Universidad Nacional del Nordeste

- Facultad de Medicina - Microbiologa e Inmunologa

Fisiologa bacteriana
Luis A. Merino

Fisiologa bacteriana Las bacterias son capaces de realizar una serie de transformaciones qumicas mediante reacciones enzimticas que se traducen en sntesis de nuevos productos, transporte, movimiento y duplicacin celular Se considera crecimiento bacteriano al aumento ordenado de todos los componentes celulares con el consiguiente aumento del nmero de clulas bacterianas, o sea que el resultado final del crecimiento bacteriano es la duplicacin celular. El crecimiento bacteriano se inicia con la captacin de nutrientes a partir del medio ambiente y los pasos intermedios entre la captacin de nutrientes y la divisin celular constituyen el metabolismo bacteriano. El metabolismo bacteriano est compuesto de dos etapas: una de sntesis o Anabolismo y una de destruccin o Catabolismo. Durante el anabolismo o fase anablica las sustancias simples se convierten en sustancias complejas y durante el catabolismo o fase catablica las sustancias complejas se convierten en sustancias simples. El conocimiento de los requerimientos metablicos y de las condiciones de crecimiento de las bacterias es til para predecir la forma correcta de obtencin, remisin y conservacin de muestras clnicas, para seleccionar los medios de cultivo que se utilizarn en el diagnstico y para estimar el tiempo necesario para que la bacteria alcance un nmero suficiente como para que su desarrollo se haga visible. Nutricin bacteriana Las bacterias deben obtener del medio ambiente los sustratos que sern utilizados para su crecimiento. Nutricin bacteriana es el proceso mediante el cual las bacterias captan nutrientes a partir del medio que las rodea. Dichos nutrientes deben estar en solucin, an aquellos que son gaseosos. Si bien los constituyentes generales de las bacterias son muy similares, la capacidad de captacin de nutrientes y de sntesis de nuevos productos es muy variable entre distintas especies bacterianas Todas las bacterias necesitan para desarrollar ciertos elementos bsicos como ser C, P, S, N y agua. Aunque muchas bacterias slo requieren adicionalmente algunas molculas simples para crecer (como ser aminocidos y azcares) y son consideradas nutricionalmente no exigentes (Pseudomonas, Escherichia, Staphylococcus), existen otras consideradas nutricionalmente exigentes que requieren adems compuestos ms complejos como vitaminas y cofactores para poder desarrollar (Haemophilus, Neisseria). Ciertas bacterias son incapaces de producir y almacenar su propia energa por lo que deben tomarla a partir de la clula que se encuentran infectando y se denominan bacterias energticamente exigentes (Chlamydias y Rickettsias). Los dos primeros grupos mencionados son capaces de desarrollar en medios fabricados artificialmente en el laboratorio (in vitro) mientras que el ltimo grupo slo desarrolla en medios de cultivos que contengan clulas vivas. Absorcin de nutrientes La encargada de la absorcin selectiva de nutrientes es la membrana citoplasmtica ya que la pared es porosa e impide solo el paso de elementos de gran tamao insolubles o particulados.

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A travs de la membrana no slo ingresan sustancias sino que muchas son eliminadas a travs de ellas, tanto en procesos activos como pasivos. Transporte a travs de la membrana plasmtica La absorcin de nutrientes se realiza a travs de la membrana plasmtica mediante los siguientes mecanismos de transporte: Difusin pasiva: se produce por diferencia de concentraciones de los nutrientes entre el interior celular y el medio ambiente (glicerol, agua, O2, CO2) Difusin facilitada: participan aqu ciertas protenas de la membrana denominadas permeasas que permiten el paso de molculas desde el exterior al interior celular (aminocidos, azcares). Transporte activo:. Este mecanismo implica un gasto de energa y constituyen las denominadas bombas de transporte, por ejemplo bombas de sodio, calcio, oxgeno, etc. Translocacin de grupo: implican que la sustancia que ingresa pierde un grupo qumico en el exterior y gana otro en el interior celular, es decir existe una alteracin molecular (lpidos) Captacin de hierro: debi-do a la alta carga que posee el in Fe3+, ste debe unirse primero a ciertas protenas denominadas siderforos y recin as puede ser introducida a la clula bacteriana. En la figura de la izquierda se presentan ejemplos de los mecanismos de transporte transmembrana mencionados. Ciertas molculas de gran tamao deben ser previamente digeridas mediante enzimas que libera la bacteria (exoenzimas) para que recin puedan ser absorbidas las molculas ms pequeas. Se mencionan ejemplos de molculas de gran tamao y las exoenzimas que las digieren: Almidn - amilasas, Protenas proteasas, ADN - Desoxirribonucleasas, Gelatina - gelatinasas, Lpidos - lipasas y fosfolipasas.

