, juntar este filtrado con el anterior. Repetir la extraccin hasta la extraccin total de la grasa. Para verificar que se ha extrado toda la grasa, dejar caer una gota del filtrado sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa. Evaporar el disolvente en rotavapor, secar el extracto lipdico en la estufa a 100C durante 30 min. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.4 Mtodo Mojonnier (James, 1999)
Pesar 10g de muestra y colocarla en el tubo de extraccin Mojonnier Adicionar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Adicionar 10 mL de etanol, mezclar y enfriar. Adicionar 25 mL de ter etlico, tapar el tubo y agitar vigorosamente por un minuto. Enfriar, adicionar 25 mL de ter de petrleo, agitar vigorosamente por 30 s). Dejar reposar por 30 min o hasta que est completamente separada la fase orgnica. Si es necesario, adicione agua destilada para establecer una interfase entre los 2 lquidos en la parte mas angosta del tubo. Decantar la fase etrea en un matraz bola previamente puesto a peso constante.
40
Repetir la extraccin 3 veces usando una mezcla de 5 mL de etanol, 25 mL de ter etlico y 25 mL de ter de petrleo. Adicionando el extracto en el matraz bola. Evaporar el disolvente en rotavapor, secar el extracto lipdico en la estufa a 100C durante 1 h y pesar. Calcular el porcentaje de grasa.
8.1.5
Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999)
Colocar a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullicin en la estufa a 100C, aproximadamente 1 h. A) Pretratamiento a la muestra a) Leche. Pesar 10-11g de muestra en un tubo Rose Gottlieb. Adicionar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. b) Leche en polvo. Pesar 1g de muestra en un tubo de extraccin Rose Glottlieb. Adicionar cuidadosamente 9 mL de agua y mezclar hasta que desaparezcan los grumos. Adicionar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. c) Crema. Pesar 2g de muestra en un tubo de extraccin Rose-Gottlieb. Adicionar 8 mL de una solucin de cloruro de sodio 0.5% (m/v). Adicionar 1 mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. d) Yogurt, helado y dulce de leche. Pesar 4 g de muestra en un tubo Rose-Gottlieb. Adicionar 6 mL de agua a 60C, agitar hasta dispersar la muestra. Adicionar 1.5mL de hidrxido de amonio 0.88 y mezclar. Dejar reposar toda la noche a temperatura ambiente. B) Extraccin de grasa Adicionar 10 mL de etanol, mezclar y enfriar. Adicionar 15 mL de ter etlico, tapar el tubo y agitar por un minuto. Enfriar, adicionar 15 mL de ter de petrleo y agitar por un minuto. Dejar reposar por 30-60 min o hasta que la capa etrea est completamente separada. Quitar el tapn, enjuagarlo y el cuello del matraz con 5 mL de una mezcla de ter etlico:ter de petrleo (1:1). Insertar el tubo sifn, recuperar el solvente en el matraz bola a peso constante, enjuagar el tubo sifn con solvente recuperando este en el matraz. Repetir la extraccin y lavados 2 veces.
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Eliminar el solvente en el rotavapor, secar el matraz por 1h a 100C y pesar. Calcular el contenido de grasa.
8.2
8.2.1
CARACTERIZACION DE LPIDOS
ndice de saponificacin (Nielsen, 2003)
Montar un equipo de reflujo en la campana, colocar en el matraz bola con boca esmerilada 2 g de lpidos y adicionar 25 mL de solucin alcohlica de KOH 0.5 M. Llevar a ebullicin suave y mantener durante 1 h. Adicionar 1 mL de solucin de fenolftalena (0.1%). Titular en caliente el exceso de lcali con cido clorhdrico 0.5 N Calcular el ndice de saponificacin (mg KOH necesarios para saponificar los cidos grasos totales de un gramo de muestra).
8.2.2 Material Insaponificable (AOAC Official method 972.28F)
Transferir el lquido titulado del ndice de saponificacin a un embudo de separacin, usando 50 mL de agua para lavar el matraz. Extraer la solucin con 50 mL de ter etlico, tres veces, juntar los extractos etreos. Lavar dos veces con 20 mL de agua en un embudo de separacin los extractos etreos. Deshidratar el extracto etreo pasndolo por un filtro con sulfato de sodio anhidro. Recuperar el extracto etreo en un matraz parado y evaporar el disolvente a presin reducida, hasta sequedad, utilizando un rotavapor. Colocar el matraz en una estufa de secado a 70C, hasta llegar a peso constante. Cuantificar el material in saponificable por gramo de muestra.
8.2.3 ndice de yodo (Mtodo de Hanus) (Nielsen, 2003)
Pesar de 0.1g a 0.5g de muestra en matraces de yodo. Adicionar 10 mL de diclorometano para disolver la grasa. Preparar un blanco con 10 mL de diclorometano. Pipetear 25 mL del reactivo de Hanus en el matraz. Dejar reposar por 30 min en la oscuridad agitando ocasionalmente. Adicionar 10 mL de KI al 15%, agitar vigorosamente. Adicionar 100mL de agua recientemente hervida y fra, enjuagando el tapn.
42
Titular el yodo con una solucin estandarizada de tiosulfato de sodio 0.1N adicionando gradualmente y con agitacin vigorosa hasta que el color amarillo desaparezca. Adicionar 1mL de solucin indicadora de almidn y continuar titulando hasta que desaparezca el color azul. Registrar el volumen gastado. Reportar g de yodo absorbido por 100g de muestra
8.2.4 Peso especfico (Aurand et al, 1987)
Colocar un picnmetro a peso constante. Llenar con el aceite y colocarlo en un bao a 25C por 30 min. Secar y pesar. Referir el peso especfico relacionando el peso del aceite al peso del agua a 25C
8.2.5
ndice de refraccin (Aurand et al, 1987)
Se emplea un refractmetro, se realiza la prueba de 20-25C para aceites y a 40C para grasas. Se puede mantener la temperatura empleando un bao de agua a temperatura constante para que circule a travs de los prismas. Colocar la muestra en los prismas del refractmetro de campo, adecuadamente calibrado. Cierre la tapa, suavemente, la muestra debe cubrir completamente la superficie del prisma. Mirar la escala a travs de la mirilla. Leer en la escala, en la interseccin de los campos. En caso de que la separacin de los campos no sea clara, ajustar moviendo la base del objetivo. Eliminar la muestra del prisma, utilizando un papel suave.
8.2.6 Vitamina A. Mtodo de Carr-Price (Aurand et al, 1987)
Preparacin de la muestra: Saponificacin. Se agregan 30 mL de etanol a 100 mg de muestra en un matraz de 250 mL. Posteriormente se aade 10 mL de hidrxido de potasio (50g/50mL agua) y se somete a reflujo durante 30 min. Extraccin. Una vez saponificada la muestra, se deja enfriar a temperatura ambiente. Se extrae la fraccin insaponificable en un embudo de separacin con 4 o 5 lavados de 30 mL de ter etlico. Se juntan los extractos etreos y se lavan con agua destilada hasta que los lavados no den reaccin con la fenolftalena. El extracto etreo se trata con sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua. Evaporacin del solvente. El extracto etreo se evapora en el rotavapor.
43
Determinacin: Las lecturas de deben realizar 10 s despus de haber agregado el reactivo de Carr-Price (tricloruro de antimonio al 20% en diclorometano o cloroformo). En un tubo se colocan 0.5mL de solucin problema y se adicionan 5 mL del reactivo de Carr Price. Se lee en el espectofotmetro a 620nm Se prepara una curva estndar de 7-30UI/mL de la misma forma que la muestra.
8.2.7 Colesterol (Kenny, 1952)
