CAPTULO 3 FISIOLOGA BACTERIANA

Mara Antonieta Cruz y Germn Hermosilla D.

La Fisiologa microbiana comprende el estudio de las funciones realizadas por los microorganismos. La funcin fundamental de todo ser vivo es el crecimiento, esto es aumentar en forma ordenada el nmero y la masa de todos sus componentes celulares, tales como pared celular, membrana citoplasmtica, cidos nucleicos (ADN y ARN), flagelos, fimbrias, entre otros. Estas estructuras celulares estn compuestas fundamentalmente de macromolculas: protenas, polisacridos, lpidos y cidos nucleicos. Las bacterias son muy eficientes fisiolgicamente, sintetizan en forma muy rpida todos sus componentes celulares, siendo la mayora autosuficientes a pesar de su simpleza estructural. Para que esto ocurra, en la bacteria se desencadenan una serie de procesos qumicos que en su conjunto constituyen el metabolismo bacteriano. En el metabolismo bacteriano, los procesos qumicos por los cuales la bacteria construye componentes celulares, a partir de compuestos simples externos (nutrientes), se denomina anabolismo. En cambio, aquellas reacciones destinadas a obtener energa a partir de compuestos qumicos corresponden al catabolismo. Desde su hbitat o entorno la bacteria incorpora las sustancias necesarias para vivir, proceso llamado nutricin. Una vez incorporados estos nutrientes, a travs del metabolismo bacteriano, la clula ser capaz de reproducirse y transmitir su material gentico a la progenie. NUTRICIN Desde la poca de Pasteur, se han usado como medios de cultivo, extractos de tejidos animales o vegetales, recibiendo el nombre de caldos. Slo con los estudios de Meller se empez a conocer en forma fraccionada los elementos que son necesarios para que una bacteria se desarrolle. Las bacterias que evolutivamente se adaptaron a vivir libremente en la tierra y el agua, tienen requerimientos ms simples que aquellas que viven en la superficie de tejidos animales, las que requieren compuestos nutritivos ms complejos, como aminocidos, vitaminas y bases nitrogenadas. En estas bacterias, la carencia de una va metablica determina requerimientos ms complejos que las bacterias de vida libre, las cuales poseen vas metablicas mucho ms complejas. Es difcil determinar cules son los mnimos nutrientes necesarios para que la bacteria sobreviva y se multiplique, sin embargo, considerando los componentes celulares, se afirma que las bacterias necesitan fundamentalmente:
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Agua:

Ms del 80% de la composicin celular bacteriana es agua. Es el solvente universal, cumple una funcin tampn y acta como coenzima de enzimas hidrolasas.

Fuente de Carbono: Todos los compuestos orgnicos poseen carbono. Las fuentes ms simples de carbono son el CO2 y el CH4. Fuentes ms complejas son aminocidos, hidratos de carbono y lpidos. De acuerdo a la fuente de carbono utilizada, las bacterias pueden ser clasificadas como auttrofas y hetertrofas. Es importante sealar que no existe un lmite preciso de separacin entre ambos grupos. Bacterias auttrofas son aquellas bacterias que utilizan como fuente de carbono sustancias simples, como CO2 y CH4. En cambio, las bacterias hetertrofas requieren macromolculas orgnicas como fuente de carbono, tales como los hidratos de carbono. La mayora de las bacterias patgenas para el hombre son heterotrfas. Nitrgeno (N2): El nitrgeno, es otro elemento fundamental, ya que es el componente principal de protenas y cidos nucleicos, constituyendo el 10% del peso seco de una bacteria. El N2 en el interior de la clula se encuentra como grupo amino (R-NH2), sin embargo, las bacterias lo pueden adquirir en forma de NO3, NO2, N2, NH4, RNH2. Las bacterias cumplen un rol fundamental en el ciclo geoqumico del N2, porque la urea, que es el principal producto de excrecin del metabolismo de las protenas en los mamferos, es inestable y se descompone rpidamente a amoniaco (NH3), compuesto voltil que se perdera s no existieran las bacterias nitrificantes del suelo, las que por oxidacin lo llevan a NO3 no voltil. Este NO3 puede ser captado por las plantas y transformado a compuestos orgnicos. Tambin existen las bacterias denitrificantes que reducen el NH3 a N2, en regiones anaerbicas del suelo, liberndolo a la biosfera. Azufre (S): Este elemento es utilizado por la bacteria para sintetizar aminocidos azufrados, tales como cistena y metionina. Tambin, forma parte de vitaminas, como biotina y tiamina. La mayora de las bacterias son capaces de obtener S a partir de SO4 y lo reducen a H2S, el que generalmente es transportado por una molcula de O acetil serina.

