CAPTULO 2.3.8.

BABESIOSIS BOVINA

RESUMEN
La babesiosis es una enfermedad del ganado bovino transmitida por garrapatas y causada por los parsitos protozoarios Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens y otras especies. Boophilus spp., vectores principales de B. bovis y B. bigemina, se encuentran ampliamente distribuidos en paises tropicales y subtropicales. El vector ms importante de B. divergens es Ixodes ricinus. Otros vectores importantes incluyen Haemaphysalis y Rhipicephalus spp. Identificacin del agente: Es posible la demostracin de los parsitos en los animales muertos mediante el examen microscpico de frotis de sangre, cerebro, rin, hgado y bazo, con tal de que la descomposicin no est avanzada. Los frotis se fijan con metanol, se tien con Giemsa al 10% durante 20-30 minutos, y se examinan a 800-1000X con aceite de inmersin. En el caso de animales vivos, se deben preparar frotis finos o gruesos de sangre capilar obtenidos, por ejemplo, a partir del extremo de la cola. Se encuentran disponibles pruebas sensibles de la reaccin en cadena de la polimerasa que pueden detectar y diferenciar especies de Babesia en el ganado bovino. Pruebas serolgicas: El mtodo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la prueba ms ampliamente utilizada para la detecccin de anticuerpos frente a B. bovis y B. divergens, aunque los enzimoinmunoensayos estn ganando en popularidad. La prueba IFI ha sido utilizada para la detecccin de anticuerpos frente a B. bigemina, pero las reacciones serolgicas cruzadas hacen difcil el diagnstico de la especie. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En varios pases se preparan vacunas con cepas vivas o atenuadas de B. bovis, B. bigemina o B. divergens se producen en varios pases a partir de la sangre de animales donantes infectados. Las vacunas se presentan en forma congelada o refrigerada. Se recomienda generalmente la produccin de la vacuna congelada ya que permite un exhaustivo control de post-produccin de cada lote. El riesgo de contaminacin de esta vacuna derivada de sangre hace que sea esencial un minucioso control de calidad, aunque puede ser prohibitivamente caro. Las vacunas vivas de Babesia no son completamente seguras. Una recomendacin prctica es limitar su uso a terneros, donde la inmunidad inespecfica minimizar el riesgo de reacciones frente a la vacuna. Cuando van a vacunarse animales viejos, el riesgo de reaccin justifica el seguimiento riguroso y el tratamiento con un babesicida, si surgen reacciones. La inmunidad protectora se desarrolla en 3-4 semanas y dura varios aos despus de una sola vacunacin.

A. INTRODUCCIN
La babesiosis bovina est causada por parsitos protozoarios del gnero Babesia, orden Piroplasmida, phylum Apicomplexa. De las especies que afectan al ganado bovino, dos -Babesia bovis y B. bigemina- se encuentran ampliamente distribuidas y son muy importantes en Africa, Asia, Australia y Amrica Central y del Sur. Babesia divergens es importante econmicamente en algunas partes de Europa. El vector de Babesia son garrapatas (18). Boophilus microplus es el vector principal de B. bigemina y B. bovis, y se encuentra ampliamente distribuido en los trpicos y subtrpicos. El vector de B. divergens es Ixodes ricinus. Otros vectores importantes incluyen Haemaphysalis, Rhipicephalus y Boophilus spp. Babesia bigemina presenta la distribucin ms amplia de todas.

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Generalmente, B. bovis es ms patgeno que B. bigemina y B. divergens. Las infecciones se caracterizan por fiebre alta, ataxia, anorexia, shock circulatorio generaly, a veces tambin sntomas nerviosos como resultado del secuestro de eritrocitos infectados en los capilares cerebrales. En casos agudos, la mxima parasitemia (porcentaje de eritrocitos infectados) en sangre circulante es menor del 1%. Esto contrasta con las infecciones por B. bigemina, donde la parasitemia a menudo excede del 10% y puede llegar a un 30%. En las infecciones por B. bigemina, los sntomas ms inportantes incluyen fiebre, hemoglobinuria y anemia. En las infecciones por B. bigemina no tiene lugar el secuestro intravascular de eritrocitos infectados. La parasitemia y aspecto el clnico de las infecciones por B. divergens son algo parecidas a las infecciones por B. bigemina (20). Los animales infectados desarrollan una inmunidad de por vida frente a la reinfeccin con las mismas especies. Tambin existe evidencia de un grado de proteccin cruzada en animales inmunes a B. bigemina frente a posteriores infecciones por B. bovis. Los terneros raramente muestran signos clnicos de enfermedad despus de la infeccin, independientemente de la especie de Babesia implicada o el estado inmune de las madres (8, 10, 11).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente

El mtodo tradicional de identificacin del agente en animales infectados es mediante el examen microscpico de frotis finos y gruesos de sangre teidos, por ejemplo, con Giemsa. La sensibiliad de esta tcnica es tal que puede detectar parasitemias tan bajas como un parsito por 107 glbulos rojos (RBCs) (6). La diferenciacin de especies es buena en frotis finos pero pobre en los frotis gruesos, ms sensibles. Esta tcnica es adecuada, normalmente, para la deteccin de infecciones agudas, pero no para la deteccin de portadores donde las parasitemias son en su mayora muy bajas. La identificacin y diferenciacin del parsito puede mejorarse empleando un colorante fluorescente, como el naranja de acridina, en lugar del Giemsa (19). Se ha desarrollado un mtodo BBC (Cuantitative Buffy Coat ) empleando naranja de acridina para teir parsitos en los vasos capilares para demostrar Plasmodium en sangre humana y potencialmente podra detectar tambin parasitemias bajas por Babesia, aunque la diferenciacin es probable que resulte deficiente (6). Las muestras de animales vivos deberan recogerse preferiblemente de capilares, como los de la punta de la oreja o el extremo de la cola, ya que B. bovis es ms comn en la sangre capilar. Los parsitos Babesia bigemina y B. divergens se encuentran distribuidos uniformemente a lo largo del tejido vascular. Si no es posible preparar frotis frescos a partir de sangre capilar, se debera recoger sangre estril de la yugular en presencia de un anticoagulante con cido eitilen diamino tetra-actico (EDTA) (por ejemplo 1 mg/ml). La heparina puede afectar a las caractersticas de color de la tincin y no est recomendada. La muestra debe mantenerse fra, preferiblemente a 5C, hasta que se transporte al laboratorio, de nuevo preferiblemente en pocas horas desde su recogida. Los frotis de sangre se secan al aire, se fijan en metanol absoluto durante 1 minuto, y se tien con el colorante Giemsa al 10% durante 20-30 minutos. Es preferible teir los frotis de sangre tan pronto como sea posible despus de su preparacin para asegurar una definicin adecuada del colorante. Los frotis gruesos se preparan depositando una gota pequea (aproximadamente 50 l) de sangre sobre un porta limpio. Entonces esta gota se seca al aire, se fija por calor a 80 durante 5 minutos, y se tie con Giemsa al 10% durante 15-20 minutos. Los frotis de sangre sin teir no deben guardarse en soluciones con formol ya que puede afectar a la calidad de la tincin. Las muestras de animales muertos deben consistir en frotis finos de sangre, as como de (en orden preferente) cortex cerebral, rin, hgado, bazo y mdula sea. Los frotis de rganos se preparan presionando un porta limpio sobre la superficie de un corte fresco del rgano o aplastando una pequea muestra del tejido entre dos portas limpios colocados longitudinalmente para dejar una pelcula de tejido sobre cada superficie. Entonces, el frotis se seca al aire (en climas hmedos ayudado mediante calentamiento suave), se fija durante 5 minutos en metanol absoluto, y se tie durante 20-30 minutos en Giemsa al 10%. Este mtodo resulta especialmente adecuado para el diagnstico de infecciones por B. bovis, pero es poco fiable si las muestras se recogen 24 o ms horas despus de que se haya producido la muerte. Sin embargo, los parsitos a menudo pueden ser detectados en sangre recogida de las venas de los miembros bajos uno o ms das despus de la muerte. Todos los frotis teidos se observan con aceite de inmersin utilizando (como mnimo) lentes ocular de 8X y objetivo de 60X. B. bovis es un parsito pequeo, localizado normalmente en posicin central en el eritrocito. Mide aproximadamente 1-1.5 m de largo y 0.5-1.0 m de ancho y, habitualmente, se encuentra en parejas que forman un ngulo obtuso entre ellas. Babesia divergens es tambin un parsito pequeo y es morfolgicamente muy parecido a B. bovis. Sin embargo, las parejas que forman ngulos obtusos estn localizadas normalmente en el borde del eritrocito. Babesia bigemina tiene forma tpica de pera, aunque se encuentran muchas formas variadas y sencillas. Tiene 3-3.5 m de largo y 1-1.5 m de ancho, y las formas apareadas a menudo tienen en cada parsito dos puntos separados teidos de rojo (B. bovis y B. divergens siempre tienen slamente uno). En casos agudos, la parasitemia por B. bovis raramente alcanza el 1%, pero con B. bigemina y B. divergens la

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norma son parasitemias mucho ms elevadas. Los frotis gruesos de sangre son especialmente tiles para el diagnstico de infecciones por B. bovis de bajo nivel, como son los frotis de rganos (1). Se han utilizado sondas para detectar ADN de algunas especies de Babesia, pero generalmente no son ms sensibles que la microscopa directa y la aplicacin en diagnsticos de rutina es limitada (19). Los ensayos de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) han demostrado ser muy sensibles, particularmente en la deteccin de B. bovis y B. bigemina en ganado portador (7, 11, 17, 35). Se han descrito niveles de deteccin tan bajos como tres eritrocitos parasitados en 20l de clulas concentradas (36). Se han descrito varias tcnicas de PCR que pueden detectar y diferenciar especies de Babesia en infecciones de portador (7, 35). Sin embargo, los ensayos de PCR no se prestan bien para pruebas a gran escala y son poco prometedores para sustituir a las pruebas serolgicas como mtodo de eleccin para estudios epidemiolgicos. Los ensayos de PCR son tiles como pruebas confirmativas y en algunos casos como pruebas reguladoras. Se han utilizado mtodos de cultivo in-vitro para demostrar la presencia de infecciones portadoras de Babesia spp. (22), y B. bovis tambin ha sido multiplicada en cultivo. La parasitemia mnima detectable mediante este mtodo depender, en gran medida, de las infraestructuras disponibles y las habilidades del usuario (6), pero puede ser tan baja como 1010 (19), haciendo de ste un mtodo muy sensible para la demostracin de la infeccin. Un beneficio aadido es que es 100% especfico. La confirmacin de la infeccin en un animal sospechoso de ser portador tambin puede realizarse transfundiendo intravenosamente aproximadamente 500 ml de sangre de yugular en un becerro esplenectomizado libre de Babesia, y monitorizando al ternero para la presencia de infeccin. Este mtodo es incmodo y caro, y obviamente no adecuado para el uso diagnstico rutinario. Sin embargo, los gerbos de Mongolia (Meriones unguiculatus) se pueden utilizar para demostrar la presencia de B. divergens.

