UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLS DE HIDALGO. ESCUELA DE QUMICO FARMACOBIOLOGA.

Espectrofotometra de absorcin. La espectrofotometra de absorcin es un mtodo de anlisis cuantitativo y cualitativo que se basa en medir la cantidad de luz absorbida por una sustancia (muestra). Cuando le aplicamos luz visible a una sustancia, si no absorbe ninguna la veremos transparente e incolora. Cuando la absorcin ocurre a longitudes de onda que el ojo humano no percibe la veremos incolora. Cuando se absorbe toda la luz se ver negra y si absorbe selectivamente una sola longitud de onda la veremos coloreada. La cantidad de luz absorbida a una longitud de onda en particular depender del tipo de sustancia y de la cantidad de tomos o molculas presentes en el trayecto del haz de luz. En este mtodo se hace pasar a travs de la muestra un haz de longitud de onda definida (Se usan filtros y luz visible), se mide la absorcin mediante un instrumento llamado fotocolormetro o un espectrofotmetro en donde la longitud de onda se obtiene usando rejillas de difraccin o un prisma, se puede usar luz UV o Infrarroja. El instrumento se calibra previamente para que de una lectura de cero de A usando el solvente puro y 100% de A bloqueando el paso de la luz. Cuando la sustancia que se quiere analizar no absorbe luz se hace una reaccin qumica para formar un producto que si absorba.

Anlisis cualitativo: Se requiere de un espectrofotmetro. Se mide la cantidad de luz absorbida por la muestra en un intervalo apropiado de l; la grfica espectro de absorcin y es caracterstico para cada sustancia. La muestra se identifica por comparacin del espectro de absorcin contra el de una serie de substancias puras o interpretndolo. La interpretacin consiste en asignar una a cada banda de absorcin el grupo funcional que la produjo (grupo cromforo) en funcin de su posicin, forma e intensidad. Para las sustancias orgnicas ste mtodo tiene una utilidad muy limitada cuando se usa luz visible o ultravioleta; (es mucho ms selectivo cuando se usa luz infrarroja).

Absorcin emisin.

Anlisis cuantitativo: Se mide la cantidad de luz absorbida por la muestra a una l especfica. Esta es directamente proporcional a la concentracin de la sustancia, la cual podemos obtener por comparacin con la absorcin de uno o varios estandares. La l a la que se realizan las mediciones generalmente es aquella donde la sustancia presenta su mxima absorcin (lmax, la cual se obtiene de su espectro) y en los mtodos analticos de rutina queda en la regin visible o UV.

Emisin.

Si se mide la emisin, la relacin es lineal.

% Luz Transmitida.

Si se mide la transmisin la relacin es logartmica.

C
Las cantidades para medir la absorcin se llama absorbancia y son funcin logartmica del porcentaje de luz transmitida.

A.

Cuando se usan varios standards se hace una grfica de lectura contra concentracin. Esta grfica se llama curva de calibracin y es el mejor mtodo de anlisis. Tericamente debe de dar una lnea recta pero no siempre es as; si se da el caso, este es el nico mtodo de anlisis que dar resultados exactos. Las clases de sustancias que pueden analizarse con luz visible o UV son los compuestos orgnicos que contengan enlaces p conjugados, as como muchos otros compuestos inorgnicos. Con luz IR, cualquier compuesto orgnico. Los anlisis de rutina se realizan con luz visible, ya que los equipos que permiten trabajar con luz UV e IR son muy costosos, sobre todo los IR.
CURVA DE CALIBRACION
0.6

0.5

0.4
ABSORCION

0.3

0.2

0.1

0 0 0.1 0.2 0.3 0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Aplicaciones: Anlisis cuantitativos de sustancias orgnicas e inorgnicas. Identificacin de sustancias desconocidas por comparacin del espectro con un estandar. Pruebas enzimticas. Determinacin de velocidades de reaccin. Anlisis qumicos, clnicos, farmacuticos, bromatolgicos (alimentos) y ambientales. Para detectar el paso de una sustancia en algunos mtodos de separacin (HPLC y CE). Anlisis remoto ambiental e industrial.