Dadores de H2 y receptores de H2: Las bacterias patgenas para la especie humana, realizan su metabolismo en base a reacciones qumicas, obteniendo energa fundamentalmente por xido-reduccin. De tal manera que necesitan sustratos oxidables y aceptores finales de electrones. Ej.: glucosa, como dador de electrones y O2, como receptor de stos.

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Iones inorgnicos (P, K, Mg): El fsforo es esencial en estructuras como cidos nucleicos, ATP, fosfolpidos de membrana y algunas coenzimas, como NAD y FAD. El P puede ser captado como fosfato o P libre (Pi). Elementos traza u oligoelementos: Son aquellos elementos que las bacterias requieren en cantidades muy pequeas, como Fe, Cu, Mo, Zn. Generalmente, basta con la cantidad que contiene el H2O u otros elementos del medio. Respecto al Fe, se ha determinando que existen en las bacterias molculas transportadoras de Fe denominadas siderforos, que compiten con la lactoferrina y transferrina del hospedero. Por ejemplo, E. coli tiene un opern que codifica para el siderforo entero-quelina y para una protena de membrana que acta como un receptor que capta las deficiencias de Fe del ambiente. Factores de crecimiento: Se definen como aquellas sustancias que son indispensables para la vida de la bacteria, pero que ella es incapaz de sintetizar Ej.: vitaminas, bases nitrogenadas, aminocidos y colesterol. Estos compuestos hay que aportarlos al medio, puesto que su carencia no es compatible con la vida bacteriana. Como ya se mencion, la nutricin tiene por objeto el aporte de sustancias necesarias para el proceso de sntesis de componentes celulares o biosntesis. Este proceso requiere energa, la cual puede ser obtenidas por las bacterias desde dos fuentes: luz y compuestos qumicos. Dependiendo de cual es la fuente de energa, las bacterias pueden ser clasificadas como organismos fosfosintticos o quimiosintticos, respectivamente. En ambos grupos, la energa se conserva en forma de ATP. Las bacterias de importancia mdica son quimiosintticas, debido a que deben vivir en la obscuridad de nuestras mucosas y tejidos.

Adems de todos los nutrientes antes mencionados, el medio que rodea a las bacterias debe proporcionar las condiciones fsico-qumicas apropiadas, que favorezcan el crecimiento bacteriano, tales como, temperatura, presin osmtica y pH. Temperatura: La mayora de las bacterias pueden crecer en un amplio rango de temperatura. Sin embargo, slo presentan un estrecho rango de crecimiento ptimo. Delimita este rango una temperatura mnima de crecimiento y una mxima. Por debajo de la mnima la multiplicacin se deteriora. Se sabe que la sntesis proteica es un proceso muy sensible a bajas temperaturas. Por sobre la temperatura mxima se produce muerte bacteriana debido a coagulacin y denaturacin de protenas. La temperatura de crecimiento es un rango taxonmico muy importante, pudindose clasificar a las bacterias segn su ptimo trmico en tres grandes grupos:

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Psicrfilas Mesfilas Termfilas

10 - 20 20 - 40 50 - 60

La mayora de las bacterias patgenas para la especie humana, se encuentra en el grupo de las mesfilas, pero existen algunas especies psicrfilas que pueden llegar a producir patologas, como es el caso de Listeria monocytogenes. pH: En el interior de la bacteria siempre el pH es neutro, lo que nos demuestra el eficiente sistema de membrana de las bacterias. La mayora de las bacterias puede soportar cambios entre 3 y 4 unidades de pH. Se puede agrupar a las bacterias en tres grupos segn el pH: alcalfilas, neutrfilas y acidfilas. La mayora de las bacterias son neutrfilas. Excepciones notables son Lactobacillus spp, microorganismo acidfilo que crece a pH = 4.5 y Vibrio cholerae, un alcalfilo que puede vivir a pH 9.