2.

Pruebas serolgicas

La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es utilizada ampliamente para detectar anticuerpos frente a Babesia spp., aunque el ensayo tiene una especificidad baja en B. bigemina. En la prueba IFI para B. bigemina las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a B. bovis son un problema particular en areas donde coexisten los dos parsitos. La prueba IFI tienen las desventajas del manejo de pocas muestras y la subjetividad. Se ha desarrollado una prueba de enzimoinmunoensayo (ELISA), validada internacionalmente para el diagnstico de infeccin por B. bovis (13, 29, 38), pero, a pesar de los esfuerzos de varios investigadores en diferentes laboratorios, no existe un ELISA parecido validado para B. bigemina. Los ELISAs para anticuerpos frente a B. bigemina tienen una especificidad baja. En un estudio (16), un antisuero frente a B. bigemina pareci reaccionar especficamente con fibringeno. Sin embargo, un ELISA desarrollado y validado recientemente en Australia (30) resulta esperanzador. En ausencia de otra prueba factible para B. bigemina, se ha incluido aqu el procedimiento para dicha prueba. Tambin se han desarrollado ELISAs para B. divergens (9) utilizando antgeno derivado de cultivo, de gerbos (Meriones) o de ganado vacuno, pero no parece existir uno que haya sido validado internacionalmente.

a)

Enzimoinmunoensayo para Babesia bovis

La preparacin del antgeno est basada en una tcnica descrita por Waltisbuhl et al. (38). A partir de un ternero esplenectomizado se recoge la sangre infectada (normalmente 5-10% de parasitemia) en presencia de EDTA. La sangre se lava tres veces en cinco volmenes de tampn fosfato salino (PBS), y las clulas infectadas se concentran mediante lisis diferencial de las clulas no infectadas en solucin salina hipotnica. Las clulas infectadas son ms resistentes a la lisis en solucionas salinas hipotnicas que las clulas no infectadas. Se preparan series de soluciones salinas hipotnicas, oscilando entre el 0,35% hasta 0,50% de NaCl, con incrementos del 0,025%. Para encontrar la mejor concentracin, se aaden cinco volmenes de cada solucin salina a un volumen de RBC concentrados, que se mezclan suavemente y se dejan reposar durante 5 minutos. Las mezclas se centrifugan y los sobrenadantes se aspiran. Se aade un volumen igual de plasma (conservado a partir de la sangre original) a cada tubo con los RBC concentrados, y los contenidos de los tubos se mezclan. Se preparan frotis finos de sangre a partir de las mezclas de clulas sanguneas resuspendidas, se fijan en metanol, y se tien con Giemsa. Estos frotis se examinan al microscopio para determinar que solucin salina lisa la mayora de los RBC no infectados pero deja intactos a los RBC infectados. Debera ser posible conseguir una infeccin >95% en los RBC intactos restantes. La mayor parte de los RBC concentrados se lisa diferencialmente con la solucin salina ptima y se centrifugan. El sedimento (>95% de RBC infectados) se lisa en agua destilada a 4C, y los parsitos se precipitan a 12,000 g durante 30 minutos. El precipitado se lava tres veces en PBS mediante resuspensin y centrifugacin a 4C. Se resuspende entonces en uno a dos volmenes de PBS a 4C, y se sonica en volmenes adecuados utilizando una potencia media durante 60-90 segundos. El material sonicado se ultracentrifuga, (105.000 g durante 60 minutos a 4C) y se conserva el sobrenadante. El sobrenadante se

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mezcla con un volumen igual de glicerol y se conserva en alicuotas de 2-5 ml a 70C. Es aceptable la conservacin a corto plazo a 20C para la alicuota de trabajo. i) Procedimiento de la prueba Se aaden 100 l del antgeno, diluido 1/400 a 1/600 en tampn carbonato 0,1M, pH 9,6, a cada pocillo de una placa de microtitulacin de poliestireno con 96 pocillos. La placa se cubre y se incuba durante la noche a 4C. Se elimina el antgeno y los pocillos se bloquean durante 2 horas a temperatura ambiente mediante la adicin de 200 l de una solucin de caseinato sdico al 2% en tampn carbonato. Despus de bloquear, los pocillos se lavan brevemente con PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBST) y se aaden 100 l de suero bovino diluido 1/100 en PBST que contiene 5% de suero normal de caballo o 5% de leche desnatada en polvo, y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. La fase de lavado consiste en un lavado suave con PBST, seguido de tres lavados de 5 minutos con el mismo tampn (durante los cuales la placa se agita vigorosamente), y finalmente las placas se someten a un lavado suave. A continuacin, se aaden 100 l de IgG anti-bovina marcada con peroxidasa y diluida adecuademente en PBST con suero de caballo o leche desnatada y las placas se agitan durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. (NB: algunos lotes de leche desnatada en polvo pueden contener inmunoglobulinas que pueden interferir con las IgG anti-bovinas conjugadas). Los pocillos se lavan como se describi anteriormente en la fase iv, y se aaden 100 l de substrato de peroxidasa (ABTS [2, 2- Azino-bis-(cido 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfnico)]) a cada pocillo. La reaccin del substrato se deja continuar hasta que la absorbancia de un control positivo fuerte incluido en cada placa se acerca a 1. En este punto se lee la absorbancia a 414 nm en un lector de placas de microtitulacin.