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No todas las especies bacterianas son capaces de producir todas las exoenzimas, por lo que el estudio de la produccin de algunas de ellas es til en la identificacin de los gneros y especies. Requerimientos de O2 y CO2 En funcin de los requerimientos de O2 y CO2, las bacterias pueden clasificarse en:

Bacterias aerobios estrictas: necesitan una concentracin de alrededor del 21% de oxgeno para poder desarrollar. (Pseudomonas, Mycobacterium, Corynebacterium) Bacterias microaerfilas: slo necesitan alrededor de un 5% de oxgeno para desarrollar. Mayores concentraciones inhiben su desarrollo. (Campylobacter, Helicobacter) Bacterias anaerobios obligadas o estrictas: son incapaces de sobrevivir en presencia de oxgeno, es decir requieren un 0% de oxgeno (Fusobacterium, Clostridium) Bacterias anaerobias aerotolerantes: pueden sobrevivir, aunque no crecer, en presencia de hasta un 0,5% de oxgeno. (Actinomyces, Propionibacterium) Bacterias anaerobias facultativas: son capaces de crecer en una atmsfera tanto con o sin oxgeno. (Streptococcus, Staphylococcus, Enterobacteriaceae) Bacterias capnfilas: son bacterias aerobias que necesitan adems para crecer un 5-10% de CO2. (Neisseria, Haemophilus)

Para estudiar en el laboratorio los requerimientos de oxgeno de las bacterias, se coloca la bacteria en un medio de cultivo en un tubo profundo (Tubo 1) y se lo incuba durante 24 horas a 37C. Al cabo de ese tiempo se observa el sitio en el cual desarroll la bacteria. Si la bacteria desarroll slo en la superficie o sea en contacto con el oxgeno, la bacteria es aerobia estricta (Tubo A). Si en cambio slo se verifica desarrollo en la profundidad del medio e cultivo, la bacteria es anaerobia estricta (Tubo B). Una bacteria microaerfila desarrollar a cierta distancia de la superficie, donde la concentracin de oxgeno es baja (Tubo C) y una bacteria anaerobia facultativa desarrollar en todo el volumen del medio de cultivo (Tubo D)

24 hs 37 C

Tubo 1

Temperatura ptima de crecimiento Las bacterias requieren diferentes temperaturas para desarrollar y sobrevivir. Esta caracterstica es importante para comprender ciertas caractersticas patgenas de las bacteria, para entender sobre la forma en que las bacterias pueden transmitirse desde el medio ambiente al hombre y para mantener las muestras clnicas a la temperatura adecuada hasta su procesamiento en el laboratorio.

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En base a su temperatura ptima de desarrollo y sobrevida, las bacterias se clasifican en:

Bacterias Psicrfilas: soportan bajas temperaturas, entre 0 - 20C (Pseudomonas, Listeria) Bacterias Mesfilas: desarrollan mejor a temperaturas intermedias, entre 20 - 45C (Staphylococcus, Streptococcus) Bacterias Termfilas: son capaces de soportar altas temperaturas, de 55C o ms (Bacterias no patgenas) Bacterias Estenotrmicas, son mesfilas pero slo desarrollan y sobreviven en rangos estrechos de temperatura, entre 35 - 36C (Neisseria) Bacterias Euritrmicas: son capaces de sobrevivir en amplios rangos de temperatura, entre 0- 44C. (Enterococcus)