Pesar 100 mg. de material lipdico y disolver en un volumen conocido de diclorometano. Colocar 0.2 mL en un tubo de ensaye. Adicionar con precaucin 4 mL de anhdrido actico (6.33 M en c. actico). Mezclar y dejar 10 min en reposo. Adicionar 1 mL de H2SO4 conc. y agitar con precaucin. Dejar 30 min a temperatura ambiente. Leer contra un blanco de reactivos a 620 nm Preparar una curva patrn con colesterol en un intervalo de concentracin de 0.2 -2 mg/mL. Llevar a cabo la reaccin, como se menciono anteriormente y leer a 620 nm. Calcular el contenido de colesterol por gramo de lpidos y por gramo de muestra. 8.3
8.3.1
DETERIORO DE LPIDOS
Acidez titulable (Nielsen, 2003)
En un matraz Erlenmeyer de 125 o 250 mL, colocar 0.5 g de lpidos y adicionar 25 mL de alcohol previamente neutralizado (utilizando fenolftalena 0.1% como indicador). Calentar en un bao de agua en ebullicin suave y titular en caliente con KOH 0.0025 N, agitando fuertemente despus de cada adicin de lcali. Calcular el ndice de acidez, como equivalentes de KOH por 100 g de aceite.
8.3.2 Determinacin de ndice de Perxidos Method 965.33) Mtodo volumtrico (AOAC Official
Pesar 5.00 0.05 g de aceite o grasa en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y adicionar 25 mL de una solucin de cido actico/diclorometano (3:2), disolviendo perfectamente. Adicionar 0.5 mL de una solucin saturada de yoduro de potasio y dejar reposar en la oscuridad durante 60 s, medidos con cronmetro.
44
Aadir 75 mL de agua desionizada hervida y fra, titular lentamente con tiosulfato de sodio 0.1 N. Si se gastan menos de 3 mL, diluir el titulante a 0.01 N. Agitar vigorosamente durante la titulacin hasta obtener un color amarillo plido. Adicionar 0.5 mL de solucin de almidn indicador (almidn soluble al 1% en agua) y continuar la titulacin hasta la desaparicin del color azul por 30 seg. El ndice de perxidos se obtiene calculando los miliequivalentes de tiosulfato utilizados en la titulacin por kilogramo de muestra.
8.3.3
Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)
Pesar 0.5 0.05 g de aceite o grasa en un matraz Erlenmeyer de 125 o 250 mL y adicionar 2.5 mL de una solucin de cido actico/diclorometano (3:2), disolviendo perfectamente. Adicionar 0.05 mL de una solucin saturada de yoduro de potasio y dejar reposar en la oscuridad durante 60 seg., medidos con cronmetro. Aadir 7.5 mL de agua desionizada hervida y fra, adicionar 0.1 mL de solucin de almidn indicador (almidn soluble al 1% en agua). Si se presenta una coloracin azul oscuro (en toda la solucin o en forma de puntos aislados) titular lentamente con tiosulfato de sodio 0.001 N hasta la desaparicin total del color azul. El ndice de perxidos se obtiene calculando los miliequivalentes de tiosulfato utilizados en la titulacin por kilogramo de muestra.
8.3.4
Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996)
Disolver una cantidad conocida diclorometano/metanol (70:30).
de
grasa
aceite
en
una
mezcla
de
Colocar el equivalente a 0.001-0.1 g de lpidos en un tubo de vidrio y llevarlo a 10 mL con el mismo disolvente. Adicionar 0.05 mL de una solucin de tiocianato de amonio (30%), mezclar y medir la Absorbancia a 500 nm frente a un blanco de solventes (Eo). Adicionar 0.05 mL de solucin de cloruro ferroso (FeCl2), al 0.35% con 2% de HCl 10M, mezclar y tomar el tiempo. Despus de exactamente 5 min medir la absorbancia a 500 nm (E2). Simultneamente hacer una determinacin del blanco (E1). Preparar una curva de calibracin con cloruro frrico (FeCl3) en concentraciones que contengan entre 5 y 50 g de Fe/10 mL. Es importante mencionar que el FeCl3 deber
45
encontrarse disuelto en la mezcla de disolventes. La curva se prepara mezclando 10 mL de cada dilucin de FeCl3 con 0.05 mL de tiocianato de amonio y 0.05 mL de HCl 0.2M, leyendo a la misma longitud de onda. El ndice de perxidos (IP en mEq/Kg) se obtiene relacionando la cantidad de Fe, expresados comog/10 mL obtenidos en la reaccin, con el peso de la muestra. La cantidad de Fe se obtiene a partir de la curva de calibracin, utilizando la absorbancia obtenida, una vez corregida por los blancos [E2 - (E1 + Eo)].
8.3.5
ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923)
Disolver de 50 a 500 mg de grasa en 5 mL de diclorometano. Aadir 10 mL de una solucin de cido tricloroactico al 30% en cido actico glacial y 1 mL de floroglucinol al 1% en cido actico. Agitar e incubar por 15 min, en un bao mara a 45C, dejar enfriar y agregar 4 mL de etanol. Medir la absorbancia de la muestra a 540 nm frente a un blanco de reactivos. El ndice de Kreis se calcula como Abs a 540 nm/g de grasa.
46
9 9.1
9.1.1
ANLISIS DE PROTENAS
DETERMINACIN DE PROTENAS
Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)
Nota: Mtodo digestin en parrilla (boque de calentamiento) usando cobre como catalizador y unidad de destilacin con vapor. Equipo Bchi
DIGESTION:
Pesar de 0.1-0.2g de muestra e introducir en un tubo de Kjeldahl, y agregar 0.15g de sulfato de cobre pentahidratado, 2.5g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 mL de cido sulfrico concentrado. NOTA. No colocar el papel. Encender el aparato y precalentar a la temperatura de 360C. Colocar los tubos en el portatubos del equipo Kjeldahl y colocarlo en el bloque de calentamiento. (Ver Fig. 10)
Fig.10 Unidad de digestin Kjeldahl. Bchi. Ajustar la unidad de evacuacin de gases con las juntas colocadas sobre los tubos de digestin. (Ver Fig. 11)
Fig. 11 Unidad de extraccin y neutralizacin de vapores cidos de la reaccin Kjeldahl
47
Accionar la trampa de succin de gases antes de que se produzcan stos. Calentar hasta total destruccin de la materia orgnica, es decir hasta que el lquido quede transparente, con una coloracin azul verdosa. Una vez finalizada la digestin, sin retirar la unidad de evacuacin de gases, colgar el portatubos para enfriar. NOTA. Tener la precaucin de colocarlo adecuadamente, de lo contrario se podra caer. Despus del enfriamiento, terminar la digestin con la tecla stop y desconectar la trampa.
DESTILACIN
En un matraz Erlenmeyer de 250 mL adicionar (segn se indique) 50 mL de HCl 0.1N y unas gotas de indicador rojo de metilo .1% o bien 50 mL de cido brico 4% con indicadores Conectar el equipo de destilacin y esperar unos instantes para que se genere vapor. Colocar el tubo de digestin con la muestra diluida y las sales disueltas en un volumen no mayor de 10 mL de agua destilada, en el aparato de destilacin cuidando de introducir la alargadera hasta el fondo de la solucin. (Ver Fig. 12)
Fig. 12. Unidad de destilacin Bchi. Presionar el botn blanco para adicionar sosa al 36% (hasta 40 mL aproximadamente). Colocar la palanca de vapor en posicin ON hasta alcanzar un volumen de destilado en el matraz Erlenmeyer de 100-150mL, lavar la alargadera con agua destilada, recoger el agua de lavado sobre el destilado. Una vez finalizada la destilacin, regresar la palanca de vapor a la posicin original.
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Titular el exceso de cido (en el caso de recibir el destilado en HCl 0.1N) con una solucin de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con cido brico, con una solucin de HCl 0.1N. Calcular el % de protena considerando las reacciones que se llevan a cabo.
9.1.2
Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)