ii) iii)

iv)

v)

vi)

Para controlar la variacin entre placas, se incluyen en cada placa sueros conocidos positivos y negativos (38). Los sueros problema se bareman en relacin al control positivo. Los resultados del ELISA se expresan como un porcentaje de dicho control positivo (porcentaje de positividad). Los valores umbral positivo y negativo deben determinarse en cada laboratorio probando tantos sueros positivos y negativos como sea posible. Cada lote de antgeno y conjugado deben ser valorados empleando un sistema de doble entrada o mtodo del tablero de ajedrez. El enzima ms adecuado para el conjugado es la peroxidasa de rbano picante. El ABTS o la tetrametil benzidina (TMB) son substratos adecuados. Con esta prueba, es posible detectar anticuerpos hasta cuatro aos despus de una infeccin simple. Deberan producirse de un 95-100% de reacciones positivas con animales inmunes a B. bovis, 1.2% de reacciones falsos positivos con suero negativo y <2% de reacciones falsos positivos con animales inmunes a B. bigemina.

b)

Enzimoinmunoensayo para Babesia bigemina

Este ELISA est basado en un antgeno de 58 kDa identificado por varios grupos en aislamientos de B. bigemina en Australia, Amrica Central y Texas, Estados Unidos de Amrica, Egipto y Kenia (30). Se ha utilizado un anticuerpo monoclonal (Mab) (D6) (Tick Fever Research Centre, Qld, Australia) dirigido contra este antgeno para desarrollar un ELISA de inhibicin competitiva (30). El antgeno utilizado en el ELISA es un pptido de 26 kDa (Tick Fever Research Centre, Qld, Australia), codificado por un fragmento de 360 bp del gen p58, expresado en E. coli y purificado mediante columnas de afinidad. Este antgeno tambin puede ser empleado en un formato de ELISA indirecto, aunque se debe esperar alguna reaccin cruzada de anticuerpos frente a B. bovis. i) Procedimiento de la prueba El antgeno recombinante de 26 kDa se diluye hasta una concentracin de 2 g/ml en tampn carbonato 0,1 M, pH 9.6, y se aaden 100 l en cada pocillo de una placa de microtitulacin de 96 pocillos. Las placas se incuben durante la noche a 4C. Se retira el exceso de antgeno y los pocillos se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente mediante la adicin a cada pocillo de 200 l de una disolucin del 2% de caseinato sdico en tampn carbonato.

ii)

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iii)

Despus de un lavado suave (3 x 200 l) con PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBST), se aaden 100 l de suero sin diluir y las placas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacin suave. Las placas se lavan entonces con PBST (5 x 200 l, 5 minutos de incubacin con agitacin), y se aaden a cada pocillo 100l de Mab D6 marcado con peroxidasa diluido a una concentracin de 0,03 g/ml en PBST conteniendo un 2% de leche desnatada en polvo. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin suave. Las placas se lavan de nuevo, se aaden 100l de substrato de peroxidasa TMB a cada pocillo, y se incuban en la oscuridad hasta que la absorbancia de los pocillos control conjugados (sin suero) se aproxima a 1. En este momento la reaccin se para mediante la adicin de 50 l de cido sulfrico y se lee la absorbancia a 450 nm. Se deben incluir en cada placa de ensayo sueros control positivos y negativos.

iv)

v)

Se calcula el porcentaje de inhibicin (PI) para el suero problema relativo al control conjugado (PI = 100[100 x absorbancia problema/absorbancia del control conjugado]). Los valores umbral positivo y negativo deben determinarse en cada laboratorio probando tantos sueros positivos y negativos como sea posible. La especificidad del ELISA ha sido estimada en un 97% y la sensibilidad para la deteccin de anticuerpos en terneros infectados experimentalmente es del 95,7% (30).

c)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta

Preparacin del antgeno Los portas con antgeno se preparan a partir de sangre de yugular, de manera ideal cuando la parasitemia se encuentra entre un 2% y 5%. La sangre se recoge en presencia de un anticoagulante adecuado (citrato sdico o EDTA), y despus se lava al menos tres veces en cinco a diez volmenes de PBS para eliminar las protenas contaminantes del plasma, y, en particular, las inmunoglobulinas del hospedador. Despus de lavar, los RBC infectados se resuspenden en dos volmenes de PBS con 1% de seroalbmina bovina (BSA). La BSA se emplea para adherir los RBCs al porta. Preferentemente, se preparan frotis monocapa depositando una gota de sangre sobre un porta limpio, el cual se centrifuga en una citocentrfuga. El sistema proporciona frotis muy uniformes. Alternativamente, se pueden preparar frotis finos mediante la tcnica convencional (arrastrando una gota de sangre con el extremo de otro cubreobjetos). Los frotis se secan al aire y se fijan en un horno de aire caliente a 80C. Los frotis de sangre fijados se tapan (por ejemplo con papel de aluminio o cinta adhesiva de papel de estraza) para permanecer hermticos, y se guardan a 70C hasta que se necesiten (mximo 5 aos). Procedimiento de la prueba