Presin osmtica: En general las bacterias soportan un amplio rango de presiones, debido a la presencia de la pared celular que es una importante barrera. Si se coloca a las bacterias en un medio hipertnico, el H2O sale de la bacteria y se produce el fenmeno de plasmlisis. Existen las bacterias halfilas extremas que soportan hasta un 30% de sales y las halfilas corrientes que soportan entre 2 a un 10% de concentracin de sal, Ej.: Staphyloccus aureus. METABOLISMO BACTERIANO Se define como el conjunto de reacciones que se realizan en el interior de las clulas. Estas reacciones pueden ser de sntesis (anablicas) y de degradacin (catablicas). La mayora de las reacciones en los organismos vivos no ocurren espontneamente, sino que requieren la accin de un catalizador, el cual incrementa la velocidad de la reaccin. Los catalizadores de las reacciones biolgicas son protenas llamadas enzimas. Las enzimas son altamente especficas para las reacciones que catalizan. Las enzimas bacterianas pueden clasificarse segn su lugar de accin en: endoenzimas y exoenzimas. Las endoenzimas, son aquellas enzimas que actan en el interior de la clula. Ej. oxidasas, reductasas y transaminasas. Las exoenzimas, son enzimas que siendo tambin sintetizadas en el interior de la clula, para ejercer su funcin deben ser exportadas al medio extracelular en bactarias Gram (+) y al espacio periplsmico en las bacterias Gram (-). Su funcin principal es degradar macromolculas, las que por su tamao no atraviesan las capas superficiales de la clula procaritica. Las enzimas bacterianas, tambin pueden ser clasificadas considerando s su sntesis es o no modificada por el medio ambiente. De acuerdo a esto, las enzimas pueden ser constitutivas o inducidas. Las enzimas constitutivas son aquellas cuya sntesis es

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independiente del medio externo. Se sintetizan siempre, Ej. enzimas que degradan la glucosa. En cambio, las enzimas inducidas son aquellas cuya sntesis depende de la presencia o ausencia del sustrato en el medio, Ej. -galactosidasa, la cual acta sobre la lactosa, slo es sintetizada cuando existe lactosa en el medio (Figura 3-1). Las bacterias son metablicamente eficientes ya que la mayora de sus enzimas son inducidas. En un medio ptimo, la clula bacteriana regula sus vas metablicas tan eficientemente que ningn intermediario es sintetizado en exceso. Si existe una fuente de carbono en exceso, se pone en juego toda la maquinaria enzimtica para utilizarla. En forma opuesta, si un aminocido esta en exceso, se reprime su biosntesis. La regulacin enzimtica se realiza fundamentalmente en dos niveles: actividad enzimtica (enzimas alostricas, fosforilacin) y sntesis enzimtica (regulacin de la expresin gnica). En bacterias, la sntesis enzimtica est regulada a travs del sistema de operones, los cuales corresponden a unidades regulatorias gnicas.
Organizacin Opern Lac
i

P O

Z
galactosidasa

Y
Permeasa

X
Acetilasa

Gen regulador Promotor

Operador

En ausencia del inductor

P O

represor

En presencia del inductor

P O
ARN polimerasa ARNm

Y
transcripcin

X
ARNm

traduccin Complejo represor-inductor inductor Protenas: -galactosidasa permeasa acetilasa