Colocar la solucin problema debidamente diluida en una celda de cuarzo del espectrofotmetro, de 1 cm de paso, y determinar la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solucin en que se encuentra preparada la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 50 a 500 g/mL
9.1.3 Mtodo de Biuret (Gornall et al, 1949)
Colocar 1 mL de la solucin de protena adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar 4 mL del reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 min. a temperatura ambiente. Determinar la absorbancia del color violeta producido a 540 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 mL de la solucin en que se encuentra diluida la muestra. La concentracin de protena se obtiene por referencia a una curva de calibracin preparada con albmina bovina srica con concentraciones de 1 a 10 mg/mL.
9.1.4
Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951))
Colocar 1 mL de la solucin adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar tomando el tiempo 3 mL del reactivo C preparado recientemente (50 mL de A y 2 de B) Despus de exactamente 10 min adicionar a la mezcla 0.3 mL del reactivo D (1 parte de reactivo de Folin con 1 parte de agua), agitando inmediatamente. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 min. Determinar la absorbancia del color azul producido a 750 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 mL de agua en vez de la solucin problema. La concentracin de protena se calcula a partir de una curva patrn preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 10 a 100 g/mL, tratadas de la misma manera con los reactivos.
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9.1.5
Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957)
Mezclar 1 mL de la solucin problema con 4 mL de alguna de las siguientes soluciones: cido sulfosaliclico al 2.5% cido tricloroactico al 5%% ferrocianuro de potasio 0.75% y adicionar una gota de cido actico Dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Medir espectrofotomtricamente la turbidez a 600 nm, utilizando un blanco con 1 mL de agua tratada de la misma manera. La concentracin de protenas se calcula a partir de una curva patrn preparada con albmina bovina srica en concentraciones de 0.1 a 1.0 mg/mL, tratadas de la misma manera con los reactivos.
9.1.6
Unin a colorantes Mtodo de Bradford (Nielsen, 2003)
Colocar en un tubo de ensaye perfectamente etiquetado, 0.1 mL de la muestra adecuadamente diluida. Adicionar 5.0 mL del reactivo de colorante Azul Brillante de Coomasie G-250. Mezclar perfectamente, en vrtex o por inversin del tubo. Dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente. Lea la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco de reactivos. La concentracin de protena se calcula a partir de una curva patrn preparada con una solucin de albmina bovina srica de 1 a 10 mg/mL, tratada de la misma manera que el problema.
9.2
EXTRACCION DE PROTENAS (Osborne y Mendel, 1914)
La extraccin de protenas mediante el proceso secuencial desarrollado por Osborne y Mendel en 1914 con base en las diferencias de solubilidad entre las protenas. Las fracciones protenicas que se obtienen son: albminas (solubles en agua), globulinas (solubles en soluciones salinas), prolaminas (solubles en soluciones alcohlicas) y glutelinas (solubles en lcali diluido)
9.2.1 A. Albminas Pesar 100 g de harina desengrasada en un vaso de precipitados de 500 mL, agitar con 250 mL de agua desionizada por 1 h en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min. Recolectar el sobrenadante y lavar con 200 mL de agua el residuo siguiendo el mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua por 24 hrs.
50
cambiando por lo menos tres veces el agua, finalmente las protenas se liofilizan. El residuo se utiliza para la extraccin de globulinas.
9.2.2 B. Globulinas Agregar al residuo 250 mL de solucin salina (NaCl 0.5M) y agitar por 1 h en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min, separar el sobrenadante y lavar el residuo siguiendo el mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua, finalmente las protenas son liofilizadas. El residuo se utiliza para la extraccin de prolaminas.
9.2.3 C. Prolaminas Agregar 100 mL de la solucin alcohlica (etanol al 70%-acetato de sodio 0.5%) al residuo anterior y agitar por 1 h. en refrigeracin. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min. Colectar el sobrenadante y, lavar 2 veces ms el residuo siguiendo el mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar contra agua por 24 hrs. cambiando por lo menos tres veces el agua, finalmente las protenas se liofilizan. El residuo de utiliza para la extraccin de glutelinas.
9.2.4 D. Glutelinas Agregar 100 mL de solucin de etanol al 70%-acetato de sodio 0.5%-mercaptoetanol 0.1M al residuo anterior y agitar por 30 min. Separar el sobrenadante y lavar el residuo 2 veces ms con la solucin de etanol-acetato de sodio-mercaptoetanol. Se juntan los sobrenadantes y dializar contra agua.
9.3
PROPIEDADES FUNCIONALES
9.3.1
A. Capacidad de gelificacin
(Avanza y An, 2001)
Realizar ensayos de calentamiento de suspensiones protenicas de concentracin conocida. Observar el aspecto despus de un tiempo determinado de tratamiento. Color, consistencia y textura del producto. Para realizar esta determinacin, sellar en ambos extremos con tapones de goma tubos de vidrio de 5 cm de largo y 8 mm de dimetro. Introducir un volumen de suspensin de 0.5 mL aproximadamente. Utilizar suspensiones de cada fraccin protenica al 10, 7.5 y 5% p/v.
51 (Fennema, 1993)
9.3.2
B. Capacidad de emulsificacin
La capacidad de emulsificacin se define como el volumen de aceite (mL) que puede ser emulsificado por cada gramo de protena, antes de que se produzca la inversin de fases. Para efectuar este ensayo, agitar una disolucin o dispersin de la protena en agua (o en una disolucin salina), mientras se va aadiendo, a ritmo constante, aceite o grasa fundida. La inversin de fases se detecta por la cada sbita de la viscosidad, el cambio de color o el incremento de la resistencia elctrica
9.3.3
C. Capacidad de espumado (Ahmedna et al, 1999)
La capacidad de espumado se define como los mL de espuma por mL de lquido. Para determinarla, se utiliza el siguiente procedimiento: 75 mL (Vi) de soluciones al 3% (p/v) de cada una de las fracciones, mezclar por 3 min. usando una licuadora de alta velocidad, verter en una probeta graduada e inmediatamente registrar el volumen de espuma (Vf). La capacidad de espumado (FC) se calcula de acuerdo a la siguiente expresin: FC= Vf/Vi
9.3.4 D. Capacidad de retencin de agua
(Robertson et al, 2000)
La capacidad de retencin de agua se define como la cantidad e agua que permanece unida a la protena hidratada despus de la aplicacin de una fuerza externa (presin, o ms comnmente, centrifugacin). Para cuantificar la cantidad de agua retenida por un peso conocido de protena se realiza el siguiente procedimiento: Pesar 1 g de muestra y colocar en un tubo de centrfuga, adicionar 30 mL de agua destilada, agitar y dejar en reposo por 18 hrs. Despus de este tiempo centrifugar a 3000rpm g por 20 min. Decantar el sobrenadante y pesar el residuo rehidratado, posteriormente secar y nuevamente pesar. La capacidad de retencin de agua se expresa como la cantidad de agua retenida por gramo de muestra seca.
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10 ANALISIS DE CARBOHIDRATOS
10.1 CARBOHIDRATOS TOTALES