Los sueros control y problema se diluyen 1/30 en PBS. Los sueros se pueden utilizar con o sin inactivacin del complemento por calor durante 30 minutos a 56C. Los portas se marcan con 8-10 divisiones con un lpiz graso para crear divisiones hidrofbicas. Utilizando una pipeta de precisin se aaden 5-10 l de cada dilucin de suero en cada cuadrado de prueba. Las preparaciones se incuban a 37C durante 30 minutos en una cmara hmeda. En cada porta de prueba se emplean como controles diluciones de sueros positivos y negativos dbiles. Despus de la incubacin, los portas se lavan cuidadosamente una vez con PBS, dos veces ms durante 10 minutos con PBS, y despus otra con agua. Entonces se aade en cada cuadrado de prueba una dilucin adecuada de un anticuerpo antibovino marcado con isotiocianato de fluorescena (disponible comercialmente). Cada nuevo lote de conjugado debe ser titulado previamente, y el rango de trabajo normalmente se encuentra entre 1/400 y 1/200. Generalmente, para este propsito, son ms adecuados los anticuerpos conjugados de conejo y pollo que los anticuerpos de cabra. Los portas con el conjugado se incuban de nuevo a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se lavan como antes. Los portas hmedos se montan con cubreobjetos con glicerol y PBS 1:1, y se examinan mediante microscopa de fluorescencia. Un operario competente puede examinar aproximadamente 150 muestras por da.

d)

Otras pruebas
En aos recientes se han descrito otras pruebas serolgicas, que incluyen un ELISA de punto, un ELISA en porta (25), y pruebas de aglutinacin de latex y en tarjeta (3, 26). Estas pruebas presentan niveles aceptables de sensibilidad y especificidad en B. bovis y, en el caso del ELISA de punto, tambin para B. bigemina. Sin embargo, ninguna de estas pruebas parece haber sido adoptada para uso diagnstico en otros laboratorios ms que en aquellos en los que tuvieron lugar su desarrollo original y validacin. Por tanto se desconoce la adaptabilidad de estas pruebas para laboratorios de diagnstico rutinario.

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C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

El ganado vacuno desarrolla una inmunidad larga y duradera despus de una infeccin con B. bovis, B. divergens o B. bigemina. Esta caracterstica ha sido explotada en algunos paises para inmunizar ganado ferente a la babesiosis (8, 14, 27, 34). La mayora de estas vacunas vivas contienen cepas especialmente seleccionadas de Babesia, principalmente B. bovis y B. bigemina, y son producidas como un servicio para las industrias de ganadera en instalaciones de produccin costeadas por el gobierno, concretamente en Australia, Argentina, Sudfrica, Israel y Uruguay. En Irlanda se ha empleado con xito una vacuna experimental de B. divergens preparada a partir de sangre de Meriones (gerbos) infectados (21). En Austria se prepara una vacuna muerta de B. divergens a partir de la sangre de terneros infectados, aunque existe poca informacin disponible sobre el nivel y duracin de la inmunidad conferida. Tambin se han desarrollado vacunas experimentales que contienen antgenos sintetizados in vitro (2, 32), aunque el nivel y duracin de la proteccin frente a un estmulo heterlogo es poco claro. Se han caracterizado protenas del parsito y ha habido algn progreso en el desarrollo de vacunas de subunidades (11, 33). No existe una vacuna de subunidades efectiva disponible comercialmente. Las instrucciones para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el Captulo I. 1. 7. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se ofrecen aqu y en el Captulo I. 1. 7 pretenden ser de naturaleza general y pueden ser completadas mediante requisitos nacionales o regionales. Esta seccin tratar la produccin de vacunas vivas de babesiosis, principalmente aquellas frente a infecciones en ganado vacuno por B. bovis y B. bigemina. La produccin conlleva la infeccin de terneros con cepas seleccionadas, y el uso de la sangre como vacuna (8, 12, 14). Los terneros utilizados para la infeccin con estas cepas deben encontrarse libres de agentes infecciosos que puedan ser transmitidos por productos derivados de su sangre. En el caso de B. divergens, la sangre de los gerbos infectados (Meriones unguiculatus) puede ser empleada en lugar de la sangre bovina. Tambin se han utilizado mtodos de cultivo in-vitro para producir parsitos para vacuna (24, 27). Sin embargo, el relativamente alto coste de produccin a partir de cultivo y la evidencia de una posible deriva antignica durante su mantenimiento en cultivo a largo plazo, hacen impracticable en la actualidad el cultivo en masa de Babesia en la mayora de los laboratorios. Las vacunas de Babesia bovis y B. bigemina pueden prepararse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la demanda, los sistemas de transporte y la disponibilidad de suministro de nitrgeno lquido o hielo seco. Es preferible la preparacin de vacuna congelada (12, 14, 27, 34), ya que permite un control riguroso de postproduccin de cada lote. Sin embargo, es ms costosa de producir y ms difcil de transportar que la vacuna refrigerada. EL riesgo potencial de contaminacin de esta vacuna derivada de sangre convierte en esencial el control de post-produccin, pero puede situar la produccin ms all de los recursos financieros de algunos pases en regiones endmicas (14). Es poco probable que una instalacin de produccin que suministre a un mercado anual menor de 50.000 dosis funcione sin respaldo financiero.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Cepas disponibles internacionalmente Se han utilizado eficientemente cepas australianas atenuadas de B. bovis y B. bigemina para inmunizar ganado vacuno en Africa, Amrica del Sur y Sureste de Asia (12, 14). Estn disponibles cepas transmisibles y no transmisibles mediante garrapatas. Tambin se ha desarrollado una cepa de B. divergens con una virulencia reducida en Meriones (39). Aislamiento y purificacin de cepas locales.