Figura 3-1: Opern Lac

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Por ejemplo, se denominan bacterias Lactosa + a aquellas con la capacidad de sintetizar las enzimas necesarias para utilizar la lactosa, (-galactosidasa, permeasa y acetil-transferasa). Las tres enzimas son codificadas en el opern Lac (Figura 3-1). Sobre este opern, acta una protena represora de la transcripcin, codificada por el gen i (regulacin gnica negativa). Sin embargo, la protena represora es inactivada por la presencia de lactosa en el medio, por lo que la expresin del opern Lac procede. Una bacteria es Histidina + cuando posee el opern His. Este opern contiene los genes necesarios para la sntesis de este aminocido. En este caso la protena represora es activada por el aminocido respectivo, constituyendo tambin un ejemplo de regulacin gnica negativa. Por otro lado, las bacterias tambin poseen sistemas de regulacin gnica positiva. Es el caso de los operones relacionados con la utilizacin de la maltosa en Escherichia coli, cuya expresin depende de la presencia de una protena activadora de la transcripcin. Sin embargo, la protena activadora no puede unirse a los operones Mal a menos que primero se una a la maltosa, que es el efector. En ausencia de maltosa, la protena activadora no es capaz de interactuar con los operones Mal y por lo tanto estos no se expresan. Para ejemplificar lo que ocurre al interior de una clula microbiana, con la incorporacin de un determinado nutriente, vamos a destacar algunas etapas de la utilizacin de glucosa, el monosacrido ms abundante de nuestro organismo. La mayora de las bacterias patgenas son Glucosa +, a excepcin de un grupo denominado bacilos Gram (-) no fermentadores (BGNNF). La glucosa entra a la clula por transporte activo como glucosa-6-P. Posteriormente, se reorganiza y se transforma en fructosa-1,6-difosfato. Luego, es partida en 2 triosas: gliceraldehdo-3-P y dihidroxi acetona fosfato. Finalmente, se llega a piruvato, una encrucijada metablica, igual a lo que sucede en nuestras clulas. Si el cido pirvico encuentra un ambiente sin O2, sigue la va glicoltica (Embden Meyerhof) hasta llegar a cido lctico. Esta es la va fermentativa que algunos gneros microbianos como Staphylococcus y Streptococcus utilizan para oxidar glucosa y a travs de la cual obtienen energa, proceso denominado fosforilacin a nivel de substrato. Por otro lado, en presencia de O2, el cido pirvico se descarboxila oxidativamente, llegando a acetil coA, una molcula capaz de ingresar al ciclo de Krebs. Este ciclo, se lleva a cabo en el citosol, muy cerca de la membrana citoplasmtica. Aunque no es el objetivo de este captulo analizar sus diversas etapas, es importante destacar que como resultado de la oxidacin de los compuestos, se liberan tomos de H2, los que van a ser captados por molculas especializadas, como el NAD, que forman parte de las molculas transportadora de la cadena respiratoria. En E. coli, se han encontrado molculas transportadoras similares a las presentes en mitocondrias. Estas molculas estn ubicadas de tal manera en la membrana citoplasmtica que se produce una direccin vectorial de electrones. Por otra parte, coexisten molculas que slo transportan electrones (FAD y citocromos) y las restantes que llevan electrones y protones. Los protones que no son transportados son expulsados al exterior de la membrana citoplasmtica, creando un potencial de membrana de dos componentes: pH y elctrico.

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Debido a este potencial, los protones son capaces de ingresar por el complejo ATPasa, al interior de la clula, proporcionando la energa para que el ADP se fosforile y se transforme en ATP. Este mecanismo se conoce con el nombre de fosforilacin oxidativa (Figura 3-2).
Medio Exterior 2H+
2e-

2H+
2e-

2H+
2e-

1/2O2+2H+

H2O

ATPasa

H+

ADP+Pi NAD NADH+H+

Citoplasma H
+

Membrana ATP

Figura 3-2: Cadena transportadora de electrones en la respiracin y su relacin con la generacin de ATP. Todos los seres vivos son capaces de sintetizar ATP por estos dos mecanismos: fosforilacin oxidativa y fosforilacin a nivel de sustrato. Las bacterias no constituyen una excepcin a esta regla. En la clula humana, el aceptor final de electrones en la cadena respiratoria es siempre el O2. En las bacterias, el aceptor final puede ser O2, nitratos, sulfatos, o sustancias orgnicas. Esta capacidad de cambiar el aceptor final de electrones permite clasificar a las bacterias en tres grupos: aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos. Aerobios estrictos Anaerobios estrictos : Son aquellas bacterias en que el aceptor final de electrones es el O2. Ej. Mycobacterium tuberculosis. : Son aquellos micoorganismos en que el aceptor final es una molcula inorgnica, como SO4 o NO3. No utilizan O2 y ms an ste es txico, ya que carecen de la capacidad de sintetizar catalasa, superxido dismutasa. Ej. Clostridium perfringens.