10.1.1 Mtodo del fenol-sulfrico (Dubois et al, 1956)
Preparar una solucin o suspensin de la muestra en agua, procurando que los carbohidratos se encuentren en el intervalo de sensibilidad del mtodo (10-100g/mL). En tubos de ensaye perfectamente etiquetados, colocar 1 mL de la solucin o suspensin acuosa de la muestra. Para cada tubo adicionar 0.6 mL de una solucin acuosa de fenol al 5%. Mezclando perfectamente, adicionar cuidadosamente 3.6 mL de cido sulfrico concentrado, homogeneizar. NOTA. Realizar todo el procedimiento para un tubo antes de seguir con el siguiente. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min.) y determinar la intensidad del color naranja obtenido en un colormetro a 480 nm, frente a un blanco preparado de la misma manera utilizando agua. Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrn preparada con el carbohidrato de inters en el intervalo del mtodo (10-100g de glucosa/mL), tratada de la misma manera que el problema.
10.2 ANLISIS DE POLISACARIDOS

10.2.1 Determinacin de fibra diettica (985.29)
Correr un blanco a lo largo de toda la determinacin. Pesar por 1g de muestra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras no debe diferir en ms de 20 mg. Adicionar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6 0, Medir pH y ajustar a pH 6 0.2 si es necesario. Adicionar 0.1 mL de la solucin de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz en un bao a ebullicin durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con termmetro que los matraces mantengan 95-100C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente
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Ajustar a pH 7.5 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa (disolver 50 mg de proteasa en 1mL de buffer de fosfatos. Adicionar 0.1mL de la solucin a cada matraz). Cubrir el matraz con papel aluminio y colocarlos en un bao a 60C por 30 minutos con agitacin continua. Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 10 mL de HCL 0.325N. Ajustar el pH a 4.04.6, adicionar 0.1mL de amiloglucosidasa, incubar a 60C por 30 minutos con agitacin continua. Adicionar 280 mL de etanol 95% precalentado a 60C (medir el volumen antes de calentar). Dejar en reposo 1 h Pesar el crisol conteniendo la celita, humedecer y redistribuir la cama de celita con etanol 78%. Aplicar succin. Mantener la succin y cuantitativamente transferir el precipitado de la digestin enzimtica. Lavar el residuo con 3 porciones de 20 mL de etanol 78%, lavar con 2 porciones de 10 mL de etanol 95%, lavar con 2 porciones de 10 mL de acetona, si se forma una forma una goma, mover con la esptula para mejorar la filtracin Secar el crisol conteniendo el residuo toda la noche a 70C Enfriar en desecador y pesar Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo Analizar protena a uno de los crisoles, analizar cenizas al otro crisol. Corregir el residuo restndole las cenizas y protena correspondiente.
10.2.2 ALMIDN 10.2.2.1 Extraccin selectiva de almidn (Southgate, 1991) 10.2.2.1.1 Con cloruro de calcio (recomendado para el anlisis polaromtrico del almidn).
Colocar 2-50g de muestra en un matraz Erlenmeyer y formar una pasta con 10 mL de agua. Adicionar 50 mL de solucin de cloruro de calcio cida (620 g CaCl2 6H2O en 180 mL de agua, con 18 g de acetato de sodio trihidratado en 20 mL de agua, ajustar el pH a 2-3 con cido actico) y calentar en autoclave a 120 C por 10 min. Enfriar la mezcla en un bao de agua fra y transferir a un matraz aforado de 100 mL, utilizando solucin de cloruro de calcio hasta un volumen cercano a 90 mL. Adicionar 2 mL
54
de reactivo de Carrez I y mezclar bien, adicionar 2 mL de solucin de Carrez II, agitar nuevamente y llevar a la marca con solucin de cloruro de calcio. Filtrar a travs de papel Whatman No 541, el filtrado debe ser claro. En esta solucin se encuentra el almidn disuelto.
10.2.2.1.2 Con cido perclrico (recomendado para la formacin de un complejo insoluble con yodo).
Colocar 50-250 mg de muestra seca en un tubo de ensaye con un poco de arena y adicionar 4 mL de agua. Calentar en un bao de agua hirviendo el tubo por 15 min., hasta gelatinizar el almidn. Enfriar el tubo a temperatura ambiente y adicionar rpidamente con agitacin 3 mL de solucin de cido perclrico al 72%. Dispersar la muestra con una varilla de vidrio durante un minuto, repetir la operacin eventualmente durante 15-20 min. Enjuagar con 20 mL de agua la varilla, recuperando en el tubo, centrifugar y decantar el sobrenadante. Realizar una vez ms la extraccin en el residuo, con 4 mL de agua y 3 mL de cido perclrico. Combinar los sobrenadantes y llevarlos a un volumen de 50 mL con agua. Se recomienda analizar inmediatamente.
10.2.2.1.3 Con etanol y cido perclrico (recomendado para realizar una reaccin con antrona o fenol-sulfrico)
Pesar aproximadamente 0.2 g de muestra slida finamente molida y colocar en un tubo de centrfuga de 50 mL, adicionar dos gotas de etanol al 80% (v/v) para humedecer la muestra. Adicionar 5 mL de agua y agitar. Adicionar 25 mL de etanol al 80% caliente, agitar y dejar reposar 5 min. Centrifugar, decantar el sobrenadante y repetir la extraccin con 30 mL de etanol al 80%. En solucin se encuentran los azcares y para su anlisis es necesario eliminar el alcohol por evaporacin a presin reducida. Adicionar 5 mL de agua a la porcin insoluble, posteriormente 65 mL de solucin de cido perclrico al 52% (v/v), agitar la mezcla. Continuar la agitacin por 15 min., despus adicionar 20 mL de agua, centrifugar. Decantar el sobrenadante en un matraz aforado de 100 mL y re-extraer el residuo como se indico previamente. Mezclar los extractos y llevar a la marca con agua, filtrar la solucin si presenta partculas. Las soluciones obtenidas pueden ser analizadas con mtodos como el de antrona para cuantificar los carbohidratos totales, adjudicando el valor del extracto con cido perclrico al almidn y el obtenido con etanol a los azucares solubles.
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10.2.2.1.4 Con dimetil sulfxido (DMSO) (recomendado para preparar extractos sometidos a hidrlisis con amiloglucosidasa)
Mezclar porciones de aproximadamente 100 mg de muestra finamente dividida con 20 mL de DMSO y 5 mL de HCl 8M, calentar en un bao de agua a 60C por 30 min. Diluir a 50 mL con agua y neutralizar con NaOH 5M. Enfriar a temperatura ambiente y aforar a 100 mL. Filtrar si la solucin no es clara. Esta solucin puede ser utilizada directamente para tratamiento con amiloglucosidasa para cuantificar la glucosa formada.
10.2.2.2 Cuantificacin de almidn ( ielsen, 1998) 10.2.2.2.1 Por hidrlisis cida directa
Este procedimiento puede ser usado cuando se sabe que slo se encuentran presentes almidn (y dextrinas) y cuando se permite un bajo nivel de precisin. La muestra debe estar finamente molida o dispersa, para que se puedan tomar alcuotas representativas. Es recomendable eliminar la posible presencia de azucares, por lo que se puede utilizar el residuo insoluble en etanol al 80%. Colocar 100-500 mg de muestra en un matraz de bola de fondo plano de 1L y agregar 450 mL de una solucin de cido sulfrico 0.18M. Colocar a ebullicin en reflujo por 4 hrs., asegurando que todas las partculas se encuentran inmersas en la solucin de cido, para ello a los 30 min enjuagar las paredes del matraz con la solucin, realizar agitacin leve, repetir esta operacin las veces que sean necesarias. Enfriar a temperatura ambiente una vez concluida la hidrlisis y neutralizar parcialmente con una solucin de hidrxido de sodio 10M (aprox. 15 mL), llevar a un volumen de 500 mL. Filtrar y neutralizar completamente con carbonato de sodio slido. Cuantificar la glucosa liberada por la hidrlisis.
10.2.2.2.2 Por precipitacin de complejos con yodo
Se recomienda utilizar el extracto obtenido por solubilizacin con cido perclrico. Transferir una porcin del extracto de c. perclrico (1 a 10 mL) a un tubo calibrado a 10, 15 y 20 mL, y diluir a 10 mL. Adicionar 2 mL de una solucin de cloruro de sodio 20% (p/v), seguida de 2 mL de solucin de I/KI al 3%. Dejar reposar 20 min. Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 5 mL de solucin de cloruro de sodio alcohlica y lavar por centrifugacin.
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El almidn se cuantifica gravimtricamente o descomponiendo el complejo en medio alcalino y cuantificando con un mtodo como el de antrona o fenol-sulfrico. As mismo el almidn liberado puede ser sometido a hidrlisis enzimtica con amiloglucosidasa y cuantificar la glucosa liberada.
10.2.2.2.3 Por reaccin colorida con yodo
Este procedimiento nicamente puede ser utilizado cuando el almidn se encuentra completamente disuelto (gelatinizado). Colocar 2 mL de la solucin de almidn en un tubo de ensayo y adicionar 3mL de una solucin de I/KI preparada diluyendo 2 mL de solucin de yodo a 100 mL con agua. Medir la intensidad del color azul producido en un espectrofotmetro a 600 nm, frente a un blanco de reactivos. Calcular la cantidad de almidn presente en la muestra a partir de una curva patrn preparada en el intervalo de 0.02-0.2 mg de almidn soluble/mL, tratada de la misma manera que el problema. Los resultados de esta determinacin son relativos, ya que no todas las fuentes de almidn forman el mismo complejo colorido con yodo.
10.2.3 ANLISIS DE PECTINAS (Nielsen, 1998)
Colocar 3 g de muestra desengrasada, de preferencia con etanol/benceno, en un embudo con filtro de vidrio poroso y extraer con una solucin al 0.5% (p/v) de oxalato de amonio durante 2 h. a 85C. Repetir la extraccin 4 veces. Combinar los filtrados y acidificar ligeramente con HCl 1M. Adicionar 4 volmenes de etanol con agitacin y dejar sedimentar el precipitado. Decantar el sobrenadante sobre un embudo con filtro de vidrio poroso previamente colocado a peso constante. Transfiera el precipitado al embudo y lave con etanol al 70% ligeramente acidificado con HCl, seguido de etanol y terminando con acetona. Colocar el embudo en la estufa a 100C hasta secar completamente, enfriar y pesar. El residuo corresponde a las sustancias pcticas. 10.3 AZCARES EN SOLUCIN
10.3.1 Preparacin de la muestra (Southgate, 1991)
Si las soluciones de azcares tienen partculas en suspensin se requiere eliminarlas por filtracin en papel Whatman No. 1.
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Para muestras slidas se recomienda disolver una cantidad conocida en un volumen exacto de agua y filtrar, en caso de presentarse material insoluble. Cuando las muestras son turbias o muy coloridas se requiere de clarificacin, para lo cual tomar una alcuota (entre 10 y 50 mL, dependiendo de la cantidad de azcares que contienen), y colocar en un matraz aforado de 100 mL. Diluir aproximadamente 50 mL y tratar con 1mL de solucin saturada de acetato de plomo, diluir al volumen y filtrar sobre papel Whatman N 1, recuperando una solucin clara. Para eliminar el exceso de plomo adicionar oxalato de sodio o potasio slido, mezclar y filtrar nuevamente, descartando los primeros mL.
10.3.2 Carbohidratos solubles totales 10.3.2.1 Medicin por ndice de refraccin (James, 1999)
Colocar una o dos gotas de la solucin en el prisma del refractmetro de campo, adecuadamente calibrado. Cierre la tapa, suavemente, la muestra debe cubrir completamente la superficie del prisma. Mirar la escala a travs de la mirilla. Leer en la escala, en la interseccin de los campos. En caso de que la separacin de los campos no sea clara, ajustar moviendo la base del objetivo. Eliminar la muestra del prisma, utilizando un papel suave hmedo. Los refractmetros ATC-1 y N10 solamente se calibran a 0%, colocando unas gotas de agua destilada en el prisma. Si la separacin de los campos no marca 0%, en la escala, ajustar girando el tornillo que se encuentra en la parte superior de la base del prisma.
10.3.3 Determinacin de carbohidratos reductores 10.3.3.1 Mtodo cido dinitrosaliclico (D S) ( ielsen, 2003)
Tomar 1mL de la solucin acuosa de la muestra, adicionar 1mL del reactivo de DNS y calentar por 5 min en un bao de agua hirviente, enfriar y diluir con 10 mL de agua destilada. Leer la absorbancia del color producido a 540 nm frente a un blanco de reactivos y agua tratado igual que la muestra. Cuantificar los azcares reductores interpolando los valores de absorbancia obtenidos en una curva estndar preparada con el carbohidrato reductor de inters en concentraciones de 0.2 a 2 mg/mL.
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10.3.3.2 Mtodo de Fehling (Aurand et al, 1987)
Mezclar en un matraz Erlenmeyer 2.5 mL de solucin A y 2.5 mL del reactivo B y agregar 50 mL de agua destilada. Calentar a ebullicin (con un mechero o una plancha de calentamiento) y sin quitar de la fuente de calentamiento, aadir con bureta la solucin con los carbohidratos reductores, de tal manera que slo falte agregar de 0.5 a 1 mL para terminar la titulacin, para lo que deber realizarse una prueba inicial y agregue 0.5 mL de indicador de azul de metileno. Todo el proceso debe realizarse en menos de 3 min. Las soluciones debern tener una concentracin tal, que se requiera ms de 10 mL y menos de 40 mL para reducir todo el cobre del reactivo de Fehling, si se usa una bureta de 50 mL Titular el reactivo de Fehling de igual forma, empleando una solucin estndar para obtener el factor correspondiente, que debe ser expresado como gramos del carbohidrato que reduce todo el cobre en las condiciones de trabajo.
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10.4 OTRAS DETERMINACIONES