Requerimientos de pH La concentracin de iones hidrgeno en el medio condiciona el crecimiento de las bacterias. En funcin de su capacidad para desarrollar a diferentes pH, las bacterias pueden clasificarse en:

Neutrfilas: entre 5,5 - 8,0 (Staphylococcus, enterobacterias) Acidfilas: entre 0,0 - 5,5 (Lactobacillus) Alcalfilas: entre 8,0 - 11,5 (Vibrio)

El conocimiento del pH ptimo para el desarrollo de las bacterias permite conocer los equilibrios y cambios posibles dentro de los diferentes ecosistemas bacterianos existentes en el organismo, ya que existen bacterias que se aseguran un ambiente cido para impedir el desarrollo de bacterias neutrfilas y alcalfilas. Obtencin de energa Para poder desempear los procesos metablicos, las bacterias, como todos los seres vivos deben producir y almacenar energa para luego poder reutilizarla. Slo el grupo mencionado ms arriba (energticamente exigentes) es incapaz de obtener energa por s solos. El proceso general de obtencin y consumo de energa puede sintetizarse como sigue: Molculas complejas Degradacin Metabolitos intermedios Sntesis Molculas complejas consumo de Energa produccin de Energa

Para obtener energa, las bacterias pueden valerse de diferentes mecanismos: A) Respiracin aerbica (Oxidacin): Ocurre en presencia de oxgeno, es decir en aerobiosis. El sustrato es la glucosa u otro azcar y el aceptor final de electrones es el oxgeno molecular.

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CO2 + H2 O + 38 ATP

La respiracin aerbica involucra los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. Gluclisis Decarboxilacin oxidativa Ciclo de Krebs Transporte de electrones

Durante el proceso de forman productos txicos (O2- y H2 O2) que deben ser transformados por la bacteria productora en O2 y agua mediante enzimas como la peroxidasa y la superxidodismutasa. Este mecanismo es utilizado por las bacterias aerobias y anaerobias facultativas en aerobiosis. B) Respiracin anaerbica: Ocurre en ausencia de oxgeno. El sustrato es la glucosa u otros azcares y los aceptores finales de electrones son iones inorgnicos. Glucosa + S CO2 + SH2 + 34 ATP

La respiracin anaerbica involucra los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. Gluclisis Decarboxilacin oxidativa Ciclo de Krebs Transporte de electrones

Durante el proceso no se liberan productos txicos. Este mecanismo es utilizado por las bacterias anaerobias obligadas y las anaerobias facultativas en anaerobiosis. C) Fermentacin: es un proceso que ocurre en ausencia de oxgeno. El sustrato es la glucosa u otros azcares y los aceptores finales de electrones son molculas orgnicas. Glucosa + NADH La fermentacin involucra los siguientes pasos: 1. Gluclisis 2. Degradacin del piruvato 3. Productos con alta energa: cido lctico, propinico, butrico, actico, alcohol etlico, etc. Este mecanismo es utilizado por las bacterias anaerobias estrictas y anaerobias facultativas en anaerobiosis. Para estudiar el metabolismo energtico de las bacterias, se siembran con la bacteria en estudio dos tubos conteniendo glucosa y un indicador de pH, uno de los cuales se cubre con vaselina lquida de manera tal de impedir que el medio de cultivo se ponga en contacto con el oxgeno ambiental (Tubos 1 y 2). Luego de 24 hs. de incubacin a 37 C se observa lo ocurrido en ambos tubos. Un cambio de color de verde a amarillo en el medio de cultivo indica que la bactePiruvato + NAD+ + ATP

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ria a desarrollado y utilizado la glucosa como fuente de energa, produciendo una acidificacin del medio con el consiguiente cambio en el color del indicador de pH. Si el cambio de color se evidencia en el medio expuesto al aire, significa que la bacteria utiliz la glucosa en presencia de oxgeno, es decir tubo lugar una oxidacin (Tubo A) y la bacteria es oxidadora. Si el cambio de color ocurre en el medio tapado con vaselina, la utilizacin de la glucosa se realiz en ausencia de oxgeno, es decir ocurri una fermentacin (Tubo B) y la bacteria es fermentadora. Si no se registra cambio en ninguno de los tubos, significa que la bacteria es no glucidoltica, es decir, no es capaz de utilizar la glucosa como fuente de energa.