Las cepas de B. bovis, B. divergens y B. bigemina que se encuentran libres de contaminantes, tales como Anaplasma, Eperythrozoon, Theileria, Trypanosoma y varios agentes bacterianos y virales, son ms fcilmente aislables alimentando garrapatas infectadas en ganado vacuno esplenectomizado. Los vectores y modos de transmisin de las especies difieren, y estas caractersticas pueden ser utilizadas para diferenciar las especies (18). Babesia spp. tambin puede ser aislada a partir de ganado vacuno infectado mediante subinoculacin de sangre en terneros esplenectomizados susceptibles. Una desventaja importante de este mtodo es la dificultad de separar Babesia spp. de contaminantes tales como Anaplasma y Eperythrozoon. El aislamiento de B. divergens es un procedimiento relativamente simple debido a la susceptibilidad de Meriones (21). Se puede realizar el mantenimiento de las cepas aisladas in vitro (23) para eliminar la mayora de los contaminantes, pero no para distinguir Babesia spp. Se puede emplear la quimioterapia selectiva para

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obtener B. bovis puro a partir de una infeccin mixta por Babesia, mientras que el trnsito rpido en terneros susceptibles permitir el aislamiento de B. bigemina (1). Atenuacin de las cepas

Se han comunicado varias formas de atenuar Babesia spp. El mtodo ms seguro de reducir la virulencia de B. bovis conlleva el trnsito rpido de la cepa a travs de terneros esplenectomizados susceptibles. La atenuacin no est garantizada, pero normalmente aparece despus de 8 a 20 pases en ternero (8). La virulencia de B. bigemina disminuye durante la permanencia prolongada del parsito en animales con infeccin latente. Esta caracterstica ha sido empleada para obtener cepas avirulentas mediante infeccin de terneros, esplenectomizndolos despus de 3 meses y utilizando los parsitos resultantes para repetir el proceso (8). Atenuacin de B. divergens para Meriones seguida de mantenimiento in vitro a largo plazo (39). Se ha intentado la atenuacin de Babesia spp. con irradiacin, aunque los resultados han sido variables. De manera similar, se ha utilizado experimentalmente la conservacin in vitro en medios modificados. Las cepas avirulentas deben guardarse como muestras vivas para pruebas de seguridad y uso futuro como inculo para la produccin de vacuna.

b)

Preparacin y almacenamiento del inculo original

Las cepas avirulentas son fcilmente almacenables como sangre infectada congelada en nitrgeno lquido o hielo seco. El dimetil sulfxido (DMSO) (28) y la polivinilpirrolidona PM 40.000 (37) son los crioprotectores recomendados, ya que permiten la administracin intravenosa despus de congelar el inculo original. Un informe detallado sobre la tcnica de congelacin empleando DMSO se comunica en otra parte (28). Brevemente, implica lo siguiente: La sangre infectada se recoge y se enfra a 4C. Se aade entonces, agitando lentamente, el crioprotector fro (4M DMSO en PBS) hasta una relacin final sangre/protector de 1:1, siendo la concentracin final de DMSO de 2M. Este mtodo de dilucin se lleva a cabo en un bao de hielo, y la sangre diluida se reparte en contenedores adecuados (por ejemplo crioviales de 5 ml), y se congela tan pronto como sea posible en la fase de vapor de un contenedor de nitrgeno lquido. Los viales se almacenan en la fase lquida de un depsito destinado para prevenir la prdida de viabilidad y la contaminacin. Almacenados de esta forma, se ha sabido de lotes de inculos originales de Babesia que han permanecido viables durante 20 aos.

c)

Preparacin y almacenamiento del inculo de trabajo

El inculo de trabajo se prepara de la misma forma que el inculo original (Seccin C. 1. b.), utilizando ste ltimo como material de partida.

d)

Validacin de la seguridad y eficacia del inculo de trabajo

La idoneidad de un inculo de trabajo se determina mediante la inoculacin de una cantidad adecuada de ganado bovino susceptible con la vacuna preparada a partir de ste, y estimulndolos a ellos y a controles susceptibles con una cepa virulenta heterloga. La seguridad y la eficacia pueden juzgarse mediante la medida de la fiebre, las parasitemias en frotis sanguneos teidos, y la disminucin de los volmenes de clulas concentradas. La pureza del inculo de trabajo se analiza valorando la presencia de posibles contaminantes en el ganado utilizado en la prueba de seguridad, como se menciona en la Seccin C. 4. b.

2.
a)

Mtodo de fabricacin
Produccin de un concentrado de vacuna congelado
Primero, se descongelan rpidamente volmenes de 5-10 ml del inculo de trabajo mediante inmersin de los viales en agua precalentada a 40C. El material descongelado se mantiene en hielo y se utiliza tan pronto como sea posible (en 30 minutos si se utiliza DMSO) para infectar un ternero esplenectomizado susceptible (libre de contaminantes potenciales para la vacuna) mediante inoculacin intravenosa. La sangre adecuada para la vacuna se obtiene mediante monitorizacin de frotis de sangre de yugular y recoleccin del volumen necesario de sangre cuando se alcanza una parasitemia adecuada. Una parasitemia de 1 x 108/ml (aproximadamente 2% de parasitemia en sangre de yugular) es adecuada, por lo general, para la produccin de la vacuna. Si no se obtiene una parasitemia adecuada de B. bovis, puede