10.4.1 Determinacin de densidad calrica
La muestra debe ser lo ms representativa del total, para lo cual se recomienda este finamente molida. Si se trata de una muestra de baja humedad (< 10 %) como harinas o similares, se puede determinar el contenido calrico directamente. Si por el contrario se tiene una muestra liquida o semislida, ser necesario someterla a secado de preferencia en estufa de vaco, y determinar el contenido de humedad para poder expresar el resultado en la muestra original. La cantidad de muestra depende del contenido calrico esperado, ya que se recomienda que la cantidad pesada libere aproximadamente 16 KJ (4.0 Kcal.), para que entre en el intervalo de deteccin del instrumento. Materiales con alta densidad calrica como grasas con 0.4 g de muestra ser suficiente; mientras que para muestras con baja densidad como la urea se requerir hasta de 1.5 g de material. La muestra en forma de harina se coloca en un crisol tarado junto con la mecha de algodn, de tal manera que el hilo quede introducido dentro de la muestra y se procede a pesar en una balanza analtica lo que corresponda al peso preliminar (Pp), recomendndose pesar un exceso aproximado del 10 % del peso deseado. Se compacta la muestra con el mango metlico de tal forma que quede lo ms uniforme posible y la mecha quede introducida dentro de la muestra, sobrando un tramo que servir para contactar con el alambre de ignicin de la bomba. Se debe eliminar con mucho cuidado el material que no se haya compactado y el crisol con la muestra compactada se pesa nuevamente para tener el peso final (Pf). El crisol se coloca en la base superior del pilar central de la bomba y con mucho cuidado se introduce la punta suelta de la mecha de algodn en el alambre de ignicin, (ver Fig.13)
Fig. 13. Esquema de bomba calorimtrica
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Se procede a realizar la combustin, para lo cual se debe revisar que el O-RING se encuentre en perfectas condiciones, ya que se debe obtener un cierre hermtico. El cierre se realiza colocando el capuchn de la bomba sobre el anillo metlico y se gire ste hasta que coincida la rosca con el del capuchn, el sellado se debe hacer con la fuerza de la mano, no utilizar herramienta alguna. En seguida se coloca el sensor del termopar en el orificio del capuchn. Teniendo suministro de Oxgeno a presin (cilindro con mnimo 30 bars), se procede abrir la vlvula de paso girando de a la perilla y se debe obtener una presin dentro de la bomba balstica de 25 bars (1 bar 0.987 atm) en aproximadamente 20 a 30 seg. Una vez alcanzada la presin, se cierra la vlvula de paso y se procede a ajustar el galvanmetro primero con la ayuda del ajuste grueso y posteriormente con el dispositivo de ajuste fino. Si las condiciones anteriores se mantienen por aproximadamente 10 s, se oprime el botn de ignicin y en 10 a 15 s se lleva a cabo la combustin, notndose por un aumento en la presin del manmetro, que a su vez se traduce en una seal en la escala del galvanmetro, ya que una vez alcanzado el valor mximo empieza a decaer rpidamente. La lectura mxima obtenida en el galvanmetro, es directamente proporcional al calor liberado en la combustin. Una vez tomada la lectura, se abre la vlvula de salida de los gases de combustin, la cual se localiza en la base de la bomba del lado opuesto a entrada del oxgeno; a la vez, se desconecta el sensor del termopar y una vez liberados los gases de combustin, se procede abrir la bomba girando el anillo metlico en sentido inverso al cierre. Por ltimo cierre la vlvula de liberacin de gases y enfre el capuchn de la bomba en un bao de agua fra hasta temperatura ambiente, para poder realizar una nueva determinacin. CLCULOS. Para poder calcular la densidad calrica de la muestra, es necesario contar con una curva estndar, para la cual se debe realizar la combustin de diferentes pesos de cido Benzoico y anotar la respectiva lectura del galvanmetro. Se recomienda pesar entre 0.1 a 0.7g de cido benzoico (valor calrico certificado); adems ser necesario llevar acabo la combustin exclusiva de la mecha de algodn, ya que el valor obtenido se debe restar, o la escala del galvanmetro se puede ajustar para obtener la lectura en forma directa. Es necesario realizar la determinacin mnimo por triplicado, y una vez obtenida la lectura, se debe convertir a unidades energticas, para lo cual tenemos las siguientes conversiones: 1 g de cido benzoico = 26, 454.3 J = 26.45 KJ
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4.1868 KJ = 1 Kcal Una vez que se cuente con la curva estndar de contenido calrico (abscisas) en funcin de la lectura del galvanmetro (ordenadas), se podr obtener por interpolacin la densidad calrica de la muestra. La determinacin calrica en la bomba calorimtrica, da la mxima energa potencial que en trminos fisicoqumicos corresponde al calor de combustin del respectivo material. Por si mismo el termino de Energa Gruesa (EG) no tiene un valor prctico desde el punto de vista alimenticio, ya que los trminos de mayor aplicacin son aquellos que nos dan la energa biodisponible, como es el caso de la energa metabolizable (EM). No obstante varios investigadores han realizado estudios bastante completos y representativos en alimentacin humana y animal, de los cuales se han podido derivar ecuaciones relativamente sencillas, que nos pueden estimar con cierta exactitud, trminos energticos de aplicacin prctica. A continuacin, se tienen algunas frmulas que pueden estimar con cierta aproximacin, trminos energticos biolgicos a partir de la EG, digestibilidad aparente y composicin qumica de los Alimentos o dieta. TND = (g protena / g dieta) + (g CHOs / g dieta) + [2.25 * (g lpidos / g dieta)] ED = TND x 18.42 EM = 0.95 EG 31.88 N EM = [(0.95 F) EG] 31.4 N Donde: TND: total de nutrientes digeribles EM: energa metabolizable (KJ/g) EG: energa gruesa (KJ/g) ED: energa digerible (KJ/g) N: nitrgeno (g N/ g de alimento) F: fibra cruda (g fibra/ g de alimento) La penltima frmula se usa para dietas que tengan un contenido bajo de fibra cruda (< de una ingesta de 30 g de fibra/ da); mientras que la ultima puede ser usada para cualquier tipo de dieta, pero se debe contar con el dato de contenido de fibra.
62
11 BIBLIOGRAFA. AHMEDNA, M., Prinyawiwatkul, W. y Rao R.M. (1999) Solubilized wheat protein isolate: functional properties and potential food applications. JAFC, 47:1340-1345. APHA, AWWA,WEF.- 1995 Standard methods for the examination of water and waste water. 19th edition. Washington. AURAND, L.W., Woods, A.E., Wells, M.R. Food Composition and Analysis. An AVI Book, New York. 1987 AVANZA, M y An, M (2001). Protenas funcionales de protenas de amaranto: Capacidad de gelificacin. IWT, 48:81-88. BOEKENOOGEN, H. A.; Analysis and characterization of oils, fat, and fat products; London 1964. BOUMANS, H., Van Gaalen, M.C.M., Grivell, L.A. y Berden, A. 1997. Differential Inhibition of the Yeast bc1 Complex by Phenanthrolines and Ferroin. The Journal of Biological Chemistry. 272, 2, 19753-19760. BURKE, R. W; Diamondstone B. I; Velapoldi R. A. and Menis O.; 1974, Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak Color Reactions for Cholesterol, Clinical Chemistry 20/7, 794-801 CROWE T. D.; White P. J. 2001. Adaptation of the AOCS Official Method for Measuring Hydroperoxides from Small-Scale Oil Samples. JAOCS. Vol. 78, no. 12 DUBOIS, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A y Smith, F. (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Analytical Chemistry, 28:3:350-356 FENNEMA O.; Qumica de alimentos; Acribia, segunda edicin; Espaa 1993. GORNALL, A.G; Bardawill, Ch. J. y David, M.M. (1949) Determination of serum proteins by means of the Biuret reaction. The Journal of Biological Chemistry, 177, 751-766 NOLLET, L. M. L (Ed).; Handbook of Food Analysis; M. Dekker, Nueva York 1996. HART F. L; Anlisis moderno de los alimentos; Acribia. Zaragoza (Espaa), 1991. HOFFMANN, G.; The chemistry and technology of edible oils and fats and their high fat products; Academia Press, Londres 1989.
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65
ANEXO 12 PREPARACION DE SOLUCIONES