Cantidad y estado fsico de la muestra. La cantidad de muestra puede ser muy poca (fracciones de mL en lquidos) o mg (muestra slidas) dependiendo del equipo. En los equipos varia entre 0.510 mL. La muestra puede ser slida, lquida o gaseosa, el requisito es que sea transparente y est libre de turbidez. Si la muestra es opaca puede medirse con un equipo especial para reflectancia (se mide la luz reflejada). Aunque lo ms comn es trabajar con soluciones. Preparacin de la muestra y tiempo de anlisis. Los slidos deben disolverse en un solvente que no absorba a la l de medicin. Si la muestra es incolora se hace una reaccin para formar un compuesto coloreado (si la medicin es en el visible). Si hay impurezas que interfieran o turbidez debe realizarse un tratamiento previo (filtracin, precipitacin, etc.). El material de vidrio debe estar escrupolosamente limpio. El tiempo de anlisis puede varias entre 2-30 minutos por muestra si se usa un instrumento manual. Con equipo automatizado puede llevarse unos cuantos segundos (aunque, si la muestra requiere de un tratamiento especial, el anlisis puede durar varias horas). Ventajas. Alta precisin y exactitud, sobre todo si el anlisis es por curva de calibracin. Rapidez. El costo de los equipos es relativamente bajo (para el caso de anlisis en el visible). Desventajas y limitaciones. Las lecturas de A deben ser menores de 2. El intervalo ptimo de C vara entre 0.01-100 %. Los compuestos fotosensibles son difciles de analizar. La turbidez de la muestra produce dispersin de la luz (lecturas errneas). En anlisis de mezclas, si las l donde los compuestos presentan su mxima absorcin estn muy prximas se reduce la precisin de los resultados. Los lmites de deteccin son relativamente altos (no permiten medir C muy bajas). Anlisis muy susceptibles a interferencias de otros compuestos que absorban a l cercanas.

FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRA. La espectrofotometra es cualquier procedimiento que se base en utilizar la luz para obtener la C de una sustancia (o identificarla): Espectrofotometra de absorcin, en la cual se hace pasar un haz de luz a travs de la muestra y se mide la cantidad de luz que absorbi. Espectrofotometra de emisin, en esta se mide la cantidad de luz producida por la muestra al aplicarle energa.

El anlisis cuantitativo se basa en que la cantidad de luz absorbida (o emitida) es directamente proporcional a la C el cualitativo en la comparacin de las caractersticas de absorcin (o emisin) de la muestra contra sustancias conocidas.

Absorcin de la luz.
Exceso de energa radiante

Energa radiante Absorcin de energa

Emisin Estado basal

Estado basal (energticamente favorable)

Estado excitado (energticamente desfavorable)

Al recibir un fotn de la l adecuada, los electrones de la capa de valencia pasan de un nivel a otro superior. El mover la masa del electrn de un nivel a otro consume energa y esta es la causa de la absorcin. El estado basal es la configuracin electrnica de mnima energa, mientras que el estado excitado es energticamente desfavorable. Esto da lugar a que los electrones regresen a su configuracin del estado basal y emitan el exceso de energa como un fotn, pero de l mayor a la original debido a que parte de la energa se gast en mover al electrn. Las leyes que rigen la absorcin de la luz. La absorcin de la luz por una solucin est relacionada a la cantidad de energa luminosa (radiante) gastada en la excitacin de los electrones de las molculas que contiene. A mayor facilidad de excitacin de los electrones, la energa gastada en este proceso ser menor. Entre los compuestos inorgnicos, las sustancias coloreadas son principalmente aquellas que contienen elementos de los subgrupos secundarios con los orbitales electrnicos incompletos (Fe, Cr, Co). Entre las sustancias orgnicas, el requisito principal para que ocurra absorcin es la presencia de dobles ligaduras conjugadas. L l y la intensidad de la absorcin se modifican por la presencia de sustituyentes donadores de electrones (-NH2, -OH, etc.), aceptores de electrones (-NO2, -SO3H, etc.) y algunos otros grupos funcionales. En los primeros experimentos se intent hallar la correlacin entre la intensidad del color con: El espesor de la capa de la solucin. Esto dio lugar a la ley de BouguerLambert: Las capas de espesores iguales de una misma sustancia, bajo las

mismas condiciones, siempre absorben fracciones iguales de un flujo luminoso incidente. La concentracin, lo que dio lugar a la ley de Beer: En condiciones iguales, la cantidad de luz absorbida por una solucin es directamente proporcional a la concentracin de la sustancia absorbente. Generalizando, la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al nmero de molculas absorbentes que se encuentran en el trayecto del flujo luminoso. De que factores depende este nmero?: Del espesor de la capa de la solucin: a mayor espesor, habr mayor nmero de molculas.

De la concentracin: a mayor concentracin tambin habr mayor nmero de molculas. A partir de aqu se obtiene la ley de Bouguer, Lambert y Beer, que relaciona los cambios de absorbancia debidos a los cambios en el espesor de la capa absorbente y la concentracin. A = abc. Donde: A = Absorbancia. a = Absortividad. Es una constante que depende de la longitud de onda de la luz incidente, la naturaleza de la sustancia absorbente y la temperatura de la solucin. b = Longitud del trayecto del flujo luminoso a travs de la muestra (cm). c = Concentracin. Si la concentracin se expresa en g-mol / L, nos queda: A = ebc. Donde e se llama coeficiente de extincin molar.