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ser necesario el pase de la cepa mediante subinoculacin de 100-500 ml de sangre en un segundo ternero esplenectomizado. No se recomienda el pase de B. bigemina. La sangre del ternero donante infectado se recoge mediante canulacin de la yugular empleando como anticoagulante heparina libre de conservantes (5 Unidades Internacionales [UI]de heparina/ml de sangre). En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla con volmenes iguales de glicerol 3M en PBS suplementado con glucosa 5 mM (la concentracin final de glicerol es 1.5 M) a 37C durante 30 minutos. La mezcla se equilibra entonces a 37C durante 30 minutos, y se dispensa en contenedores adecuados (por ejemplo crioviales de 5 ml). Los viales se enfran a razn de aproximadamente 10 C /minuto en la fase de vapor de nitrgeno lquido y, una vez congelados, se almacenan en la fase lquida (12, 14). El DMSO puede ser empleado como crioprotector en lugar del glicerol. Ello se lleva a cabo de la misma forma que la descrita para la preparacin del inculo original (34). Si una vacuna congelada con glicerol va a ser diluida, el diluyente debe ser iso-osmtico y consistir en PBS conteniendo glicerol 1.5 M y glucosa 5 mM. De manera similar, el diluyente empleado en la vacuna criopreservada con DMSO debe ser iso-osmtico, y debe contener la misma concentracin de DMSO en PBS. Se puede preparar una vacuna congelada que contenga tanto B. bovis como B. bigemina (27) mezclando igual nmero de parsitos obtenidos a partir de donantes distintos. Despus de su reconstitucin y dilucin, la dosis recomendada de vacuna oscila entre 1 a 2 ml, dependiendo de las prcticas y requisitos locales.

b)

Produccin de vacuna refrigerada

El material infeccioso utilizado en la preparacin de la vacuna refrigerada se obtiene de la misma manera que la vacuna congelada, pero debe ser expedido y utilizado tan pronto como sea posible despus de la recogida. Si es necesario obtener el mximo nmero de dosis por ternero, el material infeccioso puede diluirse para proporcionar el nmero necesario de parsitos por dosis (normalmente 2,5 a 10 x 107). Un diluyente adecuado es suero bovino estril al 10% en una solucin equilibrada de sales conteniendo los siguientes ingredientes por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g), KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g). La sangre que contiene B. divergens puede diluirse en solucin de Hanks. Si no se necesita diluyente, se pueden emplear como anticoagulantes dextrosa cido ctrico o dextrosa citrato fosfato estriles, a razn de una parte por cuatro partes de sangre, para proporcionar la glucosa necesaria para la supervivencia del parsito.

3.
a)

Control interno
Fuentes y mantenimiento de los donantes de vacuna
Debe identificarse una fuente de donantes libres de infecciones naturales con Babesia, otras enfermedades transmitidas por insectos, y otros agentes infecciosos transmisibles por la sangre. Si no se encuentra disponible una fuente adecuada, puede ser necesario criar terneros donantes en condiciones libres de garrapatas con ese objetivo especfico. Los terneros donantes se deben mantener en condiciones que prevengan la exposicin a enfermedades infecciosas y a garrapatas e insectos chupadores. En ausencia de las instalaciones adecuadas, se debe estimar el riesgo de contaminacin con los agentes de enfermedades infecciosas presentes en el pas implicado, y se deberan sopesar los beneficios de la produccin local de vacuna (en contraposicin a la importacin de un producto adecuado) frente a las posibles consecuencias adversas de diseminacin de la enfermedad (8).

b)

Ciruga
Los terneros donantes deben ser esplenectomizados pera permitir un rendimiento mximo de parsitos para la produccin de la vacuna. Esto se realiza mejor en terneros jvenes y bajo anestesia general.

c)

Eleccin de donantes de vacuna antes de la inoculacin

Los terneros donantes deben examinarse para la presencia de agentes de todas las infecciones transmisibles por la sangre prevalentes en el pas, incluyendo Babesia, Anaplasma, Theileria y

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Trypanosoma. Ello se puede realizar mediante el examen rutinario de tinciones de frotis de sangre despus de esplenectoma, y preferiblemente mediante pruebas serolgicas pre- y post-cuarentena. Los terneros que muestren evidencia de infecciones naturales con alguno de estos agentes deben ser rechazados. Se debe confirmar la ausencia de otros agentes infecciosos endmicos en el pas, pudiendo incluir los agentes de la leucosis bovina enzotica, el virus de la inmunodeficiencia bovina, pestivirus bovino, rinotraqueitis bovina infecciosa, la enfermedad de Akabane, fiebre efmera, lengua azul, glosopeda y peste bovina. Los procedimientos de ensayo dependern de las enfermedades prevalentes en el pas y la disponibilidad de pruebas, pero deben consistir en serologa de parejas de sueros y, en algunos casos, aislamiento de los virus y deteccin del antgeno o ADN (12, 34).

d)

Seguimiento de las parasitemias despus de la inoculacin.

En la sangre recogida para la vacuna es necesario determinar la concentracin de parsitos. Existen tcnicas precisas para determinar el recuento de parsitos (1), aunque la concentracin parasitaria puede ser estimada a partir del recuento de RBC y la parasitemia (% de RBCs infectados).

e)

Recogida de sangre para la vacuna

Todo el equipamiento debe ser esterilizado antes de usarse (por ejemplo mediante autoclavado). Cuando se alcanza la parasitemia deseada se recoge la sangre en presencia de heparina empleando tcnicas estrictas de asepsia. Ello se realiza mejor si el ternero es sedado con, por ejemplo, xylazina y mediante el empleo de un sistema de recogida en circuito cerrado. Se pueden recoger hasta 3 litros de sangre fuertemente infectada a partir de un ternero de 6 meses. Est indicada la transfusin de una cantidad similar de sangre de un donante adecuado si el ternero se va a mantener vivo. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente despus de recoger la sangre.

f)

Distribucin de la vacuna
Todos los procedimientos se realizan en un ambiente adecuado, tal como una cabina de flujo laminar, empleando tcnicas estriles estndar. El uso de un agitador magntico o mecnico asegurar la correcta mezcla de la sangre y el diluyente a lo largo del proceso de reparto.