12.1 Reactivo de Hanus
Disolver 13.615 g de yodo en 825 mL de cido actico glacial, calentar para disolver. Enfriar. Tomar 25 mL de la solucin de yodo y titular con tiosulfato 0.1N, usando 1mL de almidn como indicador. Adicionar 3mL de Bromo a 205 mL de cido actico glacial. A 5 mL de solucin de bromo adicionar 10 mL de KI al 15% y titular con tiosulfato de sodio al 0.1N y 1 mL de almidn como indicador. Calcular el volumen de la solucin de bromo requerida para adicionar a los 800 mL de solucin de yodo, de forma que la solucin final contenga el doble de halgeno.
12.2 Reactivo de DNS
Mezclar 80 mL de NaOH al 10% con 150 mL de agua destilada, agregar 150 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado Calentar a 50C y agitar constantemente Agregar 5 g de DNS y agitar constantemente a 50C., enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Aforar a 500 mL. Guardarlo en frasco mbar en lugar fresco y seco.
12.3 Reactivo de Biuret
1.- Disolucin A: Disolver 1,5 g de CuSO4.5H2O y 6 g de tartrato sdico-potsico en 500 ml de agua destilada. 2.- Disolucin B: Preparar 300 ml de NaOH al 10% (p/v) 3.- Juntar las disoluciones A y B y llevar el volumen a 1 litro
12.4 Reactivo de Lowry
Preparacin de las soluciones Solucin prestock: Disolver 4 g de NaOH + 30 g de Na2CO3. Aforar con agua destilada a 1 L (guardar a temperatura ambiente). Tartrato de Sodio y Potasio 4% (wv): Disolver 4g de KNaC4H4O6. 4H2O y aforar con agua destilada a 100 mL (guardar en refrigerador). Sulfato cprico 2% (wv): Disolver 2g de sulfato de cobre y afora con agua destilada a 100mL (guardar a temperatura ambiente). Solucin Lowry A: Mezclar 1 ml de solucin de tartrato de sodio y potasio + 1 ml de solucin sulfato de cobre aforar con solucin pre-stock a 100 ml. Nota: respeta el orden de adicin de las soluciones para evitar formacin de precipitados. La cantidad de nuestra a preparar es de acuerdo al nmero de muestras a procesar. Solucin Lowry B: Diluir Reactivo Folin 1:1 con agua destilada. Calcular la cantidad a preparar segn las muestras procesadas diarias. Esta solucin se dura solo un da.
66 12.5 Reactivo de Fehling (James, 1999)
Reactivo A Disolver 69.28 g de sulfato de cobre pentahidratado y 1 mL de cido sulfrico 1M en 1L de agua. La solucin puede almacenarse indefinidamente Reactivo B Disolver 346g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado (sal de Rochelle) y 100g de hidrxido de sodio en agua y aforar a 1L. La solucin es estable indefinidamente si es almacenada en un recipiente hermtico
12.6 Reactivo de yodo (para determinacin calorimtrica de almidn)
Pesar 1.269 g I2 y mezclarlos con 1.8 g de KI disolver en 100 mL con agua.