24 hs a 37C

Tubos 1 y 2

Medios de Cultivo Se denomina medio de cultivo al conjunto de sustancias que permiten el crecimiento de los microorganismos bajo determinadas condiciones de incubacin (Tiempo, temperatura y oxgeno). stos deben reunir los nutrientes mnimos indispensables para que las bacterias puedan sobrevivir y desarrollarse. Los medios de cultivo cumplen un papel fundamental en el aislamiento de bacterias a partir de muestras clnicas y en la obtencin de grandes cantidades de microorganismos para fabricar vacunas. Los medios de cultivo pueden clasificarse segn su consistencia, su composicin y la finalidad de uso. Segn su consistencia

Medios lquidos, tambin denominados caldos Medios slidos, poseen una sustancia solidificante que generalmente es agar-agar, una sustancia que solidifica a temperatura ambiente y slo sirve de soporte para los nutrientes.

Al inicio de la Microbiologa como ciencia slo se poda obtener las bacterias en medios lquidos pero era muy difcil y a veces hasta imposible obtener en forma aislada dos bacterias que se encontraban juntas en una muestra. El desarrollo de medios de cultivos slidos marca un hito importante dentro de la ciencia mdica debido a que a partir de su aplicacin en el diagnstico de las enfermedades infecciosas se ha podido recuperar a las bacterias en forma aislada para

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poder realizarle las pruebas de identificacin, sensibilidad a antimicrobianos e inoculacin en animales (2, 3 y 4 postulados de Koch) Segn su composicin

Medios sintticos o simples, poseen composicin exactamente conocida, slo contienen sustancias orgnicas e inorgnicas conocidas. Por ejemplo: agar glucosa, indicador de pH. Medios complejos: poseen una composicin que slo se conoce en parte ya que algunos de los ingredientes posee una composicin variable Por ejemplo: medios con sangre, suero equino, yema de huevo, extracto de carne, etc. Tambin se denominan medios enriquecidos.

Segn su finalidad

Medios para aislamiento primario: son medios slidos que se usan para obtener bacterias aisladas a partir de una muestra clnica. Son ejemplos de medios de aislamiento primario los siguientes: Agar nutritivo, Agar sangre, Agar chocolate, Agar Eosina-Azul de Metileno (E.M.B.), Agar Salmonella-Shigella (S.S.), Agar Manitol Salado, etc. Medios de enriquecimiento: son medios lquidos en los cuales se siembra inicialmente la muestra para aumentar el nmero de bacterias antes de ser subcultivado a un medio slido. Son ejemplos de medios de enriquecimiento los siguientes: Caldo selenito, Caldo CerebroCorazn, Caldo Tioglicolato Medios de identificacin: son medios lquidos o slidos que permiten estudiar alguna caracterstica metablica de la bacteria como ser produccin de enzimas. Son ejemplos de medios de identificacin los siguientes: Agar triple azcar hierro (TSI), Agar citrato, Agar urea, etc.

Segn sus propiedades

Medios generales: Permiten el crecimiento de la mayora de las bacterias presentes en la muestra. Por ejemplo: agar sangre, agar chocolate, agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo cerebro corazn. Medios selectivos: Permiten el crecimiento de slo determinado tipo de bacteria presente en la muestra, impidiendo el desarrollo de otras debido a que contienen sustancias (antibiticos, colorantes, sales, etc.) que inhiben el desarrollo de ciertas bacterias. Por ejemplo: agar manitol salado (alta concentracin de ClNa), Agar Thayer-Martin (presencia de antibiticos), agar EMB (contiene eosina y azul de metileno que inhiben a las bacterias grampositivas), etc. Medios diferenciales: Poseen sustancias que permiten diferenciar entre grupos bacterianos segn determinadas caractersticas biolgicas (hemlisis, fermentacin de azcares, precipitacin de sales, etc) y permiten realizar una identificacin presuntiva inicial de las bacterias presentes en la muestra. Son ejemplos: agar sangre (hemlisis), agar EMB (fermentacin de lactosa), etc.