4.

Control del lote

La potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se pueden determinar en el caso de la vacuna refrigerada, y las especificaciones de la vacuna congelada dependen del cdigo prctico del pas implicado. A continuacin se indican las especificaciones para la vacuna congelada producida en Australia.

a)

Esterilidad y ausencia de contaminantes

Para cada lote de vacuna y diluyente se utilizan ensayos estndar de esterilidad. Se determina la ausencia de contaminantes realizando pruebas serolgicas apropiadas en el ganado donante y mediante inoculacin de linfocitos donantes en ovejas monitorizndolas para la presencia de infecciones vricas. Los agentes de la leucosis bovina enzotica, rinotraqueitis infecciosa bovina, pestivirus bovino, fiebre efmera, enfermedad de Akabane, el virus Aino, Brucella abortus y Leptospira, glosopeda, enfermedad nodular cutnea de los bvidos, fiebre del valle del Rift, peste bovina, pleuroneumona bovina contagiosa, cowdriosis, enfermedad de Jembrana, y especies patgenas de Theileria y Trypanosoma (12, 14) son contaminantes potenciales.

b)

Inocuidad
Las reacciones a la vacuna en el ganado inoculado en la prueba de potencia (ver Seccin C. 4. c.) se monitorizan midiendo la parasitemia, la fiebre y la prdida del volumen de las clulas concentradas. Solamente se libran para su uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o menores que un estndar predeterminado.

c)

Potencia
El concentrado congelado de vacuna con glicerol se descongela y se diluye 1/5 con diluyente isotnico (12, 14). La vacuna preparada se incuba entonces durante 8 horas a 30 C, y se inoculan subcutneamente cinco terneros con dosis de 2 ml cada uno. En los terneros inoculados se monitoriza la presencia de infecciones mediante el examen de frotis de sangre teidos. Solamente se libran para su uso los lotes completamente infectivos a una dilucin de trabajo de 1/5.

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d)

Duracin de la inmunidad
Normalmente la inmunidad a largo plazo es consecuencia de una sola inoculacin. Se han descrito evidencias de fallos en vacunas de B. bovis (4) y estn relacionados con el tipo de cepas de vacuna, la presencia de cepas silvestres heterlogas, y factores del hospedador. Existe escasa evidencia de disminucin de inmunidad con relacin al tiempo (8).

e)

Estabilidad
La vacuna se puede mantener almacenada en nitrgeno lquido durante 5 aos. El diluyente estril se puede almacenar en el frigorfico durante 2 aos. La vacuna descongelada pierde rpidamente potencia y no se puede volver a congelar.

f)

Conservantes
En el momento de la dispensacin se aaden a la vacuna penicilina (500,00 UI/litro) y estreptomicina (370,000 g/litro).

g)

Uso de la vacuna
En el caso de la vacuna congelada, los viales se deben descongelar mediante inmersin en agua precalentada a 40C. La vacuna con glicerol debe mantenerse fra y usarse en 8 horas (9, 10), mientras que la vacuna con DMSO como crioprotector debe mantenerse en hielo y ser utilizada a los 15-30 minutos de descongelacin. La vacuna fra debe mantenerse refrigerada y usarse a los 4-7 das de la preparacin, dependiendo de la viabilidad de los parsitos. Las cepas de B. bovis, B. divergens y B. bigemina empleadas en la vacuna pueden presentar virulencia atenuada, por lo que no sern completamente seguras. Por tanto, una recomendacin prctica consiste en limitar el uso de la vacuna a terneros, donde la inmunidad inespecfica minimizar el riesgo de reacciones a la vacuna. Si se van a vacunar animales viejos, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones aparecen poco frecuentemente, aunque las hembras gestantes o las reservas de engorde valiosas justifican la debida atencin, y deben ser observados diariamente durante 3 semanas despus de la vacunacin. De manera ideal, se deberan tomar las temperaturas rectales del ganado vacunado y los animales deben ser tratados si se desarrolla fiebre apreciable. Las reacciones frente a B. bigemina y B. divergens se observan generalmente hacia el da 6-8 y las de B. bovis hacia el da 10-16 (8). La inmunidad protectora se desarrolla en 3-4 semanas y en la mayora de los casos dura al menos 4 aos. A menudo las vacunas de babesiosis y anaplasmosis se utilizan conjuntamente, aunque no es aconsejable utilizar otras vacunas al mismo tiempo (8).

h)

Precauciones
Las vacunas de B. bovis y B. bigemina no son infectivas en humanos. Sin embargo han sido descritos casos de B. divergens en individuos esplenectomizados. Cuando la vacuna se almacena en nitrgeno lquido, se aplican las precauciones habituales referidas al almacenamiento, transporte y manejo de material ultracongelado.

5.
a)

Pruebas en el producto final

Inocuidad
Ver Seccin C. 4. b.

b)

Potencia
Ver Seccin C. 4. c.

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