12.7 Ortofenantrolina al 1%
Pesar 0.1g de ortofenantrolina y disolverlo en 80mL de agua destilada a 80C, enfriar y aforar a 100 mL)
12.8 Buffer de Acetatos para determinacin de Fe
Pesar 8.3 g de acetato de sodio anhidro, adicionar 12 mL de cido actico glacial y aforar a 100 mL con agua destilada
12.9 Acido brico con indicadores
Pesar 40g de cido brico y disolverlo en 800 mL de agua destilada posteriormente adicionar 35 mL de fenolftalena al 0.1% en alcohol, y 10 mL de una mezcla de rojo de metilo 0.066% con verde de bromocresol 0.033% en alcohol. Aforar a 1L
12.10 Reactivo colorante Azul Brillante
Preparar una solucin colorante de Azul Brillante de Coomasie G-250 0.1 mg/mL con cido fosfrico al 8.5% y etanol al 4.75%.
12.11 Solucin de Carrez I Pesar 21.9 g de acetato de zinc dihidratado y adicionar 3.0 mL de c. Actico glacial, aforar a 100 mL de agua 12.12 Solucin de Carrez II
Pesar 10.6 g de ferrocianuro de potasio y disolverlo en 100 mL de agua 12.13 Solucin I/KI al 3% Disolver 7.5 g de I2 y 7.5 g de KI en 250 mL de agua
12.14 Solucin de cloruro de sodio alcohlica
Mezclar 350 mL de alcohol con 50 mL de solucin de NaCl 20% y aforar a 500 mL con agua