Aislamiento primario Una vez obtenida la muestra clnica, para realizar el diagnstico etiolgico de la enfermedad infecciosa, o sea, para aislar al agente causal de la misma, es necesario sembrar (inocular) la muestra en medios de cultivo slidos (y eventualmente lquidos si se desea realizar un enriquecimiento previo) (Ver figura inferior)

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Muestras clnicas Slido Medios de cultivo Lquido

El objetivo de este paso es obtener colonias bacterianas aisladas. Se denomina colonia al conjunto de bacterias que provienen de una misma clula madre y en los medios de cultivo aparecen como acmulos de miles de bacterias que pueden observarse a simple vista. Las colonias aisladas se obtienen diseminando la muestra sobre la superficie del agar con ayuda de un ansa bacteriolgica. Las figuras siguientes muestran un esquema de cmo se disemina la muestra sobre la superficie del agar y una fotografa de colonias aisladas sobre una placa de agar EMB luego de 24 horas de incubacin a 37C.

Inicio de la siembra

Incubar 24 hs a 37C

Final de la siembra

Duplicacin bacteriana En organismos multicelulares la multiplicacin celular se traduce en aumento del tamao del individuo pero en organismos unicelulares el crecimiento se traduce en aumento del nmero de individuos. La duplicacin bacteriana se produce por fisin binaria en la que la divisin del ADN y la divisin celular se llevan a cabo simultneamente. El tiempo necesario para que se observen las colonias en un medio de cultivo adecuado y bajo condiciones de temperatura y atmsfera correctas depender del tiempo de duplicacin celular de la bacteria en estudio. En la figura siguiente se esquematiza un proceso de duplicacin bacteriano.

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A continuacin se presentan ejemplos de tiempos de divisin y del tiempo mnimo que debe esperarse para observar colonias en los medios de cultivo.

Escherichia coli - Divisin: 20 minutos - Colonias: 24 horas Clostridium botulinum - Divisin: 35 minutos - Colonias: 48 horas Mycobacterium tuberculosis - Divisin: 12 horas - Colonias: 30 das

Cintica del crecimiento bacteriano Debido a que las bacterias se duplican en cada generacin, la poblacin bacteriana a travs del tiempo aumentar en forma exponencial de 2. Si se presenta el nmero de bacterias en funcin del tiempo, tendremos una curva exponencial pero si representramos el ciclo vital de un grupo de bacterias tendramos cuatro fases (Ver figura siguiente):
Nmero de bacterias

3 2 1 4

Tiempo

1. Fase de latencia: las bacterias se adaptan al medio en el que se encuentran, en este perodo el nmero de clulas no vara. El tiempo de adaptacin es variable para las diferentes

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bacterias. En esta etapa, por ejemplo, las esporas bacterianas se transforman en clulas vegetativas. 2. Fase exponencial: es aqu donde se inicia la multiplicacin bacteriana, el nmero de bacterias aumenta exponencialmente y es aqu donde se liberan las enzimas y toxinas. 3. Fase estacionaria: llega un momento en que existe una competencia por los nutrientes ya que estos van disminuyendo en su concentracin y las bacterias dejan de crecer. En este perodo las bacterias esporuladas comienzan a esporular. Algunas bacterias mueren pero otras se dividen por lo que el nmero de clulas se mantiene sin variaciones. 4. Fase de muerte: el nmero de bacterias comienza a disminuir debido a que las bacterias que mueren supera al nmero de bacterias que se dividen. En la prctica, este modelo de crecimiento bacteriano nos sirve para conocer cunto tiempo deber ser incubado un medio de cultivo con el objeto de que las bacterias en estudio siempre se encuentren en la fase de crecimiento exponencial, ya que es all cuando se manifiestan todas sus propiedades bioqumicas y patognicas.

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