Anaerobios facultativos: Pueden vivir con O2 y sin O2. Si estn en un medio con O2 (aerobio), lo utilizan como aceptor final de electrones, forman ATP por fosforilacin oxidativa. Pero si las condiciones del medio cambian y se termina el O2, estos microorganismos son capaces de cambiar todo su patrn enzimtico relacionado con la respiracin. Se ha comprobado que E. coli es capaz de sintetizar 50 enzimas nuevas en pocos minutos para seguir la va anaerbica. Tambin en

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el grupo de los anaerobios facultativos se ubican la mayora de las bacterias patgenas para la especie humana, lo que implica una ventaja biolgica muy importante para las bacterias en su capacidad de multiplicacin tanto in vitro, como in vivo. Dentro de las bacterias aerobias cabe mencionar aquellas que si bien pueden utilizar el oxgeno, slo lo toleran cuando su concentracin es ms baja que la del aire (<21%), usualmente por su limitada capacidad de respirar o porque contienen alguna molcula o enzima sensible al oxgeno. stas se denominan bacterias microaerfilas, como por ejemplo Campylobacter spp. Otro grupo interesante corresponde a las bacterias capnoflicas, las cuales para crecer en forma ptima necesitan de elevadas concentraciones de CO2, por ejemplo Haemophilus spp y Neisseria spp. La fermentacin es un tipo de metabolismo anaerbico, conocido por el hombre desde pocas remotas (fermentacin del pan y el vino). La fermentacin, se define como un proceso en que el dador de electrones es una molcula orgnica, generalmente un azcar, y el receptor de electrones tambin es orgnico, generalmente un derivado de la molcula oxidada. No necesita O2, no hay molculas transportadoras de electrones, formndose ATP por fosforilacin a nivel de sustrato. La mayora de las bacterias patgenas para el hombre son capaces de seguir la va fermentativa. Segn el producto final tenemos fermentacin lctica (Streptococcus y Staphylococcus) y fermentacin cido mixta (Enterobacterias). MULTIPLICACIN Como resultado del metabolismo bacteriano, el microorganismo crece y se multiplica. La multiplicacin implica el aumento del nmero, pero no del tamao bacteriano. Estas, se reproducen normalmente por fisin binaria. El primer paso es la duplicacin del ADN. Posteriormente, la membrana citoplasmtica y la pared celular se invaginan, separando en dos regiones el ADN cromosmico. Finalmente, las paredes en crecimiento se unen formando dos clulas individuales, cada una de las cuales es esencialmente idntica a la clula parental. La mayora de las bacterias se divide cada 20 minutos (tiempo de gestacin). El bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis) constituye una excepcin, ya que se divide cada 24 hrs. Si en el laboratorio se tiene un cultivo puro bacteriano, en condiciones ptimas de desarrollo, uno puede predecir el aumento y disminucin de la poblacin microbiana. Al hacer un recuento de las bacterias vivas en diferentes intervalos de tiempo y trazar un grfico, podemos obtener una curva de crecimiento con cuatro etapas o fases caractersticas. Fase de latencia, logartmica o exponencial, estacionaria y de regresin o muerte (Figura 3-3). Latencia : La fase de latencia dura aproximadamente 4 hrs. No hay crecimiento visible y de hecho puede haber una reduccin en el nmero de bacterias. Es un perodo de adaptacin, en que las bacterias tienen una gran actividad metablica, pero no se dividen. (Figura 3-3: A-B).

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Logartmica : Despus de 6 hrs, aproximadamente, de haber sembrado las bacterias en un medio ptimo, las bacterias comienzan a dividirse en forma constante y mxima. El nmero de bacterias aumenta en progresin geomtrica y la resultante es una lnea recta ascendente. Este perodo termina ms o menos a las 12 hrs, debido a la disminucin de los nutrientes disponibles. (Figura 3-3: C-D). Estacionaria : Debido a la acumulacin de desechos metablicos y disminucin de los nutrientes, la actividad metablica decae. Las bacterias se dividen con menor frecuencia y el nmero total de bacterias vivas permanece constante, puesto que el nmero de muertes se equilibra con el de multiplicacin. En la mayora de las bacterias esta fase se produce entre las 18 a 24 hrs. (Figura 3-3: E-H). Regresin : En esta fase, conocida tambin como fase de muerte, las bacterias dejan de multiplicarse y mueren con el tiempo, debido al trmino de nutrientes, acumulacin de material de desecho y disminucin del espacio fsico. No todas las bacterias del cultivo se encuentran en esta fase al mismo tiempo, por lo tanto se representa como una pendiente, que no llega a 0. Esta curva slo se produce en condiciones de laboratorio.

CRECIMIENTO BACTERIANO (LOG)

FASE ESTACIONARIA

FASE DE REGRESIN

FASE LOGARITMICA

B C

A
FASE DE LATENCIA

TIEMPO

Figura 3-3:

Curva de crecimiento. Eje Y, logartmo del crecimiento bacteriano en funcin del tiempo (Eje X).

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