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ANLISIS DE ALIMENTOS.

Agradecemos a PAPIME EN203504 por el financiamiento para el desarrollo del proyecto

Anlisis de Alimentos. Fundamentos y tcnicas

Anlisis de Alimentos. Fundamentos y tcnicas

ndice de Kreis. ......................................................................................................19 ndice de TBA .........................................................................................................19

A LISIS DE LPIDOS .....................................................................................................38

Anlisis de Alimentos. Fundamentos y tcnicas

Anlisis de Alimentos. Fundamentos y tcnicas

Fig. 1. Diagrama de destilacin azeotrpica

Secado en estufa de vaco

2 2.1 Definicin de cenizas

Determinacin de elementos minerales

Fig. 3. Esquema de extraccin Soxhlet.

Fig. 4. Equipo de extraccin Goldfish

Fig. 5. Matraz de extraccin Mojonnier

CARACTERIZACIN DE LPIDOS 3.2.1 Peso especfico

4 4.1 Determinacin de protenas

Fig. 6. Estructura qumica de los aminocidos aromticos

Fig. 7. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos

Tabla 4. Comparacin entre los mtodos usados para determinacin de protenas

Interferencia de amoniaco, buffer, detergentes Baja sensibilidad

Extraccin de protenas. (Mtodo de Osborne y Mendel).

Propiedades funcionales de las protenas

COOH OH H OH OH CH2OH O2N

Tcnicas de anlisis de alimentos

Tcnicas de anlisis de alimentos

Tcnicas de anlisis de alimentos

Determinacin de cloruros en la muestra. Mtodo de Mohr (Kirk et al, 1996)

Tcnicas de anlisis de alimentos

Determinacin de cloruros en las cenizas Mtodo de Mohr (Nielsen, 2003)

Determinacin de Fe en las cenizas (NMX-F-503-1987)

Determinacin de Calcio Titulacin con EDTA (APHA, 1995)

Tcnicas de anlisis de alimentos

EXTRACCIN Y CUANTIFICACION DE LPIDOS

Mtodo de Goldfish (Pomeranz y Meloan, 2000)

Tcnicas de anlisis de alimentos

Tcnicas de anlisis de alimentos

Mtodo Rose-Gottlieb (James, 1999)

Tcnicas de anlisis de alimentos

Tcnicas de anlisis de alimentos

ndice de refraccin (Aurand et al, 1987)

Tcnicas de anlisis de alimentos

Tcnicas de anlisis de alimentos

Mtodo Volumtrico-Micromtodo (Crowe y White, 2001)

Determinacin de ndice de Perxidos Mtodo colorimtrico (Kirk et al, 1996)

Disolver una cantidad conocida diclorometano/metanol (70:30).

Tcnicas de anlisis de alimentos

ndice de Kreis (Holm y Greenbank, 1923)

Tcnicas de anlisis de alimentos

Fig. 11 Unidad de extraccin y neutralizacin de vapores cidos de la reaccin Kjeldahl

Tcnicas de anlisis de alimentos

Tcnicas de anlisis de alimentos

Absorcin a 280 nm (Warburg y Christian, 1941)

Mtodo de Lowry (Lowry et al, 1951))

Tcnicas de anlisis de alimentos

Mtodo turbidimtrico (Layne, 1957)

Unin a colorantes Mtodo de Bradford (Nielsen, 2003)

EXTRACCION DE PROTENAS (Osborne y Mendel, 1914)

Tcnicas de anlisis de alimentos

(Avanza y An, 2001)